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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

सी. एलिगेंस निकालनेवाला नहर Intracellular लुमेन Morphogenesis के लिए एक मॉडल के रूप में और Vivo में एक एकल कक्ष में ध्रुवीकरण झिल्ली की उत्पत्ति: लेबलिंग द्वारा GFP-फ्यूजन, RNAi इंटरेक्शन स्क्रीन और इमेजिंग

Published: October 3, 2017 doi: 10.3791/56101
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1,3, 1, 1
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Developmental Biology and Genetics Core, Massachusetts General Hospital for Children, Harvard Medical School, 2College of Life Sciences, Jilin University, 3Faculty of Health Sciences, University of Macau

Summary

C. एलिगेंस निकालनेवाला नहर de नोवो के vivo विश्लेषण में दृश्य के लिए एक अनूठा एकल सेल मॉडल है कि झिल्ली की उत्पत्ति । इस प्रोटोकॉल मानक आनुवंशिक/RNAi और इमेजिंग दृष्टिकोण, कोशिकीय tubulogenesis निर्देशन अणुओं की पहचान और लक्षण वर्णन के लिए अनुकूलनीय का एक संयोजन का वर्णन करता है, और शिखर झिल्ली और लुमेन ।

Abstract

चार ग. एलिगेंस निकालनेवाला नहरों संकीर्ण ट्यूब एक एकल सेल से जानवर की लंबाई के माध्यम से विस्तारित कर रहे हैं, लगभग उतना ही दूर विस्तारित intracellular endotubes के साथ कि निर्माण और एक झिल्ली और उपझिल्ली के साथ लुमेन को स्थिर शिखर चरित्र का cytoskeleton । निकालनेवाला सेल अपनी लंबाई लगभग २,००० बार फैलता है इन नहरों उत्पंन करने के लिए, इस मॉडल को vivo में मूल्यांकन के लिए अद्वितीय बना de नोवो ध्रुवीय झिल्ली की उत्पत्ति, intracellular लुमेन morphogenesis और कोशिकीय tubulogenesis । प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत कैसे मानक लेबलिंग, लाभ और हानि-समारोह आनुवंशिक या आरएनए हस्तक्षेप (RNAi) गठबंधन करने के लिए, और सूक्ष्म दृष्टिकोण नेत्रहीन टुकड़े के लिए इस मॉडल का उपयोग करें और कार्यात्मक एक आणविक स्तर पर इन प्रक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए दिखाता है । एक लेबलिंग दृष्टिकोण का एक उदाहरण के रूप में, प्रोटोकॉल tubulogenesis के लाइव विश्लेषण के लिए फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन के साथ ट्रांसजेनिक जानवरों की पीढ़ी की रूपरेखा । एक आनुवंशिक दृष्टिकोण के एक उदाहरण के रूप में, यह एक दृश्य RNAi-आधारित बातचीत के मुख्य बिंदुओं पर प्रकाश डाला गया एक लाभ के समारोह सिस्टिक नहर phenotype संशोधित करने के लिए डिज़ाइन । विशिष्ट वर्णित तरीके है कैसे: लेबल और फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करके नहरों कल्पना; नहर morphogenesis के आणविक विश्लेषण के लिए एक लक्षित RNAi पुस्तकालय और strategize RNAi स्क्रीनिंग का निर्माण; नेत्रहीन नहर phenotypes के संशोधनों का आकलन; प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा उन्हें स्कोर; फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा उच्च संकल्प पर उपसेलुलर नहर घटकों की विशेषता; और दृश्य मापदंडों को बढ़ाता है । यह दृष्टिकोण जांचकर्ता के लिए उपयोगी है जो कि एलिगेंस निकालनेवाला नहर का लाभ लेने में रुचि रखता है और निस्र्पक जीन intracellular लुमेन और कोशिकीय के phylogenetically संरक्षण प्रक्रियाओं में शामिल की पहचान करने के लिए ट्यूब morphogenesis.

Introduction

सभी आंतरिक अंगों ट्यूब से बना रहे हैं, इस तरह के परिवहन और गैसों, तरल पदार्थ और पोषक तत्वों और चयापचय अपशिष्ट के उत्सर्जन के आदान-प्रदान के रूप में उनके कई विभिंन कार्यों के लिए महत्वपूर्ण है । अलग शिखर और लुमेन झिल्ली के साथ उनके ध्रुवीय चरित्र, इन विशिष्ट कार्यों के लिए अनुकूलित है, और उनके इंडो की उत्पत्ति में दोष-और प्लाज्मा झिल्ली प्रणालियों मानव रोग1,2का लगातार कारण हैं । vasculature और आंतरिक अंगों की नलियों के बहुमत कोशिकीय और फार्म एक लुमेन के रूप में कर रहे हैं; हालांकि, कोशिकीय ट्यूबों, जो लुमेन intracellularly फार्म, उदाहरण के लिए कर सकते हैं, के रूप में ज्यादा के रूप में 30-मानव केशिका बिस्तर के 50% का प्रतिनिधित्व2। बहु और कोशिकीय ट्यूबों के ध्रुवीकरण झिल्ली की संरचना में समान हैं, हालांकि उनके microdomains ट्यूब के विशिष्ट समारोह के आधार पर अलग हो सकता है (जैसे, निकालनेवाला नहर canaliculi बनाम आंत्र microvilli में Caenorhabditis एलिगेंस; C. एलिगेंस आंत्र tubulogenesis)3पर कागज के साथ देखें । ध्रुवीय झिल्ली के सिद्धांतों के उत्पत्ति और tubulogenesis metazoans के बीच संरक्षण कर रहे हैं, और एक समान आणविक मशीनरी उंहें1,2,4निर्देशन ।

इस C. एलिगेंस निकालनेवाला सिस्टम में पांच कक्ष होते हैं: निकालनेवाला सेल (ईसी), डक्ट सेल (DC), ताकना सेल (पीसी) और दो थाइराइड कोशिकाएं । चुनाव आयोग, डीसी या पीसी के पृथक शरीर गुहा में द्रव संचय का कारण बनता है और जानवरों के एक प्रारंभिक लार्वा चरण5में मर जाते हैं । साज़िश, इन तीन कोशिकीय ट्यूबों तीन अलग तरीकों से अपने लुमेन बनाने के लिए: द्वारा सेल खोखले (ईसी); सेल सेलुलर जंक्शन गठन (पीसी) के साथ युग्मित लपेटकर; और सेल रैपिंग (डीसी) के साथ युग्मित द्वारा; लुमेन morphogenesis के विभिंन तंत्र है कि सभी phylogenetically6,7संरक्षित कर रहे हैं । चुनाव आयोग, पीछे ग्रसनी बल्ब के बाएं पार्श्व पक्ष में स्थित है, बाहर दो पार्श्व एक्सटेंशन है जिसमें से चार नहरों शाखा से बाहर भेजता है के लिए पूर्वकाल और पीछे का विस्तार (दोनों सही और बाईं ओर) है कीड़ा नाक और पूंछ की नोक , क्रमशः (चित्रा १)५,६,८. चुनाव आयोग लगभग 1 µm से 2 x १,००० µm, यह जानवर में सबसे बड़ा सेल बनाने से फैली हुई है । एक सेलुलर स्तर पर, निकालनेवाला नहर एक सरल ट्यूब, pseudocoelom की ओर निर्देशित एक बेसल झिल्ली से उत्पन्न होता है, और एक लुमेन झिल्ली (endotube) द्वारा सुरंग । नहर लुमेन झिल्ली अपने ही सेलुलर जंक्शन पर डक्ट लुमेन झिल्ली को जोड़ता है; नहरों में उनकी लंबाई (चित्रा 1) के साथ अंयथा जंक्शन रहे हैं । निकालनेवाला नहर लुमेन झिल्ली और उसके उपझिल्ली cytoskeleton शिखर हैं, उनके आणविक संरचना है कि शिखर झिल्ली और cytoskeleton ट्यूबों की उपझिल्ली कोशिकीय, जैसे आंत के रूप में की संरचना के द्वारा परिभाषित, और अंय (उदा, फ़्लैट) epithelia । Cytoplasmic organelles सहित endosomal vesicular और अन्य (उदा., Golgi) endomembranes नहर की लम्बाई के साथ वितरित किए जाते हैं. इसके अलावा, एकाधिक canalicular बुलबुले-या तो लुमेन झिल्ली से जुड़ा है, और/या परस्पर, या पृथक-नहर के माध्यम से लड़ी पिरोया है कोशिका7,8,9,10 . इस गतिशील प्लाज्मा-झिल्ली/canalicular कनेक्शन आगे नहर की झिल्ली प्रणाली का विस्तार और दोनों लुमेन morphogenesis और osmoregulation10करने के लिए योगदान देता है । निकालनेवाला नहर इस प्रकार इंडो-और प्लाज्मा झिल्ली के लगभग पूरी तरह से होते हैं, ध्रुवीय झिल्ली के विश्लेषण के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल उपलब्ध कराने के उत्पत्ति और इंडो के विनियमन प्लाज्मा झिल्ली इंटरफेस करने के लिए । नहर morphogenesis के दौरान शिखर झिल्ली के नाटकीय विस्तार-इस एकल सेल प्रणाली लुमेन विस्तार के साथ संपाती में-भी वास्तु को स्थिर करने के लिए और एक intracellular लुमेन झिल्ली केंद्र की आवश्यकता से उत्पंन होने वाली समस्याओं का विश्लेषण करने की अनुमति देता है . इस प्रोटोकॉल नहर है ट्यूब और लुमेन संरचनात्मक morphogenesis और intracellular झिल्ली गतिशीलता के विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित करने के बजाय इस प्रक्रिया के लिए आवश्यक संकेतों पर है कि प्रत्यक्ष सेल आंदोलनों कि चुनाव आयोग की स्थिति में उत्पंन निकालनेवाला प्रणाली और अंय सेलुलर तत्वों के लिए अपनी जटिल कनेक्शन का निर्माण (6में समीक्षित) ।

C. एलिगेंस एकल सेल नहर प्रणाली का एक और लाभ के विश्लेषण के लिए ध्रुवीकरण झिल्ली और intracellular लुमेन के लिए अपने अलग करने की क्षमता है, विकास के समय के माध्यम से, अपनी झिल्ली के विभिंन घटकों की पीढ़ी और जंक्शन । चुनाव आयोग ventral बंद करने के समय पैदा होता है और ventro-बाद में ग्रसनी के मध्य embryogenesis5,6,8, के दौरान जो समय पार्श्व नहर विस्तार और शाखाओं में बंटी के दौरान बसा हुआ है । यह देर से embryogenesis, एक प्रक्रिया है कि L1-लार्वा चरण (चित्रा 1) में जारी है के दौरान पूर्वकाल पीछे नहर विस्तार के बाद है. एक नए रची लार्वा में, पीछे नहर टिप कीड़ा के बीच लगभग पहुंचता है, पूरी तरह से L1 चरण के अंत में पूंछ के लिए विस्तार, जिसके बाद समय नहर कीड़ा के साथ8बढ़ाव । एक गति से अधिक है कि पशुओं के विकास के इस प्रकार के पहले लार्वा चरण में समाप्त होता है पर सक्रिय नहर विकास, तथापि, आगे की वृद्धि अतिरिक्त लार्वा चरणों (L2-4) के दौरान पूरे जानवर के विकास के साथ समानांतर में होता है । यह सेटिंग de नोवो के भिंन चरणों का विश्लेषण करने का अवसर प्रदान करती है, जो ध्रुवीय कोशिका विभाजन या माइग्रेशन से स्वतंत्र है । इसके अलावा, यह जंक्शनों के विधानसभा से इस प्रक्रिया की जुदाई परमिट (जो लुमेन दीक्षा से पहले भ्रूण में होते हैं); उनकी झिल्ली ध्रुवीकरण में सटीक आवश्यकता अभी भी ध्रुवीय क्षेत्र में एक खुला सवाल है । अंत में, यह विशिष्ट बेसल झिल्ली विस्तार से शिखर अलग, उत्तरार्द्ध निकालनेवाला नहरों में पूर्व पूर्ववर्ती प्रक्रिया10। C. एलिगेंस निकालनेवाला नहर मॉडल इसलिए एक विशेष रूप से जानकारीपूर्ण आंत्र मॉडल है जो ध्रुवीय झिल्ली के विश्लेषण के लिए इन फायदों की एक संख्या के शेयरों के लिए पूरक है, लेकिन यह एक कोशिकीय सेटिंग में निष्पादित (देखें आंतों tubulogenesis पर साथ कागज3) ।

