Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

התעלה Excretory C. elegans כמודל עבור מורפוגנזה לומן תאיים ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן בתא יחיד: תיוג על ידי התכה GFP, RNAi אינטראקציה עם המסך הדמיה

Published: October 3, 2017 doi: 10.3791/56101
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1,3, 1, 1
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Developmental Biology and Genetics Core, Massachusetts General Hospital for Children, Harvard Medical School, 2College of Life Sciences, Jilin University, 3Faculty of Health Sciences, University of Macau

Summary

התעלה excretory C. elegans הוא מודל תא בודד ייחודית לניתוח חזותי ויוו של דה נובו מקוטב ממברנה להן. פרוטוקול זה מתאר שילוב של גישות, וישימה זיהוי ואפיון של מולקולות בימוי חד־תאיות tubulogenesis, הפסגה להן קרום ו לומן סטנדרטי גנטי/RNAi והדמיה.

Abstract

התעלות excretory 4 C. elegans הינם צינורות צרים מורחב לכל אורך החיה של תא בודד, עם endotubes תאיים כמעט באותה מידה רחוק מורחב זה לבנות ולייצב את לומן עם קרום, submembraneous שלד התא אופי הפסגה. התא excretory מרחיבה את אורכו כ 2000 פעמים ליצירת תעלות אלו, מכין מודל זה ייחודי להערכה ויוו של דה נובו מקוטב ממברנה להן, מורפוגנזה לומן תאיים ו חד־תאיות tubulogenesis. פרוטוקול המוצגת כאן מראה כיצד לשלב תקן תיוג, רווח, הפסד-של-פונקציה גנטית או התערבות ב RNA (RNAi)-, וגישות מיקרוסקופיים לשימוש מודל זה כדי לנתח באופן חזותי ולנתח באופן פונקציונלי תהליכים אלה ברמה המולקולרית. כדוגמה של גישה תיוג, הפרוטוקול מתאר את הדור של חיות הטרנסגניים עם חלבונים פיוז'ן פלורסנט לניתוח בשידור חי של tubulogenesis. כדוגמה של גישה גנטיים, זה מדגיש את נקודות המפתח של חזותי מבוסס-RNAi אינטראקציה מסך המיועד לשינוי הפנוטיפ רווח-של-הפונקציה לתעלה פיברוזיס. הן השיטות הספציפיות תיאר כיצד: תווית והמחש התעלות בהבעת פלורסנט חלבונים; לבנות ספרייה RNAi יישוב ו אסטרטגיה RNAi הקרנת לניתוח מולקולרית של תעלת מורפוגנזה; מבחינה ויזואלית להעריך שינויים של תעלת פנוטיפים; ציון אותם על ידי לנתח פלורסצנטיות מיקרוסקופ; לאפיין את תעלת subcellular הרכיבים ברזולוציה גבוהה יותר על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית; ולכמת פרמטרים חזותי. הגישה היא שימושית עבור החוקר מעוניין ניצול תעלת excretory C. elegans עבור זיהוי ואפיון גנים המעורבים בתהליכי phylogenetically שנשמרת לומן תאיים ו חד־תאיות מורפוגנזה שפופרת.

Introduction

כל האיברים הפנימיים מורכבים של צינורות, חיונית עבור שלהם פונקציות שונות, כגון תחבורה, חילופי גזים, נוזלים וחומרים מזינים, את הפרשת פסולת מטבולית. אופיים מקוטב, עם ממברנות הפסגה, lumenal ברורים, מותאמת עבור פונקציות ספציפיות אלה, ויש פגמים להן המערכות שלהם אנדו - ואת קרום פלזמה הגורם השכיח של מחלות אנושיות1,2. הרוב המכריע של צינורות של להערכת ושל האיברים הפנימיים הם multicellular ויוצרים לומן intercellularly; עם זאת, חד־תאיות צינורות, היוצרים לומן intracellularly, ניתן, לדוגמה, לייצג בדיוק כמו 30%-50% של מיטות נימי האנושי2. הממברנות מקוטב של רב - וצינורות חד־תאיות דומים בהרכב, למרות microdomains שלהם עשויים להיות שונים בהתבסס על התפקוד המסוים של הצינור (למשל, תעלת excretory canaliculi לעומת microvilli מעיים ב Caenorhabditis elegans; ראה המלווה נייר על tubulogenesis מעיים C. elegans )3. עקרונות להן קרום מקוטב tubulogenesis נשמרים בין metazoans, מכונות מולקולרי דומה ומכוונת אותם1,2,4.

מערכת excretory C. elegans מורכב של חמישה תאים: תא excretory (EC), צינור תא (DC), הנקבוביות התא (PC) ואת שני תאים בלוטת. אבלציה של EC, DC או PC גורמת להצטברות נוזלים לתוך חלל הגוף ולמות חיות את הפרפרים והעשים מוקדם5. מסקרן, אלה שלושה צינורות חד־תאיות ליצור שלהם לומן בשלוש דרכים שונות: על ידי תא הולו (EC); תא גלישת בשילוב עם היווצרות צומת autocellular (PC); על-ידי גלישת תא ביחד עם autofusion (DC); מנגנונים שונים של לומן מורפוגנזה כי הם phylogenetically שנשמרת6,כל7. EC, הממוקם בצד הלטראלי השמאלי של הנורה בלוע האחורי, שולח שתי הרחבות לרוחב אשר התעלות ארבע להתרחב להאריך anteriorly, posteriorly (בצד שני מימין ומשמאל) קצה האף של התולעת וזנב , בהתאמה (איור 1)5,6,8. EC נמשך כ 1 מיקרומטר 2 x 1,000 מיקרומטר, שהופך אותו התא הגדול ביותר החיה. ברמה subcellular, התעלה excretory הוא צינור פשוטה, המופקים קרום הבסיס מכוונים את pseudocoelom, ואת חפר על ידי קרום lumenal (endotube). קרום lumenal תעלת מתחבר צינור קרום lumenal בצומת רק המערכת שלה; התעלות הן אחרת junctionless לאורך שלהם אורכי (איור 1). קרום lumenal תעלת excretory שלד התא שלו submembraneous הם הפסגה, שהוגדרו על-ידי ההרכב המולקולרי שלהם, הדומה ההרכב של קרום הפסגה, שלד התא submembraneous צינוריות multicellular, כגון המעי, ושל אחרים (למשל, שטוח) epithelia. Organelles cytoplasmic, כולל endosomal vesicular, אחרים (למשל, גולג'י) endomembranes מופצים לאורך התעלה. בנוסף, שלפוחית canalicular מרובים - מחובר ממברנה lumenal, ו/או מחוברים או מבודד - מושחלים דרך תעלת הציטופלסמה7,8,9,10 . חיבור פלזמה-ממברנה/canalicular דינמי זה עוד יותר מרחיבה את מערכת קרום של התעלה ותורם בשני לומן מורפוגנזה ו- osmoregulation10. התעלה excretory וכך מורכב כמעט כולו אנדו - ממברנות פלזמה, מתן מודל מצוין עבור הניתוח של קרום מקוטב להן ועל ויסות אנדו-ממשק קרום פלזמה. הרחבה דרמטית של קרום הפסגה במהלך מורפוגנזה תעלת - במערכת זו תא בודד חופפת לומן סיומת – גם מאפשרת לנתח את הבעיות אדריכלי הנובעים על ידי צורך לייצב ובאמצע של הממברנה lumenal תאיים . פרוטוקול זה מתמקדת על הניתוח של מורפוגנזה מבנית של התעלה צינור של לומן, את הדינמיקה ממברנה תאיים הדרושים עבור תהליך זה, ולא על האותות לכוון את התנועות תאים המייצרים בעמדה של EC מערכת excretory ולבנות אתהקשרים מורכב מאלמנטים אחרים התאית (נבדקה ב6).

יתרון נוסף של המערכת תעלה תא בודד C. elegans לניתוח של קרום מקוטב, לומן תאיים להן הוא היכולת להפריד, בזמן התפתחותית, הדור של מרכיבים שונים של ממברנות שלה לעיקולים ומעברים. הנציבות האירופית נולד בזמן הסגר הגחון לבין מתיישב ventro-רוחבית של הלוע במהלך אמצע מופרה5,6,8, שבמהלכן זמן לרוחב התעלה והסיומת מסעף לבצע. זה ואחריו תעלת הקדמי-אחוריים סיומת במהלך מופרה מאוחר, תהליך הנמשך אל תוך L1-הזחל (איור 1). זחל בימיו, הקצה האחורי התעלה מגיע בערך באמצע של התולעת, מלא לכיוון הזנב בסוף השלב L1, לאחר זמן תעלת מאריך יחד עם תולעת8. תעלת פעיל הצמיחה במהירות העולה על זה של הצמיחה של החיה ובכך מסתיימת בשלב הזחל הראשון, עם זאת, בהמשך צמיחה מתרחשת במקביל עם הצמיחה של כל החיות הזחל נוספים (L2 – 4). הגדרה זו מספקת את ההזדמנות כדי לנתח שלבים שונים של דה נובו מקוטב להן קרום עצמאית של חלוקת התא מקוטב או העברה. יתר על כן, הוא מאפשר את ההפרדה של תהליך זה מההרכבה של צמתי (אשר מתרחשים העובר לפני תחילתן לומן); דרישה המדויק שלהם בתוך הממברנה קיטוב הוא עדיין שאלה פתוחה בשטח קוטביות. בסופו של דבר, זה ייחודי מפריד הפסגה של התרחבות קרום הבסיס, התהליך האחרון שלפני לשעבר תעלות excretory10. המודל תעלת excretory C. elegans ולכן הוא מהווה השלמה אינפורמטיבי במיוחד למודל מעיים משתף מספר יתרונות אלה לניתוח של קרום מקוטב להן אך מבוצע זה באווירה multicellular (ראה העיתון הנלווה על מעיים tubulogenesis3).

למרות פראי-סוג תעלות בקוריאנית ודק במיוחד בתולעת קטנה זו, לומן שלהם יכול להיות השישיsualized ישירות על-ידי Nomarski אופטיים בחיה שקוף. למעשה, ניתן לאפיין מורפולוגיות תעלת פיברוזיס המוטציות בבעלי ללא תווית באמצעות הגדלה נמוכה לנתח מיקרוסקופ, אשר שימש אפקט נהדר במסכים גנטי קדימה כדי לזהות גנים המעורבים tubulogenesis11. ויזואליזציה משופרת של המורפולוגיה של תעלות, ההבחנה של הקרומים מקוטב שלהם, רכיבי cytoskeletal, organelles תאיים שונים ומבנים אחרים subcellular, עם זאת, דורש תיוג, גבוה יותר כוח פלורסנט ויבתר ו קונאפוקלית מיקרוסקופ. למרות המבנה הדק של התעלות מציב מספר קשיים על תיוג, מיקרוסקופ, ממברנות ורכיבים subcellular ניתן להבחין דרך ייחודית כל תא מולקולות ספציפיות, בעלי חיים יכול להיות בבטחה מותקן עבור מיקרוסקופ אם זהירות מסויימים נלקחים כדי למנוע החדרת חפצים (ראה פרוטוקול של דיון). תיוג יכול להיעשות אימונוהיסטוכימיה בדגימות קבוע, או על ידי יצירת תולעים הטרנסגניים המבטאים חלבונים פיוז'ן פלורסנט תחת השליטה של משלהם או excretory היזמים תעלת ספציפי עבור הדמיה ויוו . פרוטוקול זה מתאר את שיטת תיוג האחרון (ראה את העיתון הנלווה tubulogenesis מעיים עבור נוגדן מכתים3).

