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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

C. 线虫小肠作为细胞间腔形态发生和体内极化膜生物单细胞水平的模型: 抗体染色、rna 干扰功能分析和成像标记

Published: October 3, 2017 doi: 10.3791/56100
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1,3, 1
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Developmental Biology and Genetics Core, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2College of Life Sciences, Jilin University, 3Faculty of Health Sciences, University of Macau

Summary

透明的C. 线虫小肠可作为 "体内组织室", 用于研究多细胞 tubulogenesis 中的单细胞和亚 apicobasal 膜和腔生物。本协议描述了如何结合标准标记, 功能的遗传/rna 干扰和微观的方法来解剖这些过程的分子水平。

Abstract

多细胞管, 所有内脏的基本单位, 由极化上皮或内皮细胞组成, 顶端膜内衬的流明和侧膜接触对方和/或细胞外基质。在器官形态发生过程中, 这种独特的膜不对称是如何建立和维持的仍然是一个尚未解决的细胞生物学问题。本协议将线虫小肠描述为一个模型, 用于分析管状形态发生中的极化膜生物, 重点是心尖膜和腔生物。C. 线虫二十细胞单肠上皮被安排成一个简单的双边对称管, 允许在单细胞水平上进行分析。在早期胚胎发生过程中, 细胞膜极化伴随着极化细胞分裂和迁移, 但当细胞不再增殖和移动时, de 从头极化膜生物继续贯穿幼虫生长。后一种设置允许一个分离亚细胞的变化, 同时调解这些不同的极化过程, 很难区分在大多数极性模型。顶端, 侧膜-, 连接, 骨架和膜成分可以标记和跟踪整个开发中的 GFP 融合蛋白, 或评估的原位抗体染色。与生物体的遗传多样性, C. 线虫小肠因此提供了一个独特的体内模型的视觉, 发展, 和分子遗传学分析极化膜和管生物。这里描述的具体方法 (所有标准) 包括如何: 通过抗体染色对肠亚细胞成分进行标记;通过功能 tubulogenesis 基因的研究, 分析极化膜生物中涉及的基因;评估不同发育阶段的极性缺陷;用荧光、差分干涉对比 (DIC) 和共聚焦显微镜解释表型;量化视觉缺陷。该协议可以用来分析任何通常高度保守的分子涉及上皮极性, 膜生物, 管和流明形态发生。

Introduction

细胞及亚细胞不对称的产生, 如极化膜域的形成, 对于组织和器官的形态和功能是至关重要的1。极化膜生物在上皮细胞中的研究仍然是一个技术上的挑战, 因为在亚单位成分分配的方向性变化取决于多个连续和重合的胞外和胞内信号很难分离在大多数模型和强烈依赖于模型系统。这里提出的模型-单线虫线虫肠道-是一个精致的简单组织。与单细胞的c. 线虫排泄管 (见附纸的极化膜生物在c. 线虫排泄管)2, 它提供了几个独特的优势, 以识别和极化膜生物所需分子的表征。从酵母到人类的分子极性提示的保护使这个简单的无脊椎动物器官成为优秀的 "体内组织室", 以解决与人类系统直接相关的上皮极性问题, 这仍然是非常复杂的, 允许在单个单元格级别在体内对这些事件进行可视化剥离。

虽然多个保守的极性提示从 (1) 外矩阵, (2) 血浆膜及其交界处, (3) 胞内水泡贩运已被确定为3, 其基本的原理是它们在过程中集成极化上皮膜和组织生物不太了解4。经典的单细胞在体内模型 (e.g.S. 酵母和C. 线虫合子) 在确定极化细胞分裂和前后极性的原则方面发挥了重要作用, 并确定了关键膜相关的极性决定因素 (小 GTPases/CDC-42, 分区瑕疵的部)5,6, 但它们依赖于唯一的对称折断提示 (芽疤, 精子进入) 和缺乏连接保护apicobasal 膜域和, 想必, 相应的胞内 apicobasal 分拣机械。然而, 我们目前对组织的极化贩运上皮的知识, 主要依赖于哺乳动物2D 单一7, 缺乏生理细胞外和发展的线索, 可以改变膜的位置贩运轨道的领域和方向 (从2D 到3D 的一个开关,在体外培养系统仅能在 MDCK (Madin-达比犬肾脏) 细胞中逆转膜极性)8。在体内无脊椎动物模型生物体的上皮极性的发育研究最初在扁平上皮中进行, 例如在果蝇表皮, 在那里他们确定了关键的贡献为极性细胞迁移和细胞板料运动的接合动力学9, 并且吞贩卖为极端维护10。3D体外和体内分析了 MDCK 细胞中管状上皮的腔内形态发生, 并分别在线虫肠道中, 最近确定了细胞内贩运的要求. 从头(心尖) 域和流明生物和定位11,12,13。管状 (相对扁平) 上皮细胞的厚度是一个优势, 3D 分析的亚单位不对称, 因为它允许卓越的视觉区分顶端腔膜, apico 侧结, 侧膜, 和细胞器的位置。对于这些视觉优势, C. 线虫模型添加了体内设置、发育轴、透明度、人体计划的简单性、不变和定义的细胞谱系、分析 (遗传) 和下面描述的其他优点。

线虫本身是管状结构的蛔虫, 其透明和简单的结构使其同样管状的内部器官直接进入管和流明形态发生的可视化分析。它的肚腑的二十细胞 (偶尔地21或22个细胞)14从一个单一的祖细胞 (E) 获得, 并且从一个双层上皮发育成一个双侧对称的九 INT 环管 (四个细胞在第一圈;图 1示意图)14,15,16。肠道的谱系和组织分析, 最初由 Nomarski 光学通过核身份17和随后通过荧光显微镜通过标记的膜, 提供了重要的洞察力的形态发生,特别是细胞自治和细胞自治的要求为它的定向细胞分裂和运动 (例如, 插层, 左不对称, 前和后管旋转)14,18.早期胚细胞规范和基因调控网络控制该克隆模型器官的发育, 具有良好的特征19,20。然而, 这里的重点是分析单管细胞中的极化膜和腔生物, 以及伴随这个过程的 endomembranes、骨架结构和细胞器的胞内不对称。这一分析是便利的简单的这一管, 所有顶端膜 (在超微结构的水平, 由绒毛) 面对的流明和所有基底膜面对外管表面, 与侧膜接触对方,由接合处与顶端膜分离 (图 1示意图; 为C. 线虫特定组织的紧密和黏着连接组件的参考 (16,21)。顶端膜生物与腔内形态形成重合。此外, 成年小肠细胞的大小-这个小动物的最大的细胞 (除排泄细胞外)-近似哺乳动物细胞的大小, 允许在体内对亚单位元素的视觉跟踪,例如囊泡轨迹, 通常是在培养皿中尝试体外。

对于这种细胞和亚型分析的目的, 适当的标签是至关重要的。肠内-或等离子膜领域, 结, 骨架结构, 细胞核和其他亚细胞细胞器可以通过标记其特定的分子成分来可视化。许多此类组件已被定性并继续被发现 (表 1提供了几个示例并引用了资源)。例如, 不同的分子区分管状和/或水泡室的肠道膜系统, 从 ER 到高尔基通过后高尔基囊泡到等离子膜, 已被确定为22。特定的蛋白质 (以及脂质和糖) 可以直接标记, 或通过结合蛋白间接。本协议侧重于原位固定标本的抗体染色, 这是两种标准标记技术之一 (参见排泄运河 tubulogenesis 的附文, 用于描述其他技术2 -体内标记通过荧光蛋白融合-这是直接适用于肠道;Table2提供了一些肠道特异促进剂的例子, 可以用来驱动这种融合蛋白在肠道中的表达。双或多个标签的两种方法, 或结合额外的化学染色, 允许更大的 in-depth 视觉分辨率和检查的空间和时间的变化, 在共存和招募特定分子或亚细胞组分 (图 2)。本协议中描述的固定和染色程序支持在免疫过程中保存绿色荧光蛋白 (GFP) 标记。对于成像, 通过标准显微程序 (荧光解剖和共聚焦显微镜) 检测和表征 tubulogenesis 表型的关键点被描述(图 3, 4)。这些可以扩展到更高的分辨率成像方法, 例如超显微镜和透射电子显微镜 (这里没有描述)。