हालांकि जंगली प्रकार नहरों इस छोटे कीड़ा में ultrathin नलिकाओं हैं, उनके लुमेन vi जा सकता हैइस पारदर्शी जानवर में Nomarski प्रकाशिकी द्वारा सीधे sualized । वास्तव में, उत्परिवर्ती सिस्टिक नहर morphologies कम आवर्धन विदारक सूक्ष्म, जो आगे आनुवंशिक स्क्रीन में महान प्रभाव के लिए इस्तेमाल किया गया है tubulogenesis में शामिल जीन की पहचान का उपयोग कर unलेबल्ड पशुओं में विशेषता हो सकती है11। नहरों और उनके ध्रुवीकरण झिल्ली, cytoskeletal घटकों, विभिन्न intracellular organelles और अन्य उपसेलुलर संरचनाओं के भेद की आकृति विज्ञान के बेहतर दृश्य, तथापि, लेबलिंग और उच्च शक्ति फ्लोरोसेंट की आवश्यकता है विदारक और फोकल माइक्रोस्कोपी । हालांकि ' नहरों ठीक संरचना लेबलिंग और माइक्रोस्कोपी के लिए कठिनाइयों के एक नंबर बन गया, झिल्ली और सेलुलर घटकों विशिष्ट प्रत्येक डिब्बे के लिए अद्वितीय अणुओं के माध्यम से प्रतिष्ठित किया जा सकता है, और जानवरों को सुरक्षित रूप से माइक्रोस्कोपी के लिए घुड़सवार किया जा सकता है अगर कलाकृतियों को शुरू करने से बचने के लिए कुछ सावधानियां बरती गई हैं ( प्रोटोकॉल और चर्चादेखें) । लेबलिंग निश्चित नमूनों में immunohistochemistry द्वारा किया जा सकता है, या अपने स्वयं के नियंत्रण के तहत फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त ट्रांसजेनिक कीड़े पैदा करके या निकालनेवाला नहर- vivo इमेजिंग में के लिए विशिष्ट प्रवर्तक. इस प्रोटोकॉल उत्तरार्द्ध लेबलिंग तकनीक का वर्णन करता है (एंटीबॉडी धुंधला के लिए आंतों tubulogenesis पर साथ कागज देखें3) ।

vivo नुकसान में गठबंधन करने की क्षमता-या विकास के दौरान एकल कोशिका स्तर पर vivo इमेजिंग विश्लेषण में लाभ के साथ समारोह के अध्ययन सी. एलिगेंस निकालनेवाला नहर आणविक के लिए एक विशेष रूप से मजबूत मॉडल बनाता है और कोशिकीय tubulogenesis के सेलुलर विश्लेषण । आगे या रिवर्स आनुवंशिक स्क्रीन एक जंगली प्रकार या लेबल ट्रांसजेनिक पशु नहर morphogenesis phenotypes (उदाहरण के लिए, अल्सर) और उनके अंतर्निहित जीन दोषों की पहचान के साथ शुरू किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, ऐसी स्क्रीन एक उत्परिवर्ती phenotype (जैसे, एक सिस्टिक नहर के साथ शुरू कर सकते हैं) और दमन या इस phenotype के बढ़ाने की पहचान करने के लिए जीन है कि कार्यात्मक रूप से उत्परिवर्ती phenotype कारण जीन के साथ बातचीत की पहचान । आनुवंशिक केकारण उत्परिवर्ती phenotype नुकसान (उदा, जीन विलोपन के माध्यम से ) या एक लाभ (उदाहरण के लिए, एक उत्परिवर्तन को सक्रिय करने के माध्यम से या अतिरिक्त जीन प्रतियां की शुरूआत के माध्यम से) की जांच की समारोह प्रेरित कर सकते हैं । आगे mutagenesis या व्यवस्थित RNAi स्क्रीन जीन समारोह पर धारणाओं के बिना कर रहे है और ब्याज के समारोह में शामिल जीन की निष्पक्ष पहचान की अनुमति । जीनोम की उपलब्धता को देखते हुए व्यापक RNAi खिला पुस्तकालयों, लगभग हर जीन आसानी से कर सकते है नीचे दस्तक RNAi द्वारा सी. एलिगेंसमें, ऐसी है कि ब्याज की किसी भी जीन या जीन के किसी भी समूह (उदाहरणके लिए, लक्षित स्क्रीन में) भी तेजी से जांच की जा सकती है एक रिवर्स आनुवंशिकी दृष्टिकोण में उनके प्रभाव के लिए । दृष्टिकोण का एक संभव संयोजन प्रदर्शित करने के लिए, हम यहां एक लक्षित RNAi बातचीत स्क्रीन का वर्णन, एक लाभ के समारोह सिस्टिक निकालनेवाला नहर उत्परिवर्ती, cytoplasmic नहर ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के साथ लेबल के साथ शुरू । उत्परिवर्ती phenotype के द्वारा उत्पंन किया गया था एर्म-1, एक उच्च संरक्षित सी. एलिगेंस ortholog झिल्ली की-actin linker परिवार Ezrin-Radixin-Moesin (एर्म), जो लुमेन morphogenesis और झिल्ली में फंसाया गया है कई प्रजातियों में संगठन12. C. एलिगेंस एर्म-1 स्थानीयकरण आंतरिक अंगों, जैसे निकालनेवाला नहर और आंत के लुमेन झिल्ली के लिए, और दोनों में लुमेन गठन के लिए आवश्यक है13. एर्म-1 अत्यधिक actin और बुलबुले नहर लुमेन के लिए भर्ती, लुमेन में प्रवाह में वृद्धि और एक छोटी सिस्टिक नहर पैदा करने और गाढ़ा actin कोट के साथ एक समेटना लुमेन झिल्ली9... प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे निकालनेवाला के साथ ट्रांसजेनिक उपभेदों उत्पंन करने के लिए-नहर-व्यक्त लेबल फ्यूजन प्रोटीन (या अंय प्रोटीन); इस तरह के उपभेदों के साथ शुरू लक्षित RNAi स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए कैसे, एक नहर phenotype के संशोधक की पहचान करने के लिए; और कैसे नेत्रहीन प्रतिदीप्ति विदारक और फोकल माइक्रोस्कोपी से ऐसी स्क्रीन के परिणामों का विश्लेषण करने के लिए, जानकारीपूर्ण tubulogenesis phenotypes यों तो सरल तरीके भी शामिल है । वैकल्पिक लेबलिंग तकनीक और RNAi के विवरण, अक्सर घातक tubulogenesis जीन को समायोजित, आंतों tubulogenesis3पर साथ कागज में पाया जा सकता है । नहर tubulogenesis पर अन्य प्रश्नों की जांच के लिए विभिन्न संयोजनों में सभी तरीकों का प्रयोग किया जा सकता है ।

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. C. एलिगेंस निकालनेवाला नहर को फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन द्वारा लेबल करना < सुप क्लास = "xref" > 14

< p class = "jove_content" > नोट: साथ आंतों tubulogenesis पर पेपर देखें < सुप क्लास = "xref" > 3 निकालनेवाला नहर के लिए अनुकूलनीय प्रक्रियाओं सीटू एंटीबॉडी में द्वारा लेबलिंग के लिए । देखें तालिका 1 ग. एलिगेंस निकालनेवाला नहर इंडो visualizing के लिए उपयोगी साबित अणुओं के उदाहरण के लिए-और प्लाज्मा झिल्ली, तालिका 2 निकालनेवाला नहर के लिए अभिव्यक्ति ड्राइविंग के प्रवर्तकों के उदाहरण के लिए, और तालिका 3 विभिंन fluorophores के चयन पर चर्चा करते हुए संदर्भ सहित मार्करों और प्रमोटरों के अधिक व्यापक संग्रह के लिए संसाधनों के लिए ।