היכולת לשלב ויוו הפסד או רווח-של-פונקציה לימודים עם ויוו הדמיה האנליזה התא הבודד רמה לאורך כל גורם פיתוח התעלה excretory C. elegans מודל חזק במיוחד מולקולרית ו ניתוח הסלולר של חד־תאיות tubulogenesis. קדימה או אחורה מסכי גנטי יכול להתבצע החל חיה הטרנסגניים פראי-סוג או שכותרתו לזהות תעלת מורפוגנזה פנוטיפים (למשל, ציסטות) פגמים הגן הבסיסי שלהם. לחלופין, מסכי כזה ניתן להתחיל עם הפנוטיפ המוטנטי (למשל, תעלה פיברוזיס), לזהות מדכאי או משפרי של פנוטיפ זה לזיהוי גנים המקיימים אינטראקציה פונקציונלית עם הגן הגורם של פנוטיפ מוטציה. הפגם הגנטי גורם של פנוטיפ מוטציה יכולה לגרום לאובדן (למשל, via -ג'ין מחיקה) או רווח (למשל, באמצעות מוטציה הפעלת או דרך המבוא של ג'ין עודף עותקים) של הפונקציה ובדוקים. מוטגנזה מכוונת קדימה או מסכי RNAi שיטתית ללא דעות קדומות על תפקוד הגן, מאפשרות זיהוי גנים המעורבים בפונקציה של עניין לא משוחדת. לאור זמינותו של ברמת הגנום RNAi האכלה ספריות, כמעט בכל גן יכול להיות בקלות הפיל ידי RNAi ב- C. elegans, כך גנטית יחיד בכל עניין או כל קבוצה של גנים (למשל, במסכים יישוב) יכול גם להיות במהירות ובחן על השפעתם בגישה הפוכה גנטיקה. להפגין שילוב אפשרי של גישות, כאן נתאר מסך יישוב אינטראקציה RNAi, החל מוטנט רווח-של-הפונקציה לתעלה excretory פיברוזיס, המסומנת חלבון פלואורסצנטי ירוק cytoplasmic התעלה (GFP). פנוטיפ מוטציה נוצר על ידי ביטוי של אמ-1, שנשמרת מאוד C. elegans ortholog של משפחת מקשר ממברנה-אקטין אזרין-Radixin-Moesin (ERM), אשר היה מעורב מורפוגנזה לומן, ממברנה ארגון מינים רבים12. C. elegans ERM-1. רגישה לממברנות lumenal של איברים פנימיים, כגון excretory תעלת המעי, ו נדרש עבור לומן היווצרות שני13. ביטוי ERM-1 מגייס אקטין עודף ושלפוחיות על קרום תעלת lumenal, הגדלת השטף לתוך לומן, הפקת תעלה פיברוזיס קצר ואת קרום lumenal הכיווץ אקטין מעובה פרווה9. הפרוטוקול מתאר כיצד ליצור זנים הטרנסגניים עם excretory הביע תעלת שכותרתו פיוז'ן חלבונים (או חלבונים אחרים); כיצד לבצע יישוב מסכי RNAi החל זנים כאלה, כדי לזהות מודיפיקטורי הפנוטיפ התעלה; ואיך לנתח את התוצאות של מסכים כאלה באופן חזותי באמצעות מיקרוסקופ ויבתר ו קונאפוקלית פלורסצנטיות, כולל דרכים פשוטות כדי לכמת פנוטיפים tubulogenesis אינפורמטיבי. ניתן למצוא חלופה תיוג הפרטים של RNAi, התרגלו הגנים tubulogenesis לעתים מזומנות קטלנית, וטכניקות בעיתון הנלווה על מעיים tubulogenesis3. כל השיטות יכול לשמש בשילובים שונים עבור החקירה של שאלות נוספות על תעלת tubulogenesis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תיוג התעלה Excretory C. elegans מאת חלבונים פיוז'ן פלורסנט 14

הערה: לראות את הנייר הנלווה על מעיים tubulogenesis 3 סימון על-ידי בחיי עיר נוגדן מכתים הליכים ומצוידת התעלה excretory. ראו טבלה 1 לדוגמאות של מולקולות הוכח שימושית ליצירת אפקטים של C. elegans תעלת excretory אנדו - ו ממברנות פלזמה, שולחן 2 לדוגמאות של היזמים שנוסעים ביטוי התעלה excretory, ו טבלה 3 עבור משאבים עבור אוספי מקיף יותר של סמנים, היזמים, כולל הפניות דנים את מבחר שונה fluorophores.

  1. בניית רקמות פלסמידים סמן פלורסנט ספציפיים על-ידי אנזים הגבלה המבוסס על שיבוט 15
    הערה: ראו דיון על טכניקות חלופיות לבנות פיוז'ן פלורסנט חלבונים.
    1. זיהוי הרצף של האמרגן (עבור fusions תעתיק) או של הגן כל עניין עם האמרגן שלה (עבור translational fusions) ב- WormBase 44.
      הערה: עבור היזמים, כ 1 – 3 kilobase (kb) מספיקה עבור מרבית הגנים C. elegans. ניתן לבנות חלבונים פיוז'ן translational גם על-ידי הצבת הגן עניין תחת יזם ספציפי תעלה excretory (ראה טבלה 2).
    2. עיצוב ואחורה צבעי יסוד הגברה של האמרגן (עבור fusions תעתיק) ו/או גן מלא עם יזם (עבור translational fusions). להוסיף אנזים הגבלה linkers-5 ’, 3 ’ קצוות תחל.
      הערה: בחר אנזימי הגבלה הנוכחים וקטור פלסמיד (למשל, pPD95.79) 16. עבור translational fusions, 3 ’ מקשר (linker) צריך להיות מתוכנן כך לאחר עיכול אנזים הגבלה מצדו עם וקטור, המסגרת codon הוספה יהיה רציף עם codons של fluorophore, למשל, ה-GFP. אחד ייתכן שעליך להוסיף 1 או 2 בסיסים נוספים linkers אנזים הגבלה טיפוסית 14; להקפיד כדי לא ליצור stop codon.
      3. תגובת שרשרת
    3. בצע פולימראז (PCR) כדי להגביר את יזם או גנים באורך מלא באמצעות תולעים חיות או פראי-סוג הדנ א cDNA כמו תבנית 15.
      הערה: בעת שימוש תולעים כתבנית, תחילה lyse תולעים פירוק מאגר (PCR מאגר בתוספת Proteinase K) 17. שלב מעורב תולעים יכול לשמש כתבנית. תולעים מורעבים יכול לשמש כדי למנוע זיהום חיידקי לדנ א.
    4. בצע agarose (1%) ג'ל אלקטרופורזה על מוצרים PCR לזיהוי הגודל הנכון של המוצר מוגבר.
      הערה: אם במידה נכונה, המשך לשלב הבא. אם להקות מרובים נוצרים, לשפר תנאים הגברה לייצר הלהקה יחיד. אם זה לא עובד, לחתוך את הלהקה הנכון של הג'ל, לטהר את ה-DNA על ידי בשיטות הרגילות 15 ולאחר מכן המשך עם הצעד הבא.
    5. בצע תקציר ההגבלה על המוצר PCR ועל את פלסמיד וקטור שמכיל את fluorophore (למשל, pPD95.79) צינורות נפרדת באמצעות בשיטות הרגילות 15.
    6. להפריד את DNAs מתעכל על ידי אלקטרופורזה בג'ל, elute את המוצר PCR, וקטור DNA להקות צינורות נפרדת.
    7. לטהר את DNAs של ג'ל פרוסות על-ידי שיטות תקן 15. למדוד את ריכוז הדנ א על ידי ספקטרופוטומטרים.
    8. מאתרים ומפסיקים את המוצר PCR, וקטור DNA על ידי בשיטות הרגילות, להפוך את DNAs רקומביננטי תאים המוסמכת על ידי בשיטות הרגילות 15.
    9. התפשט 10 μL, 50 μL ו- 100 μL של התאים טרנספורמציה על שלוש צלחות מרק לוריא (LB) בודדים בתוספת 50 אמפיצילין μg/mL-
      הערה: להפיץ כמויות שונות של תאים על גבי לוחות שונים עבור קשת של טרנספורמציה היעילות. למשל, ציפוי גם בצפיפות אינו רשאי לאפשר את הבידוד של המושבות אם השינוי הוא יעיל.
    10. דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת בבוקר, להוציא את הצלחות מן החממה.
      הערה: אם המושבות הם קטנים מאוד, תקופת דגירה של כמה שעות.
    11. הכן פלסמיד DNAs מן המושבות יחיד על ידי שיטות תקן 15. לערבב תבנית DNA ו תחל, ולשלוח. עבור רצף (בדרך כלל מתבצעות במרכז שירות הליבה).
    12. לקרוא את רצפי, לוודא את תקינות הבונה פיוז'ן.
      הערה: קריטית: לאשר את המסגרת הנכונה codon בין גנים שנוספו סמן פלורסנט ג'ין עבור תרגום fusions. באופן אידיאלי, רצף הגן כולו כדי לאשר כי אין מוטציה הוצגה ה-PCR ושגרות מצדו.
    13. לייצר יותר פלסמיד ה-DNA (באמצעות שלב 1.1.11) של הזרקת עבור שלב 1.2.
  2. דור של חיות הטרנסגניים מאת microinjection של ה-DNA של טרנספורמציה germline 18
    הערה: ראו הדיון על טכניקות חלופיות עבור היכרות עם transgenes. ההליכים מחולקת לרמות יכול לשמש כדי ליצור חיות הטרנסגניים שנושאים חלבון כימרי של זריחה או כל חלבון אחר עניין. למשל, חלבון אקסוגני יכול להיות הציג לאחרונה (למשל, ortholog heterologous) או יכול להיות שבקנדה (למשל, שלה מוטציה germline המתאימה לחילוץ) או overexpressed ליצירת הפנוטיפ (למשל, הזרקת חלבון אנדוגני erm - 1 שימש ליצירת פנוטיפ תעלת פיברוזיס של ביטוי המשמש כיעד עבור שינוי המסך אינטראקציה RNAi המתוארים להלן).
    1. מיקס לבנות DNA (1 – 50 ng/μL) עם סמן פלסמיד DNA (בדרך כלל 100 ng/μL), למשל סמן דומיננטי rol-6 (su1006) (ראה 1.2.3 עבור אפשרויות סמן).
      הערה: קריטית: ריכוז ה-DNA מוזרק להיקבע מדעית כדי למנוע את כניסתה של פנוטיפים artefactual (ציסטות, סיומת פגמים, lethality) כאשר ביטוי גנים התעלות excretory כי הם במיוחד רגיש הביטוי של transgenes. אפשר, למשל, להכין מספר תערובות של פלסמידים בריכוזים של 1 ng/μL, 10 ng/μL, 50 ng/μL ו- 100 ng/μL עם ng/μL 100 rol-6(su1006) לבחון את מגוון של ריכוזים לדור של זן בר קיימא עם הביטוי הרצוי או פנוטיפ (ריכוזים גבוהים עלולים להיות רעילים הלא ספציפית עבור תעלת מורפוגנזה ו יכול להיות קטלני).
    2. לסנן את התערובת דנ א דרך 0.22-μm (מיקרומטר) נקבובית גודל ספין-x צנטריפוגה צינור מסנן.
      הערה: אל תשאירו את המכסה של הצינור הפתוח כדי למנוע אבק שיכול לחסום את המחטים microinjection.
    3. Microinject פלסמידים רקומביננטי לתוך בלוטת המין של תולעים פראי-סוג או מוטציה על ידי בשיטות הרגילות לשינוי germline (ראה התייחסות 18 לפרטים הליך).
      הערה: תקן סמן פלסמידים הן, למשל: rol-6(su1006), dpy-20, unc-119, פא-1. Transgenes דומיננטי כמו rol-6(su1006) יוכנסו פראי סוג התולעים, ואילו transgenes להציל יוכנסו מוטציות המתאימים שלהם. סמן פלסמידים הן מוזרק משותפת עבור תחזוקה קלה של הקווים הטרנסגניים מאז extrachromosomal transgenes אובדים באופן אקראי במהלך חלוקת התא (ראה 1.2.8). כאשר הזרקת גנים קידוד עבור fluorophore fusions, אחד ניתן להשתמש גם את fluorophore, ה-GFP, המתקרא סמן. rol-6 המניע תולעים להתגלגל עצמם שבדרך כלל יתרון על ההערכה של פנוטיפים מורפוגנזה.
    4. תולעים העברה מוזרק אל Escherichia coli נזרע צלחות תולעים נימיות צמיחה בינוני (NGM) (למשל, פלטה/תולעים 5) (ראה התייחסות 19 עבור תקן C. elegans תרבות ושגרות אחזקה, טבלה של חומרים).
    5. דגירה הלוחות ולתת רומא לפתח ב- 20 ° C כ 3 ד
    6. לבחון הוא צאצא F1 תחת המיקרוסקופ ויבתר Rol תולעים (מתגלגל) (או כל הזרקה ספציפי הסמן השני, למשל GFP) ולבחור רולים tלוחות בודדים o.
    7. בחר צלחות עם מתגלגל F2 חיות ואשר נוכחותם של קרינה פלואורסצנטית תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות ויבתר (בדרך כלל כל החיות רולר הם GFP חיובי).
      הערה: F2 רולים מציינים הדור מוצלחת של קו מהונדס. שורות בודדות עשויה להיות שונה, למשל, לגבי קצב השידור transgene. לכן זה שימושי כדי לשמור ולאחסן כמה שורות.
    8. לשמור על הקווים הטרנסגניים על ידי העשרת את לוחיות הרישוי לבעלי סמן-חיוביים.
      הערה: ה-DNA מוזרק הוא שולב את germline כמערך extrachromosomal. קצב שידור עבור מערכים extrachromosomal הם משתנה אבל בדרך כלל בסביבות ~ 50%. כדי לא לאבד את המתח, לכן זה קריטי להעשיר באופן ידני קווים עם סמנים דומיננטי (למשל, קווים שאינו מאובטח על-ידי בחירה שלילי).
    9. להקפיא שורות הטרנסגניים בטכניקות מקפיא רגיל לאחסון לטווח ארוך ב-80 מעלות צלזיוס 19.
      הערה: Transgenes במערכים extrachromosomal גם ניתן לשלב את germline על ידי הקרנת UV ב צעד נוסף להניב הומוגני שורות 18. לדוגמה, erm-1 השתלב את germline על ידי הקרנת UV כדי להשיג את המתח ERM-1 [++] fgIs2[erm-1p::erm-1;rol-6p::rol-6(su1006)] שבו כל חיה נושאת את transgene, דרישה עבור השימוש בו מבוסס על RNAi אינטראקציה עם המסך המתוארת להלן. זן זה סומן בנוסף על ידי תעלת excretory cytoplasmic GFP דרך מעבר בזן המכיל vha-1 p:: GFP transgene (שנוצר על ידי אותם הליכים, כפי שתואר לעיל; ראה הפניה 20 לטירונות גנטי הליכים כגון צלבים) מתייחסים אליה כאל ERM-1 [++]; vha-1 p:: זן GFP למטה.