这个系统的一个关键力量是能够在不同发育阶段的个体细胞中分析极性, 从胚胎发育到成年。例如, 顶端膜领域和流明生物可以跟踪整个开发在单细胞水平通过标记与 ERM-1, 高度保守的膜肌动蛋白链接器的 Ezrin-Radixin-Moesin 家族23,24.ERM-1 形象化顶端膜生物 (1) 在胚胎管形态发生时, 当它伴随极化细胞分裂和迁移 (细胞移动顶部在流明期间在插层期间)15;(2) 在晚期胚胎和幼体管延长期间, 在没有细胞分裂或迁移的情况下进行;和 (3) 在成人肠道, 在那里的极化膜域保持 (图 1)。在扩张的有丝分裂幼虫上皮, 从头极化膜生物因此可以从极化组织形态发生分离, 这是不可能在大多数 体内和体外上皮极性模型,包括具有单细胞分辨率的 (例如3D MDCK 囊肿模型8)。对于其他成分的标签, 这个设置提供了机会 (特别是在 L1 幼虫阶段, 当细胞具有较高的细胞质/核比), 以区分这些细胞内的变化是特定的极化膜生物 (例如重新定向贩运的轨迹), 使之与极化细胞分裂和迁移所需的同时进行。

遗传多样性的线虫是众所周知的25, 并使它成为一个强大的模型系统的分子分析的任何生物问题。例如, 对形态发生的研究可以从一种野生型菌株开始, 这种转基因菌株的结构利益 (例如膜) 是用荧光标记标记的, 或者是有缺陷的功能突变体。结构.一个典型的反向遗传研究可能会产生一个突变体, 在系 (例如被目标删除) 中删除感兴趣的基因 (通常是产生点突变, 随之而来的损失、减少或增加功能的基因), 或者它的转录减少的 rna 干扰。在线虫26中, 通过喂养方便地进行 rna 干扰, 还有助于设计有针对性的屏幕, 以检查更大的一组感兴趣的基因。一个遗传模型生物体可以说是最大的力量是能够进行在体内前向屏幕 (如诱变, 系统或全基因组的 rna 干扰屏幕), 允许公正的调查分子原因的表型兴趣.例如, 一个无偏的视觉线虫rna 干扰 tubulogenesis 屏幕, 开始与 ERM-1-labeled 顶端膜的转基因动物, 发现了一个有趣的可逆性肠道极性转换和异位腔表型, 使用这里是这类分析的一个例子。这个屏幕确定了糖的损耗 (GSLs; 强制膜脂质, 通过他们的生物合成酶鉴定) 和囊泡涂层的组分格和它的 AP-1 适配器作为特定分子瑕疵导致这个极性转换表型, 从而将这些贩运分子定性为在体内提示心尖膜极性和流明定位12,13。当从特定的基因突变/形态发生表型开始时, 这样的屏幕 (或单一的基因/rna 干扰交互实验) 也可以检查两个或多个感兴趣的基因之间的功能相互作用 (参见随附的纸张排泄运河为这样分析的例子)2。该协议的重点是 rna 干扰, 除了它的能力, 以直接确定的基因, 其损失导致表型在前屏幕, 提供了具体的优势, 分析的形态发生。由于基因产物对形态发生的作用通常以剂量依赖性的方式起作用, 所以 rna 干扰通常是成功地生成了一个表型的频谱。产生信息性部分功能表型的能力也有助于解决大多数重要的 tubulogenesis 基因是必不可少的, 它们的损失导致不孕和早期胚胎致死的问题。该协议包括有条件的 rna 干扰策略, 以克服这一困难, 并建议的方法, 以优化生成更广泛的表型, 如位系列产生的突变。

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Protocol

1。标记 C. 线虫 小肠

注意: 有关排泄管 tubulogenesis 2 用于组织特异性荧光标记物的分析, 请参阅所附文件质粒和转基因动物的产生, 包括讨论转录和转化融合蛋白 (后者需要的亚细胞定位的一个分子的兴趣)。这些程序可以通过使用特定的促进剂来驱动肠道中的分子来适应。请参见 表 1 , 以了解用于可视化 C. 线虫 肠道内和细胞膜及其连接的分子的示例, 表 2 以推动表达的例子, 在肠道,和 表 3 用于更全面地收集肠道标记物和促进剂的资源.

  1. 抗体染色 C. 线虫 肠道 27 28
    1. 固定
        采取清洁的玻璃滑动, 使用聚 l-赖氨酸为蠕虫产生一个薄膜。放置30和 #181; l 0.1-0.2% 多聚 l-赖氨酸 在幻灯片上, 并在多聚 l-赖氨酸滴上放置第二张幻灯片, 以使 #34; 三明治和 #34;。然后轻轻地擦几下幻灯片, 使两个表面都湿润, 让它们风干30分钟. 用铅笔将幻灯片的磨砂面标签.
        注: 0.2% 聚 l-赖氨酸等分200和 #181; 我是由溶解粉末在 dH 2 O;这可以存储在-20 和 #176; c. 使用高分子量聚 l-赖氨酸改善蠕虫的黏附。聚 l-赖氨酸的浓度也很重要。太低的浓度不会让蠕虫黏附, 但过高的浓度可能产生荧光背景信号。一部太厚的胶卷可能会全部松动.
      1. 将一个扁平金属块牢牢地放在容器的底部 (如: 聚苯乙烯容器), 装满液氮.
        注: 一个可以使用干冰代替, 但液氮使金属块更稳定的容器底部和发冷.
      2. 通过将蠕虫从他们的盘子中洗掉, 用 M9 29 或选取不同的阶段蠕虫 (鸡蛋、L1、L2、L3 或 L4 幼虫阶段蠕虫) 到每张幻灯片上。通常, 选择〜100幼虫和 #160; 和胚胎或〜20成人每张幻灯片。放置10和 #181; 我把虫子洗到滑梯的中间, 或者把鸡蛋/虫子放到 10 #181; l M9 或10和 #181; l 1x PBS 27 (磷酸盐缓冲盐水)。
        1. 使用吸管分散大量的蠕虫以避免结块.
          注: 由于拥挤和不同的阶段厚度, 混合的被冲刷的蠕虫的人口, 不黏附好并且是较少有效地冻裂 (参见下面), 因此采摘阶段特定蠕虫 (或同步的人口) 给卓越的结果。幼虫比成年人棒得多, 每张幻灯片可以放置更多的动物.
        2. 在将蠕虫移到幻灯片上之前, 将它们转移到 线虫生长培养基 (NGM) 板 29 , 而不 OP50 细菌。附着在蠕虫上的过量细菌也会干扰黏附。当心蠕虫不会干涸.
      3. 轻轻地放置 (放置) 22 毫米和 #215; 22 mm 片交叉在收集的蠕虫的顶部, 使其边缘在幻灯片的至少一侧挂起。轻轻地按下, 但牢牢地用一两个手指片。避免剪切会损害组织的完整性.
      4. 立即轻轻地将滑块移至液态氮气中的金属方块, 并让它坐约5分钟即可冻结。然后, #34; 挥 #34; 片在一个快速移动通过使用悬垂边缘.
        注意: 这一步必须果断地完成, 而幻灯片被冻结, 以达到和 #34; 开裂和 #34; 角质层。注意: 使用液氮时, 请遵循 PPE (个人防护设备) 指南.
      5. 将冻结裂纹的幻灯片浸入到 甲醇 填充的玻璃 Coplin 罐中, 在-20 和 #176 中为5分钟;然后转移到一个 丙酮 填充玻璃 Coplin 罐为另5分钟, 在-20 和 #176; C.
        注: 甲醇和丙酮应贮存在-20 和 #176; C 至少在使用前30分钟。在固定后, 幻灯片可以存储在-20 和 #176; 注意: 甲醇和丙酮是有毒的.
      6. 从 jar 中取出幻灯片, 并在使用前使其在室温 (RT) 中风干.
    2. 着色
      1. 环绕固定蠕虫区域, 幻灯片上有一层薄薄的凡士林。在幻灯片底部的该区域周围绘制一个圆圈以标记该点.
        注意: 重要的是, 果冻圈保持完整的染色程序, 以防止泄漏的染色解决方案.
      2. 准备 #34; 湿室和 #34; 在带有盖子的塑料桶中放置湿纸巾。将幻灯片放在 #34 的机架上; 湿室和 #34; 防止在染色过程中滑滑梯的干燥.
        注: 幻灯片不应与水或彼此接触.
      3. 轻轻吸管大约50和 #181; L 1x PBS 进入果冻圈, 足以覆盖该地区。关闭 #34; 湿室和 #34; 盖子在 RT 中孵育5分钟
        注意: 为了避免在这一步失去蠕虫, 不要将 PBS 直接移到蠕虫上。轻轻地将吸管尖端放在圆的边缘, 让液体平滑地分散在蠕虫上.
      4. 倾斜幻灯片并用吸管缓慢地吸入 PBS。将幻灯片向后平放到机架上, 并添加50和 #181; L (或所需的金额以覆盖现场) 阻止解决方案 仔细。在 RT 的潮湿室内孵育15分钟。在等待时, 稀释阻断溶液中的主要抗体 (请参阅 材料表 中的主要抗体和浓度的例子).
        注意: 使用 1x PBS (10 毫升)、10% 吐温 (50 和 #181; L) 和奶粉 (0.2 克) 的新鲜制备堵塞液。洗涤剂的数量和牛奶的浓度可能因所使用的抗体而异, 可能需要根据经验确定。从滑梯吸出的液体是容易失去蠕虫的又一步骤。检查在解剖范围下的幻灯片的进度, 但要注意幻灯片不会变干.
      5. 倾斜幻灯片并使用上述相同的预防措施来抽离阻塞解决方案。将幻灯片向后平放到机架上, 然后慢慢地添加50和 #181; 使用相同的预防措施稀释主抗体。关闭和 #34; 湿室和 #34; 孵育在4和 #176; C 夜间或在 RT 上较短的时间.
        注意: 潜伏期可能需要对特定抗体进行经验测定.
      6. 吸掉 主抗体解决方案 , 如其他解决方案所做的那样。然后用阻塞解决方案清洗幻灯片10分钟, 3 次, 添加和删除解决方案的方式与上面描述的相同.
      7. 添加 辅助 (荧光标记) 抗体 在阻塞溶液中稀释, 在 RT 处孵育1小时。有关次要抗体和浓度的示例, 请参见 材料表 .
      8. 移除二次抗体并清洗, 如上所示, 与阻塞解决方案2次, 并清除堵塞解决方案, 与 1x PBS, 每10分钟.
      9. 将尽可能多的 PBS 吸走, 而不允许标本晾干, 并小心地除去标本周围的果冻.
      10. 添加一滴 安装介质 到标本上, 并把片轻轻放在上面。用指甲油封住片的边缘。将幻灯片放在深色的幻灯片框中, 以保存着色并存储在4和 #176; C.
        注意: 由于光线敏感 (荧光可能随着时间的推移而褪色) 并防止空气暴露, 由于同样的原因, 在黑暗中保持幻灯片。幻灯片可在4、#176、c 或-20、#176 等长时间内存储; c.

