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Developmental Biology

細胞間腔の形態形成と単一細胞レベルでのIn Vivo偏光膜生合成のためのモデルとして線虫腸: 抗体の汚損、RNAi 損失の機能解析、イメージングによるラベリング

Published: October 3, 2017 doi: 10.3791/56100
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1,3, 1
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Developmental Biology and Genetics Core, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2College of Life Sciences, Jilin University, 3Faculty of Health Sciences, University of Macau

Summary

透明な線虫の腸、「体内組織商工会議所「多細胞 tubulogenesis の中に apicobasal の膜と内腔の生合成単一セルおよび細胞内レベルでの勉強のためとして使用できます。このプロトコルでは、分子レベルでこれらのプロセスを分析するミクロ アプローチ、機能喪失遺伝的/RNAi 標準ラベルを結合する方法をについて説明します。

Abstract

多管、すべての内部器官の基本単位は、互いおよび/または細胞外マトリックスへのお問い合わせルーメンと基底膜の内側を覆う細胞膜と偏光の上皮や内皮細胞で構成されます。この特徴的な膜の非対称性を確立・器官形成の間に維持する方法はまだ細胞生物学の未解決の質問です。このプロトコルでは、頂端膜と内腔形成に重点を置いて、管の形成の間に偏光膜生合成の解析のためのモデルとして線虫腸をについて説明します。20 セル線虫 c. エレガンス一層腸上皮は単一セルのレベルの分析を許可する単純な左右相称なチューブに整理されます。偏光膜は付随して偏光の細胞分裂と初期胚発生がde novo偏極移行で発生します、もはや増殖し、移動する細胞膜器官が幼虫の成長を通して継続します。後者の設定では、同時にこれらのほとんどの極性モデルを区別することは困難異なる偏光プロセスを仲介する細胞の変化を分離することができます。頂、基底膜-、接合部-細胞骨格、-内コンポーネントのラベルし GFP の融合蛋白質によって開発全体を通して追跡かその場で抗体の汚損によって評価。一緒に生物の遺伝的多様性、 c. の elegans腸はこうして視覚、発達、ユニークな体内モデルと偏光膜および管器官の遺伝子解析を提供します。ここで説明した特定のメソッド (すべての標準) を含める方法: 抗体の汚損; 腸細胞レベル下のコンポーネントにラベルを付ける通常重要な tubulogenesis の遺伝子に適応した機能喪失研究によって偏光膜生合成に関与する遺伝子を解析します。極性; さまざまな発達段階で欠陥を評価します。落射蛍光、差動干渉の対照 (DIC)、共焦点顕微鏡による表現型を解釈します。視覚的な欠陥を定量化します。このプロトコルは、上皮細胞極性、膜器官、管および内腔の形態形成に関与する多くの場合非常に節約された分子のいずれかを分析に適応することができます。

Introduction

細胞と細胞の非対称性、偏光膜ドメイン形成などの発生は形態形成と細胞、組織、器官1の機能にとって重要です。複数連続して一致する細胞外および細胞内シグナルに依存して細胞レベル下のコンポーネント割り当ての方向変化以来、技術的な課題のまま上皮における偏光膜生合成に関する研究ほとんどのモデルの分離し、モデル システムに強く依存することは困難。モデル紹介 - 単層線虫腸 - 絶妙なシンプルさの組織であります。単一セルと一緒にc. の elegans排泄運河 ( c. の elegansの排泄管の偏光膜生合成紙に同行を参照)2、身分証明書のいくつかのユニークな利点を提供し、偏光膜生合成に必要な分子の性格描写。男に酵母から分子極性手がかりの保全するこの単純な無脊椎動物オルガン優れた「生体内で組織の部屋」はまだあまり人間のシステムに直接関係のある上皮細胞極性に関する質問を解決するシングルでこれらのイベントのビジュアル解剖を許可する複雑な細胞レベルの生体です。

複数保存されている極性 (1) などの細胞外マトリックスから手がかりを (2) 細胞膜および接合、および (3) 細胞内小胞輸送がされて識別された3の過程において彼らの統合の基本原則偏光上皮膜と組織器官はかり4です。(E.g.S. 酵母と線虫受精卵) の生体内で古典的な単一細胞モデル偏光セル分割前後極性の原理を定義することに尽力しているし、重要な識別しました。膜の極性決定要因 (小低分子量 g 蛋白質/CDC-42、分割不良パルス)5,6, しかし、彼らユニークな対称性の破れ (芽傷、精子のエントリ) の手がかりに依存しており、接点保護を欠いています。apicobasal 膜ドメインと、おそらく、機械をソート対応する細胞内 apicobasal。偏光上皮、人身売買の組織について我々 の現在の知識ただし、主に依存している哺乳類の 2D モノカルチャー7膜の位置を変更できる生理的細胞外および発達の合図を欠いています。ドメインおよび人身売買軌跡の方向 (2 D から 3 Dの in vitro培養系単独への切り替えは (マディン-ダービー犬腎臓) MDCK 細胞の膜の極性を反転するのには十分である)8。無脊椎動物モデルで上皮細胞の極性に関する発達研究生体内をフラット上皮、例えば、彼らは重要な貢献を認識、キイロショウジョウバエ表皮で最初行った偏光細胞遊走と細胞シートの動き9、ジャンクション ダイナミクスとエンドサイトーシスの極性メンテナンス10の人身売買。3 D体外と体内の MDCK 細胞とc. の elegansの腸、尿細管上皮細胞の内腔の形態形成解析, 最近識別したドの細胞内輸送の要件novo (尖) ドメインと腔器官および11,12,13を位置決めします。厚みの鋼管 (フラット) 対上皮細胞は細胞の非対称性の 3次元解析のための利点それは内腔側のアピカル膜、切端側接合、外側の膜の優れた視覚的に区別を可能にするので、細胞内小器官の位置。これらの視覚の利点に線虫モデル追加の体外、発達軸、透明性、ボディ計画、インバリアントと定義された細胞系譜、分析の単純化 (遺伝) と以下の付加的な利点。

線虫自体は、その透明性と単純なアーキテクチャを作る同様に管状の臓器管と内腔の形態の視覚的分析に直接アクセスできる管状構造の回虫です。その腸 (21 または 22 セル時々)14の 20 セル単一前駆細胞 (E) から派生するため 9 INT リングの左右相称なチューブにインターカレーション一歩二層上皮から開発 (細胞の 4 つ、最初のリング;図 1概略)14,,1516。腸の系列と組織分析、核アイデンティティ17を介してノマルスキー光学およびその後ラベルの付いた膜を介して蛍光顕微鏡最初によって決まりますがその形態形成に重要な洞察力を提供します。特定方向の細胞分裂の動き (例えばインターカレーション、左右非対称、前部と後部のチューブ回転)14,18 細胞自律的および細胞非自律的要件.初期の内胚葉細胞の仕様、このクローン モデル器官の開発を制御する遺伝子調節ネットワークよく特徴付けられて19,20.ここでは、フォーカスはただし、単一の尿細管細胞の偏光膜と内腔の膜、細胞骨格構造、このプロセスに伴う細胞内小器官の細胞の非対称性の解析です。分析はどこ (微細構造レベルの微絨毛によって区別) のすべて頂端膜内腔に直面し、すべての基底膜直面アウター チューブ表面膜互いに接触、このチューブのシンプルさによって促進されます。接合による管腔膜から分離 (図 1の模式図; c. の elegansの参照参照 (16,21)-タイトの所属する組織や単接合部品)。頂側膜器官、内腔の形態と同一です。さらに、成人腸細胞 - この小動物の (を除く排泄セル) の最大細胞 - のサイズおおよその細胞の要素、例えば体内視標追跡を許可する哺乳類のセルのサイズ通常は小胞の軌跡は体外培養皿にしようとしました。

この細胞と細胞内局在の解析を目的として、適切なラベルを付けることは重要です。腸の遠藤やプラズマ膜ドメイン、接合、細胞骨格構造, 核とその他の細胞小器官は、その特定分子コンポーネントのラベル化による視覚化できます。このような多くのコンポーネント、特徴づけられているそして発見される続けます (表 1いくつかの例を与えるし、リソースを参照)。例えば、細胞膜にポスト ゴルジ小胞を介してゴルジに ER と腸内システムの鋼管および/または小胞のコンパートメントを区別する様々 な分子は、識別された22をされています。特定蛋白質 (と同様、脂質、糖質) どちらかラベル付けできますが、直接または間接的結合蛋白質を介して。このプロトコルはその場で抗体染色固定標本は、2 つの標準的な分類の技術の 1 つに焦点を当てて (排泄管 tubulogenesis 他手法の2 - の説明のために付属の紙を見る体内標識蛍光タンパク質融合 - 経由; 腸に直接適用されます。テーブル2の例を示します腸管特異的発現プロモーター腸へのような融合蛋白質の表現をドライブするために使用できます)。ダブル複数分類のどちらの方法でも両方プラス追加化学染色の組み合わせ、または、詳細な視覚解像度を大きくとの共局在の時空間変化の検討し、特定の募集分子や細胞レベル下のコンポーネント (図 2)。固定と染色免疫染色手順中に表示緑色蛍光タンパク質 (GFP) のこのプロトコル サポートの保存で説明されている手順。イメージングのための検出のポイントし、標準的な顕微鏡手順 (蛍光性解離性と共焦点顕微鏡) 経由で表現型が tubulogenesis の特性説明(図 3, 4)。これらより高い解像度 (ここでは説明しません) インスタンス, 高分解能顕微鏡および透過電子顕微鏡のためのアプローチをイメージングする拡張できます。