2. בניית ממוקד בספריה RNAi וכן העיצוב של המסך האינטראקציה RNAi לשינוי הפנוטיפ תעלת

הערה: מסך האינטראקציה הגנטית מבוסס-RNAi יישוב מתואר המשתמשת של פנוטיפ תעלת פיברוזיס ביטוי כדי חיפוש של אינטראקציה excretory תעלת מורפוגנזה גנים. המתח ERM-1 [++] (ראה שלב 1.2.9) משמש דוגמה 9. גישה זו מציגה רק באחד גישות אפשריות רבות עבור ניתוח גנטי של תעלת excretory לומן מורפוגנזה (ראו מבוא ודיון. גישות גנטיות אחרות). ראית את העיתון הנלווה על tubulogenesis מעיים 3 והפניות 17 , 21 , 22 על רקע על RNAi, הפרטים של RNAi נהלים, אפנון של כוח RNAi (מותאם הגנים tubulogenesis לעתים מזומנות קטלנית) ודיון של בעיות טכניות מחובר RNAi. ראה התייחסות 19 תרבות תולעת רגיל, תחזוקה, טבלה של חומרים.

  1. לחפש ERM-1 (או אחרות הגנים עניין) מולקולות שמעצבת מאגרי מידע, מאמרים-
    הערה: פוטנציאל ERM-1 interactors יכלול כל מולקולות אשר הוצגו ניסיוניים מבחינה תפקודית, גנטית או פיזית אינטראקציה עם חלבונים ERM בכל מין ו/או כהכרחיים לעשות זאת באמצעות כל סיליקו, תפוקה גבוהה או ביולוגיה מערכתית לגשת (ראו טבלה 3 לדוגמאות של מאגרי מידע ומשאבים).
  2. ליצור רשימה של כל הגנים ולמצוא את homologs C. elegans כאשר נדרש.
    הערה: שקול הרחבת רשימת הגנים שזוהה כיתות גן, אשר לוקח בחשבון את הפונקציה של הגן עניין ומצרה את הרשת לזיהוי interactors (למשל, עבור מקשר ממברנה-אקטין ERM-1, בחר כל actins ו מולקולות הקשורות אקטין).
  3. לזהות את חיידקי האכלה שיבוטים זמינים מסחרית הגנום כולו חיידקי RNAi ספריות עבור כל הגנים המתאימים RNAi (למשל, Ahringer גנומית C. elegans RNAi האכלה ספריית 21; טבלה של חומרים)
  4. ליצור גיליון אלקטרוני עבור כל הגנים שלהם צלחת RNAi המתאימה ואת מספר טוב.
  5. לבחור בעירום ~ 50 RNAi שיבוטים על צלחות ליברות/אמפיצילין/טטרציקלין (בחירה של אנטיביוטיקה נקבעת על-ידי בניית ספריה) ליום ואת המשך עד ממוקד RNAi ספריית נוצר.
    הערה: בהתאם גודל הספרייה זרימת העבודה המתוכננת, להשמיט יצירת ספרייה מלאה ולהמשיך ישירות עם ניתוח אצווה. ניתן לאחסן צלחות ב 4 ° C, לא יותר כשבועיים (במידת הצורך, מחדש בעירום על גבי לוחיות הרישוי אחרי זה). לעומת זאת, אחד ניתן ליצור ספריות קפוא גדולים יותר בתבניות 96-ובכן או 384-ובכן שכפל עבור אחסון לטווח ארוך ב-80 מעלות צלזיוס
  6. דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת בבוקר, להסיר את הלוחות של חממה וחנות ב-4 מעלות צלזיוס
  7. RNAi לאסוף חיידקים מן צלחת על ידי קיסם סטרילי, מערבבים חיידקים עם 600 μL ליברות/אמפיצילין מרק (50 ng/μL) ב- 1.5 mL microtube, דגירה הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס, לנער ה 6
    הערה: לחסן RNAi חיידקים לתוך המרק על ידי שפשוף האיסוף (tip קיסם או micropipette) לאורך צדי microtube.
    8. ΜL
  8. זרע 70 תרבותי חיידקים לתוך כל טוב של צלחות RNAi. ובכן 6 סטים כפולים או triplicate. דגירה הלוחות RNAi ב 22 ° C בלילה.
    הערה: צלחות RNAi שנוצר על ידי הליכים סטנדרטיים (טבלה של חומרים, הפניות 3 , 17 , 21), כאן להשתמש בטישו 6-ובכן תרבות עיצוב הצלחת לגישה תפוקה גבוהה יותר המאפשר עדיין על הערכה מיקרוסקופיים של תעלת מורפוגנזה בבעלי חיים על הלוחות.
    9. בוקר
  9. הבא, שלב L4 פיק 3 ERM-1 [++]; vha-1 p:: GFP תולעים על גבי כל טוב של הלוחות RNAi.
    1. כדי למנוע זיהום עם חיידקים OP50 (ראה התייחסות 19) המפריעות RNAi קודם זרע התולעים לצלחת NGM ללא חיידקים ולתת את החיות לזחול בערך 10 דקות. רק להשתמש בבעלי חיים בריאים שאינם מורעבים.
  10. דגירה הלוחות ב 22 ° C עבור בתלת-ממד לאפשר לבעלי חיים לייצר רומא-
  11. לבחון פנוטיפים התעלה ב F1 רומא תחת המיקרוסקופ פלורסצנטיות ויבתר.