2。在 线虫 肠道中对基本 tubulogenesis 基因功能的干扰。示例: rna 干扰.

注意: C. 线虫 根据标准协议 29 在 NGM 板上播种的 OP50 细菌上培养的菌株。对于 rna 干扰, C. 线虫 在 HT115 上以25和 #181 为补充, 以 rna 为原料, 以羧和2毫米 IPTG (异丙 beta-D-1-thiogalactopyranoside) 为诱导细菌启动剂, 生成双链 RNA (dsRNA) 从介绍的 C. 线虫 基因。抗生素和 IPTG 浓度可能会因 rna 干扰克隆/库和所需的 rna 干扰强度而变化. 特定的 rna 干扰克隆可以从商业上可用的基因组范围内的 rna 干扰喂养库获得 (请参见 26 , 30 , 31 ) 为在 C. 线虫 和 材料表中的材料/试剂和 rna 干扰库中的 rna 干扰提供背景.

  1. 通过喂养的标准 rna 干扰 26 , 31
    1. 从-80 和 #176 中取出 rna 干扰库板, 然后放在干冰上。取下密封胶带, 使用无菌吸管末端将感兴趣的克隆的附着细菌转移到 LB (Luria 肉汤) 琼脂板 29 补充100和 #181; g/毫升氨苄西林和15和 #181; g/毫升四环素。细菌在琼脂板上的条纹。用新的密封胶带封住 rna 干扰库板。在37和 #176 的夜间生长细菌; C.
      注意: 这些琼脂板可以储存在4和 #176; C 几个星期。新的细菌可以直接培养, 以保护原始的 rna 干扰库.
    2. 第二天, 将从 lb 琼脂平板上接种的干扰物细菌, 放入1毫升 lb 液体培养基 29 包含50和 #181; 每毫升氨苄青霉素, 分别为 14 (8-18) h 或隔夜在37和 #176 晃动; C.
      注: 为了获得最佳效果, 每次使用新鲜细菌。请参见参考 ( 30 ), 以比较不同的区域性条件 ( 例如, 区域性的 时间).
    3. 第二天, 种子200和 #181; 每克隆在分离的 rna 干扰板上培养的 rna 干扰细菌。让盘子晾干, 在室温下过夜, 以诱导细菌启动剂.
    4. 将 4-6 L4-stage 幼虫转移到每个 rna 干扰板上。在 RT 或22和 #176 上孵育种子的 rna 干扰板; C 3-5 天.
      注意: 选择 L4 幼虫首先到一个 NGM 板上没有细菌, 以消除粘附的 OP50, 将干扰 rna, 或串行转移到一个新的 NGM 板没有 OP50 三倍。确保菌株不被污染, 因为污染细菌的 OP50 喜欢的食物, 也会干扰 rna。根据需要调整温度: 例如 以更高的温度加速发展;菌株可能是温度敏感.
    5. 为发展研究, 检查 F1 后代的表型从2天起.
      注意: 在开发过程中评估极化膜生物时, 经常检查动物以避免丢失表型 ( 例如 标记位移) 的外观或进展是至关重要的。富 F2 人口为强的表型 ( 例如 通过采摘父母雌雄同体到新的 rna 干扰板在天2选择为他们的后裔的最强烈受影响的中间部分) 很少是必要的, 因为光谱从温和到强表型是可取的.
  2. 条件性干扰
    注意: 可以对干扰条件进行修改, 以减少严重, 或增加轻度影响, 或干预阶段-具体; 修改有助于对表型效果进行全面评估致命的 tubulogenesis 基因。
    1. 幼虫干扰-在同一世代 (轻度、特定阶段的 rna 干扰) 中对 rna 效应的评估
      注: 为了克服不育或胚胎的致命性, 或扰乱基因功能在特定阶段后胚胎发生, rna 诱发幼虫, 后 embryonically。要么安置未处理的蛋 (2.2.1.1), 怀孕的成人 (2.2.1.2) 或同步 L1 (或, 如果需要, 最新阶段) 幼虫 (2.2.1.3) 在 rna 干扰板;评估在同一世代的 rna 干扰效应, 例如 在幼虫和/或成人的两天后和以后。
      1. 将30-50 个妊娠成虫放入一滴 漂白溶液 (a 1: 4 溶液 10 M 氢氧化钠和家用次氯酸钠) 置于 rna 干扰板的边缘。让干燥, 使 L1s 孵化和移动到细菌的草坪.
        注意: 漂白溶液, 一般用于去污, 将杀死一切, 但胚胎在其蛋壳。因此, 不要将漂白溶液置于或接近于 rna 干扰的细菌上.
      2. 在 rna 干扰板上选择或播种 ~ 20 年轻的妊娠成虫, 让他们产卵2-3 小时, 或直到有约300鸡蛋在盘子上, 然后摘下成人.
        注: 该方法可引起 OP50 的干扰。为了减少这种风险, 首先将成人转移到无细菌的 NGM 板上, 以去除 OP50 附着在蠕虫上的病毒。注意, 成年人不要在 rna 干扰板上停留太久, 以免对胚胎产生 rna 干扰作用.
      3. 将 L1 阶段蠕虫直接放在 rna 干扰板上 (参见参考 ( 29 )-用于同步协议).
        注意: 可以使用缩写的同步协议 ( 例如 进行适度的大规模设置), 方法是从人口稠密的 M9 中清洗蠕虫数次, 直到只剩下鸡蛋。之后, 2-3h 孵化 L1s 可以收集在 M9 从这些板块, 清洗额外的洗涤清除细菌 (3x 在 M9), 并播种到 rna 干扰板.
    2. 使用空的矢量 rna 干扰细菌 (轻度的 rna 化) 来稀释 rna. 注意: 减少 dsRNA 的数量, 通过稀释大量的 rna 干扰细菌, 可以引起更温和的效果, 也可以减少胚胎的杀伤力。不废除所有的胚胎效应对 rna 干扰细菌的稀释也用于双 rna 干涉实验和滴定条件的遗传相互作用实验 ( 例如 , 以产生轻微的效果评估的增强和强大的影响评估抑制)。
      1. 长大后的 rna 干扰和 em在 1 ml LB 培养基中与50和 #181 的 HT115 rna 干扰细菌, 如标准的 rna 处理条件下所做的 g/毫升氨苄西林.
      2. 用空的矢量 rna 干扰细菌来稀释 rna, 以达到不同浓度的范围, 例如5%、15%、30%、50%、70%。移上下混合细菌。吸管200和 #181; 我把细菌混合到一个 rna 干扰板上.
      3. 在每个 rna 干扰板上选取 4-6 L4 幼虫。从2天开始检查表型.
    3. 干扰敏感菌株 (强干扰)
      1. 使用可用的具有 rna 干扰敏感性的菌株, 例如, eri-1 (mg366)、rrf-3 (pk1426) 或 eri-1 (mg366) lin-15B (n744) (后者敏感), 并遵循标准的干扰程序描述在 2.1 31 , 32 , 33 。 注意: rna 干扰敏感菌株 ( 如 rrf-3 和 eri-1 ) 可能比野生型动物的育雏规模小, 并在25和 #176 无菌; C。他们也可能有自己的表型的低背景, 例如 低渗透胚胎的杀伤力, 在评估特定的 rna 干扰作用时必须考虑到.

3。 在体内 通过荧光解剖显微镜对 C. 线虫的肠道进行成像

    在荧光光下可视化动物之前, 在任何解剖显微镜下, 在明亮的光线下检查 rna 干扰板。评估 (并有可能记录) 表型可见在明亮的光线下可能影响分析, 如致命性, 不育 (后裔数量较少), 发育 ( 例如 和 #160; 幼虫逮捕) 和其他可见的表型, 可能有助于描述了一个涉及极化膜生物和腔内形态发生的基因的功能.
    注: 只有有足够的后代进行评估 (至少 50) 的分数, 否则尝试其他干扰条件。为了定量评估, 确保盘子不会被污染或生长 OP50 (干扰 rna).
  1. 在荧光光下可视化动物, 取下盖子, 直接在解剖荧光显微镜下放置 rna 干扰板.
    注意: 为了检测微妙的肠道表型, 你将需要一个解剖显微镜与更高功率立体声荧光附件, 允许足够的范围放大。此协议描述了一个范围的使用, 它具有1.5 和 10 x 目标, 缩放范围从3.5 到 45.
  2. 首先在明亮的光线下发现动物集中。接下来, 使用适当的过滤器, 在低放大率下 ( 例如 在1.5x 目标下) 在荧光灯下检查动物。系统检查板从左上到右下到扫描整个板块的表型.
  3. 选择感兴趣的动物并更改为10x 目标。重点在肠道和使用变焦评估 tubulogenesis/流明形态发生表型。见5节表型评分。首先, 在低放大率下拍摄图像。然后切换到高倍放大倍数.
    注意: 由于健康动物动作快, 工作迅速, 一只手在电脑鼠标的图像采集, 同时聚焦显微镜与另一只手。在大多数被逮捕的胚胎和早期幼虫中使用 tubulogenesis 表型时, 可能不需要减慢动物 (例如, 通过瞬态放置板到4和 #176; C)。这些图像可以通过显微镜安装的 CCD 摄像机和图像采集软件来捕获.

4。通过激光扫描共聚焦显微镜对 C. 线虫 小肠进行高分辨率成像 34 35

  1. 安装和固定
      使用指尖稀疏地将少量的油脂或凡士林放在玻片上的圆圈上 (直径为6-8 毫米).
      注: 油脂圈的厚度对安装至关重要。为了得到最佳的成像效果, 一次只用一个或几个幼虫, 并使用尽可能少的液体的超薄油脂圈, 使动物直接粘在玻片和盖板之间 (如果做得完美, 动物将被固定, 没有麻醉剂)。鸡蛋和较旧的动物的安装需要一个较厚的圆圈, 以避免破坏样品时, 增加盖滑移.
    1. 添加一滴通常3.5 和 #181; L 10 mM 叠氮化钠溶液 进入圆的中间, 并在解剖显微镜下将蠕虫带入它.
      注意: 在1和 #160 中溶解65.01 毫克 NaN3, 制备1米叠氮化钠溶液; ml dH 2 O;添加200和 #181; 此1M 和 #160 的 L; 解决方案为 20 mL M9 缓冲区。将蠕虫迅速放入叠氮化钠溶液中, 避免溶液干燥。挑选阶段分开为最佳的装载, 瞄准大约50胚胎每张幻灯片和大约20幼虫, 当检查更大的人口时。在采摘胚胎时, 可以使用 M9 代替叠氮化钠溶液。如果使用叠氮化钠, 动物必须在30分钟内成像, 以避免这种有毒化学物质的组织损伤.
      注意: 叠氮化钠是有毒的.
    2. 轻轻地放置一个22毫米和 #215; 22 毫米片在幻灯片上。小心别把虫子碾碎了。在解剖显微镜下使用轻度压力和检查, 确保蜗杆在滑动和盖板之间固定好。为幻灯片添加标签.
      注: 正确的压力是至关重要的, 以避免损坏标本 (太多的压力), 而不是固定好 (太小的压力: 动物漂浮而不是坚持幻灯片)。漂浮动物基本上排除了适当的成像.
  2. 图像
    1. 在共焦显微镜下放置幻灯片。搜索具有10x 目标和焦点的蠕虫.
      注意: 在可能的地方使用亮光以避免漂白.
    2. 更改为60x 或100x 目标并将焦点放在肠道上.
      注意: 在明亮的光线下, 肠道可以很容易地通过它的流明在动物中间运行, 从咽到肛门靠近尾巴尖端。为60x 或100x 油目标应用机油时要小心。混合不同类型的油可能会干扰进一步的成像。当使用垂直显微镜或使用倒置范围时, 将少量的油放在幻灯片上, 注意不要污染其他目标或显微镜的某些部分.
    3. 建立科勒 DIC/Nomarski 照明, 以便用于扫描 36 。在萤光灯下用适当的通道检查动物的肠道标记和/或检查表型, 以便选择合适的标本进行成像。工作迅速, 以避免漂白.
    4. 切换到激光扫描, 通过设置其背部和腹侧的扫描边界来限制潜在的图像到肠道.
      注意: 如果荧光也在肠道外贴上标签, 那么以这种方式包围肠道是至关重要的。在这个试点扫描, 工作与快速扫描条件的 av老漂白.
    5. 停止扫描以选择实验的扫描参数。设置6-20 部分, 用于沿 z 轴进行肠道扫描, 例如 在0.2 和 #181; m 间隔, 取决于询问、动物阶段和/或技术考虑。根据标签的复杂程度和需要的分辨率来设置帧平均每幅图像以减少噪音.
      注: 设置细节因显微镜和实验而异。如果对三不同的荧光进行顺序扫描, 则可能需要减少部分的数量以避免漂白。将帧数调整为节数 (应小于节数, 以避免图像失真; 也称漂白增加)。4-6 帧通常是足够的.
    6. 返回到扫描与确定 (慢) 激光扫描条件和调整: 亮度 (使用最小增益减少背景); 激光功率 (尽可能高的要求, 尽可能低-增加漂白; 通常最小设置是足够的);针孔 (避免打开, 如果不需要, 保持分辨率).
      注意: 扫描条件取决于样本, 需要在扫描会话开始时进行经验确定。确保亮度不超过饱和度 (将限制图像随后通过成像软件进行修改的能力)。在设置扫描条件时, 也要考虑到所有的成像实验都必须使用相同的条件来比较实验动物和对照.
    7. 捕获图像系列。将图像合并到单个投影图像中.
      注意: 可能需要根据显微镜单独保存投影图像和/或叠加.
    8. 当采用多通道图像时, 使用顺序扫描来避免通道之间的出血 (对共存研究至关重要)
      注意: 如果增加的漂白连接到更长的扫描时间, 则可能需要更改图像设置.
    9. 总是获得相应的 DIC/Nomarski 图像 (剖面) 的地标和整体状态的扫描动物的形态学.

5 。极化膜生物缺陷的定量化在 线虫 小肠中的作用

注意: 示例: let-767 引起的心尖 ERM-1::GFP 和异位侧腔形成的侧移位和 aps-1 rna 干扰.

  1. 在解剖显微镜下评分表型 ( 图 5 A, D, E)
    1. 为评分定义类别。例子: (i) 狂放类型 (ii) 侧位移 ERM-1::GFP (极性瑕疵) 和 (iii) 异位流明形成 (以后开发侧位移).
      注: 低放大度的视觉分析可以为有或没有特定表型的动物评分。在这里, 我们选择了一个三定性不同表型的例子, 同时也表明了分析的极性表现型的恶化。然而, 可以评分不同的定性和定量表型, 如流明形态缺损, GFP 阳性细胞质液泡的缺席/存在 (或数), 流明直径和 intralumenal 囊肿的大小或数量 (见强类 = "xfig" > 图 3       示例)
    2. 根据预期差异的大小, 在解剖显微镜下, 在一组重复或三遍实验中, 在其琼脂板上约有100活蠕虫得分.
      注: 在扫描板系统时, 必须对每种进入视图的动物进行评分, 例如 从板的左上角到右下角 (确保蠕虫均匀地填充板).
    3. 对3独立的实验组重复此操作。生成条形图并评估结果的重要性.
  2. 在共焦显微镜下评分表单 ( 图 5 B)
    1. 为评分定义分类, 每个动物的异位流明数 注: 放大倍数视觉分析可以为每种动物评分一个可量化的标记或表型, 并允许通过解剖显微镜而不能辨别的亚细胞标记的评分。目前的例子计数异位流明每动物在早先被评估的同一个实验的蠕虫子集 (5.1.1, 类别 3) 提炼对恶化的极性表型的评估在这里被审查。但是, 可以对其他表型或参数进行评分, 例如 囊泡的数目、存在/缺席或 co-localize 的亚细胞组分数量、荧光强度 (后者由 ImageJ 量化; 参见排泄管) 2 .
    2. 根据预期差异的大小, 在共聚焦显微镜下的一组重复或三个实验中, 在大约20动物中量化表型标记 (这里为异位流明).
    3. 重复3独立的实验集。生成条形图并评估结果的重要性.

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Representative Results

该协议描述了如何分子分析和可视化极化膜生物和流明形态发生在线虫肠道, 在单细胞和亚细胞水平。二十细胞单线虫小肠是由细胞分裂和迁移过程中形成的中期胚胎。在这个时候, 极化膜领域成为建立, 但de 从头极化膜生物继续在成熟, 但扩大上皮整个四幼体阶段, 直到成年, 允许集中分析极化膜生物 (图 1A)。

为了可视化C. 线虫的蜂窝和亚细胞成分, 通常使用两种策略: 免疫荧光 (本议定书详述, 1 节;图 2, 图 4D-f)和荧光融合蛋白的表达 (详细在排泄管极化膜生物的附文中,2;图 1B,图 2,图 4, 图 5C)。双重和多重标记, 结合不同的标签或两种方法, 可以解决膜不对称, 如顶端和侧膜域, 以及不同的亚细胞组分之间的关系 (图 2,图 4D-E)。膜骨架连接器 ERM-1::GFP 在这里显示为顶端膜生物的指示物, 与腔内形态发生在这个单上皮。通过使用这个标记, 一组肠道心尖膜/腔生物缺陷及其致病基因缺陷可以通过功能研究来确定, 例如, 通过无偏的基因组全屏幕使用 rna 干扰 (rna 干扰方法采用这类表型的产生在本议定书2节中作了说明)。图 3和图 4显示了具有高功率目标的解剖荧光显微镜所获得的顶端膜/流明生物表型的中放大图像的示例;和高放大图像获得的共焦激光扫描显微镜 (这些显微方法在3和4节描述)。作为量化极化膜生物缺陷的一个例子, rna 干扰与let-767 (编码类固醇 dehydrogenase/3-ketoacyl-CoA 还原酶) 和 aps-1 (编码格 AP-1 的西格玛亚单位的影响适配器) 在 ERM-1:: GFP 定位和流明定位显示在图 5中。

Figure 1
图1: 野生类型的细胞和亚型结构及形态发生C. 线虫肠道(A)图中的 C. 线虫肠道发育, 细胞成分, 以及内膜和细胞膜。线虫小肠是从8细胞阶段出生的 E 卵无性生成的。经过四轮细胞分裂, 其16细胞 (E16 阶段) 形成一个径向对称的双层上皮细胞15。在这个阶段, 每一个细胞的细胞质对立, 细胞核移动到未来的顶端, 和细胞质成分移动向相反 (未来的基础), 膜领域。在一个插层步左和右腹细胞移动 (在平行) 入背部细胞分层形成双边对称管 9 INT 圆环。每个细胞面对和建立的管腔, 其顶端/腔膜 (绿色; 结构区分的具体膜微, 微绒毛) 和接触相邻细胞或体腔与其侧膜 (蓝色), 除了第一由四细胞形成的 INT 环。顶端接合处 (红色) 分离顶端和侧膜域。在插层后, de 从头膜生物继续随着后期胚胎的生长和四幼虫阶段进入成年, 其中只有最小的进一步增长发生 (相极化膜维护).放大的单细胞表明膜系统与 ER 和高尔基以上的核 (N) 和内涵囊泡。(B) DIC/Nomarski 和共焦重叠显微发展的C. 线虫小肠标记的顶端膜细胞骨架标记 ERM-1::GFP。在逗号阶段的肠道是由一条白线 (ERM-1::GFP 已经依稀表达在顶端膜在插层开始, 但不能在这个图像欣赏)。动物在这里和下面显示与前 (头) 左, 后 (尾) 右, 背向上, 腹下。缩放栏: 5 µm.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图2: 开发的狂放类型的双重和三重标号的例子C. 线虫肠道使用抗体和融合蛋白。(a、B)胚胎.(A) 逗号阶段。PAR-6::GFP (绿色; 顶端 par 极性复合物的组分), anti-PAR-3 抗体 (红/TRITC (四甲基罗丹明异硫氰酸酯); 顶端 par 极性复合物的另一组分) 和 MH33 (blue/Cy5 (Cyanine5); anti-IFB-2/intermediate灯丝)。PAR-6::GFP 和 PAR-3 抗体标签的顶端膜的线虫肠道 (括号)。IFB-2, 另一个顶端标记在以后阶段, 是 panmembraneously 局部化在这早期的阶段。PAR-6::GFP 和 anti-PAR-3 也标签咽 (左);肠腔是由其重叠与 IFB-2 (绿松石) 和肠道管概述蓝色 anti-IFB-2 (右)。(B) 2 倍的阶段。AJM-1::GFP (绿色; 结部分), ICB4 抗体 (红/Alexa, ICB4 检测未知 membraneous 肠抗原)。AJM-1::GFP 标签的顶端交界处的线虫肠道, 可见的腔阶梯模式 (它也标签皮路口; 不可见, 因为图像是重点在肠道; 见4节, 共焦成像)。ICB4 染色的所有膜的线虫肠道。箭头指向侧膜染色的 anti-ICB4。(C, D)L2 幼虫。(C) LET-413::GFP (绿色)、笔 (红色/得克萨斯红、phallotoxin 绑定到 F-肌动蛋白) 和 MH33 (blue/Cyanine5、anti-IFB-2)。LET-413/Scribble 是一个组成部分的基础极性复杂和本地化侧膜的线虫肠道 (括号)。笔和 IFB-2 抗体标签的顶端 submembraneous 细胞骨架的C. 线虫肠道 (紫色)。笔还强烈地玷污了身体壁的肌肉, 压倒了肠道染色。插页显示了更高的盒装区域放大倍数。(E) L3 幼虫。SLCF-1::GFP (绿色; 整体膜莱恩组分/糖转运器), ERM-1::mCherry (红色) 和 MH27 抗体 (blue/Cyanine5, anti-AJM-1)。SLCF-1::GFP 标签的侧膜, 而 ERM-1::mCherry 标签的顶端膜的线虫肠道 (括号);AJM-1 标签的顶端交界处。(f-f"")L2 幼虫。(f, f")单色图像。SLCF-1::GFP (绿色) 标签侧膜 (由薄白色箭头指示的侧膜)。MH27 (blue/Cyanine5) 标签顶端接合处 (短黄色箭头)。(f", f"")覆盖图像与没有肌动蛋白。镶嵌显示了更高的方块区域放大倍数。请注意, 这些不同的膜/接合标记在单一颜色图像 (f、f) 中出现的表面上相似, 清楚地区分肠道细胞的 apicolateral 角.在F中,"'中的粗白色箭头指向顶端/腔肌动蛋白骨架, 由笔 (否则被肌肉肌动蛋白压倒) 标记。所有图像都是共焦投影 (z 堆栈0.2 µm), 通过顺序扫描获得, 以避免通道之间的出血。缩放条 (对于 A-E, f-f "" 和所有插入): 5 µm.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图3: 示例C. 线虫肠极化膜和腔内形态发生缺陷中放大 (解剖荧光显微).所有图像都是由一个解剖荧光显微镜, 配备了 custom-made 高功率立体声荧光附件 (材料表)。显示了不同的放大。所有表型都是通过与 ERM-1::GFP (在胚胎和早期幼体阶段的肠道和排泄管顶端/腔膜局部化) 不同基因的 rna 干扰得到的。肠腔和极性表型是: (a, B) 野生类型胚 (a) 和幼虫 (b);(C、D) 侧位移 ERM-1::GFP;小肠细胞在这个胚胎 (C, 箭头指向单肠细胞) 扩大和出现臃肿, 但在这些幼虫的野生型大小和安排 (D, 箭头指向侧膜之间的 INT II 和 III);(E) 在三胚胎中加宽和回旋腔;(F) ERM-1::GFP 扩大到侧向交界区 (曲折腔), 进入含有 GFP-阴性液泡 (箭头) 的肠道细胞质;(G) 腔囊肿之间 intralumenal 粘连 (箭头指向两个囊肿)。(H) 带异位流明 (箭头) 的细胞质和侧 ERM-1::GFP 移位;(I) ERM-1::GFP 在细胞质中向 GFP 阳性点 (箭头) 迁移。排泄运河和排泄管表型没有在这里描述 (运河是显示在左边, 肠道向右在所有的图像)。缩放栏:10 µm.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图4: 示例C. 线虫肠极化膜和腔内形态发生缺陷在较高的放大率 (共聚焦图像)。(A、C、E、G、I、K)胚胎.(B、D、F、H、J、L)幼虫.所有的表型都是通过在标记有 ERM-1::GFP (所有图像中的绿色) 的菌株中的不同基因进行 rna 干扰得到的。成像是集中在肠道。胚胎的图像也显示排泄运河 (图像的左侧), 包括运河表型 (没有描述)。(A, B)野生型胚 (A) 和幼虫 (B)。(C) 侧顶端 ERM-1::GFP 的位移 (逗号阶段; 晚期插层)。(D) 极性转换: 侧的顶端 ERM-1::GFP 的位移和侧 ICB4 的顶端堆积, 用双标记显示。F-肌动蛋白 (标记为笔-TRITC) 概述了动物的纵向肌肉束染色 (动物是三重标记)。(E) 侧 ERM-1::GFP 晚期3倍胚的移位。顶端 IFB-2 抗体 (blue/Cyanine5) 表明完整的腔和腔中间花丝。(F) 由 anti-IFB-2 (blue/Cyanine5) 标记的异位流明。(G) ERM-1::GFP 肠细胞质中的负液泡。(H) 在肠道细胞质中 ERM-1::GFP 阳性液泡。(I, J)胚和幼虫无腔, 分别。(K) 宽的肠道。(L) 囊肿性和复杂的肠道。(A、D、H、I、J、K、L)是共焦投影。(B、C、E、F)是共聚焦剖面。在G中增加亮度以突出显示细胞质 GFP-阴性液泡。鳞片条:10 µm (分别为所有胚胎和幼虫)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图5: 肠道极性转换和逆转: 一个例子为极化膜和流明生物缺陷的定量.(A, B, C)let-767和aps-1rna 干扰都导致 ERM-1::GFP 侧移位(BL)和异位腔形成(EL), 但在不同的发育阶段。(A) 通过解剖显微镜进行量化: 在 rna 干扰板上播种蠕虫后2天, 对胚胎 (左) 和幼虫 (右) 进行计数。注: 所有模拟和让-767 (rna 干扰)动物在这个时候孵化 (因而没有胚胎, 然而, 所有狂放类型极性; 残破的线专栏)。aps-1rna 干扰导致了胚胎中已经存在的极性缺陷, 而let-767rna 干扰在幼虫中诱导它们。在aps-1中, 与幼虫有关的异位流明 (vs侧位移) 的百分比较高是由于对异位流明胚胎的逮捕。(B) 通过共焦显微镜进行量化: 在幼虫的异位腔发育开始时, 每只动物的异位流明计数。let-767rna 干扰诱导更多的异位流明在幼虫比aps-1rna 干扰 (aps-1rna 干扰幼虫是 "escapers" 没有 arres泰德作为胚胎)。(C) ERM-1::GFP 侧移位 (BL) 和异位流明 (EL) 的野生型幼虫和幼虫的共焦图像;标尺: 5µm. (D, E) 极性逆转在let-767干扰动物 (计数动物与和没有极性瑕疵 [BL/EL] 通过解剖显微镜)。20让-767 (rna 干扰)轻度异位腔型的动物在4天被转移到一个 OP50 板上, 并在40小时后进行评估。(D) 超过50% 的幼虫已恢复到野生型极性 (ERM-1 在顶端膜上)。(E) 20% 的动物生长在 L1 幼虫阶段 ( 让-767 (rna 干扰)结果在 L1 逮捕)。所有数据显示为平均 +/-SEM, n = 3。请单击此处查看此图的较大版本.

表 1: C. 线虫幼虫和成人小肠膜系统的标记示例1.
蛋白质名称 亚细胞定位 蛋白质结构/功能 商业可用的 C. 线虫特定抗体 (DSHB2) 可在 CGC 的菌株的例子
OPT-2/PEPT-1 心尖跨膜蛋白 肽运输机 KWN246 (1 (e2123) III, rnyEx133 [选择-2 (aa1-412)::
GFP) + 1 (+)])
AQP-4 心尖跨膜蛋白 水道
ERM-1 顶端 brushborder membrane–cytoskeleton 链接器 ERM1
ACT-5 顶端 brushborder 细胞质肌动蛋白 (3)
IFB-2 顶端 brushborder 中间灯丝组件 MH33
EPS-8 顶端 brushborder human-epidermal-growth-factor-receptor-kinase-substrate-8 同源
PAR-6 顶端膜 顶端极性复杂组分
SLCF-1 侧跨膜蛋白 单运输机
AQP-1 侧跨膜蛋白 水道
LET-413 侧膜 同系物、适配器和极性行列式 LET413
HMP-1 顶端接合点 (CCC4) α-蛋白, 钙黏蛋白-蛋白复合组分 FT1609 (unc-119 (ed3) III; xnIs528 [发落-1 p:: 发落-1::
GFP + unc-119 (+)])
HMR-1 顶端接合点 (CCC) e-钙黏附素, 钙黏蛋白-蛋白复合组分 HMR1
AJM-1 顶端接合点 (DAC5) 接合完整性分子, DLG-1/AJM-1complex 组分 MH27 SU159 (jcEx44 [ajm-1::GFP + 6 (su1006))
DLG-1 顶端接合点 (DAC) 圆盘-大同系物, MAGUK 蛋白, DLG-1/AJM-1complex 成分 DLG1
RAB-11 内涵泡 贩运6 RT311 (unc-119 (ed3) III; pwIs69 [vha6p::gfp::rab-11, Cbunc-119 (+)])
RAB-5 内涵泡 贩运 RT327 (unc-119 (ed3) III; pwIs72 [pvha6:: gfp:: 5, Cbunc-119 (+)])
RAB-7 内涵泡 贩运 RT476 (unc-119 (ed3) III; pwIs170 [vha6p:: gfp:: 7, Cbunc-119 (+)])
RAB-10 内涵泡 贩运 RT525 (unc-119 (ed3) III; pwIs206 [pvha6:: gfp::10 Cbunc-119 (+))
勒芒 高 α-甘露 II RT1315 (unc-119 (ed3) III; pwIs503 [pvha6:: 芒:: gfp Cbunc-119 (+)])
1从 Table3 中列出的资源中选择示例。
2发展研究杂交瘤银行。
3对脊椎动物肌动蛋白交叉的抗体。
4CCC: 钙黏蛋白-蛋白复合体;本地化到顶端接合处的顶端部分;对应于黏着结 (AJ)。
5DAC: DLG-1/AJM-1complex;本地化到顶端接合处的基部;对应于紧密连接 (TJ)。
6为在肚腑表达的另外的囊泡伴生的分子看见 ref (22)。
注意: 并非所有的分子都在自己的促进者或抗体下被测试为融合蛋白。
表 2: 示例C. 线虫特定于肠道的启动子和表达式时间1.
促进 表达阶段
elt-2 表达在 2 E 细胞阶段开始并持续到成年
vha-6 表达开始于晚期胚胎并持续到成年
ges-1 表达在大约4E 细胞阶段开始并且持续入成人
end-1 表达在1E 细胞阶段以后开始并且下降在以后胚胎发生
1示例从表3中列出的资源中选择。
Table3:要查找的资源C. 线虫肠道特异分子, 标记试剂/菌株和抗体.
1. 线虫遗传学中心 (CGC)42适用于可用试剂和菌株
2. Wormbase43获取有关肠道特异分子、菌株和抗体的信息
3. 情报
关于肠道特异分子20,44 4. Transgeneome 网站45用于平移 GFP 融合构造 5。C. 线虫表达模式46用于转录 GFP 融合结构 6. 国家资源项目 (NBRP)::C. 线虫47有关肠道特定启动子的信息 7. 发育研究杂交瘤库 (DSHB)48用于C. 线虫抗体 8. 二次抗体和染料请参阅参考27,28

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Discussion

本协议描述了如何将标准的功能遗传/rna 干扰和成像 (标记和显微) 方法结合起来, 利用线虫小肠上皮作为体内的视觉和分子解剖模型偏光膜和腔生物。

标签

本协议着重于抗体染色。原位抗体标记是一种高度特定的替代方法, 通过荧光融合蛋白 (在排泄管膜生物的附文中描述)2。虽然抗体染色不允许活体成像, 它可能提供确认的本地化的一种蛋白质的兴趣 (既不标记方法是没有失败)。此外, 关于蛋白质的形态发生和/或亚细胞定位的问题通常可以用固定的动物来评估。免疫是有用的双和多标记, 它可以结合荧光融合蛋白标记, 如果这些可以通过必要的固定和性程序保存。此处概述的协议通常允许这样做 (图 2)。原位通过抗体或化学污渍对固定动物进行标记, 也可以为超显微技术 (如随机光学重建显微镜) 提供优势。免疫荧光检测内源性抗原, 并可以适应, 例如, 以区分特定的后蛋白的修改。它可以产生快速的结果, 如果抗体是可用的, 一旦原位染色技术, 而不是在C. 线虫标本, 在细胞培养-已经建立。

然而, 产生一种新的抗体 (这里没有描述) 是费时的。不幸的是, 商业上可用的线虫主要抗体的选择仍然很小, 而且并不是所有的都能够检测到抗原的原位(见表 1 , 以显示抗体的例子检测肠道抗原原位, 和表 3以增加资源)。大多数抗体产生的脊椎动物抗原不会交叉与他们的C. 线虫同系物。二次抗体的选择必须考虑第一抗体的种类 (在一般免疫荧光协议27,28中讨论)。大的选择是商业上可持续改进荧光染料 (如Alexa-氟染料)。为了优化染色, 染料可以选择, 以配合显微镜用于成像,例如激光共聚焦显微镜, 或者, 如果超分辨率显微镜也计划, 他们的能力, "眨眼"37。直接标记的主要抗体或化学污渍 (如荧光标记笔) 也可用, 特别适用于双重染色。

原位抗体染色在C. 线虫中的难点是胚胎卵壳和幼虫/成体角质层的抗渗性, 它们都需要化学和/或机械的破坏, 以使抗体能够进入组织。虽然复杂的液体抗体染色协议已经开发克服这个问题27,28, 大多数包括胶原酶性, 这往往损害目标组织。相比之下, 这里描述的冻裂方法是一个简单的方法来打开蠕虫的角质层或蛋壳。它直接在玻璃幻灯片上进行, 在那里标本收集 (和其余的染色也执行), 并特别适合的鸡蛋和幼虫, 坚持最好的玻璃幻灯片 (即主要审查的阶段tubulogenesis 研究)。它也不会干扰荧光标记的融合蛋白的保存。该技术需要一些手工灵巧, 因为正确的压力片 (在弹之前) 和避免剪切压力是关键的保存标本 (作为温和处理和移在整个染色过程)。

固定条件可能需要对要染色的结构/抗原进行经验确定和调整 (在27中讨论)。较温和的 (例如formaldehyde-based) 固定技术可以更好地保留抗原性, 尽管这必须与维持组织形态学的需要相平衡, 这对分析形态发生至关重要。较温和的固定条件也有助于在双标记实验中保存荧光融合蛋白。同样, 在洗涤液中, 堵塞剂 (如牛奶或牛血清白蛋白/BSA) 和洗涤剂的数量需要经验调整, 以平衡背景与特定染色。关于免疫荧光技术的一般方面的细节,例如讨论不同染色技术, 设计适当的控制, 和优化这些程序的蠕虫肠道的提示 (例如最小化肠道自发荧光) 可以找到一般和线虫特定的免疫荧光协议, 如参考通篇。

基因功能的干预与 tubulogenesis 表型的评价

该协议强调了特定的 rna 干扰方法, 在评估早期的、基本的和无处不在的功能时是有用的, 因为它们的部分 (而不是完整的) 损失是最丰富的, 正如大多数 tubulogenesis 基因的情况 (我们的全基因组ERM-1::GFP-labeled 肠道的屏幕提示, 这种基因的干扰导致和 #62; 90% 的所有信息 tubulogenesis 表型在这个特定的设置12)。C. 线虫为遗传操作提供的许多优点 (如例如其短的生成时间) 和扰乱基因功能的不同方法 (从函数/表型开始) 和反转 (从基因) 在一般的线虫文献中讨论了遗传方法31,38。市面上可用的全基因组 rna 干扰喂养库也允许人们使用这种反向基因技术作为一种正向遗传筛选工具 (请参阅材料表中的资源)。rna 干扰分析 tubulogenesis 的具体优势包括其能力: 生成一系列的表型等价于突变的位系列 (这通常适用于剂量依赖性的形态发生基因);去除母体 rna (通常参与早期发生的 tubulogenesis);到阶段-特别干预 (有用评价极化膜生物在 postmitotic 幼虫生长期间的影响)。

关于 rna 干扰过程的一般方面的详细信息在裁判中讨论 (26,s = "xref" > 31)。分析致命 tubulogenesis 表型的关键是能够调节 rna 干扰条件, 以增加表现型的频谱。信息 tubulogenesis 表型通常可以产生在野生类型的背景不需要肠道特定的 rna 干扰菌株39。然而, 这种菌株是可用的, 如果这失败, 也可以用来区分细胞自主和自治的效果。报告了不同的方法来调节 rna 干扰的强度,例如滴定 IPTG 浓度的诱导 dsRNA, 这种方法可能产生最可重现的结果30。然而, 在生成不同表型的光谱时, 定量精确滴定可能并不必要。总的来说, 这项分析的成功与其说是依赖于最大程度的 rna 干扰效应, 不如说是在确定产生一个信息性的表型的 rna 干扰条件 (这可能往往是次优的结果 (例如更温和的) rna 干扰条件)。