  1. ऊतक विशिष्ट फ्लोरोसेंट मार्कर plasmids के प्रतिबंध द्वारा निर्माण एंजाइम आधारित क्लोनिंग < सुप वर्ग = "xref" > १५
    नोट: देखें के निर्माण की वैकल्पिक तकनीकों के लिए चर्चा फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन ।
    1. प्रवर्तक के अनुक्रम की पहचान (transcriptional फ्यूजन के लिए) या उसके प्रवर्तक के साथ ब्याज की संपूर्ण जीन की (शोधों के लिए फ्यूजन) में WormBase < सुप वर्ग = "xref" > ४४ .
      नोट: प्रवर्तकों के लिए, लगभग 1 & #8211; 3 kilobase (kb) अधिकांश C. एलिगेंस जीन के लिए पर्याप्त है । शोधों से फ्यूजन प्रोटीन का निर्माण भी एक निकालनेवाला नहर विशिष्ट प्रवर्तक के तहत ब्याज का एक जीन रखकर किया जा सकता है (देखें टेबल 2 ).
    2. डिजाइन आगे और प्रमोटर के प्रवर्धन के लिए रिवर्स प्राइमरों (transcriptional संलयन के लिए) और/या प्रमोटर के साथ एक पूर्ण जीन (अनुवाद संलयन के लिए) । 5 & #8217; और 3 & #8217 पर पाबन्दी एंजाइम links जोड़ें, प्राइमरों के छोर.
      नोट: वेक्टर में मौजूद प्रतिबंध एंजाइम चुनें प्लाज्मिड ( eg , पीपीडी 95.79) < सुप class = "xref" > 16 . शोधों के लिए फ्यूजन, 3 & #8217; linker इसलिए डिज़ाइन किया जाना चाहिए कि प्रतिबंध एंजाइम पाचन और वेक्टर के साथ बंधाव के बाद, insert codon फ्रेम fluorophore, जैसे , GFP के codons के साथ सतत हो जाएगा. एक ठेठ प्रतिबंध एंजाइम लिंकर्स के लिए 1 या 2 अधिक कुर्सियां जोड़ने की आवश्यकता हो सकती है < सुप क्लास = "xref" > 14 ; ध्यान रखना एक स्टॉप codon बनाने के लिए नहीं.
    3. प्रदर्शन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) प्रवर्तक या पूरी लंबाई को बढ़ाना जीन का उपयोग कर लाइव कीड़े या जंगली प्रकार जीनोमिक डीएनए या सीडीएनए के रूप में टेंपलेट < सुप वर्ग = "xref" > 15 .
      नोट: जब टेंपलेट के रूप में कीड़े का उपयोग, पहले lysis बफर में लाइसे कीड़े (पीसीआर बफर प्लस Proteinase कश्मीर) < सुप वर्ग = "xref" > १७ . मिश्रित स्टेज कीड़े टेंपलेट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । भूखे कीड़े जीवाणु डीएनए के साथ संक्रमण से बचने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    4. प्रदर्शन agarose (1%) पीसीआर उत्पादों पर जेल ट्रो प्रवर्धित उत्पाद का सही आकार पहचानने के लिए ।
      नोट: यदि बैंड का आकार सही है, अगले कदम के साथ आगे बढ़ें । एकाधिक बैंड उत्पन्न कर रहे हैं, तो एकल बैंड का उत्पादन करने के लिए प्रवर्धन शर्तों में सुधार. यदि यह काम नहीं करता है, सही बैंड जेल से कट और डीएनए मानक तरीकों से शुद्ध करें < सुप क्लास = "xref" > 15 और उसके बाद अगले स्टेप के साथ आगे बढ़ें ।
    5. पीसीआर उत्पाद और वेक्टर प्लाज्मिड है कि मानक तरीकों से अलग ट्यूबों में fluorophore ( जैसे , पीपीडी 95.79) शामिल है पर प्रतिबंध डाइजेस्ट प्रदर्शन < सुप वर्ग = "xref" > १५ .
    6. को जेल ट्रो द्वारा पच DNAs को अलग कर दीजिये और पीसीआर प्रोडक्ट और वेक्टर डीएनए बैंड को अलग नलियों में elute ।
    7. मानक तरीकों से जेल स्लाइसें से DNAs शुद्ध < सुप वर्ग = "xref" > १५ . spectrophotometer.
      8. द्वारा डीएनए एकाग्रता को मापने
    8. Ligate मानक तरीकों से पीसीआर उत्पाद और वेक्टर डीएनए और मानक तरीकों द्वारा सक्षम कोशिकाओं में संयोजक DNAs को बदलने < सुप वर्ग = "xref" > 15 .
    9. फ़ैल 10 & #956; l, ५० & #956; l र १०० & #956; l तीन तास Luria शोरबा (LB) प्लेट्स पर रूपांतरित कोशिकाओं का पूरक ५० & #956; g/mL एम्पीसिलीन.
      नोट: परिवर्तन क्षमता की एक स्पेक्ट्रम के लिए अलग प्लेटों पर कोशिकाओं की विभिन्न मात्रा में फैल गया. उदाहरण के लिए, चढ़ाना बहुत घनी कालोनियों के अलगाव की अनुमति नहीं अगर परिवर्तन कुशल है हो सकता है ।
    10. पर प्लेटें ३७ & #176; ग रात भर । अगली सुबह, बाहर मशीन से प्लेटें ले लो ।
      नोट: यदि कालोनियों बहुत छोटे हैं, कई और अधिक घंटे के लिए मशीन ।
    11. मानक तरीकों से एकल कालोनियों से प्लाज्मिड DNAs तैयार करें < सुप class = "xref" > 15 . मिश्रण टेम्पलेट डीएनए और प्राइमरों और sequencing के लिए बाहर भेजने (आम तौर पर एक कोर सेवा केंद्र में प्रदर्शन किया).
    12. अनुक्रम पढ़ें और फ्यूजन का निर्माण की अखंडता को सत्यापित करें.
      नोट: महत्वपूर्ण: डाला जीन और अनुवाद संलयन के लिए फ्लोरोसेंट मार्कर जीन के बीच सही codon फ्रेम की पुष्टि करें । आदर्श रूप में, पूरे जीन अनुक्रम की पुष्टि करने के लिए कि कोई उत्परिवर्तन पीसीआर और बंधाव प्रक्रियाओं के दौरान पेश किया गया था ।
    13. उत्पन्न अधिक प्लाज्मिड डीएनए (चरण 1.1.11 का उपयोग करते हुए) चरण १.२ के लिए इंजेक्शन के लिए.
  2. पीढ़ी के ट्रांसजेनिक पशुओं के microinjection के लिए डीएनए के द्वारा germline परिवर्तन < सुप वर्ग = "xref" > १८
    नोट: transgenes शुरू करने के लिए वैकल्पिक तकनीकों के लिए चर्चा देखें । उल्लिखित प्रक्रियाओं ट्रांसजेनिक जानवरों है कि एक प्रतिदीप्ति फ्यूजन प्रोटीन या ब्याज की किसी भी अन्य प्रोटीन ले उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, एक exogenous प्रोटीन नव शुरू किया जा सकता है ( जैसे , एक heterologous ortholog) या एक अंतर्जात प्रोटीन फिर से शुरू किया जा सकता है (जैसे, बचाव के लिए अपनी इसी germline उत्परिवर्ती में) या एक phenotype उत्पन्न करने के लिए व्यक्त (उदा., इंजेक्शन एर्म-1 के नीचे वर्णित RNAi बातचीत स्क्रीन द्वारा संशोधन के लिए लक्ष्य के रूप में कार्य करता है कि व्यक्त सिस्टिक नहर phenotype उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था).
    1. मिश्रण निर्माण डीएनए (1 & #8211; ५० एनजी/& #956; l) मार्कर प्लाज्मिड डीएनए के साथ (सामान्यतया १०० एनजी/& #956; l), उदाहरण के लिए प्रमुख मार्कर rol-6 (su1006) (मार्कर विकल्पों के लिए 1.2.3 देखें).
      नोट: क्रिटिकल: इंजेक्शन डीएनए के एकाग्रता artefactual phenotypes की शुरूआत से बचने के लिए निर्धारित empirically होना चाहिए (अल्सर, विस्तार दोष, घातकता) जब निकालनेवाला नहरों में जीन व्यक्त कर रहे हैं कि विशेष रूप से transgenes की अभिव्यक्ति के प्रति संवेदनशील । उदाहरण के लिए, एक कर सकते हैं, 1 एनजी की सांद्रता पर plasmids के कई मिश्रण बनाने के लिए/& #956; l, 10 एनजी/& #956; l, ५० एनजी/& #956; l, और १०० एनजी/& #956; l with १०० एनजी/& #956; l rol-6 (su1006) के साथ एक व्यवहार्य तनाव की पीढ़ी के लिए सांद्रता की एक सीमा का परीक्षण करने के लिए वांछित अभिव्यक्ति या phenotype (उच्च सांद्रता नहर morphogenesis के लिए गैर विशेष रूप से विषाक्त होने की संभावना है और घातक हो सकता है).
    2. एक ०.२२ के माध्यम से डीएनए मिश्रण फिल्टर-& #956; एम (माइक्रोमीटर) ताकना आकार स्पिन-एक्स केंद्रापसारक ट्यूब फिल्टर.
      नोट: microinjection सुई ब्लॉक कर सकते हैं कि धूल से बचने के लिए खुला ट्यूब के ढक्कन मत छोड़ो.
    3. Microinject संयोजक plasmids gonad परिवर्तन के लिए मानक तरीकों द्वारा जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती कीड़े के germline में (संदर्भ < सुप वर्ग = "xref" > 18 प्रक्रिया विवरण के लिए).
      नोट: मानक मार्कर plasmids, उदाहरण के लिए कर रहे हैं: rol-6 (su1006), dpy-20, unc-११९, के ्ह्-1 . rol जैसे प्रमुख transgenes-6 (su1006) जंगली प्रकार के कीड़े में पेश कर रहे हैं, जबकि बचाव transgenes उनके संबंधित म्यूटेंट में पेश कर रहे हैं । मार्कर plasmids ट्रांसजेनिक लाइनों के आसान रखरखाव के लिए सह इंजेक्शन के बाद से extrachromosomal transgenes बेतरतीब ढंग से सेल डिवीजन के दौरान खो रहे हैं (देखें 1.2.8). जब fluorophore संलयन के लिए एंकोडिंग जीन इंजेक्शन, एक भी fluorophore, GFP, खुद मार्कर के रूप में उपयोग कर सकते हैं । rol-6 अपने चारों ओर रोल करने के लिए कीड़े लाती है जो अक्सर morphogenesis phenotypes के मूल्यांकन के लिए लाभप्रद है ।
    4. हस्तांतरण ई कोलाई वरीयता प्राप्त निमेटोड विकास माध्यम (NGM) प्लेटों पर कीड़े इंजेक्शन ( जैसे , 5 कीड़े/(देखें संदर्भ < सुप वर्ग = "xref" > 19 फॉर स्टैंडर्ड ग. एलिगेंस कल्चर और मेंटेनेंस प्रक्रियाओं और सामग्री ).
    5. प्लेटें और संतति को विकसित करने दें 20 & #176; C about 3 d.
      6. के लिए
    6. Rol (रोलिंग) कीड़े (या किसी भी अंय विशिष्ट इंजेक्शन मार्कर, जैसे , GFP) के लिए विदारक माइक्रोस्कोप के तहत F1 संतति की जांच करें और रोलर्स टी उठाओहे वैयक्तिक प्लेट्स.
    7. F2 जानवरों रोलिंग के साथ प्लेट का चयन करें और एक विदारक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत प्रतिदीप्ति की उपस्थिति की पुष्टि (आमतौर पर सभी रोलर जानवर सकारात्मक GFP हैं).
      नोट: F2 रोलर्स एक ट्रांसजेनिक लाइन के सफल पीढ़ी संकेत मिलता है । व्यक्तिगत लाइनें अलग हो सकता है, जैसे , transgene संचरण दर के संबंध में । इसलिए यह कई लाइनों को बनाए रखने और स्टोर करने के लिए उपयोगी है ।
    8. मार्कर पॉजिटिव जानवरों के लिए नई प्लेटों को समृद्ध करके ट्रांसजेनिक लाइनों को बनाए रखने.
      नोट: इंजेक्शन डीएनए germline में एक extrachromosomal सरणी के रूप में शामिल किया गया है । extrachromosomal arrays के लिए पारेषण दर चर रहे हैं, लेकिन आम तौर पर लगभग ~ ५०% । तनाव को खोना नहीं है, इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि मैन्युअल रूप से प्रमुख मार्करों के साथ लाइनों को समृद्ध ( जैसे , रेखाएं नकारात्मक चयन द्वारा सुरक्षित नहीं).
    9. लंबी अवधि के भंडारण के लिए मानक ठंड तकनीक द्वारा ट्रांसजेनिक लाइनों फ्रीज पर-८० & #176; ग < सुप वर्ग = "xref" > १९ .
      नोट: extrachromosomal arrays पर Transgenes भी germline में यूवी विकिरण द्वारा समरूप लाइनों उपज के लिए एक अतिरिक्त कदम में एकीकृत किया जा सकता < सुप वर्ग = "xref" > १८ . उदाहरण के लिए, एर्म-1 यूवी विकिरण द्वारा germline में एकीकृत किया गया था एर्म प्राप्त करने के लिए-1 [+ +] तनाव fgIs2 [एर्म-1p:: एर्म-1; rol-6p:: rol-6 (su1006)] जहां हर जानवर transgene, RNAi-आधारित में इसके उपयोग के लिए एक आवश्यकता वहन करती है संपर्क स्क्रीन नीचे वर्णित है । इस तनाव के अलावा एक vha-1p युक्त एक तनाव में पार के माध्यम से cytoplasmic निकालनेवाला नहर GFP द्वारा लेबल था:: GFP transgene (ऊपर उल्लिखित के रूप में एक ही प्रक्रियाओं के द्वारा उत्पंन; संदर्भ देखें < सुप वर्ग = "xref" > 20 फॉर बेसिक जेनेटिक प्रक्रियाओं जैसे काटता है) और एर्म-1 [+ +] के रूप में संदर्भित किया जाता है; vha-1p :: GFP तनाव हेर्नु.
< p class = "jove_title" > 2. एक लक्षित RNAi पुस्तकालय और एक RNAi बातचीत स्क्रीन के डिजाइन का निर्माण एक नहर को संशोधित करने के लिए Phenotype

< p class = "jove_content" > नोट: एक लक्षित RNAi-आधारित आनुवंशिक संपर्क स्क्रीन वर्णन किया गया है कि एक अधिक स्पष्ट सिस्टिक नहर Phenotype का उपयोग करता है निकालनेवाला नहर morphogenesis जीन के लिए खोज । एर्म-1 [+ +] तनाव (देखें चरण 1.2.9) उदाहरण के रूप में कार्य करता है < सुप वर्ग = "xref" > ९ . यह दृष्टिकोण निकालनेवाला नहर लुमेन morphogenesis के आनुवंशिक विश्लेषण के लिए कई संभव दृष्टिकोण में से केवल एक प्रस्तुत करता है (अन्य आनुवंशिक दृष्टिकोण के लिए परिचय और चर्चा देखें). आंतों tubulogenesis पर साथ कागज देखें < सुप class = "xref" > 3 और सन्दर्भ < सुप class = "xref" > 17 , < सुप class = "xref" > 21 , < सुप class = "xref" > 22 पर बैकग्राउंड के लिए RNAi, RNAi के वारे प्रक्रियाओं, RNAi शक्ति का मॉडुलन (अक्सर घातक tubulogenesis जीन के लिए समायोजित) और RNAi से जुड़े तकनीकी समस्याओं की चर्चा. संदर्भ < सुप वर्ग देखें = "xref" > 19 के लिए मानक वर्मी कल्चर और रखरखाव और तालिका सामग्री .