3. אין ויוו הדמיה של התעלה Excretory C. elegans על-ידי קרינה פלואורסצנטית לנתח מיקרוסקופ והניקוד של פנוטיפים Tubulogenesis

  1. הכנת גיליון הניקוד פנוטיפ (לדוגמה שמוצג בטבלה 4 ו איור 5 ).
  2. מניחים על צלחת אגר עם תולעים ישירות מתחת dissectin ידי קרינה פלואורסצנטיתg מיקרוסקופ, המכסה פתוח של הצלחת להערכה, להשתמש הגדלה נמוכה יותר להתמקד.
    הערה: פרוטוקול זה מתאר את השימוש טווח ועם 1.5 X 10 X יעדים, טווח זום מ 3.5 45 (טבלה של חומרים).
  3. להעריך בעלי חיים על ידי התמקדות אחד טוב בנפרד, החל מ- 1 טוב, ולעבוד את הצלחת.
    הערה: תמיד להתחיל עם ההערכה של פקדים. למשל, מעושה (וקטורית ריק) שלילי שליטה (HT115 RNAi חיידקים (ראו הפניות 17 , 21) בלי או עם מוסף ג'ין לא קשורים), המתאים חיובי שולט, למשל, ב מסך זה האינטראקציה, erm-1 RNAi (מעלימה את פנוטיפ ERM-1 [++]) ו- sma-1 / spectrin RNAi (מגביר את פנוטיפ תעלת ERM-1 [++]).
  4. לבחון תחילה, כללי פנוטיפים לעין תחת אור בהיר (לדוגמה: תן/קטלני, Clr/נקה, Emb/עובריים קטלני, סטי/סטרילי, Unc/הקואורדינציה, Dpy/שמנמנה, וכו '), לכמת את גן # מושגים בסיסיים על ידי ספירת מספר הכולל חיות ומספר של בעלי חיים פנוטיפ, להקליט את המספרים (ראה טבלה 4).
    הערה: עבור נפילות של גנים גורם פגמים שעשויים להשפיע על הערכה של תעלת פנוטיפים (למשל, Emb, סטי), לשקול לחזור על הניסוי עם מותנה, פוסט עובריים RNAi (ראה המלווה נייר עבור שגרות 3 ).
  5. שנית, לבחון תעלת excretory פנוטיפים תחת אור ניאון, ציון פנוטיפים לכימות (למשל, אורך התעלה, רוחב של לומן, ציסטות), להקליט את המספרים ולתאר פנוטיפים על גיליון הניקוד (ראה טבלה 4, < מחלקה חזקה = "xfig" > איור 5).
    הערה: הגדלה גבוהה יותר עם טווח הזום נדרש להעריך פנוטיפים תעלת עדינים יותר. לנוע הלוך ושוב בין הגדלה נמוך וגבוה להעריך בזהירות את התעלה ’ s אורך, רוחב, כל פנוטיפ מורפוגנזה השני של התעלה. כימות או כימות למחצה של פנוטיפים פשוטה, לספור 100 בעלי חיים (למשל, L4s זה מסך RNAi יישוב; פנוטיפים: תעלה באורך של 1/4, 1/2, 3/4, מלא של תעלות האחורי, והסיומת לומן בקוטר של תעלות אחורי, קטן ציסטות (< 1/3 מרוחב בעלי חיים), ציסטות גדולות (> 1/3 של רוחב חיות); ראה טבלה 4).
  6. ידרשו תמונות של הפנוטיפים הדומיננטית לפחות 3 בעלי חיים שונים על ידי מיקרוסקופ רכוב מצלמה דיגיטלית תשלום מצמידים מכשיר (CCD), תוכנת הדמיה המתאימה (ראה טבלה של חומרים)
    1. לרכוש תמונות, תחילה להפעיל את המצלמה, המחשב המצורפת, לחץ פעמיים על סמל התוכנה לכידת התמונה, להתמקד על שטח של צלחת תולעת באופן ידני תחת הגדלה נמוכה ולפתוח תריס המצלמה.
    2. לחץ על “ מקדימה חיה ” סמל של תוכנה ללכידת תמונה על מסך המחשב כדי להמחיש את התולעים על מסך המחשב, להתאים את המוקד באופן ידני כדי בבירור להמחיש את התולעים על המסך ולאחר מכן לחץ “ הצמד ” הסמל, ואז לחץ “ שמור ” סמל.
      הערה: חיות יעברו מהר תחת אור ניאון, לכן לשמור יד אחת על עכבר המחשב מוכן תוך כדי הזזת את הצלחת לתוך האזור עניין עם היד השנייה. מיד ולחץ “ הצמד ” סמל לרכוש את התמונה. בדרך כלל ניתן לרכוש תמונה טובה עם נסיונות מספר.
    3. לשמור את התמונות רכשה עם שם קובץ נכונה (כולל שם זן, RNAi שיבוט שם ותאריך).
      הערה: תולעים פראי-סוג נע מהר יותר עם תעלות דק וארוך קשים יותר לשיקוף יותר מוטציות. מוטציות עם פיברוזיס תעלות ו/או אחרים פנוטיפים צפויים לנוע באיטיות, למוצא הדמיה. סמן פלסמידים כגון שבעזרתם יכול להיות שימושי עבור הדמיה על ידי שמירה על בעלי חיים “ על המקום ” ולא זז קדימה, ויש אולי גם מספק תצוגה משופרת על פנוטיפ עם החיה מתגלגל סביב עצמו.

4. הדמיה של התעלה Excretory C. elegans ברזולוציה גבוהה על ידי לייזר סורק מיקרוסקופיה קונפוקלית

  1. הרכבה בעלי חיים
    1. למקם כמות זעירה של גריז או וזלין בקצה ספוגית כותנה או על הקצה אינדקס באצבע, מורחים את המשחה כדי ליצור עיגול ודק במיוחד בקוטר של ~ 6 – 8 מ מ באמצע זכוכית נקי.
    2. מקום 6 μL 5% לידוקאין פתרון (הרדמה) לתוך העיגול באמצעות בנייה micropipette.
      הערה: פתרון לידוקאין המניות יכולה להיעשות על ידי המסת אבקה לידוקאין במים. לדלל כדי 5% עם M9 מאגר 19 (טבלה של חומרים). זה קריטי לניתוח של התעלה excretory כדי למנוע את הנייח פתרונות נפוצים (כגון אזיד הנתרן) שגורמים ציסטות להיקרע, זירוז זה תעלת פנוטיפים.
    3. לבחור מספר בעלי חיים מן צלחת RNAi, ומניחים אותם בתוך תמיסת לידוקאין מאת immerging לבחור את התולעת 19 בתוך תמיסת.
      הערה: רצוי לאסוף חיות ספציפיות בשלב זה יקל על הרכבה אפילו על ידי עובי אחיד. בעלי חיים יכול להיות בחר על המיקרוסקופ פלורסצנטיות ויבתר.
    4. מקום coverslip 22 מ"מ x 22 מ"מ על גבי השקופית זכוכית; תן לזה בעדינות להתפשר על גבי המעגל גריז.
      הערה: אינן חלות כל לחץ פיסי על coverslip אשר עלול לגרום נזק מורפולוגיה התעלה, בפרט מוטציות או תולעים RNAi מטופלים עם תעלת ואולי פנוטיפים אחרים. לכן חשוב להימנע מעגל גריז עבה; אידיאלי לבעלי חיים הם בעדינות דחוקה בין שקופיות זכוכית מכסה.
    5. לכתוב את שמו של המדגם על הצד עמומה של השקופית זכוכית. מיד לקחת את השקופיות מיקרוסקופ קונפוקלי לניתוח של תעלת פנוטיפ וכדי לרכוש תמונות.
      הערה: עיכובים עלול לגרום לנזק של תעלת ציסטות או שינוי תעלת לומן מורפולוגיה.
  2. Acquiring תמונות קונאפוקלית
    1. מקום השקופית על הבמה מדגם של מיקרוסקופ קונפוקלי, למקד את התולעים בהגדלה נמוכה (10 X).
    2. תצוגה ובחר חיות תחת 60 X ו/או מטרות X 100, לבחון את התעלה excretory ’ s סלולריים ו פנוטיפים subcellular, למשל, צורה לומן, קוטר, הגודל והצורה של ציסטות; או הרכיבים subcellular תוויות לניתוח, למשל, הפסגה/lumenal ממברנה, קרום הבסיס, הציטופלסמה, endosomal לעומת canalicular שלפוחית, organelles אחרים (ראה דיון, איור 2 ו- 4 באיור).
    3. ידרשו תמונות של פנוטיפ ספציפי עניין.
      הערה: פרוטוקול זה מתאר את השימוש בלייזר (טבלה של חומרים) מיקרוסקופ קונפוקלי סורק. כדי לפתור את רכיבי subcellular דק C. elegans נדרשים תעלות excretory, הגדלה גבוהה יותר מטרות (60 X 100 X). מיקרוסקופ קונפוקלי ספינינג-דיסק יכול לשמש כדי לרכוש זמן לשגות תמונות אבל מספק פחות confocality (ראה דיון).
      1. לרכוש תמונות וידאו, הפעל את המחשב, לחץ פעמיים על התוכנה מיקרוסקופ קונפוקלי ובחר הלייזר על ידי לחיצה על סמל בלייזר ספציפי.
      2. לחץ “ סריקה ” סמל כדי להמחיש את התולעת ממוקד על מסך המחשב, להתאים את עוצמת לייזר דרך התוכנה, ולחץ שוב על “ סרוק ” סמל כדי לעצור סריקה ולאחר מכן לחץ על “ ללכוד ” סמל כדי ללכוד את התמונה ולאחר מכן לחץ על “ להציל ” סמל.
      3. לשמור תמונות עם שם קובץ נכונה וכוללים RNAi שיבוט שם, זן שם ותאריך.
        הערה: תמונות ניתן לרכוש יחידה, מקטעים מרובים (למשל, 10 – סעיפים 15 לאורך ציר z). חלוקתה מאפשר לוויזואליזציה תלת-ממדית. לרכוש הקרנת תמונות ולשמור בנפרד במידת הצורך (בהתאם מיקרוסקופ). רזולוציה אופטימלית, השתמש בהגדרות לייזר עם רווח נמוך, לא לפתוח חריר מדי ולהוסיף כמה בממוצע לכל תמונה (ראו הפניות 23 , 24 לדיון כללי קונאפוקלית הדמיה). לטפל כדי לרכוש תמונות על הבהירות להלן רמת רוויה כדי לאפשר שינוי על-ידי הדמיה בתוכנה, אם נדרש (רצוי להשתמש יבוצעו בהם שינויים תמונות)-
      4. לרכוש תמונות של זוגיות - או להכפיל את תעלות עם תוויות (למשל ירוק, אדום וכחול) באותו אופן, על ידי לחיצה על סמלים לייזר מרובים, אך להשתמש סריקה רציפה כדי למנוע דימום-דרך בין ערוצים (קריטי ללימודי הסבת שיתוף).
        הערה: אחד ייתכן שיהיה עליך לקחת בחשבון הזמן הנדרש עבור סריקה רציפה (אשר גם התוצאות תואמת להגדיל תמונה הלבנת) ולשנות הגדרות הסורק. אל תסרוק חיות משקופית אחת במשך יותר מ 30 דקות מרבי כדי למנוע השפעות לא ספציפי על תעלת מורפולוגיה. הר שקופית חדשה אם נדרשת סריקה יותר.
      5. לרכוש התערבות דיפרנציאלית המתאימים אופטיקה (DIC) / Nomarski תמונות, במיוחד אם לכימות תעלה קוטר אורך ו לומן ביחס התולעת ’ אורך הגוף s וקוטר. כיסוי פלורסצנטיות ותמונות Nomarski על ידי לחיצה על “ כיסוי ” סמל להפגין ציוני דרך ( 1D איור, איור 4A – ד).
    4. על כימות, למדוד את עוצמת קרינה פלואורסצנטית של רכיב שכותרתו עניין ImageJ תוכנה 25 ( איור 5C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש התעלות excretory C. elegans חזותי, מולקולרי לניתוח tubulogenesis חד־תאיות ו לומן תאיים מורפוגנזה בתא יחיד. במהלך השלוחה שלהם מימי אמצע מופרה לבגרות, התעלות excretory ארבע ממשיכים להרחיב שלהם basolateral וממברנות הפסגה/lumenal יחד עם שלהם canalicular endosomal endomembrane מערכת, מתן מודל ייחודי אין ויוו הניתוח של דה נובו מקוטב להן קרום (איור 1). Subcellular רכיבים כגון ממברנות הפסגה, הציטופלסמה ו endosomal לעומת canalicular שלפוחית, ניתן לאבחן על ידי הבעת חלבונים ספציפיים פיוז'ן פלורסנט (שמתואר פרוטוקול סעיף 1), וניתן להבחין בין אחד לשני על ידי כפולה או משולשת תיוג של חיה הטרנסגניים יחיד (איור 2). הפנוטיפ תעלת excretory ייחודי (איור 3 א– B) שנוצר על ידי overexpressing של מולקולה ממברנה הפסגה הקשורים (ERM-1), משמש כדי להדגים כיצד לבצע מסך RNAi יישוב לזיהוי גנים תפקוד בקרום הפסגה ו לומן להן; זה משמש דוגמה של ניתוח חזותי המולקולריים של קרום מקוטב להן במודל זה (שמתואר פרוטוקול סעיף 2). פנוטיפ תעלת ERM-1 [++] זה משמש כדי להדגים כיצד להעריך באופן חזותי, תוצאת דיכוי (איור 3C-D) ושיפור (איור 3E– F) על ידי לנתח מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (שמתואר פרוטוקול בסעיף 3) . תעלת פנוטיפים שנגזרות אפנון של אמ-1 רמות לשרת כדי להראות כיצד לפתור את הליקויים ברמה subcellular על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית (איור 4) (שמתואר פרוטוקול סעיף 4), וכיצד לכמת פנוטיפים תעלת פשוטה (אורך התעלה, ציסטה גודל) פגמים להן קרום הפסגה (איור 5).

