C. elegans tarmen som en modell för intercellulära Lumen morfogenes och In Vivo polariserade membran biogenes på Single-cell nivå: märkning av antikropp färgning, RNAi förlust-av-funktion analys och Imaging
Summary
De transparenta C. elegans tarmen kan fungera som en ”in-vivo vävnad kammare” för att studera apicobasal membran och lumen biogenes på single-cell och subcellulär nivå under flercelliga tubulogenesis. Det här protokollet beskriver hur man kombinerar standard märkning, genetiska förlust-av-funktion/RNAi och mikroskopiska metoder att dissekera dessa processer på molekylär nivå.
Abstract
Flercelliga rör, grundläggande enheter av alla inre organ, består av polariserade epitelial eller endothelial celler, med apikala membran foder lumen och basolateral membranen att kontakta varandra och/eller extracellulärmatrix. Hur denna särskiljande membran asymmetri är under och bibehållas orgel morfogenes är fortfarande en olöst fråga cellbiologi. Det här protokollet beskriver C. elegans tarmen som en modell för analys av polariserade membran biogenes under tube morfogenes, med betoning på apikala membran och lumen biogenes. C. elegans tjugo-cell singel-skiktad intestinala epitelet är ordnad in i en enkel bilateralt symmetriska tube, möjliggör en analys på en enskild cell-nivå. Membranet polarisering sker samtidigt med polariserade celldelning och migration under tidig embryogenes, men de novo polariserade membran biogenes fortsätter hela larval tillväxt, när celler inte längre föröka sig och flytta. Den senare inställningen gör att man kan separera subcellulär förändringar som samtidigt förmedlar dessa olika polariserande processer, svårt att urskilja i de flesta polaritet modeller. Apikala-, basolateral membran-, Junktional-, cytoskeletal- och endomembrane komponenter kan vara märkt och spåras under hela utvecklingen av GFP fusionsproteinerna eller bedömt i situ antikropp färgning. Tillsammans med organismens genetiska mångsidighet ger C. elegans tarmen således en unik i vivo modell för visuellt, utvecklande, och molekylär genetisk analys av polariserade membran och tube biogenes. Specifika metoder (standard) beskrivs här inkluderar hur: etikett intestinal subcellulära komponenter av antikropp färgning; analysera gener involverade i polariserade membran biogenes av förlust-av-funktion studier anpassas till vanligtvis väsentliga tubulogenesis gener; bedöma polaritet defekter under olika utvecklingsstadier; tolka fenotyper av epifluorescence, differentiell störningar kontrast (DIC) och konfokalmikroskopi; kvantifiera synfel. Detta protokoll kan anpassas att analysera någon av de ofta mycket molekylerna som är inblandade i epitelial polaritet, membran biogenes, röret och lumen morfogenes.
Introduction
Generering av cellulär och subcellulär asymmetrier, såsom bildandet av polariserade membran domäner, är avgörande för morfogenes och funktion av celler, vävnader och organ1. Studier på polariserade membran biogenes i epitel förbli en teknisk utmaning, eftersom riktade förändringar i fördelningen av subcellulära komponenter är beroende av flera på varandra följande och sammanfallande extracellulära och intracellulära signaler som är svårt att separera i de flesta modeller och starkt beroende av modell systemet. Modellen presenteras här – den enda lager Caenorhabditis elegans tarmen – är en vävnad av utsökta enkelhet. Tillsammans med encelliga C. elegans utsöndringsorganen canal (Se medföljande papper på polariserade membran biogenes i C. elegans utsöndringsorganen kanal)2, det ger flera unika fördelar för identifiering och karakterisering av molekyler som krävs för polariserade membran biogenes. Bevarande av molekylär polaritet ledtrådar från jäst till mannen göra detta enkla ryggradslösa organ en utmärkt ”i vivo vävnad kammare” att hantera frågor på epitelial polaritet som är av direkt betydelse för det mänskliga systemet, som fortfarande är alltför komplex att tillåta visuell dissektion av dessa händelser på enda cell nivå i vivo.