  1. खोज के लिए एर्म-1 (या अंय ब्याज की जीन) डेटाबेस में अणुओं और प्रकाशित लेख बातचीत ।
    नोट: संभावित एर्म-1 इंटरैक्टकर्ता उन सभी अणुओं को शामिल करेगा जो प्रयोगात्मक रूप से कार्य करने के लिए दिखाए गए थे, आनुवंशिक रूप से, या शारीरिक रूप से किसी भी प्रजाति में एर्म प्रोटीन के साथ इंटरैक्ट करते हैं और/या silico     , उच्च प्रवाह में किसी भी द्वारा ऐसा करने की भविष्यवाणी की गई थी या सिस्टंस जीवविज्ञान दृष्टिकोण (देखें तालिका 3 डेटाबेस और संसाधनों के उदाहरण के लिए) ।
  2. सभी जीन की एक सूची उत्पंन और सी एलिगेंस homologs जहां आवश्यक है ।
    नोट: जीन वर्गों के लिए पहचान की जीन की सूची के विस्तार पर विचार करें, जो खाते में ब्याज की जीन के समारोह में ले जाता है और बातचीत की पहचान के लिए नेट चौड़ी ( जैसे , झिल्ली के लिए-actin linker एर्म-1, सभी actins का चयन करें और actin से संबंधित अणु).
  3. सभी जीनों के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जीनोम-वाइड बैक्टीरियल RNAi पुस्तकालयों में इसी RNAi बैक्टीरियल खिला क्लोनों की पहचान ( जैसे , Ahringer जीनोमिक ग. एलिगेंस RNAi खिला पुस्तकालय < सुप वर्ग = "xref" > २१ ; Table of सामग्री )
  4. सभी जीन और उनके इसी RNAi प्लेट और अच्छी तरह से संख्या के लिए एक स्प्रेडशीट उत्पंन करते हैं ।
  5. उठाओ और लकीर ~ ५० LB/एम्पीसिलीन/टेट्रासाइक्लिन प्लेटों पर RNAi क्लोनों (एंटीबायोटिक की पसंद पुस्तकालय निर्माण द्वारा निर्धारित किया जाता है) प्रति दिन और लक्षित RNAi पुस्तकालय उत्पंन होता है जब तक जारी है ।
    नोट: पुस्तकालय आकार और अनुमानित कार्यप्रवाह के आधार पर, एक पूर्ण पुस्तकालय उत्पादन छोड़ और बैच विश्लेषण के साथ सीधे आगे बढ़ना । प्लेटें पर संग्रहित किया जा सकता है 4 & #176; सी, के लिए अब से लगभग 2 सप्ताह (यदि आवश्यक हो, फिर से नई प्लेटों पर लकीर उस के बाद) । इसके विपरीत, एक में बड़ा जमे हुए पुस्तकालयों उत्पंन कर सकते है दोहराने ९६-अच्छी तरह से या ३८४-well स्वरूपों में लंबी अवधि के भंडारण के लिए-८० & #176; C.
  6. पर प्लेटें ३७ & #176; ग रात भर । अगली सुबह, 4 & #176 पर मशीन और स्टोर से प्लेटें निकालें; C.
    7. एक बाँझ दंर्तखोदनी द्वारा एक थाली से
  7. उठाओ RNAi बैक्टीरिया, मिश्रण बैक्टीरिया के साथ ६०० & #956; l LB/एम्पीसिलीन (५० एनजी/& #956; एल) शोरबा में १.५ मिलीलीटर microtube, में ट्यूबों मशीन ३७ & #176; C, शेक फॉर 6 h.
    नोट: microtube के पक्ष के साथ उठाओ (दंर्तखोदनी या micropipette टिप) रगड़ द्वारा शोरबा में RNAi बैक्टीरिया लगाना.
  8. बीज ७० & #956; L एक अच्छी तरह से 6 की RNAi प्लेटों में संस्कृतिपूर्ण बैक्टीरिया डुप्लिकेट या तपसिल सेट में । RNAi प्लेट्स को 22 & #176; ग रात भर.
    नोट: RNAi प्लेट्स मानक प्रक्रियाओं द्वारा उत्पन्न होते हैं ( सामग्री की तालिका और सन्दर्भ < सुप class = "xref" > 3 , < सुप class = "xref" > 17 , < सुप class = "xref" > 21 ) और यहां एक 6-well ऊतक में इस्तेमाल किया एक उच्च प्रवाह दृष्टिकोण है कि अभी भी प्लेटों पर रहते पशुओं में नहर morphogenesis के सूक्ष्म मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है के लिए संस्कृति प्लेट प्रारूप ।
  9. अगली सुबह, उठाओ 3 L4 स्टेज एर्म-1 [+ +]; vha-1p :: GFP प्लेटों के प्रत्येक कुआं पर RNAi कीड़े ।
    1. OP50 बैक्टीरिया के साथ संक्रमण से बचने के लिए (संदर्भ < सुप वर्ग देखें = "xref" > 19 ) कि RNAi पहली बीज बैक्टीरिया के बिना एक NGM प्लेट पर कीड़े और दो जानवरों के बारे में 10 मिनट के लिए क्रॉल करने के लिए हस्तक्षेप. केवल गैर भूखे स्वस्थ पशुओं का उपयोग करें ।
  10. मशीन पर प्लेटें 22 & #176; ग के लिए 3 घ पशुओं को संतति उत्पन्न करने की अनुमति देना.
  11. की जांच नहर phenotypes विदारक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत F1 संतान में.
< p class = "jove_title" > 3. में Vivo इमेजिंग C. एलिगेंस निकालनेवाला नहर के प्रतिदीप्ति विदारक माइक्रोस्कोपी एवं प्राप्तांक के द्वारा Tubulogenesis Phenotypes

  1. एक phenotype स्कोरिंग शीट तैयार ( Table 4 में दर्शाए गए उदाहरण और < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 5 ).
  2. जगह प्रतिदीप्ति dissectin के तहत सीधे कीड़े के साथ आगर प्लेटजी माइक्रोस्कोप, मूल्यांकन के लिए थाली के खुले ढक्कन, कम आवर्धन का उपयोग करने के लिए ध्यान केंद्रित ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल का वर्णन 1.5 x और 10x उद्देश्यों के साथ एक गुंजाइश के उपयोग और ३.५ से ४५ (सामग्री के तालिका) के लिए एक ज़ूम रेंज ।
  3. एक अच्छी तरह से अलग पर ध्यान केंद्रित करके पशुओं का मूल्यांकन, अच्छी तरह से 1 के साथ शुरू, और थाली नीचे काम करते हैं ।
    नोट: हमेशा नियंत्रण के मूल्यांकन के साथ शुरू करते हैं । मसलन, एक नकली (खाली सदिश) नकारात्मक नियंत्रण (HT115 RNAi बैक्टीरिया (संदर्भ देखें < सुप वर्ग = "xref" > १७ , < सुप वर्ग = "xref" > २१ ) बिना या एक असंबंधित जीन डालने के साथ) और उचित सकारात्मक नियंत्रण, जैसे , में इस इंटरेक्शन स्क्रीन, एर्म-1 RNAi (एर्म-1 [+ +] phenotype को दबा) और sma-1 /spectrin RNAi (एर्म-1 [+ +] नहर phenotype बढ़ाता है).
  4. सबसे पहले, उज्ज्वल प्रकाश के तहत दिखाई सामांय phenotypes की जांच करें (उदाहरण के लिए: चलो/घातक, Clr/स्पष्ट, Emb/भ्रूण घातक, एसटी/बाँझ, Unc/बेबुनियाद, Dpy/डंपिंग, आदि ), पशुओं और संख्या की कुल संख्या की गणना द्वारा phenotype मात्रा phenotype के साथ जानवरों की, संख्या रिकॉर्ड ( तालिका 4 देखें).
    नोट: knockdowns के लिए दोष है कि नहर phenotypes ( जैसे , Emb, एसटी) के मूल्यांकन को प्रभावित कर सकते है पैदा जीन के लिए, सशर्त, पोस्ट भ्रूण RNAi के साथ प्रयोग दोहराने पर विचार (प्रक्रियाओं के लिए साथ कागज देखें < सुप वर्ग = "xref" > ३ ).
  5. दूसरा, फ्लोरोसेंट लाइट के तहत निकालनेवाला नहर phenotypes की जांच, स्कोर quantifiable phenotypes ( जैसे , नहर की लंबाई, लुमेन की चौड़ाई, अल्सर), संख्या रिकॉर्ड और एक स्कोरिंग शीट पर phenotypes का वर्णन (देखें तालिका 4 , < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा ५ ).
    नोट: ज़ूम रेंज के साथ उच्च आवर्धन अधिक सूक्ष्म नहर phenotypes का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक है । कम और उच्च आवर्धन के बीच आगे पीछे ले जाने के लिए सावधानी से नहर का मूल्यांकन करने के लिए & #8217; s लंबाई और चौड़ाई और किसी भी अन्य नहर morphogenesis phenotype. साधारण phenotypes के ठहराव या अर्द्ध ठहराव के लिए, गणना १०० पशुओं ( जैसे , L4s इस लक्षित RNAi स्क्रीन में; phenotypes: नहर की लंबाई 1/4, 1/2, 3/4 और पीछे नहरों के पूर्ण विस्तार, और पीछे नहरों के लुमेन व्यास, छोटे अल्सर (& #60; पशुओं की चौड़ाई का 1/3), बड़े अल्सर (& #62; 1/3 पशुओं की चौड़ाई); see Table 4 ).
  6. एक खुर्दबीन घुड़सवार डिजिटल चार्ज-युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरा और इसी इमेजिंग सॉफ्टवेयर (सामग्री की टेबल देखें)
    1. छवियों को प्राप्त करने के लिए द्वारा कम से कम 3 अलग जानवरों से प्रमुख phenotypes की छवियों को प्राप्त, पहले कैमरा पर बारी, संलग्न कंप्यूटर पर बारी, डबल क्लिक करें छवि पर कब्जा सॉफ्टवेयर आइकन, कम आवर्धन के तहत मैंयुअल रूप से कीड़ा थाली के एक क्षेत्र ध्यान केंद्रित है, और कैमरा शटर खोलो ।
    2. पर क्लिक करें & #8220; लाइव प्रीव्यू & #8221; कंप्यूटर स्क्रीन पर इमेज कैप्चर सॉफ्टवेयर का चिह्न कंप्यूटर स्क्रीन पर कीड़े की कल्पना करने के लिए, स्क्रीन पर कीड़े को स्पष्ट रूप से साफ करने के लिए ध्यान से समायोजित करें, उसके बाद & #8220; snap & #8221; चिह्न, फिर क्लिक करें & #8220; save & #8221; चिह्न.
      नोट: जानवरों फ्लोरोसेंट रोशनी के तहत तेजी से कदम होगा, इसलिए कंप्यूटर माउस पर एक हाथ रखने के लिए तैयार है जबकि दूसरे हाथ से ब्याज के क्षेत्र में थाली चलती । फिर तुरंत क्लिक करें & #8220; snap & #8221; चिह्न छवि प्राप्त करने के लिए । यह आमतौर पर कई कोशिश करता है के साथ एक अच्छी छवि प्राप्त करने के लिए संभव है ।
    3. एक उचित फ़ाइल नाम के साथ अधिग्रहीत छवियों को बचाने (तनाव का नाम, RNAi क्लोन नाम और तारीख शामिल हैं).
      नोट: तेजी से चलती जंगली-पतली और लंबी नहरों के साथ प्रकार के कीड़े म्यूटेंट से छवि के लिए और अधिक कठिन हैं । सिस्टिक नहरों और/या अंय phenotypes के साथ म्यूटेंट धीरे कदम की संभावना है, इस प्रकार इमेजिंग की सुविधा । मार्कर plasmids जैसे Rol जानवरों को रखने से इमेजिंग के लिए उपयोगी हो सकता है & #8220; ऑन द स्पॉट & #8221; पर आगे बढ़ने के बजाय, और भी अपने आप को चारों ओर जानवर रोलिंग के साथ phenotype पर एक बेहतर दृश्य प्रदान कर सकते हैं ।
< p class = "jove_title" > 4. सी एलिगेंस निकालनेवाला नहर की इमेजिंग लेजर स्कैनिंग द्वारा उच्च संकल्प पर फोकल माइक्रोस्कोपी