Figure 1
איור 1 : מורפוגנזה של C. elegans Excretory התעלה ועל מבנים תעלת Subcellular
(א) סכמטית ייצוג של הרחבת תעלת excretory (קווים כחולים) במהלך התפתחות העובר, זחל. התא excretory מגיע מיקומו הסופי על הצד ventro-הצד השמאלי של הנורה בלוע האחורי בשלב פסיק של העובר (לא מוצג). ככל שהעובר לתרמיל, זה מרחיב קודם שתי זרועות רוחבית כלפי השמאלי והימני; ואז כל זרוע bifurcates לתוך ענף anterior ואת אחורי. ענפים אלה anterior ואת אחורי להרחיב עוד יותר ברחבי התארכות של החיה במהלך ארבעה שלבים זחל, תחילה להתעדכן עם הצמיחה של החיה בשלב L2, ולאחר מכן מלווה נוספת הצמיחה שלה, עד לבגרות. דה נובו מקוטב ממברנה להן תומך בסיומת זו עד לבגרות. (B) החיה למבוגרים, הענפים תעלת הקדמי להגיע בקצה האף, הענפים האחורי, הזנב (קווים כחולים). גוף התא excretory מוצג ליד הנורה בלוע האחורי (כחול). ממברנה מקוטב תחומים נשמרים במהלך הבגרות. (ג) מוגדלת נופים של מקטע בזרוע התעלה. משמאל: תצוגת תלת-ממד של התעלה מראה: קרום הבסיס (שחור), הציטופלסמה (כחול), (ירוק) lumenal ממברנה ו לומן (לבן). משמאל: מבט מבפנים של התעלה וממברנות שלה: קרום הבסיס (שחור), הציטופלסמה (כחול), endosomes (אליפסות צהוב), שלפוחית canalicular (ספירות לבנות, שלפוחית אחת מחובר כל אחרים, מחובר לומן או מבודדים), הפסגה ממברנה (ירוק) לומן (לבן). (ד) Confocal/DIC כיסוי micrographs של התא excretory העובר ושל התעלות excretory, זחל, תווית באמצעות lumenal לעומת cytoplasmic GFP, בהתאמה. תמונה משמאל: תא excretory (חץ ירוק) העובר 1.5-fold, עם תעלת לומן דמיינו בהבעת ERM הפסגה-1::GFP תחת האמרגן erm-1 . תמונה מימין: ארבעה excretory תעלה סניפים (חץ ירוק) הזחלים L3, דמיינו ידי cytoplasmic vha-1 p:: GFP. גודל ברים = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : להמחיש רכיבים Subcellular תעלת Excretory פראי-סוג הנשק על-ידי תיוג כפול עם פיוז'ן פלורסנט חלבונים
(א) הבחנה הציטופלסמה של קרום הפסגה. ביטוי של GFP תחת האמרגן sulp-5 מדמיין הציטופלסמה התעלה (ירוק, למעלה); ביטוי של אמ-1::mCherry תחת משלו יזם מדמיין את הקרום הפסגה (אדום, האמצעי); מיזוג תמונות אלה (למטה) מבדיל בין ציטופלזמה קרום הפסגה שאחרת היה להבחין מגניחותיה על-ידי תיוג בודד אפילו בהגדלה. סרגל קנה מידה = 5 μ מ '. (B) הקובע את היחסים המרחביים של שלפוחית endosomal כדי לומן. ויזואליזציה של לומן מאת הפסגה ממברנה-הקשורים GFP חלבון כימרי (פסאודו בצבע אדום, העליון); ויזואליזציה של שלפוחית endosomal על ידי הבעת mCherry::RAB-7 (פסאודו ובצבע כחול, האמצעי); מיזוג תמונות אלה (למטה) מראה היחסיים המרחבי של שלפוחית endosomal כדי לומן. סרגל קנה מידה = 5 μ מ '. (C ו- D) פתרון תעלת צורות צינור מול תעלת subcellular רכיבים בהגדלות שונות. הציטופלסמה של הזחלים L1 מסומן על ידי הבעת GFP תחת sulp-5 יזם ושלפוחיות canalicular cytoplasmic בהבעת תעלת המים AQP-8::mCherry תחת האמרגן aqp-8 . (ג) תמונות רכשה בהגדלה נמוכה יותר לפתור דפוס "חרוזים-ב--string" המתאים ספציפית שלב varicosities (varicosities הם מאגרים בשפע שלפוחית canalicular ורכיבים אחרים הדרושים לצמיחה canal), אבל כן פותר cytoplasmic AQP-8 puncta. (ד) תמונות רכשה בהגדלה גבוהה יותר לפתור AQP-8 puncta בציטופלסמה התעלה, המתאים canalicular שלפוחית. קנה מידה: μm 20 ג' וברים μm 5 ד כל לוחות להציג תחזיות קונאפוקלית של 10 – 15 סעיפים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : ניקוד משפרי, משתיק קולs של הפנוטיפ תעלת פיברוזיס (ERM-1[++]) על ידי לנתח מיקרוסקופ
(א) ERM-1 [++]; תעלות excretory rol-6(su1006) הם דמיינו בהבעת GFP תחת מקדם vha-1 . תעלות האחורי להאריך עד הפות או אמצע הגוף של החיה (חיצים; נחשב סיומת 1/2) בהגדלה נמוכה יותר (1.5 X אובייקטיבית, זום נמוך). (B) בהגדלה גבוהה יותר, החתימה ERM-1 [++] קטן-פיברוזיס התעלה הכיווץ ניתן לפתור, עם הקצה של התעלות האחורי (זרוע אחת שצוין על-ידי חץ קטן) מרחיב את הפות או מעט מעבר (הפות שמציין החץ גדולה; תעלה לומן בחלונית D יכול להיחשב כסוג הפרוע להשוואה). (ג) דיכוי, הגדלה נמוכה: התעלות מאורכים ודקים RNAi מטופלים בעלי חיים ERM-1 [++]. (ד) בהגדלה גבוהה יותר, תעלות האחורי ניתן לראות להאריך כמעט במלואה הזנב (חיצים קטנים; השווה לזה של החיות אב, שמוצג בחלונית B); החץ גדולה מציין מיקום של הפות. שיפור (E) : עוד יותר מקוצר תעלות עם ציסטות גדולות ב- RNAi מטופלים בעלי חיים ERM-1 [++]; הגדלה נמוכה, no זום. (נ) בהגדלה גבוהה יותר, הרחבת תעלת האחורי ניתן נקבע כפחות מ 1/2 (חץ קטן) או שאינו מורחב עד הפות (מסומן על ידי חץ גדול) וציסטה בגודל העולה על 1/3 מרוחב של החיה (רחב יותר מזה של החיה האב המוצג ב- B). גודל ברים = 400 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : ניתוח ויזואלי של תעלת Excretory מורפולוגיה ורכיבים תעלת Subcellular בבעלי חשבונאי/RNAi מאת מיקרוסקופיה קונפוקלית
(א-ד) הבחנה של vacuolar של הפנוטיפ תעלת פיברוזיס (כיסוי קונאפוקלית/DIC micrographs מוצגים). (א) הציטופלסמה של תעלה פראי-סוג הוא מדמיין בהבעת GFP תחת האמרגן sulp-5 (מדומה בצבע כחול הבחנה מן הפסגה ממברנה תיוג, ירוק באיור בחלונית B). (B) קרום הפסגה של תעלה פראי-סוג הוא מדמיין בהבעת ERM-1::GFP; שים לב לומן אינה גלויה בהגדלה זה תיוג בודד זה אינו מסוגל להבחין cytoplasmic מ תיוג ממברנה. (ג) תעלת Excretory פנוטיפ המושרה על ידי RNAi: תיוג cytoplasmic לא יכול להבחין וקואלות cytoplasmic לבין ציסטות intralumenal. (ד) תעלת Excretory פנוטיפ המושרה על ידי RNAi: תיוג ERM הפסגה-1::GFP מזהה הצטברות נוזל בתוך לומן, בזיהוי ציסטות (lumenal) יותר מאשר וקואלות (cytoplasmic) (איור 4I עבור וקואלות cytoplasmic להשוות). סרגל קנה מידה = 40 μm עבור A-D, שמוצג א (E – J) בניתוח תופעות הפסד, רווח-של-פונקציה על רכיבים תעלת subcellular (תמונות קונאפוקלית של תעלת אחת הזרועות מוצגים). (E-G) השפעת erm-1 RNAi לוקליזציה subcellular של canaliculi. (ה) פראי-סוג תעלת הציטופלסמה; הערה GFP אי-הכללה של לומן אנלוגיים. (נ) פראי-סוג cytoplasmic AQP-8::GFP puncta, המקביל canalicular שלפוחית. (G) Cytoplasmic ותזוזה הבזליים של AQP-8::GFP puncta ב erm-1(RNAi) בעלי חיים. לומן רציף (H) ופרטים של לומן עצה הפתולוגיה (סלסול ואובדן של לומן מרכוז) ב erm-1(mildRNAi) בעלי חיים (ראו3 עבור הכוח ויסות כוח RNAi); הערה שאת הציטופלסמה תעלת חורג הקצה של לומן, שציין פה ציסטות קטנות. (I) Cytoplasmic וקואלות תעלת excretory בגוף ללא הסיומת התעלה ב השפיעה מאוד על בעלי חיים erm-1(RNAi) 3; שימו לב: מעשה-5::GFP הוא לא מגויס לומן (למעט מספר כתמים קטנים סביב כמה וקואלות). גיוס (J) של עודף מעשה-5::GFP, AQP-8::mCherry כדי לומן של משולש בעל חיים הטרנסגניים overexpressing ERM-1 (הערה חגורה עבה של מעשה-5::GFP ובתצורות AQP-8::mCherry חופפים סביב לומן פיברוזיס). סרגל קנה מידה = 5 μm עבור E – J, שמוצג אי אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : דוגמאות של כימות של תעלת פגמים על ידי מיקרוסקופ ויבתר ו קונאפוקלית
(א) ייצוג סכמטי של פראי סוג (החלונית העליונה), מוטציה פיברוזיס (לוחות התחתון) תעלות excretory על כימות של אורך תעלת וגודל ציסטה. אורך תעלת האחורי הוא לכמת כמו 0, 1/4, 1/2, 3/4 ו- 1. אורך תעלת '0' מציינת אין סיומת, '1' מציין סיומת באורך מלא. גודל הציסטה היא לכמת כמו < 1/3 (קטן), > 1/3 (גדול) מקוטר גוף. (B) כימות של תעלת ברוטו מורפולוגיה של שליטה ובעלי ERM-1 [++](RNAi) על ידי פלורסנט לנתח מיקרוסקופ. ב מעושה(RNAi) ERM-1 [++] בעלי חיים, האורך תעלת האחורי הוא כ 1/2 מורחבת ב 95% בעלי חיים (תמונת ייחוס, איור 3A– B). בבעלי ERM-1 [++](RNAi) משתיק קול, אורך אחורי של התעלה מתרחבת כמעט במלואה בבעלי חיים 80-90% (תמונת ייחוס, איור 3C-D). משפר חיות ERM-1 [++](RNAi) , כ- 60-70% תעלות יש ציסטות גדולות באורך קצר יותר (< 1/2) (תמונת ייחוס, איור 3E– F). נתונים שהוצגו אומר ± SD (n > 3). (ג) כימות עוצמת קרינה פלואורסצנטית שלד התא תעלת הפסגה/lumenal על ידי ImageJ מתמונות קונפוקלי. ממברנה הפסגה של התעלה נקראת על ידי מעשה-5::GFP, פראי-סוג תעלת הזרוע מוצג, ERM-1 [++] תעלת יד שמאל, בצד ימין. השאירה לוחות: עוצמת של מעשה-5::GFP ב פראי סוג ממברנה השרוול הוא כ- 50 (אפור ערך/ממברנה; שצוין על-ידי חץ שחור ואדום), עלילה המוצגות מתחת התמונה. נכון לוחות: עוצמת המעשה-5::GFP ERM-1 [++] הוא מעל 100 (ערך אפור של הממברנה הגבי הוא בערך 110 (חץ שחור), של קרום הגחון הוא בערך 140 (חץ אדום)), עלילה המוצגות מתחת התמונה. גודל ברים = 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