Även om flera bevarade polaritet ledtrådar från (1) extracelluar matris, (2) plasmamembranet och dess korsningar och (3) intracellulära vesikulär människohandel har varit identifierade3, de underliggande principerna för deras integration i processen för polariserade epitelial membran och vävnad biogenes är dåligt förstådd4. De klassiska encelliga i vivo modellerna (e.g.S. cerevisiae och C. elegans zygoten) har varit avgörande för att fastställa principerna för polariserade celldelning och främre-bakre polaritet och har identifierat kritiska membran-associerade polaritet bestämningsfaktorer (den små GTPases/CDC-42, partitionering-defekta parsna)5,6, men de är beroende av unika symmetri bryta cues (knopp ärr, spermier posten) och saknar junction-säkrade apicobasal membran domäner och, förmodligen, den motsvarande intracellulära apicobasal sortering maskiner. Vår nuvarande kunskap om organisationen av polariserade människohandel epitel, dock främst förlitar sig på däggdjur 2D monokulturer7, som saknar fysiologiska extracellulära och utvecklingsmässiga ledtrådar som kan ändra positioner av membran domäner och riktningar av människohandel banor (en switch från 2D till 3D i vitro kultur system ensam räcker för att invertera membran polaritet i MDCK (Madin-Darby canine njure) celler)8. In vivo utvecklande studier på epitelial polaritet i ryggradslösa modellorganismer genomfördes initialt med platt epitel, exempelvis i Drosophila melanogaster epidermis, där de identifierade kritiska bidrag korsningen dynamics för polariserade cellmigration och cell ark rörelse9och endocytic människohandel för polaritet underhåll10. 3D i in vitro- och in-vivo analys av lumen morfogenes i tubulär epitel i MDCK celler och i C. elegans tarmen, respektive har nyligen identifierat kravet av intracellulära människohandel för de Novo (apical) domän och lumen biogenes och placering11,12,13. Tjockleken av tubulär (kontra platt) epitelceller är en fördel för 3D analys av subcellulär asymmetrier eftersom det tillåter en överlägsen visuell skillnad av den apikala-lumenal membranen, apico-laterala korsningar, laterala membranet, och den placerar av intracellulära organeller. Till dessa visuella fördelar, C. elegans modellen lägger den i vivo inställning, utvecklingsmässiga axel, öppenhet, enkelhet kropp plan, invarianta och definierade cellen härstamning, analytiska (genetisk) och ytterligare fördelar som beskrivs nedan.
C. elegans själv är en spolmask tubulär struktur vars öppenhet och enkla arkitektur göra dess jämväl tubulär inre organ direkt tillgänglig för visuell analys av röret och lumen morfogenes. Tjugo cellerna av dess tarmen (ibland 21 eller 22-celler)14 härleds från en enda progenitor cell (E) och utvecklas från ett epitel med dubbla lager av ett interkalation steg till ett bilateralt symmetriska rör av nio INT ringar (fyra celler i den första ring; Figur 1 Schematisk)14,15,16. Tarmens härstamning och vävnad analys, initialt bestäms av Nomarski optik via nukleära identiteter17och därefter av fluorescensmikroskopi via märkt membran, har gett viktiga insikter om dess morfogenes, i särskilt de cell-autonoma och cell-icke-självständiga krav för dess riktnings celldelningar och rörelser (t.ex., interkalation, höger-vänster asymmetrier, främre och bakre tube rotation)14,18 . Tidiga endodermal cell specifikation och gen rättsliga nätverket styr utvecklingen av denna klonala modell orgel är väl karakteriserade19,20. Fokus här, är dock på en analys av polariserade membran och lumen biogenes i inre tubulära cellerna, och de intracellulära asymmetrierna endomembranes, cytoskeletal strukturer och organeller som åtföljer denna process. Analys underlättas av enkelheten i denna tube, där alla apikala membran (på ultrastrukturella nivå kännetecknas av Mikrovilli) möta lumen och alla basala membran möta yttre röret ytan, med laterala membran att kontakta varandra, skild från det apikala membranet genom korsningar (figur 1 Schematisk; se referenser (16,21) för i C. elegans-specifik organisation av tight och adherens junction komponenter). Apikala membran biogenes är således sammanfaller med lumen morfogenes. Dessutom storleken på vuxen intestinala celler – de största cellerna i detta lilla djur (med undantag av utsöndringar cellen) – ungefärliga storleken på en däggdjursceller, tillåter i vivo visuell spårning av subcellulär element, t.ex. vesikler banor, som oftast är försök in vitro- i en kultur maträtt.
I syfte att denna cellulär och subcellulär analys är lämplig märkning avgörande. Intestinal endo – eller -plasmamembranet domäner, korsningar, cytoskeletalstrukturer, kärnor och andra subcellulär organeller kan visualiseras genom märkning deras specifika molekylära komponenter. Många sådana komponenter har karaktäriserats och fortsätta att bli upptäckta (tabell 1 ger några exempel och refererar till resurser). Exempelvis varit olika molekyler skilja de tubulära eller vesikulär fack av intestinal endomembrane systemet, från ER till Golgi via post-Golgi blåsor till plasmamembranet, identifierade22. Den specifika proteiner (och lipider samt sockerarter) kan antingen vara märkt direkt eller indirekt via bindande proteiner. Detta protokoll fokuserar på i situ antikropp färgning av fasta prover, en av två standard märkning tekniker (se det medföljande papperet på utsöndringsorganen canal tubulogenesis för en beskrivning av andra teknik2 – in-vivo märkning via fluorescerande protein fusions – som är direkt tillämplig på tarmen; Tabell 2 ger exempel på tarmen-specifika initiativtagare som kan användas för att köra uttrycket av sådan fusionsproteiner till tarmen). Dubbel- eller flera märkning med antingen tillvägagångssätt eller med en kombination av båda plus ytterligare kemisk färgning, tillåter större djupgående visuella upplösning och undersökning av rumsliga och tidsmässiga förändringar i samtidig lokalisering och rekrytering av specifika molekyler eller subcellulära komponenter (figur 2). Fixering och färgning procedurerna som beskrivs i detta protokoll stöd bevarandet av grönt fluorescerande protein (GFP) märkning under immunfärgning förfaranden. För imaging, huvudpunkter av detektion och karakterisering av tubulogenesis fenotyper via mikroskopiska standardförfaranden (fluorescens dissekera och confocal microscopy) är beskrivs ()figur 3, 4). Dessa kan utökas till högre upplösning imaging metoder, för instans superresolution mikroskopi och överföring elektronmikroskopi (inte beskrivs här).
En styrka av detta system är förmågan att analysera polaritet i enskilda celler i olika utvecklingsstadier, från embryogenes genom vuxenlivet. Exempelvis kan apikala membran domän och lumen biogenes spåras i hela utveckling på enskild cell nivå via märkning med ERM-1, en mycket membran-aktin länkare av Ezrin-Radixin-Moesin familj23,24 . ERM-1 visualiserar apikala membran biogenes (1) under embryonala tube morfogenes, när det uppstår samtidigt med polariserade celldelning och migration (celler flytta apikalt runt lumen under interkalation)15; (2) under sena embryonala och larver tube förlängning som intäkterna i avsaknad av celldelning eller migration. och (3) i vuxen tarmen, där polariserade membran domäner bibehålls (figur 1). I det expanderande efter mitotiska larval epitelet, de novo polariserade membran biogenes kan således skiljas från polariserade vävnad morfogenes, vilket inte är möjligt i de flesta i vivo och in vitro- epitelial polaritet modeller, inklusive de med encelliga upplösning (t.ex. 3D MDCK cysta modell8). Med märkning för andra komponenter, den här inställningen ger möjlighet (särskilt på den L1 larvstadium när celler har en högre cytoplasman/nucleus ratio) att skilja de intracellulära ändringar som är specifika för polariserade membran biogenes ( t.ex. omorienteringen av människohandel banor) från dem som samtidigt krävs för polariserade celldelning och migration.
Genetiska mångsidigheten hos C. elegans är välkända25och gör det en kraftfull modellsystem för molekylär analys av biologiska frågor. En studie på morfogenes, exempelvis kan börja med en vildtyp stam, en transgena stam där strukturen av intresse (t.ex. ett membran) är märkt med en fluorescerande markör, eller med en förlust – eller gain-of-function mutation med en defekt i detta struktur. En typisk omvänd genetisk studie kan generera en mutant där genen intresseanmälan raderas i den könsceller (t.ex. genom en riktad borttagning), ändrat genom mutagenes (vanligtvis producerar punktmutationer med påföljande förlust, minskning eller vinst i funktion av genen), eller där dess avskrift minskas med RNAi. Lättheten av RNAi genom utfodring i C. elegans26 lämpar sig också till design av riktade skärmar som undersöker en större grupp av gener av intresse. En genetisk modellorganism utan tvekan största styrka är förmågan att genomföra i vivo framåt skärmar (e.g. mutagenes, systematisk eller genome-wide RNAi-skärmar) som tillåter en förutsättningslös utredning molekylär orsaka för en fenotyp av intresse. Exempelvis en opartisk visual C. elegans RNAi tubulogenesis skärmen, börjar med en transgena djur med ERM-1-märkt apikala membran, upptäckte en spännande reversibel intestinal polaritet konvertering och ektopisk lumen fenotyp, används här som ett exempel för denna typ av analys. Denna skärm identifierats utarmning av glykosfingolipider (GSLs; obligata membran lipider, identifieras via sin GLS-biosyntetiska enzymer) och delar av den vesikler coat clathrin och dess AP-1 adapter som de specifika molekylära defekter som orsakar denna polaritet konvertering fenotyp, därmed karaktärisera dessa människohandel molekyler som i vivo ledtrådar för apikala membran polaritet och lumen positionering12,13. När du startar med en specifik genetisk mutation/morfogenes fenotyp, kan sådana skärmar (eller enda genetiska/RNAi interaktion experiment) även undersöka funktionella interaktioner mellan två eller flera gener av intresse (Se medföljande papper på den utsöndringar kanalen för ett exempel på sådan analys)2. Detta protokoll fokuserar på RNAi som, utöver sin förmåga att direkt identifiera den gen vars förlust orsakar fenotypen i framåt skärmar, ger särskilda fördelar för analys av morfogenes. Eftersom genprodukter styra morfogenes ofta arbeta på ett dosberoende sätt, är RNAi oftast framgångsrik generera ett spektrum av fenotyper. Förmågan att generera informativ partiella-förlust-av-funktion fenotyper hjälper även till att ta itu med problemet att majoriteten av viktiga tubulogenesis gener är avgörande och att deras förluster orsaka sterilitet och tidig embryonal dödlighet. Detta protokoll villkorlig RNAi strategier för att övervinna denna svårighet och föreslår olika sätt att optimera generering av ett bredare spektrum av fenotyper, såsom en alleliska serie producerad av mutagenes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det här protokollet beskriver hur man kombinerar standard förlust-av-funktion genetiska/RNAi och imaging (märkning och mikroskopiska) metoder för att dra nytta av C. elegans intestinal epitel som modell för visuella och molekylär dissektion av i vivo polariserade membran och lumen biogenes.
Märkning
Detta protokoll fokuserar på antikropp färgning. In situ märkning av antikroppar är en mycket specifik alternativa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Mario de Bono (MRC laboratorium för molekylärbiologi, Cambridge, UK), Kenneth J. Kemphues (Cornell University, Ithaca, USA), Michel Labouesse (Institut de Biologie Paris Seine, Université Pierre et Marie Curie, Paris, Frankrike), Grégoire Michaux (Université deRennes 1, Rennes, Frankrike) och CGC, finansierad av NIH Office infrastruktur forskningsprogram (P40 OD010440), för stammar och antikroppar. Detta arbete stöds av bidrag NIH GM078653, MGH är 224570 och SAA 223809 till V.G.
Materials
| Antibody staining | |||
| poly-L-lysine | Sigma | P5899 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A949SK-4 | |
| Tween | Fisher Scientific | 50-213-612 | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Powdered milk | Sigma | MT409-1BTL | |
| Primary antibodies | |||
| MH27 (mouse) | Concentration: 1:20 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank. | ||
| MH33 (mouse) | Concentration: 1:10 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank. | ||
| anti-ICB4 (rabbit) | Concentration: 1:5 Resources: A gift from MariodeBono (Medical Research Council, England) | ||
| anti-PAR-3 (rabbit) | Concentration: 1:50 Resources: A gift from Kenneth J. Kemphues (Cornell University) | ||
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Floor 568 (anti-rabbit) | ABCam | AB175471 | Concentration: 1:200 |
| Cy5 (anti-mouse) | Life technologies | A10524 | Concentration: 1:200 |
| TRITC (anti-rabbit) | Invitrogen | T2769 | Concentration: 1:200 |
| FITC (anti-mouse) | Sigma | F9006 | Concentration: 1:100 |
| Labeled chemicals | |||
| Texas Red-Phalloidin | Concentration: 1:100 Resources: Molecular Probes-T7471 | ||
| Materials | |||
| Vacuum Grease Silicone | Beckman | 335148 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 4448 | |
| Microscope coverslips (22×22-1) | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| C. elegans related | see reference29 for standardC. elegans culture and maintenance procedures. | ||
| LB Medium and plates | see reference29 for protocols. | ||
| Tryptone | Acros Organics | 611845000 | |
| Yeast Extract | BD Biosciences | 212750 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214040 | |
| Ampicillin | Sigma | A0116 | |
| Tetracycline | Fisher Scientific | BP912 | |
| M9 Medium | see reference29 for protocols. | ||
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KH2PO4 | Sigma | P0662 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
| MgSO4 | Sigma | M2773 | |
| NGM plates | see reference29 for protocols. | ||
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Tryptone | Acros Organics | 611845000 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214040 | |
| MgSO4 | Sigma | M2773 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| Cholesterol | Sigma | C8667 | |
| K2HPO4 | Sigma | P3786 | |
| KH2PO4 | Sigma | P0662 | |
| RNAi plates | see reference30 for protocols. | ||
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Tryptone | Acros Organics | 611845000 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214040 | |
| MgSO4 | Sigma | M2773 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| Cholesterol | Sigma | C8667 | |
| K2HPO4 | Sigma | P3786 | |
| KH2PO4 | Sigma | P0662 | |
| IPTG | US Biological | I8500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP2648 | |
| NaOH | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Sodium hypochlorite | Fisher Scientific | 50371500 | |
| Bacteria | |||
| OP50 bacteria | CGC | ||
| HT115 bacteria | CGC | ||
| Genome-wide RNAi libraries Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref 30,49,50) | Source BioScience | ||
| C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref51) | Source BioScience | ||
| Imaging related | |||
| Sodium azide | Fisher Scientific | BP9221-500 | |
| Equipment | |||
| dissecting microscope | Nikon | SMZ-U | |
| dissecting microscope equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions) | Olympus | SZX12 | |
| Laser-scanning confocal microscope | Leica Microsystem | TCS SL | |
| laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope | Nikon | C2 |
References
- Bryant, D. M., Mostov, K. E. From cells to organs: building polarized tissue. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (11), 887-901 (2008).
- Zhang, N., Membreno, E., Raj, S., Zhang, H., Khan, L. A., Gobel, V. The C. elegans excretory canal as a model for intracellular lumen morphogenesis and in vivo polarized membrane biogenesis in a single cell. JoVE. , (2017).
- Rodriguez-Boulan, E., Macara, I. G. Organization and execution of the epithelial polarity programme. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (4), 225-242 (2014).
- Mellman, I., Nelson, W. J. Coordinated protein sorting, targeting and distribution in polarized cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (11), 833-845 (2008).
- Nelson, W. J. Adaptation of core mechanisms to generate cell polarity. Nature. 422, 766-774 (2003).
- Goldstein, B., Macara, I. G. The PAR Proteins: Fundamental Players in Animal Cell Polarization. Dev. Cell. 13 (5), 609-622 (2007).
- Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. Organization of vesicular trafficking in epithelia. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (3), 233-247 (2005).
- Zegers, M. M., O’Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro. Trends Cell Biol. 13 (4), 169-176 (2003).
- Tepass, U. The apical polarity protein network in Drosophila epithelial cells: regulation of polarity, junctions, morphogenesis, cell growth, and survival. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 28, 655-685 (2012).
- Shivas, J. M., Morrison, H. A., Bilder, D., Skop, A. R. Polarity and endocytosis: reciprocal regulation. Trends Cell Biol. 20 (8), 445-452 (2010).
- Bryant, D. M. A molecular network for de novo generation of the apical surface and lumen. Nat. Cell Biol. 12 (11), 1035-1045 (2010).
- Zhang, H. Apicobasal domain identities of expanding tubular membranes depend on glycosphingolipid biosynthesis. Nat. Cell Biol. 13 (10), 1189-1201 (2011).
- Zhang, H. Clathrin and AP-1 regulate apical polarity and lumen formation during C. elegans tubulogenesis. Development. 139 (11), 2071-2083 (2012).
- Asan, A., Raiders, S. A., Priess, J. R. Morphogenesis of the C. elegans Intestine Involves Axon Guidance Genes. PLoS Genet. 12 (4), e1005950 (2016).
- Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine. Dev. Biol. 216 (1), 114-134 (1999).
- Altun, Z. F., Hall, D. H. Alimentary system, intestine. WormAtlas. , (2009).
- Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 56 (1), 110-156 (1977).
- Rasmussen, J. P., English, K., Tenlen, J. R., Priess, J. R. Notch signaling and morphogenesis of single-cell tubes in the C. elegans digestive tract. Dev. Cell. 14 (4), 559-569 (2008).
- Maduro, M. F. Gut development in C. elegans. Seminars in cell & developmental biology. , (2017).
- McGhee, J. D. The Caenorhabditis elegans intestine. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 2 (3), 347-367 (2013).
- Gobel, V., Barrett, P. L., Hall, D. H., Fleming, J. T. Lumen morphogenesis in C. elegans requires the membrane-cytoskeleton linker erm-1. Dev. Cell. 6 (6), 865-873 (2004).
- Fehon, R. G., McClatchey, A. I., Bretscher, A. Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11 (4), 276-287 (2010).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
- Shakes, D. C., Miller, D. M., Nonet, M. L. Immunofluorescence microscopy. Methods Cell Biol. 107, 35-66 (2012).
- Kamath, R. S., Martinezcampos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), RESEARCH0002 (2001).
- Simmer, F. Loss of the Putative RNA-Directed RNA Polymerase RRF-3 Makes C. elegans Hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12 (15), 1317-1319 (2002).
- Kennedy, S., Wang, D., Ruvkun, G. A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans. Nature. 427 (6975), 645-649 (2004).
- Maddox, A. S., Maddox, P. S. High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).
- Netherlands, S. . Nomarski Differential Interference Contrast Microscopy. , (2008).
- Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): a method for superresolution fluorescence imaging. Cold Spring Harb. Protoc. 6, 498-520 (2013).
- Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat. Rev. Genet. 3, 356-369 (2002).
- Lee, Y. U., Son, M., Kim, J., Shim, Y. H., Kawasaki, I. CDC-25.2, a C. elegans ortholog of cdc25, is essential for the progression of intestinal divisions. Cell Cycle. 15 (5), 654-666 (2016).
- Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. Modern electron microscopy methods for C. elegans. Methods Cell Biol. 107, 93-149 (2012).
- Shi, A., Grant, B. D. In vivo analysis of recycling endosomes in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 130, 181-198 (2015).
- . Transgeneome website Available from: https://transgeneome.mpi-cbg.de/transgeneomics/index.html (2017)
- . National BioResource Project (NBRP)::C. elegans Available from: https://shigen.nig.ac.jp/c.elegans/ (2017)
- Kamath, R. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
- Kamath, R. S. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
- Rual, J. F. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14 (10B), 2162-2168 (2004).