  1. बढ़ते रहते जानवरों
    1. एक कपास झाड़ू की नोक पर या के टिप पर तेल या पेट्रोलियम जेली की एक छोटी राशि जगह तर्जनी, और तेल फैला के एक व्यास के साथ एक ultrathin सर्कल उत्पंन करने के लिए ~ 6 & #8211; 8 मिमी एक साफ गिलास स्लाइड के बीच में ।
    2. जगह 6 & #956; L 5% lidocaine समाधान (संवेदनाहारी) चक्र में एक micropipette.
      नोट: पानी में lidocaine पाउडर को भंग करके एक lidocaine स्टॉक सॉल्यूशन बनाया जा सकता है । M9 बफ़र के साथ 5% तक पतला करें < सुप वर्ग = "xref" > १९ ( टेबल ऑफ मटेरियल्स ). यह निकालनेवाला नहर के विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है आम स्थिरीकरण समाधान से बचने के लिए (जैसे सोडियम azide) कि अल्सर के कारण टूटना करने के लिए और प्रेरित है कि नहर phenotypes.
    3. एक RNAi प्लेट से कई जानवरों उठाओ, और कीड़ा उठाओ < सुप वर्ग = "xref" > 19 समाधान में उन्हें lidocaine समाधान में जगह.
      नोट: अधिमानतः चरण-विशिष्ट जानवरों है कि वर्दी मोटाई से भी बढ़ते की सुविधा होगी उठाओ । पशुओं को विदारक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर ही चुना जा सकता है.
    4. जगह एक 22 मिमी x 22 मिमी coverslip ग्लास स्लाइड पर; चलो यह धीरे तेल सर्कल पर बसा ।
      नोट: coverslip जो नहर आकृति विज्ञान, विशेष रूप से म्यूटेंट या नहर और संभवतः अन्य phenotypes के साथ इलाज कीड़े RNAi में नुकसान हो सकता है पर किसी भी शारीरिक दबाव लागू न करें । यह महत्वपूर्ण है इसलिए एक मोटी चर्बी चक्र से बचने के लिए; आदर्श रूप में जानवरों धीरे ग्लास स्लाइड और कवर पर्ची के बीच सैंडविच रहे हैं ।
    5. ग्लास स्लाइड के फ्रॉस्टेड साइड पर नमूने का नाम लिखें । तुरंत नहर phenotype के विश्लेषण के लिए और छवियों को प्राप्त करने के लिए फोकल माइक्रोस्कोप के लिए स्लाइड ले लो ।
      नोट: देरी नहर के अल्सर या नहर लुमेन आकृति विज्ञान में परिवर्तन के नुकसान में परिणाम हो सकता है.
  2. क्य फोकल वेबसाईटवर
    1. स्लाइड को फोकल माइक्रोस्कोप के नमूना स्टेज पर रखें, कम आवर्धन (10x) पर कीड़े ध्यान केंद्रित.
    2. 60X और/या 100X उद्देश्यों के तहत जानवरों को देखने और चुनने के लिए, निकालनेवाला नहर & #8217 की जांच; एस सेलुलर और उपसेलुलर phenotypes, जैसे , लुमेन आकार और व्यास, आकार और अल्सर के आकार; या विश्लेषण के लिए लेबल उपसेलुलर घटकों, उदा , शिखर/लुमेन झिल्ली, बेसल झिल्ली, कोशिका, endosomal बनाम canalicular बुलबुले, अन्य organelles (see चर्चा , < सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा २ , आणि < सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा ४ ).
    3. ब्याज की विशिष्ट phenotype की छवियां प्राप्त.
      नोट: इस प्रोटोकॉल एक लेज़र स्कैनिंग फोकल माइक्रोस्कोप (सामग्री के तालिका) के उपयोग का वर्णन करता है । पतली C. एलिगेंस निकालनेवाला नहरों में उपसेलुलर घटकों को हल करने के लिए, उच्च आवर्धन उद्देश्यों (60X करने के लिए 100X) की आवश्यकता है । एक कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोप के लिए समय चूक छवियों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन कम फोकल प्रदान करता है ( चर्चा देखें) ।
      1. के लिए फोकल छवियों को प्राप्त करने के लिए, कंप्यूटर पर बारी, फोकल सूक्ष्मदर्शी सॉफ्टवेयर पर डबल क्लिक करें, और एक विशिष्ट लेजर आइकन पर क्लिक करके लेजर का चयन करें ।
      2. क्लिक करें & #8220; स्कैन & #8221; चिह्न कंप्यूटर स्क्रीन पर केंद्रित कीड़ा कल्पना करने के लिए, के माध्यम से लेजर तीव्रता समायोजित सॉफ्टवेयर, और & #8220 पर फिर से क्लिक करें; स्कैन & #8221; आइकन स्कैनिंग रोकने के लिए, फिर & #8220 पर क्लिक करें; कैप्चर & #8221; चिह्न किसी छवि को कैप्चर करने के लिए, फिर & #8220 पर क्लिक करें; सहेजें & #8221; चिह्न.
      3. उचित फ़ाइल नाम के साथ छवियों को बचाने और RNAi क्लोन नाम, तनाव का नाम और तारीख शामिल हैं.
        नोट: छवियां एकल और एकाधिक अनुभागों के रूप में प्राप्त की जा सकती है ( उदा. , 10 & #8211; z-अक्ष के साथ 15 अनुभाग) । अनुभाग 3 डी दृश्य की अनुमति देता है । प्रक्षेपण छवियों को प्राप्त करने और अलग से बचाने के लिए यदि आवश्यक (माइक्रोस्कोप पर निर्भर करता है) । इष्टतम रिज़ॉल्यूशन के लिए, कम लाभ के साथ लेज़र सेटिंग का उपयोग करें, pinhole को बहुत अधिक न खोलें और प्रति छवि औसत जोड़ें (संदर्भ < सुप वर्ग = "xref" > 23 , < सुप वर्ग = "xref" > 24 फोकल इमेजिंग की सामान्य चर्चा के लिए). ध्यान रखना संतृप्ति स्तर से नीचे एक चमक पर छवियों को प्राप्त करने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा संशोधन के लिए अनुमति यदि आवश्यक (अधिमानतः unसंशोधित छवियों का उपयोग करें) ।
      4. की छवियों को प्राप्त डबल या गुणा लेबल नहरों ( जैसे हरे, लाल, और नीले) एक ही फैशन में, एकाधिक लेजर माउस पर क्लिक करके, लेकिन खून से बचने के लिए अनुक्रमिक स्कैनिंग का उपयोग करें-चैनलों के बीच के माध्यम से (सह स्थानीयकरण अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण).
        नोट: एक को ध्यान में अनुक्रमिक स्कैनिंग के लिए आवश्यक समय (जो भी फोटो ब्लीचिंग में एक इसी वृद्धि में परिणाम) लेने और स्कैनर सेटिंग्स को संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है । नहर आकृति विज्ञान पर विशिष्ट प्रभाव से बचने के लिए 30 से अधिक न्यूनतम के लिए एक स्लाइड से जानवरों को स्कैन न करें । नई स्लाइड माउंट यदि अब स्कैनिंग की आवश्यकता है ।
      5. इसी विभेदक हस्तक्षेप प्रकाशिकी (उद्योग)/Nomarski छवियों, विशेष रूप से अगर नहर की लंबाई बढ़ाता है और कीड़ा & #8217 के संबंध में लुमेन व्यास; एस शरीर की लंबाई और व्यास । प्रतिदीप्ति और Nomarski छवियों को ओवरले करें & #8220 पर क्लिक करके; ओवरले & #8221; आइकन को प्रदर्शित करने के लिए चिह्न (< सशक्त वर्ग = "xfig" > चित्र 1 d और < सशक्त वर्ग = "xfig" > चित्र 4a & #8211;D ).
    4. For ठहराव, उपाय प्रतिदीप्ति तीव्रता के एक लेबल घटक के द्वारा ब्याज की ImageJ सॉफ्टवेयर < सुप class = "xref" > 25 (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 5C ).

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल का वर्णन करता है कि नेत्रहीन और आणविक कोशिकीय tubulogenesis और intracellular लुमेन morphogenesis एक एकल कक्ष में विश्लेषण करने के लिए C. एलिगेंस निकालनेवाला नहरों का उपयोग करने के लिए । मध्य embryogenesis के समय से वयस्कता के लिए उनके विस्तार के दौरान, चार निकालनेवाला नहरों उनके canalicular और endosomal endomembrane प्रणाली के साथ एक साथ अपने basolateral और शिखर/लुमेन झिल्ली का विस्तार करने के लिए जारी है, के लिए एक अनूठा मॉडल प्रदान de नोवो का विवो विश्लेषण में एक झिल्ली की उत्पत्ति (चित्रा 1) । इस तरह के शिखर झिल्ली, कोशिका, और endosomal बनाम canalicular बुलबुले के रूप में उपसेलुलर घटकों विशिष्ट फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त द्वारा कल्पना की जा सकती है (प्रोटोकॉल खंड 1 में वर्णित), और वे एक दूसरे से प्रतिष्ठित किया जा सकता है एक एकल ट्रांसजेनिक पशु में डबल या ट्रिपल लेबलिंग (चित्रा 2) । एक अद्वितीय निकालनेवाला नहर phenotype (चित्रा 3-बी) एक शिखर झिल्ली जुड़े अणु (एर्म-1) को व्यक्त करने से उत्पंन, कैसे प्रदर्शित करने के लिए एक लक्षित RNAi स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए प्रयोग किया जाता है शिखर झिल्ली में कार्य जीन की पहचान और लुमेन-उत्पत्ति; यह एक आणविक और दृश्य का एक उदाहरण के रूप में कार्य करता है ध्रुवीय झिल्ली के विश्लेषण के इस मॉडल में उत्पत्ति (प्रोटोकॉल खंड 2 में वर्णित) । इस एर्म-1 [+ +] नहर phenotype कैसे नेत्रहीन मूल्यांकन करने के लिए प्रदर्शन और स्कोर दमन करने के लिए प्रयोग किया जाता है (आंकड़ा3 सी– डी) और संवर्धन (चित्रा 3E– F) विदारक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा (प्रोटोकॉल खंड में वर्णित) . एर्म-1 के स्तर के मॉडुलन द्वारा प्रेरित नहर phenotypes फोकल माइक्रोस्कोप (चित्रा 4) द्वारा उपसेलुलर स्तर पर दोषों को हल करने के लिए कैसे दिखाने के लिए सेवा (प्रोटोकॉल खंड 4 में वर्णित), और कैसे सरल नहर phenotypes (नहर की लंबाई और पुटी यों आकार) और शिखर झिल्ली की उत्पत्ति दोष (चित्रा 5) ।