キーの強さがこのシステムは、成人期を通じて胚から、さまざまな発達段階で個々 の細胞の極性を分析する能力です。ERM - 1、エズリン ラデキシン モエシン家族23,24 の非常に節約された膜アクチン リンカー ラベルを介して単一セルのレベルで開発中アピカル膜ドメインと腔器官を追跡ことができますたとえば、.ERM 1 は、胚管形成時に頂端膜器官 (1) を視覚化する偏光の細胞分裂と移行 (頂角インターカレーション中ルーメン周辺細胞移動)15; 付随して発生したとき(2) 細胞分裂または移行の不在で進む後半の胚および幼生管延長中(3) 偏光膜ドメインが (図 1) を維持、成人の腸管で。拡大の後分裂幼虫上皮におけるde novo偏光膜器官はほとんど体内と体外の上皮細胞極性モデルでは不可能です、偏光組織の形態形成からこうして分けることが単一セルの解像度 (例: 3 D MDCK 嚢胞モデル8) を含みます。この設定は他のコンポーネントの表示、(特に、L1 幼虫の段階で細胞が細胞質・核の比率が高い) 機会を提供しますに固有のこれらの細胞内の変更を区別するために偏光膜器官 (例えば人身売買の軌道の向きかえ) 偏光の細胞分裂と移行に必要な付随してそれらから。

線虫の遺伝的多様性はよく知られている25です、任意の生物学的問題の分子分析のための強力なモデル システムになります。形態形成に関する研究、例えば、野生型株、蛍光マーカーやこの欠陥または利得の-機能喪失変異体興味 (例えば膜) の構造がラベル付けされて形質転換株を始めることができます。構造体です。典型的な逆遺伝学的研究 (通常生産関数の利得や削減、結果の損失と点突然変異の突然変異誘発によって変更 (例:ターゲットの削除によって)、生殖興味の遺伝子の削除、突然変異を生成するかもしれません遺伝子) の RNAi によりその成績証明書を削減または。RNAi のc. の elegans26で供給することにより使いやすさは、興味の遺伝子の大規模なグループを調べる対象となる画面のデザインにも適しています。遺伝モデル有機体の間違いなく最大の強みは生体内で前方の画面 (例えば突然変異、組織的または全ゲノム RNAi 画面) の表現型の分子原因に対する公平な調査を許可するを実施する能力関心します。公平なビジュアルでは例えば、RNAi線虫tubulogenesis 画面で、ERM 1 ラベル頂端膜、遺伝子組換え動物から始まる魅力的な可逆的腸管極性変換と異所性内腔表現型、使用を発見しました。ここではこのタイプの分析のための例として。この画面は、この極性を引き起こしている特定の分子欠陥としてスフィンゴ糖脂質 (GSLs; 義務づける膜脂質、GLS 生合成酵素遺伝子の識別される) の枯渇および小胞のコート クラスリンとその AP 1 アダプターのコンポーネントを識別されます。変換の表現型、それにより分子を人身売買として生体内でこれらの特性の頂端膜の極性とルーメン12,13を位置決め手掛かり。特定の遺伝的変異/形態形質とを開始するときのような画面 (または単一の遺伝的/RNAi 相互作用実験) がも関心 (紙に、排泄に伴う参照の 2 つのまたは複数の遺伝子間の機能的相互作用を調べることができます。このような分析の例の運河)2。このプロトコルは、形態形成の分析の特定の利点で、直接失われる前方の画面での表現型の原因遺伝子を特定する能力に加えて RNAi に焦点を当てください。形態形成をしばしば演出遺伝子製品は、用量依存的に動作したので、RNAi は通常表現型のスペクトルの生成に成功。有益な機能の部分的な損失の表現型を生成する機能はまた重要である tubulogenesis 遺伝子の大半が不可欠であると彼らの損失が不妊や初期胚性致死を引き起こす可能性を問題に対処に役立ちます。このプロトコルは、この困難を克服するために条件付きの RNAi の戦略が含まれています、最適な表現型の突然変異誘発によって生成された対立シリーズなどの広範なスペクトルを生成する方法を示します。

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Protocol

1。線虫 c. エレガンス の腸をラベリング

注: 排泄管 tubulogenesis 2 組織特異的蛍光マーカーの建設のための分析の著者によって付属のペーパーを参照してくださいプラスミドと形質転換動物、転写と翻訳の融合蛋白質 (興味の分子の細胞内の局在に必要な後者) についての議論を含む世代。これらの手順は、腸に興味の分子を運転する特定のプロモーターを使用して合わせることができます。表 1 例については c. の elegans 腸遠藤 - と原形質膜とその接合部を可視化できる便利な分子のプロモーター、腸に式を駆動するための例については 表 2 を参照してください。腸内のマーカーとプロモーターのより包括的なコレクションのためのリソースの テーブル 3

。
    抗体の汚損 線虫 腸
  1. 27 , 28
    1. 固定
      1. きれいなガラス スライドを取るし、使用するポリ-L-リジン固執するワームの薄膜を生成します。場所 30 μ L 0.1 0.2% ポリ L リジン 場所するポリ-L-リジンのドロップで 2 番目のスライドとスライド、" サンドイッチ "。擦り込むスライドを軽く数回クリックすると両方の全体の表面が濡れているし、鉛筆で 30 分ラベルつや消し側スライドの乾燥する空気にします
        。 注: 200 μ L の 0.2% ポリ L リジン因数は dH 2 O; の粉末を溶解することにより作られました。これは、-20 ° C 使用高分子量ポリ-L-リジンでワームの付着を改善するために保存できます。多 L リジンの濃度も重要です。あまりにも低濃度は固執するワームを許可されませんが、高すぎる濃度は蛍光バック グラウンド信号を生成可能性があります。あまりにも厚いフィルムは全体に緩めること
        2. 。
      2. は、液体窒素で満たされた (例えば ポリスチレン容器) の容器の底をしっかり平らな金属ブロックを配置します
        。 注: 1 つは代わりに、ドライアイスを使用できますが、液体窒素容器の底に金属ブロックをより安定した保持し悪寒もします
        3. 。
      3. 収集ワームいずれかでそれらを洗浄は M9 29 とのプレートをオフか、各スライドに異なる段階ワーム (どちらか卵、L1、L2、L3 または L4 幼虫ワーム) を選択します。通常、〜 100 幼虫と胚または各スライドを 20 〜 大人を選ぶ。場所 10 μ L 洗浄スライドの真ん中にワームやピックの卵/ワーム 10 μ L に M9 または 10 μ L 1 × PBS 27 (リン酸緩衝生理食塩水)。
          凝集を避けるためにワームの大規模な番号を広げて
        1. ピペットを使用します
          。 注: 混合の人口少なく効果的に凍結き裂を有する (下記参照) もあり混雑のため、異なる段階の厚さは固執しないワームを洗い、したがってピッキング ステージ固有のワーム (または同期集団) が優れた結果をもたらします。幼虫は大人より固執し、スライドごとに多くの動物を配置できます
          2. 。
        2. スライド、ワームのピッキング前に OP50 細菌なし 線虫成長媒体 (NGM) プレート 29 に転送します。ワームに余分な細菌の付着は、付着で妨害することも。ワームが乾燥しないでください注意してください
          3. 。
      4. そっと上に収集した場所 (ドロップ) 22 × 22 mm coverslip の交差方法ワームの端がスライドの少なくとも 1 つの側面で掛かるような。まっすぐに軽く押しますが、しっかりと 1 つまたは 2 つの指を使って、上。組織の整合性に損害を与えるだろうをせん断を避けします
        5. 。
      5. すぐに、優しくスライドを液体窒素中での金属のブロックに転送、それを凍結する約 5 分間座ってみましょう。その後、" を弾き飛ばす " 張り出したエッジを使用して、1 つスウィフト coverslip 移動します
        。 注: この手順は断固として実行する必要があります達成するために、スライドが固定されている間、" 割れ " キューティクルの。注意: 液体窒素を使用するとき PPE (個人保護装置) のガイドラインに従ってください
        6. 。
      6. メタノール に凍結ひびの入ったスライドを浸す--20 ° C で 5 分間ガラス Coplin jar をいっぱいその後 アセトン に転送--20 で 5 分間別ガラス Coplin jar をいっぱい ° C
        メモ: メタノールとアセトンは、-20 ° C、使用する前に、少なくとも 30 分に保存必要があります。-20 で格納できるスライド固定後、° c. 注意: メタノールとアセトンが有毒な
        7. 。
      7. Jar ファイルからスライドを削除し、使用する前に室温 (RT) で乾燥する空気します
        8. 。
    2. 染色
      1. スライドのゼリーに石油の薄層で固定のワームの領域を囲みます。この周辺に目印を付けるスライドの下側に円を描画します
        。 注: 染色溶液の漏れを防ぐために染色の手順はゼリー円そのままことが重要です
        2. 。
      2. 準備、" ウェット室 " を置くことによってふた付きのプラスチック製のビンでそれに濡れたペーパー タオル。このラックにスライドを配置 " ウェット室 " 染色中にスライドの乾燥を防ぐためにします
        。 注: スライド水と接触したりしないで互い
        3. 。
      3. そっとゼリー円に、十分な領域をカバーする約 50 μ L 1 × PBS をピペットします。閉じる、" ウェット室 " ふた付き。RT で 5 分間インキュベート
        注: この手順でワームを失うことを避けるためにはないピペット PBS ワームに直接。優しく円のエッジにピペット チップを置き、ワームをスムーズに分散させるために流体を許可します
        4. 。
      4. は、スライドを傾けるし、ゆっくりピペットと PBS を吸引します。スライドをラックの上に戻ってフラットに配置し、50 μ L (またはスポットをカバーするため必要な金額) を追加 解決を妨げる 慎重に。15 分間常温ウェット室でこれを孵化させなさい。待っている間、希薄解決を妨げるの一次抗体 (一次抗体と濃度の例について 表の資料 を参照してください).
        注:たて 1x PBS (10 mL)、10% トゥイーン (50 μ L)、脱脂粉乳 (0.2 g) を使用してブロッキング液を準備します。洗剤と牛乳の濃度の抗体によって異なります、経験的に決定する必要があります。スライドからの吸引は、ワームを簡単に失う別のステップです。解離の範囲の下でスライドを調べることによって、進捗状況を確認が、世話をするスライドを乾燥していません
        5. 。
      5. 傾斜スライドとブロッキング液は、前述のように同じ注意を使用してを離れて吸い出しなさい。スライドをラックに戻ってフラットに配置し、ゆっくりと 50 の μ L 希釈した一次抗体、同じ注意を使用してを追加します。閉じる、" ウェット室 ", 4 の ° C で一晩、または室温の短い期間と
        注: インキュベーション時間は特定の抗体の経験的判断する必要があります
        6. 。
      6. 吸引 第一抗体溶解液 他のソリューションのように。ブロッキング溶液中 10 分間のスライドを 3 回、洗浄を追加して、上記のように同じ方法でソリューションを削除します
        7. 。
      7. 追加 (蛍光標識) 二次抗体 ブロッキング液で希釈した RT で 1 時間インキュベートします。材料表 二次抗体と濃度の例についてを参照してください
        8. 。
      8. 二次抗体を取り外して、洗浄、上記として、ブロック ソリューション 2 時間と、10 分の 1 × PBS でのブロッキング液をオフにします
        9. 。
      9. 離れて乾燥し、供試体周りのゼリーを慎重に取り外します標本を許可することがなく、できるだけ多くの PBS 吸引します
        10. 。
      10. 追加、試料の上に一滴 メディアをマウント し、上にそっと観察を配置します。マニキュアとカバーガラスのエッジをシールします。染色を保持し、4 に格納する暗いスライド ボックスにスライドを配置 ° C
        注: は、光感受性のため暗闇の中でスライドを維持 (蛍光は時間とともに薄れるかもしれない) し、同じ理由のために密封保存すると、大気暴露を防ぐため。スライド 4 ° C または-20 で長期間にわたって保存 ° C