טבלה 1: דוגמאות של סמני C. elegans מערכת Excretory ממברנה התעלה
חלבון שם הצוללת
לוקליזציה הסלולר פונקציה דוגמאות של זנים זמין הפניות ERM-1 תחום הפסגה מקשר של קרום – שלד התא VJ402 (fgEx13 [erm-1p::erm-1::gfp, rol-6p::rol-6(su1006)]) שופט (13) מעשה-5 תחום הפסגה אקטין apically לשפות אחרות VJ268 (fgEx12[(act-5p::act-5::gfp); unc-119 (+); unc-119 (ed3) III]) שופט (13) ABTS-2 Basolateral טרנספורטר אניון/ביקרבונט ABTS-2::GFP שופט (42) SULP-8 Basolateral Sulfatepermease SULP-8::GFP שופט (42) VHA-1 canalicular שלפוחית V-ATPase VJ535 (fgEx35 (vha-1p::vha-1::gfp; rol - 6p:: rol-6(su1006))) שופט (9) VHA-5 canalicular שלפוחית V-ATPase ML846 (vha-5(mc38) IV; mcEx337 [vha-5 (+):: GFP + rol-6(su1006)]) שופט (10) AQP-8 canalicular שלפוחית aquaporin, תעלת המים VJ533 (fgEx33 (aqp-8p::aqp-8::gfp)) שופט (9) ראב-5 שלפוחית endosomal סחר בבני אדם BK209 (qpIs99 (exc9p::mCherry::rab-5)) שופט (36) ראב-7 שלפוחית endosomal סחר בבני אדם BK210 (qpIs100 [Pexc-9::mCherry::rab-7]) שופט (36) ראב-11 שלפוחית endosomal סחר בבני אדם BK205 (qpIs97 (exc9p::mCherry::rab-11)) שופט (36) 1 דוגמאות נבחרות מן המשאבים המפורטים בטבלה 3.

בטבלה 2: דוגמאות C. elegans היזמים Excretory תעלת ספציפי
היזמים הביטוי הבמה
erm-1 פסיק בשלב העובר
sulp-5 העובר 3-fold
vha-1 העובר 2-fold
vha-5 העובר 2-fold
aqp-8 העובר 2-fold
glt-3 העובר מאוחר
1 דוגמאות נבחרות מן המשאבים המפורטים בטבלה 3.

טבלה 3: משאבים
משאבים כדי לזהות מולקולות ספציפיות תעלת excretory C. elegans, תיוג ריאגנטים/זנים של נוגדנים
1. Caenorhabditis גנטיקה מרכז (CGC)43 ריאגנטים זמין, זנים
2. Wormbase44 לקבלת מידע על מולקולות ספציפיות תעלת excretory, זנים של נוגדנים
3. מידע על מולקולות ספציפיות תעלת excretory: לראות התייחסות6
4. Transgeneome אתר45 עבור translational GFP פיוז'ן בונה
5. C.elegans ביטוי דפוס46 עבור בונה תעתיק של פיוז'ן GFP
6. הפרויקט BioResource הלאומי (NBRP)::C.elegans47 עבור מידע על C. elegans המוטציות לבין היזמים
7. Fluorophores: ראה הפניה48,49
מבוסס-אינטרנט משאבים עבור הרכבת מולקולות עבור ספריית RNAi יישוב
1. GeneMANIA50
2. AceView51
3. iHOP52
4. Wormbase44
5. saccharomyces הגנום של מסד נתונים-53
6. Flybase54
7. העכבר הגנום מסד55
8. גנום של מסד נתונים-56
9. הפיצוץ57

טבלה 4: דוגמה פשוטה פנוטיפ הניקוד גליון
RNAi הספרייה זן גנרל פנוטיפ (% סה) תעלת פנוטיפ
אורך תעלת < 1/2 (% L4) אורך תעלת > 1/2 (% L4) פנוטיפ תעלת אחרים המספר הכולל של חיות ספרתי
. לא הצלחת מספר טוב
I-1 A1 ERM-1 [++]; vha-1 p:: GFP Clr (30) 80 20 100
X-5 B12 אותו אף אחד 30 70 100
השלישי-10 C5 אותו Unc (54) 70 30 ציסטות גדולות 100

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

רב-תכליתיות גנטי של C. elegans , שקיפות, תוכנית פשוטה גוף וכל השושלת הקבועה תא שרד מודל מצוין עבור הניתוח של מורפוגנזה פרוטוקול זה מתאר כיצד לשלב מניפולציות גנטיות סטנדרטי הדמיה מחקרים כדי לנצל 2 מיקרון דק C. elegans תעלות excretory ללמוד ממברנה מקוטב ו לומן תאיים להן בשפופרת תא בודד.

תיוג
התעלות excretory C. elegans יכול להיקרא הביטוי של חלבונים פיוז'ן פלורסנט, המתיר ניתוח בשידור חי (המתוארים כאן), או על ידי נוגדנים או כימי מכתים (ראה המלווה נייר על tubulogenesis מעיים עבור צביעת נוגדן 3)-הביטוי של שניים או יותר fluorophores שונים, או השילוב של אלה שונים תיוג טכניקות, מאפשר ניתוח חזותי ברזולוציה גבוהה של אלה בקוריאנית דק (איור 2). פיוז'ן פלורסנט חלבונים למזהים התעלות על ידי יזם ספציפי התעלה הם הבחירה הראשונה של תעלת excretory תיוג מכמה סיבות, ביניהן: (1) רמות הביטוי נמוכה של חלבונים תעלת רבים, ואת המבנה הדק של התעלה (2) זה בקלות . מוצפת מכתים מחוץ התעלות שבו החלבון עניין עשויה להתבטא גם... מצד שני, תעלות רגישים ל אקסוגניים חלבונים ולפתח בקלות פנוטיפים לא ספציפי (למשל, סיומת פגמים, ציסטות או אפילו קטלני) כאשר מבוטאים חריפה כגון חלבונים. זה צריך לשקול לתוך ההחלטה בבחירת בין דרכים שונות ליצירת חיות מהונדס. בעקרון, transgenes יכול להיות מוצג כמערכים extrachromosomal (למשל, על ידי הזרקה ישירה של פלסמיד ה-DNA לתוך בלוטת לטרנספורמציה germline, כפי שמתואר כאן), אשר בדרך כלל יוצר עותק גבוהה מספר מערכים (לעתים קרובות עם גבוה ביטוי), או משולבים לתוך הגנום, בדרך כלל מספר עותק נמוך או יחיד (למשל, על ידי הפגזה26 או באמצעות עותק בודד בתיווך Mos1 ההכנסה [MosSCI]27). מערכים Extrachromsomal גם ניתן לשלב את הגנום בשלב השני (עדיין, עם זאת, במספר העתק גבוהה)18. מצד שני, כאשר הוא מוזרק את germline-ריכוז נמוך (למשל, 1 – 2 ng/µL ה-DNA, בשילוב עם ריכוז גבוה יותר של סמן הדנ א), עותק (אפילו בודד) נמוך מספר מערכים ניתן בקלות שנוצר28. תרחיש זה יש יתרון כי ריכוז ה-DNA יכולים להיות מגוונים, אשר עשוי לסייע באיתור ברמה הטובה ביותר לביטוי של תעלת תיוג, לא נמוכה מדי או גבוהה מדי (רעיל). היחס בין ריכוז ה-DNA מוזרק ורמת ביטוי תלויה גורמים רבים (למשל, האמרגן), ובכך מדעית להיקבע. לחלופין, הגן של עניין ניתן ישירות שכותרתו עם fluorophore ב germline מקובצים באופן קבוע וביניהם קצר Palindromic חוזר (CRISPR) המבוסס על תיוג הליכים29,30. אף-על-פי גישה זו ממקם את fluorophore בתוך ההקשר גנומית פיזיולוגיים ביותר שלה, זה לא תמיד נחוץ או אפילו רצוי (למשל, כאשר החלבון מתבטא ברמות נמוכות מאוד). עם זאת, ייתכן האפשרות הטובה ביותר, כך למשל אם הגן עניין גדול מאוד.