Figure 1
चित्र 1 : Morphogenesis ग. एलिगेंस निकालनेवाला नहर और उपसेलुलर नहर संरचनाओं
(क) भ्रूण और लार्वा के विकास के दौरान निकालनेवाला नहर विस्तार (नीली लाइनों) के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. निकालनेवाला सेल बाईं ventro-भ्रूण के अल्पविराम चरण में पीछे ग्रसनी बल्ब के पार्श्व पक्ष में अपने अंतिम स्थान पर पहुंचता है (नहीं दिखाया) । के रूप में भ्रूण लम्बा, यह पहले दो हथियार बाद में छोड़ दिया और सही पक्षों की ओर फैली; फिर प्रत्येक हाथ एक पूर्वकाल और पीछे शाखा में bifurcates । इन पूर्वकाल और पीछे शाखाओं चार लार्वा चरणों के दौरान पशु के बढ़ाव भर में आगे का विस्तार, पहले L2 मंच पर है पशु विकास के साथ पकड़ने, तो उसके आगे विकास के साथ, वयस्कता तक । De नोवो ध्रुवीय झिल्ली की उत्पत्ति वयस्कता के लिए इस विस्तार का समर्थन करता है । (ख) वयस्क पशु में, पूर्वकाल नहर शाखाओं नाक टिप और पीछे शाखाओं, पूंछ (नीली लाइनें) तक पहुंचने । निकालनेवाला कोशिका शरीर के पीछे ग्रसनी बल्ब (नीला) के पास दिखाया गया है । ध्रुवीकरण झिल्ली डोमेन वयस्कता के दौरान बनाए रखा जाता है । (ग) एक नहर शाखा अनुभाग के बढ़े हुए दृश्य । वाम: नहर के 3 डी दृश्य दिखाता है: बेसल झिल्ली (काला), कोशिका (नीला), लुमेन झिल्ली (हरा) और लुमेन (सफेद). सही: नहर और उसकी झिल्ली के अंदर देखने: बेसल झिल्ली (काला), कोशिका (नीला), endosomes (पीला अंडाकार), canalicular बुलबुले (सफेद क्षेत्रों, एक दूसरे से जुड़े, लुमेन या पृथक एकल बुलबुले से जुड़ा), शिखर झिल्ली (हरा) और लुमेन (सफेद) । (घ) फोकल/एक भ्रूण में निकालनेवाला कोशिका के माइक्रोग्राफ और एक लार्वा में निकालनेवाला नहरों, लुमेन बनाम cytoplasmic GFP द्वारा लेबल, क्रमशः । वाम छवि: निकालनेवाला सेल (हरे, तीर) एक १.५-गुना भ्रूण में, नहर लुमेन के साथ शिखर एर्म-1:: GFP एर्म-1 प्रमोटर के तहत व्यक्त द्वारा visualized । सही छवि: चार निकालनेवाला नहर शाखाओं (हरे, तीर) L3 लार्वा में, cytoplasmic vha-1p:: GFP द्वारा visualized । स्केल बार्स = 20 माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन के साथ डबल लेबलिंग द्वारा जंगली प्रकार निकालनेवाला नहर हथियारों में उपसेलुलर घटकों visualiz ing
(क) शिखर झिल्ली से कोशिका को भेद करना. sulp-5 प्रमोटर के तहत GFP की अभिव्यक्ति नहर कोशिका (हरा, ऊपर) visualizes; एर्म की अभिव्यक्ति-1:: अपने स्वयं के प्रवर्तक के तहत mCherry शिखर झिल्ली (लाल, मध्य) visualizes; इन छवियों को विलय (नीचे) कोशिका और शिखर झिल्ली है कि अंयथा भी उच्च आवर्धन पर एकल लेबलिंग द्वारा किया जाएगा के बीच भेद । स्केल बार = 5μm । (ख) लुमेन के लिए endosomal बुलबुले के स्थानिक संबंध का निर्धारण । एक शिखर झिल्ली से लुमेन के दृश्य-जुड़े GFP फ्यूजन प्रोटीन (छद्म लाल रंग के लिए, ऊपर); mCherry व्यक्त करके endosomal बुलबुले के दृश्य:: ऄब-7 (नीले रंग के लिए छद्म, मध्य); इन छवियों को विलय (नीचे) लुमेन के लिए endosomal बुलबुले के रिश्तेदार स्थानिक पदों से पता चलता है । स्केल बार = 5μm । (C और D) विभिन्न आवर्धन पर उपसेलुलर नहर घटकों बनाम नहर ट्यूब आकार का समाधान. L1 लार्वा के कोशिका को sulp-5 प्रवर्तक के अंतर्गत GFP व्यक्त करके लेबल किया गया है और cytoplasmic canalicular के बुलबुले को जल चैनल AQP-8:: mCherry के तहत AQP-8 प्रवर्तक के द्वारा व्यक्त किया जाता है । (ग) कम इज़ाफ़ा पर अधिग्रहीत छवियों को हल एक "मोती-पर एक स्ट्रिंग" मंच के अनुरूप पैटर्न विशिष्ट varicosities (varicosities जलाशयों canalicular बुलबुले और अंय नहर विकास के लिए आवश्यक घटकों में प्रचुर मात्रा में हैं), लेकिन क्या हल न cytoplasmic AQP-8 puncta । (घ) उच्च आवर्धन पर अधिग्रहीत छवियों को हल AQP-8 नहर कोशिका में puncta, canalicular बुलबुले के लिए इसी । स्केल बार्स: C में 20 माइक्रोन और 5 माइक्रोन में D. सभी पैनलों 10 के फोकल अनुमानों शो-15 वर्गों प्रत्येक । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : स्कोरिंग बढ़ाने और दमनएक सिस्टिक नहर Phenotype के एस (एर्म-1 [+ +]) द्वारा माइक्रोस्कोपी विदारक
(क) एर्म-1 [+ +]; rol-६ (su1006) निकालनेवाला नहरों को एक vha-१ प्रवर्तक के अंतर्गत GFP व्यक्त करके विज़ुअलाइज़ किया जाता है. पीछे नहरों योनी या पशु के मध्य शरीर तक फैली (तीर; 1/2 विस्तार के रूप में माना जाता है) कम आवर्धन पर (1.5 x उद्देश्य और कम ज़ूम) । (ख) उच्चतर आवर्धन पर, हस् एर्म-1 [+ +] छोटे-सिस्टिक समेटना नहर के पीछे नहरों की नोक के साथ हल किया जा सकता है (एक हाथ छोटे तीर द्वारा इंगित) योनी या थोड़ा परे तक फैली (योनी बड़े तीर से संकेत दिया; नहर पैनल डी में लुमेन तुलना के लिए जंगली प्रकार के रूप में माना जा सकता है) । (ग) दमन, कम आवर्धन: RNAi में लम्बी और पतली नहरों का इलाज एर्म-1 [+ +] पशु । (घ) उच्च आवर्धन पर, पीछे नहरों लगभग पूरी तरह से पूंछ (छोटे तीरों के लिए विस्तार करने के लिए देखा जा सकता है, के जनक जानवरों की तुलना में, पैनल बी में दिखाया गया है); बड़ा तीर योनी की स्थिति इंगित करता है । (ङ) संवर्धन: RNAi इलाज में बड़ा अल्सर के साथ आगे छोटा नहरों एर्म-1 [+ +] जानवरों; कम आवर्धन, कोई ज़ूम । (च) उच्च आवर्धन पर, पीछे नहर विस्तार से कम 1/2 (छोटे तीर) के रूप में निर्धारित किया जा सकता है या नहीं योनी तक विस्तारित (बड़े तीर से संकेत) और है पशुओं की चौड़ाई के 1/3 से अधिक के रूप में पुटी आकार (दिखाया जनक जानवर की तुलना में व्यापक बी में) । स्केल बार्स = ४०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : निकालनेवाला नहर आकृति विज्ञान और उत्परिवर्ती में उपसेलुलर नहर घटकों के दृश्य विश्लेषण/RNAi पशु फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा
(A – D) एक सिस्टिक नहर phenotype से एक vacuolar भेद (फोकल/माइक्रोग्राफ ओवरले दिखाए जाते हैं) । (क) एक जंगली प्रकार के नहर के कोशिका sulp-5 प्रमोटर के तहत GFP व्यक्त द्वारा कल्पना की है (छद्म शिखर झिल्ली लेबलिंग से भेद में नीले रंग, पैनल बी में हरे रंग में दिखाया गया) । (ख) एक जंगली प्रकार के नहर की शिखर झिल्ली एर्म-1:: GFP व्यक्त करके visualized है; ध्यान दें कि लुमेन इस आवर्धन पर दिखाई नहीं है और वह एक लेबलिंग झिल्ली लेबलिंग से cytoplasmic भेद नहीं कर सकते । (ग) निकालनेवाला नहर phenotype द्वारा प्रेरित RNAi: cytoplasmic लेबलिंग cytoplasmic अल्सर से vacuoles intralumenal भेद नहीं कर सकते. (घ) निकालनेवाला नहर phenotype द्वारा प्रेरित RNAi: शिखर एर्म-1:: GFP लेबलिंग लुमेन के अंदर द्रव संचय का पता लगाता है, (cytoplasmic) vacuoles के बजाय (लुमेन) अल्सर की पहचान (cytoplasmic vacuoles के लिए फिगर 4i की तुलना करें). स्केल पट्टी = एक के लिए ४० माइक्रोन-डी, में दिखाया गया एक. (E-J) नुकसान का विश्लेषण-और उप सेलुलर नहर के घटकों पर लाभ के समारोह प्रभाव (एकल नहर हथियारों की फोकल छवियां दिखाए जाते हैं) । (E-G) canaliculi के उपसेलुलर स्थानीयकरण पर एर्म-1 RNAi का प्रभाव । (ङ) वन्य-प्रकार नहर कोशिका; नोट लुमेन का संकेत GFP अपवर्जन । (च) जंगली-प्रकार cytoplasmic AQP-8:: GFP puncta, इसी canalicular बुलबुले के लिए । (छ) AQP के Cytoplasmic और बेसल विस्थापन-8:: GFP puncta में एर्म-1 (RNAi) पशु । (ज) सतत लुमेन और लुमेन टिप विकृति का विस्तार (कर्लिंग और लुमेन केंद्रीकरण की हानि) एर्म-1 (mildRNAi) पशु (3 RNAi शक्ति संग्राहक के लिए देखें); ध्यान दें कि नहर कोशिका लुमेन के टिप से परे फैली हुई है, यहां छोटे अल्सर द्वारा संकेत दिया । (I) Cytoplasmic vacuoles निकालनेवाला नहर के शरीर में बिना किसी नहर के विस्तार से दृढ़ता से प्रभावित एर्म-1 (RNAi) पशु3; ध्यान दें कि अधिनियम-5:: GFP लुमेन के लिए भर्ती नहीं है (कुछ vacuoles के आसपास कई छोटे धब्बों को छोड़कर) । (ञ) अतिरिक्त अधिनियम-5 की भर्ती:: GFP और AQP-8:: mCherry में लुमेन के लिए ट्रिपल ट्रांसजेनिक जानवर एर्म-1 (नोट मोटी बेल्ट अधिनियम-5:: GFP और अतिव्यापी AQP-8:: सिस्टिक लुमेन के आसपास mCherry के झुरमुट) । स्केल बार = 5 माइक्रोन ई के लिए-J, ई. में दिखाया गया है इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5 : नहर दोष के ठहराव के उदाहरण विदारक और फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा
(क) जंगली प्रकार (ऊपरी पैनल) और उत्परिवर्ती सिस्टिक (कम पैनलों) के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व नहर की लंबाई और पुटी आकार के ठहराव के लिए निकालनेवाला नहरों । पीछे नहर की लंबाई के रूप में मात्रा है 0, 1/4, 1/2, 3/4, और 1 । नहर की लंबाई ' 0 ' कोई एक्सटेंशन इंगित करता है और ' 1 ' पूर्ण-लंबाई एक्सटेंशन को इंगित करता है । पुटी का आकार मात्रा & #60; 1/3 (छोटा) और & #62; 1/3 (शरीर व्यास का बड़ा) है । (ख) ठहराव नियंत्रण में सकल नहर आकृति विज्ञान की और एर्म-1 [+ +](RNAi) फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा पशुओं । नकली में(RNAi) एर्म-1 [+ +] पशु, पीछे नहर की लंबाई के बारे में 1/2 ९५% पशुओं में विस्तारित (संदर्भ छवि, 3 चित्र-बी) है । दमन एर्म में-1 [+ +](RNAi) जानवरों, पीछे नहर की लंबाई लगभग पूरी तरह से 80 में विस्तारित है-90% जानवरों (संदर्भ छवि, चित्रा 3सी– डी). बढ़ाने में एर्म-1 [+ +](RNAi) पशुओं, लगभग 60-70% नहरों बड़े अल्सर और कम लंबाई (& #60; 1/2) (संदर्भ छवि, चित्रा 3E-F) है । डेटा के रूप में प्रस्तुत मतलब ± एसडी (n & #62; 3) । (ग) फोकल छवियों से ImageJ द्वारा शिखर/लुमेन नहर cytoskeleton की प्रतिदीप्ति तीव्रता के ठहराव । नहर की शिखर झिल्ली अधिनियम-5 द्वारा लेबल किया गया है:: GFP, जंगली प्रकार नहर बांह बाईं ओर दिखाया गया है, एर्म-1 [+ +] सही करने के लिए नहर बांह, । वाम पैनलों: अधिनियम की तीव्रता-5:: GFP में जंगली प्रकार झिल्ली आस्तीन के बारे में है ५० (ग्रे मूल्य/झिल्ली; काले और लाल तीर द्वारा इंगित), साजिश छवि के नीचे दिखाया गया है । सही पैनलों: अधिनियम की तीव्रता-5:: एर्म में GFP-1 [+ +] १०० से ऊपर है (पृष्ठीय झिल्ली के धूसर मूल्य के बारे में ११० (काला तीर) है, और ventral झिल्ली के बारे में है १४० (लाल तीर)), साजिश छवि के नीचे दिखाया । स्केल बार्स = 5 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

तालिका 1: के लिए मार्कर के उदाहरण C. एलिगेंस निकालनेवाला नहर झिल्ली प्रणाली
प्रोटीन का नाम उप
सेलुलर स्थानीयकरण समारोह उपलब्ध उपभेदों के उदाहरण संदर्भ एर्म-1 शिखर डोमेन झिल्ली-cytoskeleton लिंकर VJ402 (fgEx13 [एर्म-1p:: एर्म-1:: gfp, rol-6p:: rol-6 (su1006)]) रेफरी (13) अधिनियम-5 शिखर डोमेन apically स्थानीयकृत actin VJ268 (fgEx12 [(act-5p:: act-5:: gfp); unc-119 (+); unc-119 (ed3) III]) रेफरी (13) ABTS-2 Basolateral आयनों/बिकारबोनिट ट्रांसपोर्टर ABTS-2:: GFP रेफरी (४२) SULP-8 Basolateral Sulfatepermease SULP-8:: GFP रेफरी (४२) VHA-1 canalicular बुलबुले वी-ATPase VJ535 (fgEx35 (vha-1p:: vha-1:: gfp; rol-6p:: rol-6 (su1006))) रेफरी (9) VHA-5 canalicular बुलबुले वी-ATPase ML846 (vha-5 (mc38) IV; mcEx337 [vha-5 (+):: GFP + rol-6 (su1006)]) रेफरी (10) AQP-8 canalicular बुलबुले aquaporin, वॉटर चैनल VJ533 (fgEx33 (aqp-8p:: aqp-8:: gfp)) रेफरी (9) ऄब-5 endosomal बुलबुले ्े BK209 (qpIs99 (exc9p:: mCherry:: ऄब-5)) रेफरी (३६) ऄब-7 endosomal बुलबुले ्े BK210 (qpIs100 [Pexc-9:: mCherry:: ऄब-7]) रेफरी (३६) ऄब-11 endosomal बुलबुले ्े BK205 (qpIs97 (exc9p:: mCherry:: ऄब-11)) रेफरी (३६) 1 उदाहरण तालिका 3 में सूचीबद्ध संसाधनों से चयनित हैं ।

तालिका 2: के उदाहरण C. एलिगेंस निकालनेवाला नहर-विशिष्ट प्रवर्त क
प्रवर्तकों अभिव्यक्ति अवस्था
एर्म-1 अल्पविराम चरण भ्रूण
sulp-5 3 गुना भ्रूण
vha-1 2-गुना भ्रूण
vha-5 2-गुना भ्रूण
aqp-8 2-गुना भ्रूण
glt-3 देर से भ्रूण
1 उदाहरण तालिका 3 में सूचीबद्ध संसाधनों से चयनित हैं ।

तालिका 3: संसाधन
C. एलिगेंस निकालनेवाला नहर की पहचान करने के लिए संसाधन-विशिष्ट अणु, लेबलिंग रिएजेंट/उपभेदों और एंटीबॉडी
1. Caenorhabditis जेनेटिक्स केंद्र (CGC) उपलब्ध रिएजेंट और उपभेदों के लिए४३
2. Wormbase४४ निकालनेवाला नहर के बारे में जानकारी के लिए विशिष्ट अणुओं, उपभेदों और एंटीबॉडी
3. निकालनेवाला नहर-विशिष्ट अणुओं के बारे में जानकारी: संदर्भ6 देखें
४. Transgeneome वेबसाईट४५ for शोधों GFP फ्यूजन गावातील
5. सी. एलिगेंस एक्सप्रेशन पैटर्न४६ for transcriptional GFP फ्यूजन गावातील
6. राष्ट्रीय प्रसंसाधन परियोजना (NBRP):: c. एलिगेंस४७ c. एलिगेंस म्यूटेंट और प्रवर्तकों पर जानकारी के लिए
7. Fluorophores: संदर्भ४८देखें,४९
वेब आधारित एक लक्षित RNAi पुस्तकालय के लिए अणुओं कोडांतरण के लिए संसाधन
1. GeneMANIA५०
2. AceView५१
3. iHOP५२
4. Wormbase४४
5. Saccharomyces जीनोम डाटाबेस५३
6. Flybase५४
7. माउस जीनोम डाटाबेस५५
8. मानव जीनोम डाटाबेस५६
9. ब्लास्ट५७

तालिका 4: सरल Phenotype स्कोरिंग शीट का उदाहरण
RNAi पुस्तकालय तनाव सामान्य Phenotype (% कुल) नहर phenotype
नहर क लंबाई & #60; 1/2 (% L4) नहर क लंबाई & #62; 1/2 (% L4) अन्य नहर phenotype कुल गिने गए पशुओं की संख्या
प्लेट नं वेल नंबर
मैं-1 a1 एर्म-1 [+ +]; vha-1p:: GFP Clr (30) ८० 20 १००
एक्स-5 बी ही कोई 30 ७० १००
तृतीय-10 c5 ही Unc (५४) ७० 30 बड़े अल्सर १००

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Discussion

C. एलिगेंस ' आनुवंशिक बहुमुखी प्रतिभा, पारदर्शिता, सरल शरीर योजना और अपरिवर्तनीय सेल वंश सभी यह morphogenesis के विश्लेषण के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल बना । इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे मानक आनुवंशिक जोड़तोड़ और इमेजिंग अध्ययन गठबंधन के लिए 2 माइक्रोन पतली सी एलिगेंस निकालनेवाला नहरों का लाभ लेने के लिए एक सेल ट्यूब में ध्रुवीकरण झिल्ली और intracellular लुमेन उत्पत्ति का अध्ययन ।

लेबलिंग
C. एलिगेंस निकालनेवाला नहरों फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति के द्वारा लेबल किया जा सकता है, लाइव विश्लेषण की अनुमति (यहां वर्णित), या एंटीबॉडी या रासायनिक धुंधला द्वारा (एंटीबॉडी धुंधला के लिए आंतों tubulogenesis पर कागज के साथ देखें 3). दो या अधिक अलग fluorophores की अभिव्यक्ति, या इन अलग लेबलिंग तकनीक के संयोजन, इन पतली नलिकाओं (चित्रा 2) के एक उच्च संकल्प दृश्य विच्छेदन के लिए अनुमति देता है । फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन एक नहर विशिष्ट प्रमोटर द्वारा नहरों के लिए निर्देशित कई कारणों के लिए निकालनेवाला नहर लेबलिंग के लिए पहली पसंद हैं, उनमें से: (1) कई नहर प्रोटीन के कम अभिव्यक्ति स्तर, और (2) नहर के ठीक संरचना है कि आसानी से है नहरों के बाहर दाग से अभिभूत जहां ब्याज का प्रोटीन भी व्यक्त किया जा सकता है । दूसरी ओर, नहरों exogenous प्रोटीन के प्रति संवेदनशील है और आसानी से विशिष्ट phenotypes (जैसे, विस्तार दोष और अल्सर, या यहां तक कि घातकता) विकसित जब ऐसे प्रोटीन दृढ़ता से व्यक्त कर रहे हैं । इस निर्णय में वजन जब ट्रांसजेनिक पशुओं पैदा करने के विभिंन तरीकों के बीच चयन करना चाहिए । सिद्धांत रूप में, transgenes extrachromosomal arrays के रूप में शुरू किया जा सकता है (जैसे, प्लाज्मिड डीएनए के प्रत्यक्ष इंजेक्शन द्वारा germline परिवर्तन के लिए gonad में, जैसा कि यहां वर्णित), जो आम तौर पर उच्च प्रतिलिपि संख्या arrays उत्पंन (अक्सर उच्च के साथ अभिव्यक्ति), या जीनोम में एकीकृत, आमतौर पर कम या एकल प्रति संख्या पर (उदा, बमबारी से26 या via Mos1-मध्यस्थ एकल प्रतिलिपि प्रविष्टि [MosSCI]27) । Extrachromsomal arrays भी एक दूसरे चरण में जीनोम में एकीकृत किया जा सकता है (फिर भी, तथापि, एक उच्च प्रतिलिपि संख्या में)18। दूसरी ओर, जब कम एकाग्रता पर germline में इंजेक्शन (जैसे, 1-2 एनजी/µ एल डीएनए, मार्कर डीएनए के एक उच्च एकाग्रता के साथ संयुक्त), कम (यहां तक कि एक) प्रति संख्या arrays आसानी से28उत्पंन किया जा सकता है । इस परिदृश्य लाभ है कि डीएनए सांद्रता अलग किया जा सकता है, जो मदद कर सकता है नहर लेबलिंग के लिए सबसे अच्छा अभिव्यक्ति स्तर मिल जाए, न तो बहुत कम है और न ही बहुत अधिक (विषाक्त) । इंजेक्शन डीएनए एकाग्रता और अभिव्यक्ति स्तर के बीच संबंध कई कारकों पर निर्भर है (उदा., प्रवर्तक), और इस प्रकार empirically निर्धारित किया जाना चाहिए । वैकल्पिक रूप से, ब्याज की जीन सीधे संकुल द्वारा germline में एक fluorophore के साथ लेबल किया जा सकता है नियमित रूप से Interspersed लघु Palindromic दोहराता (CRISPR) आधारित लेबलिंग प्रक्रियाओं29,30। हालांकि इस दृष्टिकोण अपने सबसे शारीरिक जीनोमिक संदर्भ में fluorophore स्थानों, यह हमेशा आवश्यक या वांछनीय भी नहीं है (जैसे, जब प्रोटीन बहुत कम स्तर पर व्यक्त की है) । यह, तथापि, सबसे अच्छा विकल्प हो सकता है, उदाहरण के लिए अगर ब्याज की जीन बहुत बड़ी है ।

नहर दृश्य नहर है कि एक fluorophore द्वारा कोशिका नहर पर प्रकाश डाला जाएगा में transcriptional निर्माण निर्देशन द्वारा पूरा किया जा सकता है । इसके विपरीत, लेबलिंग उपसेलुलर नहर घटकों एक शोधों संलयन जहां पूर्ण लंबाई जीन फ्रेम में fluorophore एंकोडिंग जीन से जुड़ा हुआ है की आवश्यकता है । जब अभिव्यक्ति के लिए एक नहर विशिष्ट प्रवर्तक का उपयोग (बजाय जीन के अपने प्रमोटर), इसकी पसंद प्रमोटर की शक्ति पर आधारित होना चाहिए और विकासात्मक विश्लेषण के लिए, अपनी अभिव्यक्ति के समय । कई निकालनेवाला नहर विशिष्ट जीन लार्वा चरण से पहले व्यक्त नहीं करते हैं जब नहर के परासरणी समारोह महत्वपूर्ण हो जाता है; बहुत देर से अपने सक्रिय विस्तार चरण (एर्म-1 और पेशेवरों-1 के विश्लेषण के लिए जल्दी जीन व्यक्त कर रहे हैं)10,13। निकालनेवाला नहर इंडो के मार्करों के लिए उदाहरण-और प्लाज्मा झिल्ली और नहर विशिष्ट प्रवर्तकों के लिए टेबल 1 और 2, क्रमशः में दिया जाता है, और संसाधनों के अतिरिक्त नहर में विशिष्ट अणुओं को खोजने के लिए 3। इन संसाधनों को भी एक पहले से ही उपयुक्त फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन है, जो Caenorhabditis जेनेटिक्स सेंटर (CGC; भी तालिका 1देखें) के माध्यम से उपलब्ध हो सकता है खोजने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस तरह के प्रोटीन फ्यूजन की अभिव्यक्ति के लिए संयोजक plasmids का निर्माण, एक विभिंन क्लोनिंग तरीकों, विशिष्ट पेशेवरों और विपक्ष के साथ प्रत्येक का उपयोग कर सकते है (14कहीं पर चर्चा की) । इनमें पारंपरिक प्रतिबंध एंजाइम आधारित क्लोनिंग दृष्टिकोण, यहां वर्णित है, मॉड्यूलर क्लोनिंग एकाधिक गेटवे सिस्टम31, गिब्सन विधानसभा३२, या रिपोर्टर जीन निर्माण द्वारा "पीसीआर सिलाई" विधि14 का उपयोग कर शामिल ,३३. इन विभिंन तरीकों को germline और/या अंय विशिष्ट आवश्यकताओं में उनके परिचय के लिए चयनित विधि के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, बहुमुखी गेटवे प्रणाली बड़े पैमाने पर लेबल के दृष्टिकोण के लिए प्रमोटरों और cDNAs के फेरबदल की सुविधा) . देखभाल के लिए fluorophore के लिए सही प्रविष्टि साइट का चयन करने के लिए ले जाया जा करने की जरूरत है (यह N-बनाम सी में जोड़ने-प्रोटीन की टर्मिनस), ध्यान में ब्याज की प्रोटीन के समारोह में ले ।

जीन फंक्शन के साथ व्यवधान
कई संभव तरीके से एक के रूप में perturb जीन समारोह में सी एलिगेंसमें, इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक लक्षित RNAi बातचीत के लिए एक सिस्टिक नहर लुमेन phenotype, एक लुमेन झिल्ली घटक व्यक्त द्वारा प्रेरित संशोधित करने के लिए डिज़ाइन स्क्रीन । इस विशिष्ट मामले में, एक शिखर/लुमेन एर्म-1 के रूप में जुड़े मार्कर को व्यक्त करने सीधे वांछित लक्ष्य के लिए जांच मार्गदर्शन का लाभ है: intracellular शिखर/लुमेन झिल्ली के विश्लेषण के उत्पत्ति । एक लाभ की-समारोह phenotype से उत्पंन भी कुछ लाभ प्रदान करता है जब एक हानि के साथ संयुक्त समारोह (RNAi) बातचीत स्क्रीन के रूप में यहां वर्णित (३४ देखें नुकसान की चर्चा के लिए और लाभ-समारोह का विश्लेषण और आनुवंशिक स्क्रीन के डिजाइन) । इसके अलावा, एर्म-1 ही एक अच्छी तरह से जांच की है "लुमेन morphogenesis" और शिखर झिल्ली पहचान अणु12. इसलिए, इस मामले में, एक लक्षित (बजाय निष्पक्ष) स्क्रीन लुमेन morphogenesis के लिए सीधे जानकारीपूर्ण होने की संभावना है, जबकि concomitantly आगे निस्र्पक एर्म-1s इस प्रक्रिया में विशिष्ट समारोह । हालांकि, एक निष्पक्ष गैर लक्षित स्क्रीन एक समान फैशन में आयोजित किया जा सकता है, एक जंगली प्रकार के पशु के साथ या तो शुरू, एफ के साथ एक ट्रांसजेनिक पशुluorescently लेबल निकालनेवाला नहरों, या किसी भी नहर उत्परिवर्ती के साथ । सामांय लाभ और RNAi के नुकसान (जैसे, mutagenesis बनाम) के नुकसान की पीढ़ी समारोह phenotypes के लिए, और संचालन और सी. एलिगेंस में आनुवंशिक स्क्रीन के विभिंन प्रकार की चर्चा कर रहे है कहीं और चर्चा ३४. RNAi phenotypes की एक स्पेक्ट्रम का उत्पादन, मामूली phenotypes, अक्सर घातक tubulogenesis जीन के विश्लेषण के लिए एक विशिष्ट लाभ भी शामिल है । यह वर्णन किया गया है और आंतों tubulogenesis पर साथ कागज में चर्चा की3। विभिंन दृष्टिकोण लाभ और हानि के उत्पंन करने के लिए समारोह म्यूटेंट और शास्त्रीय आनुवंशिक प्रक्रियाओं ऐसे पार के रूप में, विस्तृत और सामांय आनुवंशिकी तरीकों साहित्य20में चर्चा कर रहे हैं ।

माइक्रोस्कोप और tubulogenesis phenotypes का मूल्यांकन
नेत्रहीन मूल्यांकन और सरल स्कोरिंग पैरामीटर (जैसे नहर लंबाई और लुमेन व्यास के रूप में) का उपयोग करके एक फ्लोरोसेंट विदारक माइक्रोस्कोप के तहत एक अच्छी तरह से परिभाषित नहर phenotype के संशोधन स्कोरिंग, के रूप में यहां वर्णित है, समय की एक छोटी अवधि में प्राप्त किया जा सकता यहां तक कि जब एक लक्षित या व्यवस्थित आनुवंशिक या RNAi स्क्रीन में पशुओं की बड़ी संख्या प्रसंस्करण । इसके विपरीत, एक समान उपंयास नहर morphogenesis phenotypes के लिए एक तनाव है कि जंगली-प्रकार है में खोज स्क्रीन (इसके नहर लेबलिंग transgene के लिए छोड़कर), और अधिक समय लगता है, लेकिन कर सकते हैं, सिद्धांत रूप में, एक ही फैशन में प्रदर्शन किया (हम बाहर किया है ऐसे कई महीनों में एक जीनोम व्यापक आधार पर स्क्रीन) । ऐसी स्क्रीन एकाधिक अलग नहर phenotypes की पहचान करेगा (यहां नहीं दिखाया गया है) और इसलिए तदनुसार अलग स्कोरिंग मापदंडों का विकास करना चाहिए, उदा, एक गुणात्मक वर्गीकरण योजना (देखें 9,11, ३५,३६,३७,३८ विभिंन तरीकों के लिए स्कोर को विदारक माइक्रोस्कोप द्वारा नहर phenotypes) । जब किसी भी नहर phenotype व्याख्या, यह ध्यान में रखना है कि पुटी गठन इस पतली ट्यूबलर संरचना के लिए कई अलग अपमान का एक विशिष्ट प्रभाव हो सकता है महत्वपूर्ण है, और यह अक्सर एक कम जानकारीपूर्ण टर्मिनल phenotype है । पुटी आकार और स्थान, दूसरी ओर, जानकारीपूर्ण हो सकता है, उदा, एक पुटी नहर सेल के लिए बंद (नहर विस्तार के शुरू में), नहर की लंबाई के साथ अल्सर, या नहर सुझावों पर अल्सर, दोष के अंतर्निहित तंत्र के लिए सुराग प्रदान करते हैं । नहर अल्सर (यहां इंट्रा-लुमेन द्रव-भरे spheroids के रूप में परिभाषित एक शिखर/लुमेन से घिरा हुआ) बुलबुले से प्रतिष्ठित किया जाना चाहिए (छोटी cytoplasmic झिल्ली-बाध्य द्रव भरा spheroids) या vacuoles (बढ़े cytoplasmic झिल्ली बंधे द्रव भरा spheroids), एक लुमेन झिल्ली से घिरा हुआ नहीं है, कि सभी सतही समान देख सकते है (चित्र 4a-डी) । Cytoplasmic vacuoles इसी तरह secondarily पैदा कर सकते हैं, बढ़ते समाधान (सोडियम azide) के विषाक्त प्रभाव के माध्यम से उदा. दोनों, बड़े अल्सर और cytoplasmic vacuoles जानवर के लगभग आकार ले सकते हैं, और आगे शास्त्रीय "स्पष्ट (Clr)" नहर phenotype कि शरीर गुहा में तरल पदार्थ के संचय के कारण होता है से प्रतिष्ठित होने की जरूरत है । अंत में, नहर की लंबाई लगभग हमेशा secondarily सिस्टिक नहरों में समझौता किया है, इसलिए एक सच्चे नहर विस्तार दोष एक पुटी मुक्त सेटिंग में प्रदर्शन करने की जरूरत है ।

उनके छोटे व्यास के बावजूद, निकालनेवाला नहरों के उपसेलुलर घटकों, जैसे शिखर बनाम बेसल झिल्ली, intracellular endosomal बनाम canalicular बुलबुले, intracellular organelles और cytoskeletal घटकों, उच्च द्वारा visualized किया जा सकता है आवर्धन, जैसे, फोकल माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2, चित्रा 4) । द्वारा फोकल इमेजिंग, एक GFP सकारात्मक नहर अकेले कोशिका एक गैर फ्लोरोसेंट लाइन (चित्रा 2a, चित्रा 4E) के माध्यम से नहर कोशिका से लुमेन भेद करने के लिए पर्याप्त है । मार्करों की पहचान endosomal बुलबुले से canalicular को हल करने के लिए योगदान देता है (भी स्पष्ट रूप से आकार में अलग), हालांकि निश्चित आवंटन immunoelectronmicroscopy३९की आवश्यकता होगी । डबल और ट्रिपल लेबलिंग ब्याज की एक अणु के उपसेलुलर स्थानीयकरण और एक दूसरे के लिए उपसेलुलर घटकों के संबंध निर्धारित कर सकते है (चित्रा 2) । एकल लेबल लुमेन नहर झिल्ली कोशिका या बेसल झिल्ली के रूप में एक ही डबल लाइन का उत्पादन है, लेकिन डबल या ट्रिपल लेबलिंग के माध्यम से प्रतिष्ठित किया जा सकता है । फोकल विश्लेषण के लिए, उचित बढ़ते महत्वपूर्ण है, नहर संरचना की कमजोरी को देखते हुए, परासरणी परिवर्तन करने के लिए अपनी संवेदनशीलता, और इसके सबसे अक्सर सिस्टिक phenotype की भेद्यता । अल्सर परासरणी परिवर्तन या शारीरिक दबाव के साथ आसानी से फट, सोडियम azide के रूप में झिल्ली विषाक्त पदार्थों के प्रति संवेदनशील हैं, और भी कुछ स्थिरीकरण के लिए इस्तेमाल किया निश्चेतक के प्रति संवेदनशील हैं (यह भी cytoplasmic vacuoles उत्पादन कर सकते हैं). हमारे हाथ में, M9 बफर में 5% lidocaine सबसे निकालनेवाला नहर परख के लिए सबसे अच्छा काम करता है । इमेजिंग प्रक्रियाओं और सभी हैंडलिंग कोमल होना चाहिए, के रूप में वर्णित है । phenotypes (जैसे, अल्सर और vacuoles) नकल कि कलाकृतियों से बचने के लिए, यह तुरंत बढ़ते के बाद छवियों को प्राप्त करने के लिए सबसे अच्छा है । यदि यह संभव नहीं है, पुटी छवियों पहले प्राप्त किया जाना चाहिए, इमेजिंग अन्य phenotypes से पहले. इस प्रोटोकॉल मानक स्कैनिंग फोकल माइक्रोस्कोप की चर्चा है कि बेहतर फोकल प्रदान करता है, के रूप में कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोपी की तुलना में जो, इसके विपरीत में, phototoxicity कम कर देता है और के गतिशील परिवर्तन के विश्लेषण के लिए पसंद की माइक्रोस्कोपी है समय के साथ उपसेलुलर घटक । उपसेलुलर गतिशीलता पर इस तरह के सवाल भी photobleaching तकनीकों का उपयोग करके संबोधित किया जा सकता है या फोटो स्विच fluorophores कि रंग बदलने के साथ लेबलिंग फ्यूजन४०। अंत में, संकल्प की सीमा आगे संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि, उच्चतम संरचनात्मक लेकिन नहीं आणविक संकल्प प्रदान) जोड़ने के द्वारा वृद्धि की जा सकती, सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी (नैनोमीटर रेंज में आणविक संकल्प प्रदान); या immunoelectronmicroscopy (प्रदान दोनों)३९,४१। 3 डी टोमोग्राफी उनि धारावाहिक वर्गों के साथ जोड़ा जा सकता है और निकालनेवाला नहरों9,10के canalicular-प्लाज्मा झिल्ली इंटरफेस के विश्लेषण के लिए विशेष रूप से उपयोगी है । इन अलग अलग इमेजिंग दृष्टिकोण के इन विभिंन प्रकार के और संयोजन के लिए बेहतर तकनीक विकसित किया जा करने के लिए जारी है ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

हम Buechner (विश्वविद्यालय कैनसस, कैनसस, संयुक्त राज्य अमेरिका), के Nehrke (विश्वविद्यालय रोचेस्टर चिकित्सा केंद्र, रोचेस्टर, ंयूयॉर्क, संयुक्त राज्य अमरीका), और Caenorhabditis जेनेटिक्स केंद्र, स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा वित्त पोषित, अनुसंधान के कार्यालय के बुनियादी ढांचे का धंयवाद कार्यक्रम (P40 OD010440) । यह काम पलाश NIH GM078653 द्वारा समर्थित था, MGH २२४५७० है और साे २२३८०९ को V.G.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cloning
Plasmid pPD95.75 Addgene Cat. No. 37464
PCR Kit Qiagen Cat. No. 27106
Ligation kit New England Biolabs Cat. No. E2611L
DNA marker Thermo Scientific Cat. No. SM1331
Agarose DNA grade Fisher Scientific Cat. No. BP164-100
Competent cells New England Biolabs Cat. No. C2987H
Tris Fisher Scientific Cat. No. BP154-1
EDTA Sigma Cat. No. ED-1KG
Acetic acid Fisher Scientific Cat. No. A38S-500
Ethidium bromide Fisher Scientific Cat. No. BP1302-10
Equipments
PCR machine  MJ Research Cat. No. PTG-200 
Centrifuge Eppendorf  Cat. No. 5415C
Water Bath Precision Scientific  Cat. No. 666A3 
Gel running instrument Fisher Scientific Cat. No. 09-528-165
Gel running power supply Fisher Scientific Cat. No. 45-000-465
Molecular Imager Gel Doc XR System Bio-Rad Cat. No. 1708195EDU
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific Cat. No. ND1000
C. elegans related1 1see reference19 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates2 2see reference19 for protocols.
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Yeast Extract BD Biosciences Cat. no. 212750
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
Ampicillin Sigma Cat. no. A0116
Tetracycline Fisher Scientific Cat. no. BP912
M9 Medium2 2see reference19 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
Na2HPO4 Sigma Cat. no. S7907
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
NGM plates 2 2see reference19 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Peptone  BD Biosciences Cat. no. 211677
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
CaCl2 Sigma Cat. no. C3881
Cholesterol  Sigma Cat. no. C8667
K2HPO4  Sigma Cat. no. P3786
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
RNAi plates3 3see reference21 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Peptone  BD Biosciences Cat. no. 211677
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
CaCl2 Sigma Cat. no. C3881
Cholesterol  Sigma Cat. no. C8667
K2HPO4  Sigma Cat. no. P3786
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
IPTG  US Biological Cat. no. I8500
Carbenicillin Fisher Scientific Cat. no. BP2648
NaOH Fisher Scientific Cat. no. SS266-1
Sodium hypochlorite Fisher Scientific Cat. no. 50371500
Bacteria
OP50 bacteria CGC
HT115 bacteria CGC
Genome-wide RNAi libraries
Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref21,58,59) Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref60) Source BioScience
Imaging related
Lidocaine MP Biomedicals,LLG Cat. no. 193917
Materials
Vacuum Grease Silicone Beckman Cat. no. 335148
Microscope slides  Fisher Scientific Cat. no. 4448
Tissue culture plate, 6 well  Corning Inc. Cat. no. 08-772-33
Equipment
SMZ-U dissecting microscope (Nikon)
SZX12 dissecting microscope (Olympus), equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions).
TCS SL Laser-scanning confocal microscope (Leica Microsystem)
C2 laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope (Nikon)

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References

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<em>सी. एलिगेंस</em> निकालनेवाला नहर Intracellular लुमेन Morphogenesis के लिए एक मॉडल के रूप में और <em>Vivo</em> में एक एकल कक्ष में ध्रुवीकरण झिल्ली की उत्पत्ति: लेबलिंग द्वारा GFP-फ्यूजन, RNAi इंटरेक्शन स्क्रीन और इमेजिंग
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Zhang, N., Membreno, E., Raj, S.,… More

Zhang, N., Membreno, E., Raj, S., Zhang, H., Khan, L. A., Gobel, V. The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging. J. Vis. Exp. (128), e56101, doi:10.3791/56101 (2017).

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