2。線虫 c. エレガンス の腸で不可欠である tubulogenesis 遺伝子の機能との干渉。例: RNAi

。

注: 標準プロトコル 29 によると NGM プレート でシード OP50 細菌に 線虫 株を培養しています。RNAi のため c. の elegans フィード HT115 RNAi 細菌 RNAi プレート 25 μ G/ml carbenicillin および 2 mM IPTG (イソプロピル β-D-1-thiogalactopyranoside) を生成する細菌のプロモーターの誘導のための補足、二本鎖 RNA (dsRNA) で、導入から 線虫 の遺伝子。抗生物質および IPTG 濃度は RNAi クローン/ライブラリおよび必要な RNAi 強度、それぞれ特定の RNAi ライブラリ (「( 26 , を給餌市販のゲノムワイド RNAi から得られるクローンによると異なる場合があります 30, 31) 材料・試薬および RNAi ライブラリの RNAi 線虫 と テーブルの材料 を餌の背景).

  1. の供給によって標準的な RNAi 26 , 31
    1. は-80 ° C から RNAi ライブラリ プレートを取り出し、ドライアイスの上に置きます。シーリング テープを外し、LB (ルリアスープ) 寒天 29 100 μ g/mL アンピシリンと 15 μ G/ml テトラサイクリン補完に関心のクローンの付着性細菌を転送する滅菌ピペット チップを使用します。寒天培地に細菌を連勝。新しいシーリング テープと RNAi ライブラリ プレートをシールします。37 で一晩バクテリア ° C
      注: これらの寒天は 4 ° C で数週間保存できます。新しい菌は元の RNAi ライブラリを保護するために彼らから直接培養することができます
      2. 。
    2. 次の日に 1 mL LB 液体培地 29 μ G/ml アンピシリンを 50 を含む LB 寒天培地プレートから RNAi 細菌を接種するため 14 (8-18) h に振るや 37 で一晩 ° C
      注: 最適な結果を得るのために使用新鮮な細菌たびに。参照してください異なる培養条件 (例えば 文化のタイミング) の比較 ( 30) を参照します
      3. 。
    3. 次日、別の RNAi プレート上の培養 RNAi 細菌のクローンあたり種子 200 μ L。プレート乾燥し細菌のプロモーターの誘導のため一晩常温おきます
      4. 。
    4. は、各 RNAi プレート 4 6 L4 期幼虫を転送します。3-5 日間の RT または 22 ° C でシードの RNAi プレートをインキュベートします
      。 注:RNAi、干渉、または連続的に転送して OP50 せず新しい NGM プレート 3 回細菌付着 OP50 を削除するなし NGM プレート L4 幼虫を最初に選びなさい。汚染細菌 - - ワームの優先 OP50 食品のような RNAi を妨げるも系統が汚染されていないを確認します。必要に応じて温度を調整: 高温で加速する など 開発系統は温度に敏感にあります
      5. 。
    5. 発達研究、2 日目以降から F1 子孫の表現型をチェックします
      。 注: それは外観や表現型 (例えば マーカー変位) の進行をとき行方不明ないように頻繁に動物をチェックする重要な開発の間に偏光膜形成を評価します。強い表現型 (例えば 当日に最も強く影響を彼らの子孫の中間部分を選択する 2 新しい RNAi プレートに親の両性具有を選択することにより) の F2 集団の濃縮は軽度から強いスペクトル以来ほとんど必要ありません、表現型が望ましい
      6. 。
  2. 条件付き RNAi
    注: 重度、軽度の効果を高めるを減らしたりまたはステージ特に干渉する RNAi 条件を変更できます変更は表現型効果の完全な評価のために有用、しばしば。致命的な tubulogenesis 遺伝子。
      同世代 (軽度、ステージ固有の RNAi) で幼虫の RNAi の RNAi の評価の効果

    1. 注: RNAi を誘導したり不妊、胚性致死を克服する特定の段階のポスト胚発生の遺伝子機能を混乱させるため、幼虫は強肩投稿します。未処理の卵 (2.2.1.1) 妊娠大人 (2.2.1.2) または L1 を同期 (か、必要な場合は後でステージ) 幼虫 (2.2.1.3) RNAi プレート;例えば 2 日後、以降、同じ世代の幼虫および大人の RNAi 効果を評価します。 1 つに
      1. ピック 30 50 妊娠大人ドロップ ソリューションを漂白 (10 M の水酸化ナトリウムと次亜塩素酸ナトリウム世帯の 1:4 のソリューション) RNAi プレートの端に配置されます。乾燥させ、ハッチ、細菌の芝生に移動して l1 を許可します
        。 注: 漂白液が浄化のため一般的に卵の殻で胚がすべてを殺すでしょう。したがって、RNAi 細菌に近い、または漂白ソリューションを配置しないでください
        2. 。
      2. 選択 RNAi プレート、それらは 2-3 h のため卵を産むように 〜 20 若い妊娠大人の種子またはプレートに約 300 の卵がなくなるまで、大人のオフを選択します
        。 注: このメソッドは OP50 で RNAi 細菌の汚染を引き起こす可能性があります。このリスクを減らすためには、まずワーム OP50 付着を削除する細菌なし NGM プレート上に大人を転送します。世話をする大人が RNAi 胚の RNAi 効果を避けるためにプレートに長時間滞在しない
        3. 。
      3. ピックアップや RNAi プレートに直接 L1 ステージ ワームを置く (を参照してください ( 29)-同期プロトコル).
        メモ: 1 つは唯一の卵になるまで数回の M9 と密に住まれたプレートからワームを洗浄することにより、簡略化された同期プロトコル (例えば の適度に大きいスケールのセットアップ) を使用できます。L1 を孵化 2-3 h は、これらのプレートから M9 で収集することができます後、細菌 (M9 の 3 x) を削除する追加の洗浄で洗浄し、RNAi プレートの上にシードします
        4. 。
    2. 空のベクター RNAi 細菌 (穏やかな RNAi) RNAi 希釈細菌
      注: RNAi の細菌の量を希釈して dsRNA 量削減穏やかな効果を誘発するのには十分である、胚性致死も減らすことができますなしすべての萌芽期の効果を廃止します。RNAi 細菌の希釈は、RNAi 実験を二重と遺伝的相互作用実験 (例えば 強化の評価のための穏やかな効果と抑制効果の評価のための強力な効果を生成する) のための条件にも使用されます。
      1. RNAi と em を育てるpty ベクトル HT115 RNAi 50 μ G/ml アンピシリンと 1 mL の LB 培地で細菌のような標準的な RNAi 条件
        2. 。
      2. 希釈濃度の違い、例えば、5%、15%、30%、50%、70% の範囲を達成するために空のベクター RNAi 細菌と RNAi 細菌です。上下にピペッティングでよく細菌を混ぜます。RNAi プレート上に菌を混合 200 μ L をピペットします
        3. 。
      3. は、各 RNAi プレートに 4-6 L4 幼虫を選択します。2 日目以降から表現型を確認してください
        4. 。
    3. RNAi 感受性株 (強い RNAi)
      1. 例、絵里-1 (mg366)、rrf-3 (pk1426) または 絵里 1 (mg366) 林-15 b (n744) (後者のプロジェクト) の利用可能な RNAi に敏感な株を使用し、に従って2.1 31 , 32 , 33 の標準的な RNAi 手順です
        。 注: RNAi 感受性株 (例えば rrf 3 と 理 1) が野生型の動物よりも低いひなサイズを持っているし、25 ° C で滅菌します。彼らは自身の表現型の低バック グラウンドもあります、例えば 特定の RNAi 効果を評価する際に考慮する必要があります浸透胚性致死率を低します
        2. 。

3。解剖顕微鏡蛍光による 線虫 腸の in vivo イメージング

  1. 蛍光ライトの下で動物を可視化する前に解剖顕微鏡の明るい光の下で RNAi プレートをチェックします。評価 (と可能性のある記録) 表現型の致死率は、不稔 (子孫の下数) など、分析に影響を与える可能性があります明るい光の下で目に見える発達 (例えば 幼虫逮捕) と役立つことがあります他の目に見える表現型偏光膜の合成と内腔の形態形成に関与する遺伝子の機能を特徴づける
    。 注意: 評価 (少なくとも 50) のための十分な子孫を持つ唯一のスコア プレートはそれ以外の場合代替の RNAi の条件をみてください。定量的評価板が汚染されていないことを確認してくださいまたは成長 (RNAi と干渉する) ある OP50
    2. 。 蛍光灯の光の下で動物を視覚化する
  2. ふたを外すし、解離性蛍光顕微鏡下で直接 RNAi プレートを配置します
    。 注: 微妙な腸の表現型を検出するには、倍率の十分な範囲では、高い電源ステレオ蛍光添付ファイル付き解剖顕微鏡を必要があります一つ。このプロトコルは 1.5 と目的、ズーム範囲は 45 3.5 x 10 スコープの使用を説明します
    3. 。
  3. は、まず、フォーカスに明るい光の下で動物を見つけます。次に、低倍率 (例えば 1.5 倍目標の下で) で蛍光灯下での動物を調べて適切なフィルターを使用しています。表現型のプレート全体をスキャンするより低い右に左上から体系的にプレートを調べます
    4. 。
  4. は興味の動物を選択し、対物レンズ 10 倍に変更します。腸に焦点を当てるし、tubulogenesis/ルーメン形態表現型を評価するためにズームを使用します。表現型の得点は、5 項を参照してください。まず、低倍率で画像を取る。高倍率に切り替えています
    。 注意: 以来、健康な動物は高速移動、片手でもう一方の手で顕微鏡の焦点を当てながらイメージ獲得のためのコンピューターのマウスを動作迅速。動物 (例えば 4 ° C プレートの一時的な配置によって) を落とす可能性があります必要はありません胚や初期の幼虫が逮捕 tubulogenesis 表現型でほとんどの作業します。画像は顕微鏡に取り付けられた CCD カメラでキャプチャすることができます、画像キャプチャ ソフトウェア
    5. 。

4。レーザー走査型共焦点顕微鏡 34 , 35 によって高い解像度で c. の elegans 腸をイメージング

  1. マウントと固定
    1. 使用指先に薄く広がる (~ 6-8 mm の直径) スライド ガラスに少量のグリスまたはワセリン円で
      。 注: グリースの円の厚さは実装にとって重要です。最適な結果を画像処理、一度に 1 つまたは複数の幼虫を画像、動物が直接スライド ガラスとカバーガラスの間にスタックしているようなできるだけ少量の液体としてと極薄のグリース円を使用 (完全に行われて、もし動物が固定化されることがなく麻酔薬)。卵より古い動物の取り付け必要カバー スリップを追加するときに、サンプルの破壊を避けるためにやや厚く円
      2. 。
    2. 円の真ん中に通常 3.5 μ 10 mM アジ化ナトリウム溶液 の滴を追加し、解剖顕微鏡の下でそれにワームをピックアップします
      。 注:1 ml dH 2 O; 65.01 mg NaN3 を溶解することにより 1 M ナトリウムのアジ化物原液を準備します。この 1 M 溶液 200 μ L を 20 mL M9 バッファーに追加します。ワームを速やかに乾くソリューションを避けるためにアジ化ナトリウム溶液のドロップを選択してください。個別に最適な取り付けより大きい人口を調べるとき、スライドおよび約 20 の幼虫あたり約 50 の胚を目指してステージを選択します。胚を選ぶとき、1 つはアジ化ナトリウム溶液の代わりに M9 を使用できます。この有毒な化学薬品の組織の損傷を避けるために 30 分以内の動物のイメージを作成する必要がありますアジ化ナトリウムを使用している場合
      。 注意: アジ化ナトリウムは毒性
      3. 。
    3. は、スライドの 22 mm × 22 mm coverslip をそっと置きます。ワームを粉砕しないように注意してください。穏やかな圧力を使用し、ワームがスライドとカバー スリップも固定かどうかを確認するには顕微鏡を解離性の下で確認します。スライドのラベルします
      。 注: 圧力の適切な量は標本 (あまりにも多くの圧力) のダメージを与えるとよくそれを修正しない場合を避けるために重要な (あまり圧力: 動物フロート スライドにこだわるのではなく)。フローティング動物は基本的に適切なイメージ投射を排除します
      4. 。
  2. 画像
    1. 共焦点顕微鏡の下の場所のスライド。ワームの 10 倍の目的とフォーカスを検索します
      。 メモ: 退色を避けるために可能な限り集中する明るい光を使用しています
      2. 。 60 倍または 100 倍に変更
    2. 目的と腸に焦点を当てるです
      。 注: 腸簡単に識別できます明るい光の下で尾の先端付近の肛門に咽頭からの動物の中央を流れる内腔によって。60 x 100 x 石油目的の油を適用するときは注意してください。さらにイメージを妨げる可能性がありますさまざまな種類のオイルを混合します。正立型顕微鏡を使用するときにスライドにまたは他の目的または顕微鏡の部分を汚染しないための世話、倒立のスコープを使用目的に油の小滴を場所です
      3. 。
    3. 36 をスキャンするために使用される目的の確立コーラー DIC/ノマルスキー照明。腸の標識を確認するやイメージングのための適切な標本を選択するために、表現型を確認する適切なチャネルで蛍光灯の下で動物を検査します。漂白を避けるために素早く作業します
      4. 。
    4. スイッチ レーザー スキャンその背側と腹側の境界を設定することによって、腸に将来イメージを制限する走査する
      。 注: この方法で腸をブラケットが蛍光ラベルで腸管外構造も不可欠です。このパイロットのスキャン中に av に高速スキャン条件と動作します。oid フォトブリーチング
      5. 。
    5. は、実験のためのスキャンのパラメーターを選択するスキャンを停止します。お問い合わせは、動物および/または技術的な考慮事項の段階に応じて、0.2 μ m 間隔で z 軸に沿って腸スキャン、例えば 6-20 セクションを設定します。ラベリングの複雑さによってイメージごとの階調を設定、必要なノイズを低減する解像度
      。 注: 設定の詳細については、実験し、顕微鏡によって異なります。1 つは 3 つの異なった fluorophores の順次スキャンを実行している場合の漂白を避けるためにセクションの量を減らす必要があります。(画像の歪みを避けるためにセクションの数よりも低い; またフォトブリーチングの増加の重量を量るべき) セクションの数するフレームの数を調整します。4-6 フレームは通常十分な
      6. 。
    6. の決定的な (低速) レーザースキャニング条件スキャンに戻るし、調整: 明るさ (背景を減らすために使用最小利得); レーザー電源 (できるだけ高く必須、低 - 増加フォトブリーチング; 通常最小設定は十分な);ピンホール (開口部を避ける場合いない解像度を維持するために必要).
      注: スキャン条件試料に依存し、スキャン セッションの初めに経験的に決定する必要があります。明るさが飽和 (その後画像処理ソフトで画像を変更する機能が制限されます) を超えていないことを確認します。スキャン条件を設定する場合も同一の条件コントロールと実験動物を比較実験のすべての投射のため使用することを検討してください
      7. 。
    7. キャプチャ イメージ シリーズ。単一の投影画像に画像をマージします
      。 注: は、投影像や顕微鏡によって個別にオーバーレイを保存する必要があります
      8. 。
    8. マルチ チャンネル画像を撮るときは、(共局在の研究重要) チャンネル間裏写りを避けるためにシーケンシャル スキャンを使用します
      。 注: イメージの設定を増加退色にもはや接続与えられた変更する必要可能性がありますスキャン時間
      9. 。
    9. 常に対応する DIC/ノマルスキー イメージ (セクション) ランドマークとスキャンした動物の形態の全体的な状態を取得します
      10. 。