קאנאל הדמיה ניתן להשיג על ידי הפניית בונה תעתיק אל תוך התעלה אשר ידגיש את הציטופלסמה התעלה על ידי fluorophore. לעומת זאת, תיוג רכיבי תעלת subcellular דורש פיוז'ן translational איפה הגן באורך מלא מחובר למסגרת כדי fluorophore קידוד גנטי. בעת שימוש מקדם תעלת ספציפי עבור הביטוי (ולא את המקדם של ג'ין), הבחירה שלו צריך להיות מבוסס על כוחו של האמרגן, לניתוח התפתחותית, הזמן של הביטוי שלה. גנים ספציפיים תעלת excretory רבים שאינם מבטאים לפני הזחל של התעלה פונקציה osmotic הופך קריטי; מאוחר מדי לניתוח של שלב סיומת הפעיל שלה (erm-1 ומקצוענים-1 הם גנים ביטוי מוקדם)10,13. דוגמאות עבור סמנים של תעלת excretory אנדו - ו ממברנות פלזמה ועבור היזמים ספציפי תעלת ניתנים בטבלאות 1 ו- 2, בהתאמה, ומשאבים על מציאת מולקולות ספציפיות תעלת נוספות בטבלה3. משאבים אלה יכולים לשמש גם למציאת של חלבון מתוצרת כבר פיוז'ן פלורסנט מתאימים, אשר עשויים להיות זמינים דרך מרכז הגנטיקה Caenorhabditis (CGC; ראה גם טבלה 1). כדי לבנות פלסמידים רקומביננטי לביטוי fusions חלבון כזה, ניתן יהיה להשתמש בשיטות שכפול שונות, כל אחד עם והחסרונות הספציפיים (נדון במקום אחר14). אלה כוללים אנזים הגבלה קונבנציונאלי המבוסס על שיבוט גישות, המתוארים כאן, מודולרי שכפול באמצעות שער ריבוי אתרים מערכת31, גיבסון הרכבה32, או הכתב ג'ין בנייה בשיטת "PCR תפרים"14 ,33. אלה גישות שונות ניתן להתאים שיטת שנבחרה עבור ההיכרות שלהם לתוך germline ו/או לצרכים אחרים ספציפיים (לדוגמה, תכליתי השער המערכת מקלה על התמרונים של היזמים, cDNAs עבור מונים תיוג גישות) . אכפת לי צרכים להילקח לבחור דרך האתר נכון fluorophore (קישור זה ב ה N-לעומת קרבוקסילי של החלבון), אם לוקחים בחשבון את תפקוד החלבון עניין.

הפרעה עם ג'ין פונקציה
כאחת הדרכים האפשריות רבות perturb ג'ין פונקציית C. elegans, פרוטוקול זה מתאר מסך אינטראקציה RNAi יישוב המיועד לשינוי הפנוטיפ לומן תעלת פיברוזיס, המושרה על ידי overexpressing רכיב הממברנה lumenal. במקרה ספציפי זה, overexpressing של הממברנה הפסגה/lumenal הקשורים סמן כגון ERM-1 יש את היתרון של ישירות מנחה החקירה אל המטרה הרצויה: הניתוח של קרום הפסגה/lumenal תאיים להן. הפנוטיפ רווח-של-פונקציה שנוצרו על-ידי ביטוי מספק גם יתרונות מסוימים בשילוב עם מסך אינטראקציה עם הפסד של הפונקציה (RNAi) כפי שמתואר כאן (ראה34 לדיון של הפסד, רווח-של-פונקציה ניתוחים ו תכנון של רשתות גנטיות). יתר על כן, אמ-1 עצמו הוא היטב ובדוקים "לומן מורפוגנזה" והפסגה הממברנה הזהות מולקולה12. לכן, במקרה זה, מסך יישוב (ולא משוחדת) סביר להניח ואינפורמציה ישירות עבור לומן מורפוגנזה בזמן/ת פונקציה של נוסף אפיון ERM-1 ספציפית בתהליך זה. עם זאת, ומציג מסך ממוקדות שאינם מוטים יכול להתנהל באופן דומה, החל גם עם חיים פראי סוג, חיה הטרנסגניים עם fluorescently שכותרתו תעלות excretory, או עם כל מוטציה התעלה. כללי היתרונות והחסרונות של RNAi (למשל, לעומת מוטגנזה מכוונת) עבור הדור של אובדן-של-פונקציה הפנוטיפים, ואת הולכה ודיון של סוגים שונים של רשתות גנטיות C . elegans נידונות במקום אחר 34. RNAi מייצרת קשת של הפנוטיפים, כולל פנוטיפים מתון יותר, יתרון מסוים עבור הניתוח של הגנים tubulogenesis לעיתים קרובות קטלני. זה הוא תיאר, דנו בעיתון הנלווה על מעיים tubulogenesis3. גישות שונות כדי ליצור רווח, הפסד-של-פונקציה מוטציות ונהלים גנטי קלאסית כמו צלבים, מפורט, הנדונה גנטיקה כללית שיטות הספרות20.

מיקרוסקופ והערכה של פנוטיפים tubulogenesis
מבחינה ויזואלית הערכת וניקוד השינוי של הפנוטיפ תעלת מוגדרים היטב תחת פלורסנט לנתח מיקרוסקופ באמצעות פרמטרים הבקיע פשוטים (כגון התעלה לאורכה לומן קוטר), כפי שמתואר כאן, יכולה להיות מושגת תוך תקופה קצרה של זמן אפילו בעת עיבוד מספרים גדולים של בעלי חיים יישוב או שיטתית גנטי או מסך RNAi. לעומת זאת, דומה מסך מחפש תעלת הרומן פנוטיפים מורפוגנזה בזן זה פראי-סוג (למעט שלה תיוג-תעלת transgene), זה עוד זמן רב, אבל יכול, באופן עקרוני, ניתן לבצע באותו אופן (ביצענו כזה מסך על בסיס הגנום כולו בחודשים הקרובים). יזהה פנוטיפים שונים תעלת מרובים (לא מוצג כאן) ומסכים כזה ולכן אפשר חייב לפתח בהתאמה הבקיע פרמטרים שונים, למשל, סיווג איכותי ערכת (ראה 9,11, 35,36,37,38 עבור דרכים שונות ציון פנוטיפים התעלה על ידי לנתח מיקרוסקופ). בעת פירוש כל פנוטיפ התעלה, חשוב לזכור כי היווצרות ציסטה יכולה להיות השפעה לא ספציפי של הרבה עלבונות שונים כדי מבנה צינורי זה רזה, לעיתים זה הפנוטיפ מסוף אינפורמטיביות פחות. ציסטה בגודל ומיקום, מצד שני, יכול להיות אינפורמטיבי, למשל, ציסטה קרוב התא התעלה (בתחילת הרחבת התעלה), ציסטות לאורך של התעלה או ציסטות-טיפים התעלה, לספק רמזים על המנגנון הבסיסי של הליקויים. תעלת ציסטות (כאן כהגדרתו אינטרה-lumenal מלאות נוזל spheroids מוקף קרום הפסגה/lumenal) צריך להיות נבדל שלפוחית (נוזל קרום מכורך cytoplasmic קטן מלא spheroids) או וקואלות (מוגדלת cytoplasmic ממברנה מכורך נוזל מילוי spheroids), שאינו מוקף קרום lumenal, יכול כל מבט שטחי זהים (איור 4A– D). וקואלות cytoplasmic יכול גם להתעורר שנית, למשל, דרך ההשפעות הרעילות של הרכבה פתרונות (אזיד הנתרן). ציסטות גדולות והן וקואלות cytoplasmic יכול לגזול כמעט בגודל של החיה, וצריך עוד להבחין בין קלאסית "לנקות (Clr)" תעלה פנוטיפ אשר נגרמת על ידי הצטברות נוזלים בחלל הגופה. לבסוף, אורך תעלת נפרצת כמעט תמיד בגיחות בתוך תעלות פיברוזיס, לכן פגם הרחבת תעלת נכון צריך ניתן להדגים באווירה חופשית ציסטה.

למרות קטרים שלהם קטן, subcellular מרכיבי excretory תעלות, כגון הפסגה לעומת ממברנות הבזליים, תאיים endosomal לעומת canalicular שלפוחית, תאיים organelles ורכיבים cytoskeletal, ניתן לאבחן על ידי גבוה יותר רמת ההגדלה, למשל, מיקרוסקופיה קונפוקלית (איור 2, איור 4). על ידי הדמיה קונאפוקלית, תעלת חיובי הציטופלסמה GFP לבד מספיקה להבחין לומן לבין הציטופלסמה התעלה באמצעות קו שאינו-פלורסנט (2A איור, איור 4E). זהותו של סמנים תורם לפתרון canalicular מן שלפוחית endosomal (גם שונה בגודל), למרות ההקצאה סופית ידרוש immunoelectronmicroscopy39. כפולים ומשולשים תיוג ניתן לקבוע לוקליזציה subcellular של מולקולה עניין וכן היחס של רכיבים subcellular אחד לשני (איור 2). ממברנות יחיד תעלת lumenal שכותרתו לייצר באותה שורה כפולה הציטופלסמה או קרום הבסיס, אך ניתן להבחין באמצעות כפול או משולש תיוג. לניתוח קונאפוקלית, הרכבה נכונה חשובה, ניתן את השבריריות של המבנה התעלה, הרגישות לשינויים osmotic הפגיעות של פנוטיפ פיברוזיס בתדירות הגבוהה ביותר שלה. ציסטות פרץ בקלות osmotic בשינויים או לחץ פיסי רגישים ממברנה רעלנים כגון אזיד הנתרן, הם גם רגישים קצת הרדמה המשמש הנייח (זה גם עשוי להפיק וקואלות cytoplasmic). בידיים שלנו, לידוקאין 5% במאגר M9 פועל באופן מיטבי עבור מבחני תעלת excretory ביותר. נהלים דימות וטיפול כל צריך להיות עדין, כמתואר. כדי להימנע חפצים המחקים פנוטיפים (למשל, ציסטות, וקואלות), מומלץ לרכוש תמונות מיד לאחר הרכבה. אם זה לא אפשרי, ציסטה תמונות כדאי לרכוש קודם, לפני הדמיה פנוטיפים אחרים. פרוטוקול זה דן תקן סריקה מיקרוסקופיה קונפוקלית המספק confocality מעולה, לעומת ספינינג דיסק מיקרוסקופיה קונפוקלית אשר, לעומת זאת, מפחית phototoxicity, והוא מיקרוסקופיה של בחירה עבור הניתוח של שינויים דינמיים של רכיבי subcellular לאורך זמן. שאלות כאלה בדינמיקה subcellular ניתן לטפל גם באמצעות טכניקות photobleaching או תיוג פיוז'ן חלבונים עם תמונה-להחלפה fluorophores לשנות צבע40. לבסוף, הטווח של רזולוציה יכול להיות גדל עוד יותר על-ידי הוספת במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM, מתן ברזולוציה הגבוהה ביותר אבל לא מולקולרית מבנית), מיקרוסקופיה super-resolution (בתנאי רזולוציה מולקולרית בטווח ננומטר); או39,immunoelectronmicroscopy (המספק את שניהם)41. טומוגרפיה 3D יכול להיות משולב עם מקטעים טורי TEM, שימושי במיוחד עבור הניתוח של הממשק canalicular--קרום פלזמה של תעלות excretory9,10. טכניקות משופרת עבור אלה סוגים שונים של מיקרוסקופיית ושילובים גישות אלה הדמיה שונים להמשיך להתפתח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים Buechner מ' (אוניברסיטת קנזס, קנזס, ארצות הברית), Nehrke ק (מרכז רפואי אוניברסיטת רוצ'סטר, רוצ'סטר, ניו יורק, ארה ב), ומרכז Caenorhabditis גנטיקה, הממומן על ידי מכוני הבריאות הלאומיים, משרד התשתיות מחקר תוכניות (P40 OD010440). עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NIH GM078653, 224570 הוא MGH, SAA 223809 כדי כלל