对于 rna 干扰诱导的 tubulogenesis 表型的可视化评估, 确定最佳的表表评价窗口是很重要的。最好是尽早开始对板块进行评估 (例如, 在标准的干扰条件下将动物采摘到它们的干扰板后的两天), 并对它们进行足够长的时间, 以可能产生晚期效应。例如, 一个恶化的极性缺陷的发展时间过程, 应该包括 3-7 天在典型的被拘捕的幼虫。postmitotic non-dividing 细胞中极化膜生物的分析条件可以进一步改善, 当使用突变体或 rna 干扰动物的增长缓慢 (例如,让-767 (干扰)或变种动物12,图 5)。如果 F2 动物出现的话, 任何时间的课程都必须流产 (可以在实验中去除 L4s, 而不是所有的动物都是幼虫)。每项实验都需要对适当的正和负控制进行相应的评估 (例如细菌 rna 干扰克隆, 它们分别诱导定义的 tubulogenesis 表型和空向量或干扰性 rna 克隆)。评估的另一个要求是足够的巢大小 (至少 50)。如果不满足, 则可以尝试其他 (例如条件) 的干扰条件。最后, 一些特别有趣的 tubulogenesis 表型发生在低显, 因此必须评估足够数量的动物。

显微镜

中放大解剖荧光显微镜和高倍率共焦显微镜, 这里描述的两个标准成像程序, 通常足以表征的基本方面的管或流明表型线虫肠道, 也可用于在前屏幕中直观地显示较大的动物组。解剖荧光显微镜允许:在体内在其板上的动物成像 (然而, 活的动物, 瞬时固定的麻醉剂, 也可以恢复从坐骑后共焦或 DIC 成像);大组动物的筛选;跟踪发展事件 (例如在膜扩张过程中的位移和替换极化标记);跟踪特定的表达模式 (某些模式和不对称性在较低的放大率下更好地区分);选择和挑选适合进一步分析的荧光蠕虫 (例如共聚焦显微镜) 或用于外转基因的维护。高放大率的可视化通过共焦显微镜允许表征的表型在单细胞和亚细胞水平。该协议描述了成像与激光扫描共聚焦显微镜, 提供了最好的 confocality 的替代品, 如旋转圆盘共聚焦显微镜。然而, 自旋盘共聚焦显微镜是动态和时移研究的选择显微镜, 因为它诱导较少的光 (参见裁判 (34,35), 以进一步讨论低放大率显微镜在线虫)。新的和传统的显微技术提供了额外的优势和允许成像在更高的分辨率进入纳米尺度范围 (例如传输电子和超分辨率显微镜; 在37中讨论, 40)。

当在共聚焦显微镜下成像线虫肠道时, 安装和固定是至关重要的。在不同的化学品的固定, 叠氮化钠-虽然有毒-工作最可靠的, 如果扫描立即完成。左旋咪唑虽然没有毒性, 但会产生 hypercontraction, 有时会干扰对形态表型的评价。有些麻醉剂可能会干扰与膜相关的荧光蛋白, 并能产生可能看起来像极性缺陷的工件。线虫是一个厚的标本, 因此, 3D 分析 (剖切) 是必要的, 以利用特定强度的管状肠上皮, 使卓越的可视化顶端交界处和侧膜 (不易可在扁平上皮中使用)。必须调整每张幻灯片的共焦设置, 以获得质量良好的图像, 包括包围、平均、激光功率、增益、针孔和亮度等参数。肠道成像的一个特殊问题是这个器官的内容, 绿色/黄色 autofluorescent 颗粒 (溶相关的细胞器 (LROs)), 可能会干扰解释的结果, 特别是当评估的位移GFP 标记的中和等离子体膜相关的成分。这个问题在这个领域得到了很好的认可, 可以通过不同的方法 (视显微镜) 来解决, 包括 DAPI 排除、频谱指纹和经验扫描仪设置13,41。

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Disclosures

作者声明他们没有竞争的金融利益。

Acknowledgments

我们感谢马里奥de博诺 (分子生物学, 剑桥, 英国), 肯尼思 j. Kemphues (康奈尔大学, 伊萨卡, 美国), 米歇尔 Labouesse (Institut de Biologie 巴黎塞纳河, 大学皮埃尔和居里夫人, 巴黎, 法国),搜索米修 (大学de雷恩 1, 雷恩, 法国) 和 CGC, 由 NIH 研究基础设施项目 (P40 OD010440) 资助, 为菌株和抗体。这项工作得到了资助, NIH GM078653, MGH 是224570和223809至 iii

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody staining
poly-L-lysine Sigma P5899
Methanol Fisher Scientific A452-4
Acetone Fisher Scientific A949SK-4
Tween Fisher Scientific 50-213-612
Permount Fisher Scientific SP15-100
Powdered milk Sigma MT409-1BTL
Primary antibodies
MH27 (mouse) Concentration: 1:20 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank.
MH33 (mouse) Concentration: 1:10 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank.
anti-ICB4 (rabbit) Concentration: 1:5 Resources: A gift from Mario de Bono (Medical Research Council, England)
anti-PAR-3 (rabbit) Concentration: 1:50 Resources: A gift from Kenneth J. Kemphues (Cornell University)
Secondary antibodies
Alexa Floor 568 (anti-rabbit) ABCam AB175471 Concentration: 1:200
Cy5 (anti-mouse) Life technologies A10524 Concentration: 1:200
TRITC (anti-rabbit) Invitrogen T2769 Concentration: 1:200
FITC (anti-mouse) Sigma F9006 Concentration: 1:100
Labeled chemicals
Texas Red-Phalloidin Concentration: 1:100 Resources: Molecular Probes-T7471
Materials
Vacuum Grease Silicone Beckman 335148
Microscope slides Fisher Scientific 4448
Microscope coverslips (22x22-1) Fisher Scientific 12-542-B
C. elegans related see reference29 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates see reference29 for protocols.
Tryptone Acros Organics 611845000
Yeast Extract BD Biosciences 212750
NaCl Sigma S7653
Bacto Agar BD Biosciences 214040
Ampicillin Sigma A0116
Tetracycline Fisher Scientific BP912
M9 Medium see reference29 for protocols.
NaCl Sigma S7653
KH2PO4 Sigma P0662
Na2HPO4 Sigma S7907
MgSO4 Sigma M2773
NGM plates see reference29 for protocols.
NaCl Sigma S7653
Peptone BD Biosciences 211677
Tryptone Acros Organics 611845000
Bacto Agar BD Biosciences 214040
MgSO4 Sigma M2773
CaCl2 Sigma C3881
Cholesterol Sigma C8667
K2HPO4 Sigma P3786
KH2PO4 Sigma P0662
RNAi plates see reference30 for protocols.
NaCl Sigma S7653
Peptone BD Biosciences 211677
Tryptone Acros Organics 611845000
Bacto Agar BD Biosciences 214040
MgSO4 Sigma M2773
CaCl2 Sigma C3881
Cholesterol Sigma C8667
K2HPO4 Sigma P3786
KH2PO4 Sigma P0662
IPTG US Biological I8500
Carbenicillin Fisher Scientific BP2648
NaOH Fisher Scientific SS266-1
Sodium hypochlorite Fisher Scientific 50371500
Bacteria
OP50 bacteria CGC
HT115 bacteria CGC
Genome-wide RNAi libraries Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref 30,49,50) Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref51) Source BioScience
Imaging related
Sodium azide Fisher Scientific BP9221-500
Equipment
dissecting microscope Nikon SMZ-U
dissecting microscope equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions) Olympus SZX12
Laser-scanning confocal microscope Leica Microsystem TCS SL
laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope Nikon C2

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发育生物学 问题 128 Tubulogenesis 上皮极性 膜生物学 发育遗传学 单细胞分析 原位成像
<em>C. 线虫</em>小肠作为细胞间腔形态发生和<em>体内</em>极化膜生物单细胞水平的模型: 抗体染色、rna 干扰功能分析和成像标记
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Zhang, N., Khan, L. A., Membreno,… More

Zhang, N., Khan, L. A., Membreno, E., Jafari, G., Yan, S., Zhang, H., Gobel, V. The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging. J. Vis. Exp. (128), e56100, doi:10.3791/56100 (2017).

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