5。偏光膜形成の定量化は c. の elegans 腸内欠陥

注: 例: let 767 による頂 ERM-1::GFP および異所性横管腔形成の基底外側変位とaps 1RNAi

。
  1. ( 図 5 A、D、E) 解剖顕微鏡の下で表現型を獲得
    1. 得点のカテゴリを定義します。例: (i) 野生型 (WT) (基底変位後開発) ERM-1::GFP (極性の欠陥)、および (iii) の異所性の管腔形成の基底 (ii) 変位します
      。 注: 低倍率の視覚的分析は特定表現の有無、動物の数を得点にそれ自身を貸します。ここでは、我々 は同じ時間を表したの分析は極性表現型の悪化は、3 つの質的に異なる表現型カテゴリの例を選択しました。しかし、定性・定量の異なった表現型の様々 なことができます得点が記録されるルーメン形態の欠陥、不在/存在 (または番号) GFP 陽性細胞質空胞の内腔の直径とサイズや嚢胞内腔間の番号など (を参照してください <強いクラス ="xfig"> 図 3 の例のため).
    2. 目的の相違の大きさによって帳票の写し、一連の実験で解剖顕微鏡の下で、寒天プレートに約 100 ライブ ワームをスコアします
      。 注: 1 つは 例えば 板の右下に左からが体系的に、プレートをスキャンするときが視界に入るすべての動物をスコアする必要があります (ワームが板を均等に設定を確認してください).
    3. は、実験の 3 独立したセットのこれを繰り返します。バー グラフを生成し、結果の有意性を評価します
      4. 。
  2. ( 図 5 B) 共焦点顕微鏡得点表現型
    1. 動物あたりのルーメンの異所性の数 など を記録するためのカテゴリを定義する
      注: 高倍率視覚的な分析によって定量化可能なマーカーまたは表現型動物ごとの得点にそれ自身を貸すでき解剖顕微鏡で識別できない可能性がある細胞のマーカーの得点します。以前解剖顕微鏡 (5.1.1, カテゴリー 3) を用いて同様の実験のワームのサブセットの動物あたりのルーメンの異所性のカウントの現在の例は、ここで調べて悪化極性表現型の評価を精製します。ただし、その他の表現型またはパラメーターの様々 なゴールによって得られる、小胞、有無や共存、蛍光細胞レベル下のコンポーネントの数の数 など (ImageJ で後者定量化; 添付の紙に、排泄管) 2
      2. 。
    2. 目的の相違の大きさに応じて表現型マーカーの定量化 (ここでは、異所性ルーメン) 帳票の写し共焦点顕微鏡実験セットで約 20 匹の動物で
      3. 。
    3. 実験の独立した 3 の繰り返しを設定します。バー グラフを生成し、結果の有意性を評価します
      4. 。

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Representative Results

このプロトコルでは、分子を分析、偏光膜の合成と内腔の形態形成単一セルおよび細胞内レベルでのc. の elegans腸内を表示する方法について説明します。20 セルの単一層にされた線虫腸は監督の細胞分裂と半ば胚発生中に移行によって形成されます。この時間、偏光膜のドメインが定着、まだde novo偏光膜器官が成熟したの継続しますが、偏光解析に焦点を当てることができます 4 つの幼虫の段階で上皮を展開すると、成人期まで、膜器官 (図 1 a)。

線虫の細胞および細胞レベル下のコンポーネントを可視化、2 つの戦略は、一般的に使用される: 蛍光抗体法 (セクション 1; は、このプロトコルの詳細図 2, 図 4F)(排泄管が偏光膜器官2に付属の紙に詳細な蛍光融合タンパク質の発現図 1 b図 2図 4, 図 5)。ダブルと複数ラベル各または両方のメソッドの異なるラベルを組み合わせることを解決できる膜の非対称性など根尖部と基底膜領域とそれぞれの (図 2、その他さまざまな細胞内コンポーネントの関係図 4-E)。膜骨格リンカー ERM 1::GFP が表示されますこの単層上皮で内腔の形態と一致する頂端膜生合成の指標としてここで。このマーカーを使用することにより腸管腔膜/器官の欠陥とその原因となる遺伝子異常の配列によって識別できます機能喪失の研究によって例えば RNAi を用いた公平なゲノム スクリーン (RNAi のアプローチを採用し、このような表現型の生成のとおりこのプロトコルのセクション 2) です。図 3と図 4頂端膜/ルーメンの低-中程度の倍率画像の例を示しています高出力目的; を搭載した解離性蛍光顕微鏡で取得した器官の表現型高倍率の画像共焦点レーザー走査顕微鏡 (これらの微視的アプローチは 3 と 4 のセクションで説明します)。偏光膜器官の欠陥、 let 767 (ステロイド脱水素酵素/3-ケトアシル-CoA レダクターゼ エンコード) RNAi の影響の定量化の例としておよびaps 1 (クラスリン AP 1 シグマ サブユニットをエンコードアダプター) ERM-1::GFP の局在とルーメンの位置は図 5に示します。

Figure 1
図1: 細胞および細胞レベル下の構造や形態形成を野生型の線虫腸。(A) C. の elegans腸管発達、細胞組成と遠藤 - および血しょう膜の回路図。線虫 c. エレガンスの腸は、8 細胞期で生まれた E 割球からクローン生成されます。細胞分裂の 4 つのラウンドの後、16 細胞 (E16 ステージ) フォームは放射状に対称な 2 倍層上皮15です。この段階で各セルの細胞質分極する、将来の頂点の, と細胞質部品の反対側への移動に移動の核 (将来の基底)、膜ドメイン。1 インターカレーション ステップで左と右腹側細胞 (平行移動) 背側の細胞層に 9 INT リングの相称のチューブを形成します。各セルに直面している、その頂/内腔の膜と内腔をビルド (緑; 特定膜ミクロ ドメイン、微絨毛によって構造的に区別) と隣接するセルまたは体腔とその基底膜 (青)、最初を除いて連絡先4 つのセルによって形成される INT リング。根尖の接合 (赤) は、樹状突起と基底膜領域を区切ります。インターカレーション、 de novo膜生合成になったら後期胚形成と 4 つの幼虫の段階の間に、大人になって腸の成長と共にのみ最小限のさらなる成長に (偏光膜メンテナンスの段階が発生します).拡大の 1 つのセルに核 (N) とエンドソーム小胞上小胞体とゴルジ内システムを示します。(B) DIC/ノマルスキーと頂端膜骨格マーカー ERM 1::GFP ラベルの付いた発展途上のc. の elegans腸の共焦点重複の顕微鏡写真。白い線でコンマ段階で腸を概説 (ERM 1::GFP インターカレーションの初めに頂端膜で表現されます既にかすかに、このイメージで高く評価されることはできません)。動物こことは前方の (頭) を左で示したように、後部 (テール) 右、背側を腹下ダウンします。スケール バー: 5 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図2: 野生型開発のラベル付けダブル、トリプルの例線虫抗体との融合蛋白質を使用して腸。(B)胚。(A) コンマ ステージ。パー 6::GFP (グリーン; 複雑な頂パー極性のコンポーネント)、反 PAR 3 抗体 (赤/TRITC (テトラメチル ローダミン イソチオ シアン酸); 複雑な頂パー極性の別のコンポーネント) と MH33 (青/Cy5 (Cyanine5); 反 IFB 2/中級フィラメント)。パー 6::GFP とパー 3 抗体 (括弧) c. の elegans腸の管腔膜にラベルを付けます。IFB-2、後の段階で別の根尖部マーカーはこの早い段階でローカライズされた panmembraneously。パー 6::GFP とアンチ PAR 3 もラベル (左); 咽頭腸管内腔は IFB 2 (ターコイズ) との重複で示され、腸の管が青アンチ-IFB-2 (右) によって説明されてい。(B) 2 倍ステージ。AJM 1::GFP (グリーン; ジャンクション コンポーネント)、ICB4 抗体 (赤/アレクサ社は、ICB4 を検出する未知の膜状腸管抗原)。AJM 1::GFP ラベル ペリ内腔梯子パターンとして表示されている線虫腸の上皮細胞接着構造 (セクション 4 を参照してください皮下接合にもラベルを付ける; 画像からは見えないが腸に焦点を当てて; 共焦点イメージング)。ICB4線虫の腸すべて膜を汚れ。矢印は、基底膜抗 ICB4 染色をポイントします。(C, D)L2 の幼虫。ファロイジン (赤/テキサス-赤、F アクチンへのバインド ファロトキシン) と MH33 (C) LET 413::GFP (緑) (青/Cyanine5、アンチ IFB 2)。LET-413/落書きは複雑な基底極性のコンポーネントであり、(括弧) c. の elegans腸の基底膜に局在します。ファロイジンと IFB 2 抗体c. の elegans腸 (紫) の頂 submembraneous 骨格をラベルします。ファロイジンも強く腸染色圧倒的な体壁筋を汚れ。挿入図は、ボックス化された領域の高倍率を示しています。(E) L3 幼虫。SLCF 1::GFP (緑; 積分なりきってrane コンポーネント/糖トランスポーター)、ERM-1::mCherry (赤)、MH27 抗体 (ブルー/Cyanine5、アンチ AJM 1)。SLCF 1::GFP ラベル ERM 1::mCherry ラベル (括弧);線虫腸の管腔膜間の基底膜AJM 1 は、その頂端接合をラベル付けします。(F F'')L2 の幼虫。(F, F')単一の色のイメージ。SLCF 1::GFP (緑) は、基底膜 (膜薄い白い矢印で示されます) をラベル付けします。MH27 (青/Cyanine5) ラベル頂接合 (短い黄色の矢印)。(F"、F'')アクチンとの画像をオーバーレイします。インセット ボックス エリアの高倍率を表示します。単色画像 (F、F') のように表面的にこれらの異なる膜/ジャンクション マーカーによる腸管細胞の apicolateral 角度の明確な区別をメモ。Fで厚い白い矢印''標識ファロイジンで (そうでなければ筋肉アクチン圧倒) 頂/内腔のアクチン細胞骨格を指します。すべての画像は、共焦点投影 (z スタック 0.2 μ m)、チャンネル間の出血を避けるためにシーケンシャル スキャンによって取得します。スケール バー (A ~ E、F F の '' とすべてのくぼみ): 5 μ mこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。

Figure 3
図3: の例線虫腸の偏光膜と内腔の形態形成 (蛍光顕微鏡解剖) 低-中程度の倍率で欠陥します。すべての画像は、カスタムメイドのハイパワー ステレオ蛍光添付ファイル (資材表) を搭載した解離性蛍光顕微鏡によって取得されます。異なる倍率が表示されます。すべての表現型は、RNAi による ERM-1::GFP (胎生期および初期幼虫の段階で、ここに示す腸内や排泄管頂/内腔の膜に局在した) の付いたひずみで異なる遺伝子が得られました。腸内腔と極性の表現型は、: (A, B) の野生型胚 (A) と (B) の幼虫(C, D) の基底外側変位の ERM-1::GFP;腸細胞が拡大され肥大化したこの胚 (C、矢印をポイント単一腸細胞)、野生型のサイズとこれらの幼虫 (INT II と III の間の外側の膜に矢印 D) の配置が(E) 拡大し、3 つの胚における腔内(F) ERM-1::GFP 横方向接合領域 (ジグザグ ルーメン) と GFP 負空胞 (矢印) が含まれている腸内の細胞質に拡大(G) 嚢胞内腔をわたってるしき intralumenal 癒着 (2 つの嚢腫を矢印ポイント)。(H) 細胞質と基底 ERM 1::GFP 変位異所性ルーメン (矢印)。(私) ERM 1::GFP GFP 陽性涙点 (矢印) 細胞質内に変位します。排泄運河と排泄管の表現型がここでは説明しません (すべての画像で右に左、腸に運河を示します)。バーをスケール: 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 4
図4: の例線虫腸偏光膜と内腔形態欠陥の高倍率 (共焦点画像) で。(A、C、E、G、I、K)胚。(B、D、F、H、J、L)幼虫。すべての表現型は、RNAi による ERM-1::GFP (すべてのイメージの緑) の付いた系統の異なる遺伝子が得られました。画像は腸に焦点を当てた。排泄運河 (画像の左側)、(説明しません) 運河の表現型を含むの胚の画像も表示します。(A, B)野生型胚 (A) と (B) の幼虫。(C) 根尖部 ERM 1::GFP (カンマ ステージ; 後半インターカレーション) の基底外側変位。(D) 極性変換: 頂 ERM 1::GFP と基底の二重標識を明らかにした ICB4 の頂の蓄積の基底外側変位。F-アクチン (ファロイジン TRITC でラベル付け) (動物はトリプル ラベル) 縦筋の筋束の汚損によって動物をについて説明します。(E) 3 倍後期胚における ERM 1::GFP の基底外側変位。頂 IFB 2 抗体 (ブルー/Cyanine5) は、そのままルーメンとペリ内腔の中間径フィラメントを示します。(F) 異所性ルーメン アンチ-IFB-2 (青/Cyanine5) でラベル付けされました。(G) ERM-1::GFP は、腸内細胞質に空胞負です。(H) 腸内細胞質に空胞を肯定的な ERM 1::GFP。(I, J)胚と幼虫で内腔の不在それぞれ。(K) 広い腸。(L) 嚢胞性と複雑な腸。(A, D, H, I, J, K, L)共焦点投影します。(B、C、E、F)共焦点のセクションします。明るさは、 G液胞 GFP 否定的な質を強調するために増加しました。バーをスケール: 10 μ m (すべての胚および幼生、同じそれぞれ)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 5
図5: 腸の極性変換と帰属: 偏光膜と内腔器官の欠陥の定量化のための例です。(A、B、C)let 767とaps 1RNAi 両方 ERM 1::GFP 基底変位が発生(BL)と異所性内腔形成(EL)、しかし、発達段階別に。(A) 解剖顕微鏡による定量化: RNAi プレート ワームを播種後 2 日間極性表現型を持つ胚 (左) や (右) の幼虫のカウントします。注: の嘲笑およびlet-767(RNAi)のすべての動物は、この時点で孵化した (したがっていたが、しかし、すべての野生型極性; 胚がない行の列を分割)。aps 1Let 767RNAi は幼虫にそれらを誘導するのに対し、RNAi は胚、すでに極性欠陥を誘発します。異所性ルーメン (対基底変位) 幼虫対aps 1RNAi 胚の割合は異所性ルーメンと胚の逮捕によるものです。(B) 共焦点顕微鏡による定量: 動物幼虫における異所性内腔開発開始時あたりのルーメンの異所性のカウントします。let-767RNAi を誘導するaps 1(ap 1RNAi 幼虫「旅行の方」がない arres である RNAi より幼虫より異所性ルーメン胚としてテッド).野生型幼虫と幼虫 ERM 1::GFP 基底変位 (BL) と異所性ルーメン (EL); (C) 共焦点画像スケール バー: 5 μ m.聞かせて 767RNAi 動物 (極性欠陥 [BL/エル] と動物の解剖顕微鏡でカウント) の (D, E) の極性反転。軽度の異所性内腔の表現型を持つ 20 let-767(RNAi)動物は 4 日目 OP50 プレートに RNAi 板から移され、40 時間後に評価されます。(D) 以上の 50% の幼虫は野生型極性 (頂側膜で ERM-1) に戻されました。(E) の 20%動物が L1 幼虫 (L1 逮捕の結果let-767(RNAi) ) を越えて成長しています。すべてのデータは、SEM、+/-平均として表示されます n = 3。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

表 1:線虫幼虫及び成虫の腸管膜システムのためのマーカーの例1.
タンパク質名 内局 タンパク質構造・機能 市販線虫抗体 (DSHB2) CGC で利用できる株の例
選ぶ 2 PEPT 1 アピカル膜貫通型タンパク質 ペプチド輸送体 KWN246 (pha-1(e2123) III、rnyEx133[opt-2(aa1-412):。
GFP) + pha-1(+)])
アクアポリン 4 アピカル膜貫通型タンパク質 水チャネル
ERM 1 根尖部の粘膜 膜-細胞骨格リンカー ERM1
法 5 根尖部の粘膜 細胞質のアクチン (3)
IFB 2 根尖部の粘膜 中間径フィラメントのコンポーネント MH33
EPS-8 根尖部の粘膜 human-epidermal-growth-factor-receptor-kinase-substrate-8 オーソログ
パー 6 頂側膜 根尖部の極性の複雑なコンポーネント
SLCF 1 基底膜貫通型タンパク質 モノカルボン酸トランスポーター
アクアポリン 1 基底膜貫通型タンパク質 水チャネル
LET-413 基底膜 落書きホモログ、アダプターと極性の決定要因 LET413
HMP 1 頂ジャンクション (CCC4) Α-カテニンは、カドヘリン ・ カテニン複合コンポーネント FT1609 (unc-119(ed3) III xnIs528 [hmp 1p::hmp 1:。
GFP + unc-119(+)])
HMR 1 頂ジャンクション (CCC) E-カドヘリン、カドヘリン ・ カテニン複合コンポーネント HMR1
AJM 1 頂ジャンクション (DAC5) ジャンクション整合性分子、DLG 1/AJM 1complex コンポーネント MH27 SU159 (jcEx44 [ajm 1::GFP + rol-6(su1006)])
メニュー 1 頂ジャンクション (DAC) ディスク大同族体、MAGUK 蛋白質、DLG 1/AJM 1complex コンポーネント DLG1
ラブ 11 エンドソーム小胞 人身売買6 RT311 (unc-119 (ed3) III; pwIs69 [vha6p::gfp::rab-11、Cbunc-119(+)])
ラブ 5 エンドソーム小胞 人身売買 RT327 (unc-119 (ed3) III; pwIs72 [pvha6::gfp::rab-5、Cbunc-119(+)])
ラブ 7 エンドソーム小胞 人身売買 RT476 (unc-119 (ed3) III; pwIs170 [vha6p::gfp::rab-7、Cbunc-119(+)])
ラブ 10 エンドソーム小胞 人身売買 RT525 (unc-119 (ed3) III; pwIs206 [pvha6::gfp::rab-10 Cbunc-119(+))
マン ゴルジ体 Α-マンノシダーゼ II RT1315 (unc-119 (ed3) III; pwIs503 [pvha6::mans::gfp Cbunc-119(+)])
1例は、表 3 に記載されているリソースから選択されます。
2発達研究のハイブリドーマの銀行。
3脊椎動物のアクチン抗体の交差反応します。
4CCC: カドヘリン ・ カテニン複合体;根尖の接合における頂端部に局在します。adherens の接続点 (AJ) に対応します。
5DAC: DLG-1/AJM-1complex;根尖の接合の基底部に局在します。タイト結合 (TJ) に対応します。
6腸で表される追加の小胞関連分子 ref (22) を参照してください。
注: しないすべての分子は、独自のプロモーターの下または抗体による融合蛋白質としてテストされています。
テーブル 2: の例C. の elegans 腸管特異的発現プロモーターと発現時1.
プロモーター 式ステージ
elt-2 式 2 E 細胞期から始まり、成年期に続く
vha 6 式の後期胚から始まり、成年期に続く
ges 1 式約 4E 細胞期から始まり、成年期に続く
エンド 1 式 1E 細胞ステージの後から始まり、後で胚の中に辞退
1例は、表 3 に示されているリソースから選択されます。
テーブル3:リソースを検索するには線虫ラベリング試薬/系統および抗体、腸管特異的分子。
1. 線虫の遺伝学センター (CGC)42利用可能な試薬、系統
2. Wormbase43腸管固有の分子、系統と抗体について
3. インフォーマ
腸管特異的分子20,44のグローバリゼ-ション 4. Transgeneome ウェブサイト45並進 GFP 融合コンストラクト 5。線虫転写 GFP 融合コンストラクトの表現パターン46 6. ナショナルバイオ リソース プロジェクト (NBRP)::線虫47腸管特異的発現プロモーターについて 7. 発達研究ハイブリドーマ銀行 (DSHB)48 線虫抗体 8. 二次抗体と染料参照27,28をご覧ください

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Discussion

このプロトコルは、標準機能喪失遺伝的/RNAi とイメージングを視覚的・分子解剖の生体内でのモデルとして線虫腸上皮の活用 (ラベルと顕微鏡的) アプローチを結合する方法をについて説明します偏光膜と内腔の器官。

ラベリング

このプロトコルは、抗体の汚損に焦点を当てています。その場で抗体による分類蛍光融合タンパク質 (排泄管膜器官に付属の紙で説明)2によって分類する特異性の高い方法であります。抗体の汚損ライブ イメージングを許容しないが、(どちらのラベリング方法は失敗することがなく) 興味の蛋白質の局在化のための確認があります。さらに、形態形成やタンパク質の細胞内局在に関する質問は固定動物でよく評価できます。免疫染色はダブルと複数ラベルに便利、これらは必要な固定と透過の手順を保持できる場合、蛍光融合タンパク質によるラベリングと組み合わせることができます。ここで輪郭を描かれたプロトコルは通常、(図 2) を許可します。その場で抗体または化学汚れによる固定の動物の標識もあります利点スーパーレゾリューションの嵐 (確率光再建顕微鏡) など顕微鏡の技術。蛍光抗体法は内因性抗原を検出し、特定翻訳蛋白質の修正を区別するために、例えば、適応することができます。それが速い結果を生む抗体がある場合、一度その場で染色法 -線虫で簡単ではなく、標本の細胞培養 - のようにが確立されています。

しかし、(ここでは説明しません) 新しい抗体の生成は時間がかかるです。残念ながら、選択市販のc. の elegansの一次抗体がむしろ小さいまますべてではなく、その場で抗原を検出することができる (に抗体の例の表 1を参照検出腸管抗原上皮内、およびその他のリソースは、表 3 )。脊椎動物の抗原に対して生成されたほとんどの抗体の線虫ホモログとは交差反応します。二次抗体の選定は、最初の抗体 (一般的な蛍光プロトコル27,28で説明) の種を考慮に入れなければなりません。蛍光染料 (例えばAlexa Fluor 色素) の継続的改善と市販されている大規模な選択。例えばレーザー共焦点顕微鏡イメージング用顕微鏡に合わせて機能のため染料を選択できる染色を最適化、ためまたは、37「点滅」する機能のため、超解像顕微鏡も予定です。直接標識一次抗体または化学 (例えば蛍光標識ファロイジン) 汚れもあり、二重染色に便利します。

線虫を汚すその場で抗体の難しさは、胎児の卵の殻と抗体の組織へのアクセスを許可する化学および/または機械的破壊両者幼虫/大人キューティクルの不浸透性です。複雑な液体抗体の汚損のプロトコルは、この問題27,28を克服するために開発されている、ほとんどは標的組織に損傷を与える傾向にある透過性コラゲナーゼを含まれます。対照的に、ここで説明した凍結クラック方法はワームのキューティクルまたは卵の殻を開く簡単な方法です。直接上に行われるガラス スライド標本が収集した (と染色の残りの部分は実行も)、およびスライド ガラス (すなわち段階を主に検討する最高固執の卵や幼虫のために特によく働くtubulogenesis 研究)。それも蛍光ラベルの融合蛋白質の保全と干渉しません。テクニック (フリック) 前に、coverslip の適切な圧力としていくつかの手先の器用さが必要で、せん断圧力の回避 (ようは、穏やかなハンドリングと全体の染色手順中にピペッティング) 供試体を維持するために欠かせない。

固定条件は、経験的判断し、構造/抗原 (27」で説明した) 染色するために調整する必要があります。(例えばホルムアルデヒド ベース) 固定技術のより穏やかな形態の分析に重要な組織形態を維持するために必要なバランスが必要これが抗原が維持可能性があります。穏やかな固定の条件も二重標識実験の蛍光融合蛋白質を維持するのに役立ちます。同様に、ブロッキング剤 (例えば牛乳またはウシ血清アルブミン/BSA) と洗浄液の洗剤量特定の染色と背景のバランスを実証的な調整が必要です。蛍光免疫測定法に関する全般的なさまざまな染色技術の議論など、適切なコントロール、およびワーム腸 (例えば腸を最小限に抑えるための手順を最適化するためのヒントのデザインの詳細については一般・全体参照としての線虫特異蛍光プロトコル蛍光) を見つけることができます。

遺伝子の機能と tubulogenesis の表現型の評価との干渉

このプロトコルが初期、本質的なユビキタス機能で、ほとんどの tubulogenesis 遺伝子 (私たちのゲノム全体の場合と同様、(完全ではなく) 部分的な損失は最も有益な遺伝子を評価するときに使用される特定の RNAi アプローチを強調表示します。ERM の画面-1::GFP-ラベル付き腸そのような遺伝子の原因とその干渉を示唆された > この特定の設定12におけるすべての有益な tubulogenesis 表現型の 90%)。遺伝子操作にc. の elegansを提供する多くの利点 (例えばその短い世代時間) し前方 (関数/表現型から始まる) によって遺伝子の機能を混乱させるし、逆にさまざまなアプローチ (で始まる、一般で遺伝子) の遺伝的アプローチを説明しているc. の elegans文学31,38。市販のゲノムワイド RNAi ライブラリも給餌の可用性前方遺伝学的スクリーニング ツールとしてこの逆遺伝学的手法を使用することができます (リソースの材料表を参照してください)。Tubulogenesis の分析のための RNAi の特定の利点は、その能力: 表現型変異対立遺伝子シリーズ (これは通常用量依存性の形態形成遺伝子のためによく作品) と同等の範囲を生成するには母体 Rna (通常初期形態形成/tubulogenesis に関与する); を削除するには特にステージに干渉 (後の幼虫の成長の間に偏光膜生合成に及ぼす影響を評価するために便利です)。

RNAi 手順の一般的な側面の詳細については、リファレンス (26,で説明します。s ="xref"> 31)。致命的な tubulogenesis の表現型解析のためのキーは、表現型のスペクトルを高めるための RNAi の条件を調整する能力です。有益な tubulogenesis の表現型は、腸管固有 RNAi 系統39を必要とせず野生型バック グラウンドで通常生成できます。ただし、このような系統は、利用可能な場合は、この失敗し、非自律系の効果から細胞自律的に区別するためにも使用できます。RNAi の強度を調整するための異なるアプローチを報告されている、例えばIPTG 濃度 dsRNA、最も再現性のある結果30を招くおそれのあるアプローチの誘導のための滴定。ただし、異なった表現型のスペクトルの生成を目指すときに、定量的に正確な滴定は必要なできません。全体的にみて、この分析の成功は表現型の有益なスペクトルを生成する RNAi 条件の決定には、RNAi 効果の最大化にそんなに依存しません (最適ではない (例えば穏やかな) の結果可能性があります多くの場合 RNAi条件)。

RNAi による tubulogenesis の表現型の視覚的評価の評価に最適なウィンドウを決定することが重要です。板早く (例えば標準的な RNAi 条件下での RNAi プレート動物を拾って後 2 日間) の評価を開始して考えられる遅発性の影響のために十分な長さのそれらに従うことをお勧めします。たとえば、悪化極性欠陥の発生時間コースは、通常逮捕された幼虫で 3-7 日をカバーするべき。(、例えば、 let-767(RNAi)または変異体動物として成長を遅らせると変異体や RNAi 動物を使用する場合、幼虫の腸の後非分裂細胞の偏光膜生合成の分析のための条件をさらに改善ことができます。12、図 5)。任意の時間のコースは F2 動物が表示される場合、中止される、(すべての動物はほとんどが幼虫として逮捕の実験で L4s を削除できます)。すべての実験には、適切な正と負のコントロール (例えば細菌の RNAi のクローンを作成定義された tubulogenesis の表現型を誘発する、ベクターまたはスクランブルの RNAi のクローンをそれぞれ空) の併用の評価が必要です。評価のためのもう一つの要件は、十分なひなサイズ (少なくとも 50) です。満たしていない場合、その他の (例えば条件付き) RNAi の条件接続を試行できます。最後に、いくつかの特に興味深い tubulogenesis の表現型は低浸透度で発生する従って十分な数の動物の評価されなければなりません。

顕微鏡

蛍光顕微鏡と高倍率共焦点顕微鏡、説明ここでは、2 つの標準画像検査手順を解離性低-中程度の倍率が通常の管や腔表現の基本的な側面の特性を十分、C.elegans腸、前方スクリーンで動物のより大きいセットを視覚的に画面にも使用できます。蛍光顕微鏡を解剖を許可: 彼らのプレート上の動物の生体内イメージング (ただし、生きている動物、一過性、麻酔薬を用いた固定化することができます後マウントから回復も共焦点または DIC イメージング);動物の大規模なセットをスクリーニング追跡発達するイベント (例えば変位および膜の拡張の間に偏光のマーカーの交換);(いくつかのパターンとの非対称性がより区別低倍率で) 特定の表現パターンの追跡選択し、蛍光ワームの詳細な分析 (共焦点顕微鏡など) や染色体外遺伝子の維持のために適したを選択します。共焦点顕微鏡による高倍率で可視化は、単一のセルおよび細胞内レベルでの表現型を特徴付けるに許可します。このプロトコルでは、レーザーの回転のディスク共焦点顕微鏡などの代替機能に最高の confocality を提供する共焦点顕微鏡とイメージングについて説明します。回転のディスク共焦点顕微鏡は、しかし、それは少ない光毒性を誘発するのでダイナミックなコマ撮り研究選択の顕微鏡 (低、高倍率について refs (34,35) を参照してください。線虫の顕微鏡検査)。従来の顕微鏡技術と同様、小説付加的な利点を提供し、(例えば透過電子と超解像顕微鏡; で説明した37、ナノスケールの範囲に高い解像度で画像を許可 40)。

共焦点の顕微鏡下での線虫腸をイメージング、マウントと固定化が重要です。固定化のための異なった化学薬品の間で - アジ化ナトリウムの毒性がほとんどの作品確実にすぐにスキャンが行われる場合。レバミゾールが有毒、形態形質の評価の妨げとなる hypercontraction が生成されます。いくつかの麻酔薬は膜準蛍光蛋白質と干渉するかもしれないし、極性の欠陥のような見えるかもしれませんが成果物を作り出すことができます。線虫が厚い標本、そして 3 D 解析 (断面) が (簡単に根尖の接合と外側の膜の優れた可視化ができる管状の腸上皮の特定の強さの利点を取ることが不可欠入手しやすいフラット上皮)。すべてのスライドとブラケット、平均、レーザー出力、利得、ピンホール、明るさのようなパラメーターを含む、良い品質の画像を取得する目的のためは、共焦点設定を調整する必要があります。腸内の画像の 1 つの特定問題は緑/黄色蛍光顆粒のこの器官の内容 (リソソームは細胞小器官 (リモート・センシング) 関連) の変位を評価する場合は特に、結果の解釈を妨げる可能性がGFP 標識遠藤とプラズマ膜関連するコンポーネント。この問題は、フィールドでよく確認される、DAPI 除外、スペクトルの指紋採取、および経験的なスキャナーの設定13,41を含む (顕微鏡) に応じてさまざまな方法で取り組むことができます。

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Disclosures

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

Acknowledgments

私たちありがとうマリオ・ デ ・ボノ (MRC 分子生物学研究所、ケンブリッジ、イギリス)、ケネス ・ J Kemphues (コーネル大学、イサカ、米国)、ミシェル ・ Labouesse (Institut de生物学パリ セーヌ川、大学ピエール エ マリー キュリー, パリ, フランス)、グルゴワール ミショー (ユニヴェルシテ・ ド ・レンヌ 1, レンヌ, フランス)、CGC、緊張および抗体の研究インフラ プログラム (P40 OD010440) の NIH のオフィスによって資金を供給します。この作品は、英領バージン諸島に SAA 223809、MGH は 224570 NIH の GM078653 の助成金によって支えられました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody staining
poly-L-lysine Sigma P5899
Methanol Fisher Scientific A452-4
Acetone Fisher Scientific A949SK-4
Tween Fisher Scientific 50-213-612
Permount Fisher Scientific SP15-100
Powdered milk Sigma MT409-1BTL
Primary antibodies
MH27 (mouse) Concentration: 1:20 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank.
MH33 (mouse) Concentration: 1:10 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank.
anti-ICB4 (rabbit) Concentration: 1:5 Resources: A gift from Mario de Bono (Medical Research Council, England)
anti-PAR-3 (rabbit) Concentration: 1:50 Resources: A gift from Kenneth J. Kemphues (Cornell University)
Secondary antibodies
Alexa Floor 568 (anti-rabbit) ABCam AB175471 Concentration: 1:200
Cy5 (anti-mouse) Life technologies A10524 Concentration: 1:200
TRITC (anti-rabbit) Invitrogen T2769 Concentration: 1:200
FITC (anti-mouse) Sigma F9006 Concentration: 1:100
Labeled chemicals
Texas Red-Phalloidin Concentration: 1:100 Resources: Molecular Probes-T7471
Materials
Vacuum Grease Silicone Beckman 335148
Microscope slides Fisher Scientific 4448
Microscope coverslips (22x22-1) Fisher Scientific 12-542-B
C. elegans related see reference29 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates see reference29 for protocols.
Tryptone Acros Organics 611845000
Yeast Extract BD Biosciences 212750
NaCl Sigma S7653
Bacto Agar BD Biosciences 214040
Ampicillin Sigma A0116
Tetracycline Fisher Scientific BP912
M9 Medium see reference29 for protocols.
NaCl Sigma S7653
KH2PO4 Sigma P0662
Na2HPO4 Sigma S7907
MgSO4 Sigma M2773
NGM plates see reference29 for protocols.
NaCl Sigma S7653
Peptone BD Biosciences 211677
Tryptone Acros Organics 611845000
Bacto Agar BD Biosciences 214040
MgSO4 Sigma M2773
CaCl2 Sigma C3881
Cholesterol Sigma C8667
K2HPO4 Sigma P3786
KH2PO4 Sigma P0662
RNAi plates see reference30 for protocols.
NaCl Sigma S7653
Peptone BD Biosciences 211677
Tryptone Acros Organics 611845000
Bacto Agar BD Biosciences 214040
MgSO4 Sigma M2773
CaCl2 Sigma C3881
Cholesterol Sigma C8667
K2HPO4 Sigma P3786
KH2PO4 Sigma P0662
IPTG US Biological I8500
Carbenicillin Fisher Scientific BP2648
NaOH Fisher Scientific SS266-1
Sodium hypochlorite Fisher Scientific 50371500
Bacteria
OP50 bacteria CGC
HT115 bacteria CGC
Genome-wide RNAi libraries Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref 30,49,50) Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref51) Source BioScience
Imaging related
Sodium azide Fisher Scientific BP9221-500
Equipment
dissecting microscope Nikon SMZ-U
dissecting microscope equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions) Olympus SZX12
Laser-scanning confocal microscope Leica Microsystem TCS SL
laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope Nikon C2

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References

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発生生物学、問題 128、 Tubulogenesis、上皮細胞極性膜生物学、発生遺伝学、単一細胞解析の in situイメージング
細胞間腔の形態形成と単一細胞レベルでの<em>In Vivo</em>偏光膜生合成のためのモデルとして<em>線虫</em>腸: 抗体の汚損、RNAi 損失の機能解析、イメージングによるラベリング
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Zhang, N., Khan, L. A., Membreno, E., Jafari, G., Yan, S., Zhang, H., Gobel, V. The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging. J. Vis. Exp. (128), e56100, doi:10.3791/56100 (2017).

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