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cloning
Plasmid pPD95.75 Addgene Cat. No. 37464
PCR Kit Qiagen Cat. No. 27106
Ligation kit New England Biolabs Cat. No. E2611L
DNA marker Thermo Scientific Cat. No. SM1331
Agarose DNA grade Fisher Scientific Cat. No. BP164-100
Competent cells New England Biolabs Cat. No. C2987H
Tris Fisher Scientific Cat. No. BP154-1
EDTA Sigma Cat. No. ED-1KG
Acetic acid Fisher Scientific Cat. No. A38S-500
Ethidium bromide Fisher Scientific Cat. No. BP1302-10
Equipments
PCR machine  MJ Research Cat. No. PTG-200 
Centrifuge Eppendorf  Cat. No. 5415C
Water Bath Precision Scientific  Cat. No. 666A3 
Gel running instrument Fisher Scientific Cat. No. 09-528-165
Gel running power supply Fisher Scientific Cat. No. 45-000-465
Molecular Imager Gel Doc XR System Bio-Rad Cat. No. 1708195EDU
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific Cat. No. ND1000
C. elegans related1 1see reference19 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates2 2see reference19 for protocols.
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Yeast Extract BD Biosciences Cat. no. 212750
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
Ampicillin Sigma Cat. no. A0116
Tetracycline Fisher Scientific Cat. no. BP912
M9 Medium2 2see reference19 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
Na2HPO4 Sigma Cat. no. S7907
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
NGM plates 2 2see reference19 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Peptone  BD Biosciences Cat. no. 211677
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
CaCl2 Sigma Cat. no. C3881
Cholesterol  Sigma Cat. no. C8667
K2HPO4  Sigma Cat. no. P3786
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
RNAi plates3 3see reference21 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Peptone  BD Biosciences Cat. no. 211677
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
CaCl2 Sigma Cat. no. C3881
Cholesterol  Sigma Cat. no. C8667
K2HPO4  Sigma Cat. no. P3786
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
IPTG  US Biological Cat. no. I8500
Carbenicillin Fisher Scientific Cat. no. BP2648
NaOH Fisher Scientific Cat. no. SS266-1
Sodium hypochlorite Fisher Scientific Cat. no. 50371500
Bacteria
OP50 bacteria CGC
HT115 bacteria CGC
Genome-wide RNAi libraries
Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref21,58,59) Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref60) Source BioScience
Imaging related
Lidocaine MP Biomedicals,LLG Cat. no. 193917
Materials
Vacuum Grease Silicone Beckman Cat. no. 335148
Microscope slides  Fisher Scientific Cat. no. 4448
Tissue culture plate, 6 well  Corning Inc. Cat. no. 08-772-33
Equipment
SMZ-U dissecting microscope (Nikon)
SZX12 dissecting microscope (Olympus), equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions).
TCS SL Laser-scanning confocal microscope (Leica Microsystem)
C2 laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope (Nikon)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lubarsky, B., Krasnow, M. A. Tube morphogenesis: making and shaping biological tubes. Cell. 112 (1), (2003).
  2. Sundaram, M. V., Cohen, J. D. Time to make the doughnuts: Building and shaping seamless tubes. Semin. Cell Dev. Biol. S1084-9521, 30130-30136 (2016).
  3. Zhang, N. The C. elegans intestine as a model for intercellular lumen morphogenesis and in vivo polarized membrane biogenesis at the single-cell level. JoVE. , (2017).
  4. Andrew, D. J., Ewald, A. J. Morphogenesis of epithelial tubes: Insights into tube formation, elongation, and elongation. Dev. Biol. 341 (1), 34-55 (2010).
  5. Nelson, F. K., Albert, P. S., Riddle, D. L. Fine structure of the Caenorhabditis elegans secretory-excretory system. J. Ultrastruct. Res. 82 (2), 156-171 (1983).
  6. Sundaram, M. V., Buechner, M. The Caenorhabditis elegans Excretory System: A Model for Tubulogenesis, Cell Fate Specification, and Plasticity. Genetics. 203 (1), 35 (2016).
  7. Altun, Z. F., Hall, D. H. Excretory system. WormAtlas. , (2009).
  8. Buechner, M. Tubes and the single C. elegans excretory cell. Trends Cell Biol. 12 (10), 479-484 (2002).
  9. Khan, L. A. Intracellular lumen extension requires ERM-1-dependent apical membrane expansion and AQP-8-mediated flux. Nat. Cell Biol. 15 (2), 143-156 (2013).
  10. Kolotuev, I., Hyenne, V., Schwab, Y., Rodriguez, D., Labouesse, M. A pathway for unicellular tube extension depending on the lymphatic vessel determinant Prox1 and on osmoregulation. Nat. Cell Biol. 15 (2), 157-168 (2013).
  11. Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Dev. Biol. 214 (1), 227-241 (1999).
  12. Fehon, R. G., McClatchey, A. I., Bretscher, A. Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11 (4), 276-287 (2010).
  13. Gobel, V., Barrett, P. L., Hall, D. H., Fleming, J. T. Lumen morphogenesis in C. elegans requires the membrane-cytoskeleton linker erm-1. Dev. Cell. 6 (6), 865-873 (2004).
  14. Boulin, T., et al. Reporter gene fusions, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. , April 5, 2006 http://www. wormbook.org (2006).
  15. Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. Sambrook, J., DW, R. ussell , Cold Spring Harbor Laboratory Press . (2006).
  16. Fire, A., Harrison, S. W., Dixon, D. A modular set of lacZ fusion vectors for studying gene expression in Caenorhabditis elegans. Gene. 93 (2), 189-198 (1990).
  17. Ahringer, J. Reverse genetics, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. 6, April 6, 2006 http://www. wormbook.org (2006).
  18. Transformation and microinjection, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. Evans, T. C. , April 6, 2006 http://www.wormbook.org (2006).
  19. Maintenance of C. elegans, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. Stiernagle, T. , February 11, 2006 http://www.wormbook.org (2006).
  20. Genetic mapping and manipulation: Chapter 7-Making compound mutants, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. Fay, D. , February 17, 2006 http://www.wormbook.org (2006).
  21. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  22. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  23. Pawley, J. B. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , Springer. (2006).
  24. Hibbs, A. R. Confocal Microscopy for Biologists. , Springer. US. (2004).
  25. Bankhead, P. Analyzing fluorescence microscopy images with ImageJ. , (2014).
  26. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157 (3), 1217-1226 (2001).
  27. Frøkjaer-Jensen, C. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nat. Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).
  28. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).
  29. Barrangou, R. Cas9 Targeting and the CRISPR Revolution. Science. 344 (6185), 707-708 (2014).
  30. Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).
  31. Esposito, D., Garvey, L. A., Chakiath, C. S. Gateway cloning for protein expression. Methods Mol. Biol. 498, 31-54 (2009).
  32. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  33. Hobert, O. PCR fusion-based approach to create reporter gene constructs for expression analysis in transgenic C. elegans. Biotechniques. 32 (4), 728-730 (2002).
  34. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat. Rev. Genet. 3 (5), 356-369 (2002).
  35. Berry, K. L., Bulow, H. E., Hall, D. H., Hobert, O. A. C. elegans CLIC-like protein required for intracellular tube formation and maintenance. Science. 302 (5653), 2134-2137 (2003).
  36. Mattingly, B. C., Buechner, M. The FGD homologue EXC-5 regulates apical trafficking in C. elegans tubules. Dev. Biol. 359 (1), 59-72 (2011).
  37. Shaye, D. D., Greenwald, I. The disease-associated formin INF2/EXC-6 organizes lumen and cell outgrowth during tubulogenesis by regulating F-actin and microtubule cytoskeletons. Dev. Cell. 32 (6), 743-755 (2015).
  38. Lant, B. CCM-3/STRIPAK promotes seamless tube extension through endocytic recycling. Nat. Commun. 6 (6), 6449 (2015).
  39. Paupard, M. C., Miller, A., Grant, B., Hirsh, D., Hall, D. H. Immuno-EM localization of GFP-tagged yolk proteins in C. elegans using microwave fixation. J. Histochem. Cytochem. 49 (8), 949-956 (2001).
  40. Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Photoactivatable fluorescent proteins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 885-891 (2005).
  41. Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).
  42. Sherman, T. The abts and sulp families of anion transporters from Caenorhabditis elegans. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 289 (2), C341-C351 (2005).
  43. Caenorhabditis Genetics Center (CGC). , http://cbs.umn.edu/cgc/home (2017).
  44. Wormbase. , http://www.wormbase.org/ (2017).
  45. Transgeneome website. , https://transgeneome.mpi-cbg.de/transgeneomics/index.html (2017).
  46. C. elegans expression pattern. , http://gfpworm.org/ (2017).
  47. National BioResource Project (NBRP)::C. elegans. , https://shigen.nig.ac.jp/c.elegans/ (2017).
  48. Heppert, J. K. Comparative assessment of fluorescent proteins for in vivo imaging in an animal model system. Mol. Biol. Cell. 27 (22), 3385-3394 (2016).
  49. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  50. GeneMANIA. , http://genemania.org/ (2017).
  51. AceView. , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ieb/research/acembly/ (2017).
  52. iHOP. , http://www.ihop-net.org/UniPub/iHOP / (2017).
  53. Saccharomyces Genome Database. , http://www.yeastgenome.org (2017).
  54. Flybase. , http://www.flybase.org (2017).
  55. Mouse Genome Database. , http://www.informatics.jax.org (2017).
  56. Human Genome Database. , http://www.gdb.org (2017).
  57. BLAST. , https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (2017).
  58. Kamath, R. S., Martinezcampos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), RESEARCH0002 (2001).
  59. Kamath, R. S. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  60. Rual, J. F. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome research. 14 (10B), 2162-2168 (2004).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 128 tubulogenesis חד־תאיות מורפוגנזה לומן תאיים תא בודד ויוו ניתוח גנטיקה התפתחותית מיקרוסקופיה פלורסצנטיות ויבתר מיקרוסקופיה קונפוקלית
התעלה Excretory <em>C. elegans</em> כמודל עבור מורפוגנזה לומן תאיים ו <em>Vivo ב</em> מקוטב ממברנה להן בתא יחיד: תיוג על ידי התכה GFP, RNAi אינטראקציה עם המסך הדמיה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, N., Membreno, E., Raj, S.,… More

Zhang, N., Membreno, E., Raj, S., Zhang, H., Khan, L. A., Gobel, V. The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging. J. Vis. Exp. (128), e56101, doi:10.3791/56101 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter