Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

C. elegans Excretory kanalen som en Model for intracellulære Lumen morfogenese og In Vivo polariseret membran Biogenese i en enkelt celle: mærkning af normal god landbrugspraksis-fusioner, RNAi interaktion skærm og billedbehandling

Published: October 3, 2017 doi: 10.3791/56101
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1,3, 1, 1
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Developmental Biology and Genetics Core, Massachusetts General Hospital for Children, Harvard Medical School, 2College of Life Sciences, Jilin University, 3Faculty of Health Sciences, University of Macau

Summary

C. elegans ekskretionsorganerne kanalen er en unik én celle model for den visuelle i vivo analyse af de novo polariseret membran Biogenese. Denne protokol beskriver en kombination af standard genetiske/RNAi og imaging tilgange, kan tilpasses til identifikation og karakterisering af molekyler lede encellede tubulogenesis og apikale membran og lumen Biogenese.

Abstract

De fire C. elegans ekskretionsorganerne kanaler er smalle rør udvidet gennem længden af dyret fra en enkelt celle, med næsten lige så langt udvidede intracellulære endotubes, der opbygger og stabilisere lumen med en membran og submembraneous cytoskelettet apikale karakter. Cellen ekskretionsorganerne udvider sin længde ca 2.000 gange til at generere disse kanaler, hvilket gør denne model enestående i vivo -vurdering af de novo polariseret membran Biogenese, intracellulære lumen morfogenese og encellede tubulogenesis. Protokollen præsenteres her viser, hvordan man kombinerer standard mærkning, gevinst og tab-af-funktion genetiske eller RNA-interferens (RNAi)-, og mikroskopisk tilgange til at bruge denne model til visuelt dissekere og funktionelt analyserer disse processer på molekylært niveau. Som et eksempel på en mærkning tilgang protokollen skitserer generation af transgene dyr med fluorescerende fusion proteiner til live analyse af tubulogenesis. Som et eksempel på en genetisk tilgang fremhæver det hovedpunkterne i en visuel RNAi-baserede interaktion skærm designet til at ændre en gevinst af funktion cystisk kanalen fænotype. De specifikke metoder beskrevet sådan: etiket og visualisere kanalerne ved at udtrykke fluorescerende proteiner; konstruere en målrettet RNAi bibliotek og strategize RNAi screening for Molekylær analyse af canal morfogenese; visuelt vurdere ændringer af canal fænotyper; score dem ved at dissekere Fluorescens mikroskopi; karakterisere subcellulært canal komponenter på højere opløsning af konfokalmikroskopi; og kvantificere visuelle parametre. Fremgangsmåde er nyttig for den efterforsker, der er interesseret i at drage fordel af C. elegans ekskretionsorganerne kanalen for at identificere og karakterisere gener involveret i de Fylogenetisk bevaret intracellulære lumen og encellede Tube morfogenese.

Introduction

Alle indre organer er sammensat af rør, afgørende for deres mange forskellige funktioner, såsom transport og udveksling af gasser, væsker og næringsstoffer og udskillelsen af metaboliske affald. Deres polariseret karakter, med særskilte apikale og lumenal membraner, er tilpasset til disse bestemte funktioner, og mangler i Biogenese aspekt(er) endo- og plasma membran er en hyppig årsag til sygdom hos mennesker1,2. Fleste af rør Vaskulaturen og indre organer er flercellede og danne en lumen intercellularly; dog kan, encellede rør, der udgør lumen intracellulært, for eksempel repræsenterer så meget som 30 – 50% af menneskelige kapillær senge2. Polariseret membraner i multi- og encellede rør er ens i sammensætning, selv om deres microdomains kan variere baseret på tube's specifikke funktion (fx, ekskretionsorganerne canal canaliculi versus intestinal microvilli i Caenorhabditis elegans; Se ledsager papir på C. elegans intestinale tubulogenesis)3. Principperne for polariseret membran Biogenese og tubulogenesis er bevaret blandt metazoans, og en lignende molekylære maskineri dirigerer dem1,2,4.

C. elegans ekskretionsorganerne system består af fem celler: ekskretionsorganerne cellen (EF), kanal celle (DC), pore celle (PC) og to kirtel celler. Ablation af EF, DC eller PC forårsager væskeophobning i kroppen hulrum og dyr dø på en tidlig larve fase5. Intriguingly, disse tre encellede rør oprette deres lumen på tre forskellige måder: ved celle udhuling (EF); celle indpakning kombineret med autocellular junction dannelse (PC); og af celle indpakning kombineret med autofusion (DC); forskellige mekanismer af lumen morfogenese, der alle Fylogenetisk bevarede6,7. EF, beliggende på den venstre laterale side af den bageste svælg pære, sender ud to laterale udvidelser fra som de fire kanaler forgrene sig for at udvide Anteriort og posteriort (i både højre og venstre side) til spidsen af den orm næse og hale , henholdsvis (figur 1)5,6,8. EF strækker sig fra ca 1 µm til 2 x 1.000 µm, hvilket gør det til den største celle i dyret. På en subcellulært niveau er den ekskretionsorganerne kanalen en enkel tube, genereret fra en basal membran rettet mod pseudocoelom, og tunneled af en lumenal membran (endotube). Canal lumenal membranen forbinder til kanalen lumenal membran på sin kun intercellulære junction; kanalerne er ellers junctionless langs deres længder (figur 1). Ekskretionsorganerne canal lumenal membranen og dens submembraneous cytoskelet er apikale, defineret ved deres molekylære sammensætning, der minder om sammensætningen af den apikale membran og submembraneous cytoskelet flercellede rør, såsom tarmen, og af andre (fxflade) epitheler. Cytoplasmatisk organeller, inklusive endosomal vesikulær og andre (fxGolgi) endomembranes er fordelt langs længden af kanalen. Derudover er flere kanalikulær vesikler - enten tilsluttet lumenal membranen, og/eller indbyrdes forbundne eller isoleret - gevind gennem kanalen cytoplasma7,8,9,10 . Denne dynamiske plasma-membran/kanalikulær forbindelse yderligere udvider kanalens membran system og bidrager til begge lumen morfogenese og osmoregulering10. Ekskretionsorganerne kanalen består således næsten udelukkende af endo- og plasma membraner, give en fremragende model for analyse af polariseret membran Biogenese og regulering af endo-plasma membran interface. En dramatisk udvidelse af den apikale membran under kanalen morfogenese - i denne single-celle systemet sammenfaldende med lumen udvidelse – giver også mulighed for at analysere de arkitektoniske problemer som følge af behovet for at stabilisere og centrere en intracellulær lumenal membran . Denne protokol fokuserer på analyse af kanalen røret og lumen's strukturelle morfogenese og intracellulære membran dynamics kræves for denne proces og ikke på de signaler, der direkte celle bevægelser, der genererer EFS holdning i de ekskretionsorganerne system og konstruere dets indviklede forbindelser til andre cellulære elementer (gennemgik i6).

En yderligere fordel af C. elegans encellede canal system til analyse af polariseret membran og intracellulære lumen Biogenese er dens evne til at adskille, gennem udviklingsmæssige tid, generation af forskellige komponenter af dets membraner og knudepunkter. EF er født på tidspunktet for ventrale lukning og afregner ventro sideværts i svælget under midten af embryogenese5,6,8, hvor tid laterale canal udvidelse og forgrening forekomme. Dette er efterfulgt af anterior-posterior canal udvidelse under sent embryogenese, en proces, som fortsætter ind i stadiet L1-larver (figur 1). I en nyklækkede larve, den bageste kanalen tip når frem til cirka midten af ormen, fuldt udvide til halen slutningen af L1 scenen, hvorefter kanalen elongates sammen med orm8. Aktive canal vækst på en hastighed på over for dyrets vækst dermed ender på den første larve stadie, men yderligere vækst sker sideløbende med en vækst på hele dyret under de ekstra larve faser (L2-4). Denne indstilling giver mulighed for at analysere forskellige trin i de novo polariseret membran Biogenese uafhængigt af polariseret celledeling eller migration. Desuden, det tillader adskillelse af denne proces fra samling af knudepunkter (som forekommer i embryoet før lumen indledning); deres nøjagtige krav i membranen polarisering er stadig et åbent spørgsmål i feltet polaritet. Endelig adskiller det entydigt apikale fra basale membran ekspansion, sidstnævnte processen forud for tidligere i ekskretionsorganerne kanaler10. C. elegans ekskretionsorganerne kanalen model er derfor en særlig informativ supplement til den intestinale model, som deler en række af disse fordele til analyse af polariseret membran Biogenese men udfører det i flercellede omgivelser (jf. den ledsagende papir på tarm tubulogenesis3).

Selv om wild-type kanaler ultratynde tubuli i denne lille orm, kan deres lumen være visualized direkte af Nomarski optik i dette gennemsigtige dyr. Mutant cystisk kanalen morfologier kan faktisk karakteriseres i umærkede dyr ved hjælp af lav forstørrelse dissekere mikroskopi, som har været brugt med stor effekt i fremad genetiske skærme til at identificere gener involveret i tubulogenesis11. Forbedret visualisering af morfologi af kanaler og skelnen mellem deres polariseret membraner, cytoskeletal komponenter, forskellige intracellulære organeller og andre subcellulært strukturer, men kræver mærkning og højere magt fluorescerende dissekere og konfokal mikroskopi. Selv om kanaler fine struktur udgør en række vanskeligheder for mærkning og mikroskopi, membraner og subcellulært komponenter kan skelnes via de specifikke molekyler unikke for hvert rum, og dyr kan være sikkert monteret til mikroskopi, hvis visse forholdsregler er truffet for at undgå at indføre artefakter (Se protokollen og diskussion). Mærkning kan gøres af Immunhistokemi i faste enheder, eller ved at generere transgene orme at udtrykke fluorescerende fusion proteiner under deres egen kontrol eller ekskretionsorganerne canal-specifikke initiativtagere til i vivo billeddannelse. Denne protokol beskriver den sidstnævnte mærkning teknik (se den ledsagende papir på tarm tubulogenesis for antistof farvning3).

Evnen til at kombinere i vivo tab eller gevinst-af-funktion undersøgelser med i vivo billeddannelse analyse på det enkelt celle niveau i hele udvikling gør C. elegans ekskretionsorganerne kanalen en særlig stærk model for den molekylære og cellulære analyse af encellede tubulogenesis. Frem eller omvendt genetiske skærme kan udføres starter med en wild-type eller mærket transgene dyr til at identificere canal morfogenese fænotyper (for eksempel, cyster) og deres underliggende gendefekter. Alternativt, sådanne skærme kan starte med en mutant fænotype (fx, en cystisk kanalen) og identificere overspændingsbeskyttere eller smagsforstærkere af denne fænotype for at identificere gener, der funktionelt interagerer med genet forårsager mutant fænotype. Den genetiske defekt forårsager mutant fænotype kan fremkalde et tab (f.eks., via gen sletning) eller en gevinst (f.eks. via en aktiverende mutation eller via indførelse af overskydende gen kopier) af de undersøgte funktion. Videresende mutagenese eller systematisk RNAi skærme er uden forudfattede meninger om genfunktioner og til upartisk identificering af gener involveret i funktionen af interesse. Betragtning af tilgængeligheden af genome-wide RNAi fodring biblioteker, kan næsten hvert gen være let slået ned af RNAi i C. elegans, således at enhver enkelt gen af interesse eller enhver gruppe af gener (fxi målrettede skærme) kan også være hurtigt aftestede for deres virkning i en omvendt genetik tilgang. For at påvise en eventuel kombination af tilgange, vi her beskrive en målrettet RNAi interaktion skærm, begyndende med en gevinst af funktion cystisk ekskretionsorganerne canal mutant, mærket med cytoplasmatisk canal grøn fluorescerende proteiner (NGL). Mutant fænotype blev genereret af overekspression af erm-1, en yderst velbevarede C. elegans ortholog af familien membran-actin linker Ezrin-Radixin-Moesin (ERM), som har været impliceret i lumen morfogenese og membran organisationen i mange arter12. C. elegans ERM-1 lokaliserer til lumenal membraner af indre organer, såsom ekskretionsorganerne canal og tarmen, og der kræves til lumen dannelse i begge13. ERM-1 overekspression rekrutter overskydende aktin og vesikler til canal lumenal membran, stigende flux i lumen og generere en kort cystisk kanalen og en krympede lumenal membran med fortykket actin underuld9. Protokollen beskriver hvordan man kan generere transgene stammer med ekskretionsorganerne udtrykt canal mærket fusion proteiner (eller andre proteiner); Hvordan til at udføre målrettede RNAi skærme starter med disse stammer til at identificere modifikatorer for en canal fænotype; og hvordan man visuelt analysere resultaterne af sådanne skærme af fluorescens dissekere og konfokal mikroskopi, herunder enkle måder at kvantificere informative tubulogenesis fænotyper. Alternativ mærkning teknikker og detaljer af RNAi, justeret til de ofte dødbringende tubulogenesis gener, kan findes i det ledsagende dokument på tarm tubulogenesis3. Alle metoder kan anvendes i forskellige kombinationer for undersøgelse af andre spørgsmål på kanalen tubulogenesis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. mærkning af C. elegans Excretory kanalen af fluorescerende Fusion proteiner 14

Note: Se den ledsagende papir på tarm tubulogenesis 3 for mærkning af i situ antistof farvning procedurer kan tilpasses til ekskretionsorganerne kanalen. Se tabel 1 eksempler på molekyler vist sig nyttige til at visualisere C. elegans ekskretionsorganerne canal endo- og plasma membraner, tabel 2 eksempler på initiativtagere køre udtryk til ekskretionsorganerne kanalen, og Tabel 3 for ressourcer til mere omfattende samlinger af markører og promotorer, herunder referencer diskuterer udvælgelsen af forskellige fluorophores.

  1. Byggeri af væv specifikke fluorescerende markør plasmider ved begrænsning enzym baseret kloning 15
    Bemærk: Se diskussion af alternative teknikker for at bygge fluorescerende fusion proteiner.
    1. Identificere sekvens af promoter (for transcriptional fusions) eller af den hele gen af interesse med dens promoter (for Translationel fusions) i WormBase 44.
      Bemærk: For initiativtagerne, omkring 1 – 3 kilobase (kb) er tilstrækkelig for de fleste C. elegans gener. Translationel fusion proteiner kan også konstrueres ved at placere et gen af interesse en ekskretionsorganerne canal specifikke promotor (Se tabel 2).
    2. Design frem og bak primere for forstærkning af promoter (for transcriptional fusions) og/eller en fuld gen med promotor (for Translationel fusions). Tilføje begrænsning enzym linkers på 5 ’ og 3 ’ ender af primere.
      Bemærk: Vælg restriktionsenzymer, der er til stede i vektor plasmid (fx, pPD95.79) 16. For Translationel fusioner, 3 ’ linker skal være konstrueret således, at efter begrænsning enzym fordøjelse og ligatur med vektoren, Indsæt codon ramme bliver løbende med fluorophore, fx normal god landbrugspraksis kodon. Man kan være nødvendigt at tilføje 1 eller 2 mere baser til typisk begrænsning enzym linkers 14; passe på ikke for at skabe et stop-codon.
    3. Udføre polymerase kædereaktion (PCR) til at forstærke promotor eller fuld-længde-genet ved hjælp af levende orme eller vildtype genomisk DNA eller cDNA som skabelon 15.
      Bemærk: Når du bruger orme som skabelon, først lyse orme i lysis buffer (PCR buffer plus Proteinase K) 17. Blandede fase orme kan bruges som skabelon. Udsultet orme kan bruges til at undgå forurening med bakteriel DNA.
    4. Udføre Agarosen (1%) gel elektroforese på PCR-produkter til at identificere den korrekte størrelse af forstærkede produkt.
      Bemærk: Hvis band størrelse er korrekte, fortsætte med næste trin. Hvis der genereres flere bands, forbedre forstærkning betingelser at producere enkelt band. Hvis dette ikke virker, skæres den korrekte bånd fra gel og rense DNA af standardmetoder 15 og derefter gå videre med næste trin.
    5. Udføre begrænsning digest på PCR-produktet og vektor plasmid, der indeholder fluorophore (fx, pPD95.79) i separate rør af standardmetoder 15.
    6. Adskille de fordøjede DNAs ved gelelektroforese og elueres PCR produkt og vektor DNA bands i separate rør.
    7. Rense DNAs fra gel skiver af standardmetoder 15. Måle DNA koncentration af Spektrofotometer.
    8. Ligate PCR produkt og vektor DNA af standardmetoder og omdanne de rekombinante DNAs til kompetente celler af standardmetoder 15.
    9. Sprede 10 μL, 50 μL og 100 μL af de transformerede celler på tre enkelte Luria bouillon (LB) plader suppleret med 50 μg/mL ampicillin.
      Bemærk: Spredt forskellige mængder af celler på forskellige plader til et spektrum af transformation effektivitetsgevinster. For eksempel, plating for tæt, må ikke tillade isolering af kolonier hvis transformation er effektiv.
    10. Ruger plader ved 37 ° C natten over. Næste morgen, tegne plader fra rugemaskinen.
      Bemærk: Hvis kolonierne er meget lille, inkuberes i flere timer.
    11. Forbered plasmid DNAs fra enkelt kolonier af standard metoder 15. Bland template DNA og primere og sende til sekvensering (typisk udføres i en core servicecenter).
    12. Læse sekvenser og kontrollere integriteten af fusion konstruere.
      Bemærk: kritisk: bekræfte korrekte codon rammen mellem indsatte gen og fluorescerende markørgen for oversættelse fusioner. Ideelt, en sekvens af hele genet for at bekræfte, at ingen mutation blev indført under PCR og ligatur procedurer.
    13. Generere flere plasmid DNA (ved hjælp af trin 1.1.11) til injektion for trin 1.2.
  2. Generation af transgene dyr ved mikroinjektion af DNA for kønscelleoverførsel transformation 18
    Bemærk: Se diskussion for alternative teknikker til indførelse af transgener. De skitserede procedurer kan bruges til at generere transgene dyr, som bærer et fluorescens fusion protein eller nogen andre protein af interesse. For eksempel, en eksogen protein kan være nyindførte (f.eks. en heterolog ortholog) eller en endogene protein kan være genindført (f.eks. i dens tilsvarende kønscelleoverførsel mutant for rescue) eller overexpressed for at generere en fænotype (f.eks. indsprøjtning erm - 1 blev brugt til at generere overekspression cystisk kanalen fænotype, der fungerer som mål for ændring af skærmbilledet RNAi samspillet beskrevet nedenfor).
    1. Mix konstruere DNA (1 – 50 ng/μl) med markør plasmid DNA (typisk 100 ng/μl), for eksempel den dominerende markør rol-6 (su1006) (Se 1.2.3 for indstillinger for markør).
      Bemærk: kritisk: koncentration af injicerede DNA bestemmes empirisk at undgå indførelsen af artefactual fænotyper (cyster, udvidelse defekter, dødelighed) Hvornår giver udtryk for gener i de ekskretionsorganerne kanaler, der er særligt følsomme til ekspression af transgener. Man kan eksempelvis lave flere blandinger af plasmider i koncentrationer på 1 ng/μl, 10 ng/μl, 50 ng/μl og 100 ng/μl med 100 ng/μl rol-6(su1006) til at teste en række koncentrationer for generation af en levedygtig stamme med den ønskede udtryk eller fænotype (høje koncentrationer er tilbøjelige til at være ikke-specifikt giftigt for kanalen morfogenese og kan være dødbringende).
    2. DNA blandingen filtreres gennem et 0,22 μm (mikrometer) pore størrelse spin-x centrifuge tube filter.
      Bemærk: Lad ikke låget af røret åbent at undgå støv, der kan blokere mikroinjektion nåle.
    3. Microinject rekombinant plasmider i gonade af wild-type eller mutant orm af standardmetoder for kønscelleoverførsel transformation (Se reference 18 for procedure detaljer).
      Bemærk: Standard markør plasmider er, for eksempel: rol-6(su1006), dpy-20, unc-119, pha-1. Dominerende transgener som rol-6(su1006) er indført i vildtype orm, der henviser til, at redde transgener føres ind i deres respektive mutanter. Markør plasmider er co injiceres for nem vedligeholdelse af de transgene linjer, da extrachromosomal transgener er tilfældigt tabt under celledeling (Se 1.2.8). Når indsprøjte gener kodning for fluorophore alternativ, kan man også bruge fluorophore, normal god landbrugspraksis, selv som markør. ROL-6 inducerer orme til at rulle rundt selv, som ofte er fordelagtige for evaluering af morfogenese fænotyper.
    4. Overførsel injiceres orme på Escherichia coli seedede Nematode vækst Medium (NGM) plader (f.eks., 5 orme/plade) (Se reference 19 for standard C. elegans kultur-og vedligeholdelsesprocedurer og Tabel over materialer).
    5. Ruger pladerne og lad afkom udvikle ved 20 ° C i ca. 3 d.
    6. Undersøge F1-afkom under dissekere mikroskop for Rol (rullende) orme (eller nogen andre specifikke injektion markør, fx normal god landbrugspraksis) og vælge ruller to særskilte trykplader.
    7. Vælg plader med rullende F2 dyr og bekræfte tilstedeværelsen af fluorescens under et dissekere fluorescens mikroskop (normalt alle roller dyr er normal god landbrugspraksis positive).
      Bemærk: F2 ruller angiver den succesfulde generation af en genetisk modificeret linje. Individuelle linjer kan være forskellige, f.eks., hvad angår transgen transmission sats. Det er derfor hensigtsmæssigt at opretholde og gemme flere linjer.
    8. Bevare de transgene linjer af berigende nye plader til markør-positive dyr.
      Bemærk: Den injicerede DNA er indarbejdet i germline som en extrachromosomal matrix. Overførselshastigheder for extrachromosomal arrays er variabel, men generelt omkring ~ 50%. For at ikke miste stammen, det er derfor afgørende for at berige manuelt linjer med dominerende markører (fx, linjer ikke sikret af negative udvalg).
    9. Fryse transgene linjer af standard frysning teknikker til lang sigt opbevaring på-80 ° C 19.
      Bemærk: Transgener på extrachromosomal arrays kan også integreres i germline ved UV-bestråling i et yderligere skridt til at give homogen linjer 18. For eksempel erm-1 blev integreret i germline af UV-bestråling at opnå ERM-1 [++] stamme fgIs2[erm-1p::erm-1;rol-6p::rol-6(su1006)] hvor hvert dyr bærer transgen, et krav om dens anvendelse i RNAi-baseret interaktion skærmen beskrevet nedenfor. Denne stamme var desuden mærket af cytoplasmatisk ekskretionsorganerne kanalen normal god landbrugspraksis via passage i en stamme, der indeholder en vha-1 p:: normal god landbrugspraksis transgen (genereres af de samme procedurer som skitseret ovenfor, se reference 20 for grundlæggende genetiske procedurer såsom Kors) og er benævnt ERM-1 [++]; vha-1 p:: normal god landbrugspraksis stamme nedenfor.

2. Opbygningen af et målrettet RNAi bibliotek og Design af et RNAi interaktion skærmen til at ændre en Canal fænotype

Note: en målrettet RNAi-baserede genetiske interaktion skærm er beskrevet der bruger en overekspression cystisk kanalen fænotype til søgning efter interagerende ekskretionsorganerne canal morfogenese gener. ERM-1 [++] stamme tjener (Se trin 1.2.9) som eksempel 9. Denne strategi udgør kun en af mange mulige tilgange til genetisk analyse af ekskretionsorganerne canal lumen morfogenese (Se Introduktion og diskussion til andre genetiske metoder). Se den ledsagende papir på tarm tubulogenesis 3 og referencer 17 , 21 , 22 for baggrundsoplysninger om RNAi, detaljer af RNAi procedurer, graduering af RNAi styrke (justeret til de ofte dødbringende tubulogenesis gener) og diskussion af tekniske problemer forbundet med RNAi. Se reference 19 for standard orm kultur og vedligeholdelse og tabel materialer.

  1. Søg for ERM-1 (eller andre gen af interesse) interagerende molekyler i databaser og publicerede artikler.
    Bemærk: Potentielle ERM-1 interactors ønsker omfatter alle molekyler, der blev eksperimentelt vist at funktionelt, genetisk eller fysisk interagere med ERM proteiner i alle arter og/eller blev forudsagt af nogen i siliciummangan, høj produktivitet eller systembiologi tilgang (Se tabel 3 eksempler på databaser og ressourcer).
  2. Genererer en liste over alle gener og finde C. elegans homologs hvor det er påkrævet.
    Bemærk: Overveje at udvide listen over identificerede gener til gen klasser, som tager højde for funktionen af gen af interesse og udvider på nettet for at identificere interactors (fx membran-actin linker ERM-1, vælge alle actins og aktin-relaterede molekyler).
  3. Identificerer de tilsvarende RNAi bakteriel fodring kloner i kommercielt tilgængelige genome-wide bakteriel RNAi biblioteker for alle gener (fx Ahringer genomisk C. elegans RNAi fodring bibliotek 21; Tabel over materialer)
  4. Genererer en regneark for alle gener og deres tilsvarende RNAi plade og godt nummer.
  5. Pluk og streak ~ 50 RNAi kloner på ampicillin-LB-tetracyklin plader (valg af antibiotikum bestemmes af bibliotek konstruktion) pr. dag og fortsætte indtil målrettet RNAi bibliotek genereres.
    Bemærk: Afhængigt af bibliotek størrelse og forventede arbejdsproces, udelader generere en fuld bibliotek og fortsætte direkte med batchanalyse. Pladerne kan opbevares ved 4 ° C, ikke længere end ca. 2 uger (hvis nødvendigt, igen streak på nye plader ovenpå). Omvendt, man kan generere større frosne biblioteker i Repliker 96-brønd eller 384-godt formater til langtidsopbevaring ved-80 ° C.
  6. Ruger plader ved 37 ° C natten over. Næste morgen, fjerne plader fra rugemaskinen, og butikken ved 4 ° C.
  7. Pluk RNAi bakterier fra en plade af en steril tandstikker, bland bakterier med 600 μl LB/ampicillin (50 ng/μl) bouillon i 1,5 mL microtube, inkuberes rør ved 37 ° C, ryste for 6 h.
    Bemærk: Podes RNAi bakterier i bouillon ved at gnide pick (tandstikker eller mikropipette tip) langs siden af microtube.
  8. Frø 70 μL kulturperler bakterier i hver brønd af 6-godt RNAi plader i dobbelt eller tredobbelt sæt. Inkuber RNAi plader ved 22 ° C natten.
    Bemærk: RNAi plader er genereret af standardprocedurer (Tabel af materialer og referencer 3 , 17 , 21) og her bruges i en 6-godt væv kultur plade format for en højere overførselshastighed tilgang, der stadig giver mulighed for den mikroskopiske evaluering af canal morfogenese i levende dyr på pladerne.
  9. Næste morgen, pick 3 L4 fase ERM-1 [++]; vha-1 p:: normal god landbrugspraksis orme på hver brønd af RNAi plader.
    1. Til at undgå forurening med OP50 bakterier (Se reference 19), der interfererer med RNAi første frø orme på en NGM tallerken uden bakterier og lade dyr kravle i ca 10 min. Brug kun ikke-hungrende sunde dyr.
  10. Inkuberes plader ved 22 ° C til 3 d så dyr at producere afkom.
  11. Undersøge canal fænotyper i F1 afkom under dissekere fluorescens mikroskop.

3. In Vivo Imaging af C. elegans Excretory kanalen ved fluorescens dissekere mikroskopi og Scoring af Tubulogenesis fænotyper

  1. Forbered en fænotype scoring ark (eksempel vist i tabel 4 og figur 5 ).
  2. Placer agar plade med orme direkte under fluorescens dissecting mikroskop, åbne låget på pladen for evaluering, bruge lavere forstørrelse til fokus.
    Bemærk: Denne protokol beskriver brugen af en scope med 1,5 X og 10 X mål og et zoomområde fra 3,5 til 45 (Table of Materials).
  3. Evaluere dyr ved at fokusere på hver godt separat, begyndende med godt 1 og arbejde ned pladen.
    Bemærk: Start altid med evalueringen af kontrolelementer. For eksempel, en mock (Tom vektor) negativ kontrol (HT115 RNAi bakterier (Se referencer 17 , 21) uden eller med en ikke-forretningsmæssigt forbundne gen Indsæt) og relevant positiv kontrol, fx i Denne interaktion skærm, erm-1 RNAi (undertrykker ERM-1 [++] fænotype) og sma-1 / spectrin RNAi (forbedrer ERM-1 [++] kanalen fænotype).
  4. Først skal undersøge generelle fænotyper synlig under skarpt lys (f.eks: Lad/lethal, Clr/clear, Emb/embryonale dødbringende, Ste/sterilt, UNC-/ ukoordinerede, Dpy/nivellering, etc.), kvantificere fænotype ved at tælle antallet af dyr og antallet af dyr med fænotype, optage numre (Se tabel 4).
    Bemærk: For knockdowns af gener, der forårsager defekter, der kan påvirke vurderingen af canal fænotyper (f.eks. Emb, Ste), overveje at gentage eksperimentet med betinget, bogføre embryonale RNAi (Se ledsager papir til procedurer 3 ).
  5. Undersøge ekskretionsorganerne canal fænotyper under fluorescerende lys andet, score kvantificerbare fænotyper (fx, længden af kanalen, bredde af lumen, cyster), indspille numrene og beskrive fænotyper på en scoring ark (Se tabel 4, < stærk class = "xfig" > figur 5).
    Bemærk: Højere forstørrelse med zoomområdet er forpligtet til at evaluere mere subtile canal fænotyper. Flytte frem og tilbage mellem lav og høj forstørrelse omhyggeligt evaluere kanalen ’ s længde og bredde og eventuelle andre canal morfogenese fænotype. For kvantificering eller semi-kvantificering af simple fænotyper, tæller 100 dyr (f.eks. L4s i denne målrettede RNAi-skærm, og fænotyper: canal længde af 1/4, 1/2, 3/4 og fuld forlængelse af posterior kanaler og lumen diameter af posterior kanaler, lille cyster (< 1/3 af animalske bredde), store cyster (> 1/3 af animalske bredde); Se tabel 4).
  6. Erhverve billeder af den fremherskende fænotyper fra mindst 3 forskellige dyr af et mikroskop monteret digital charge - sammen enhed (CCD) kamera og tilhørende software til billedbehandling (Se Tabel af materialer)
    1. at erhverve billeder, først at tænde kameraet, tænde vedlagte computer, dobbeltklik på ikonet image capture software, fokusere et område af ormen pladen manuelt under lav forstørrelse og åbne kamera lukkeren.
    2. Klik på den “ opholde sig forpremiere ” ikon image capture software på skærmen for at visualisere orme på computerskærmen, justere fokus manuelt til klart visualisere orme på skærmen og derefter klikke på den “ snap ” ikon, derefter Klik på den “ Gem ” ikon.
      Bemærk: Dyr vil bevæge sig hurtigere under fluorescerende lys, derfor holde én hånd på computermus klar mens flytte pladen ind i området af interesse med anden hånden. Klik straks den “ snap ” ikon at erhverve billedet. Det er normalt muligt at erhverve et godt image med flere prøver.
    3. Gemme de erhvervede billeder med et passende filnavn (omfatter stammenavn, RNAi klon navn og dato).
      Bemærk: Hurtigere bevægelige vildtype orm med tynde og lange kanaler er vanskeligere at billede end mutanter. Mutanter med cystisk kanaler og/eller andre fænotyper er tilbøjelige til at bevæge sig langsomt, således at lette billedbehandling. Markør plasmider som Rol kan være nyttige for billeddannelse ved at holde dyr “ på stedet ” snarere end bevæger sig fremad, og kan også give en forbedret visning på fænotype dyret rullende rundt selv.

4. Imaging af C. elegans Excretory kanalen i højopløsning af Laser Scanning konfokalmikroskopi

  1. montering levende dyr
    1. placere en lille mængde smørefedt eller vaseline på spidsen af en vatpind eller på spidsen af den indeksere finger, og sprede fedt for at generere en ultratynde cirkel med en diameter på ~ 6 – 8 mm i et rent glas dias.
    2. Sted 6 μL 5% lidocain løsning (bedøvende) ind i cirklen af en mikropipette.
      Bemærk: En lidocain stamopløsning kan laves ved at opløse lidocain pulver i vand. Fortyndes til 5% med M9 buffer 19 (Tabel af materialer). Det er kritisk for analysen af ekskretionsorganerne kanalen til at undgå de fælles immobilisering løsninger (såsom natriumazid), der forårsager cyster at briste og at fremkalde canal fænotyper.
    3. Vælge flere dyr fra et RNAi plade, og placere dem i lidocain løsning af immerging orm pick 19 oploesningen.
      Bemærk: Vælge helst fase-specifikke dyr, der vil lette selv-montering af ensartet tykkelse. Dyr kan være forvalgt på dissekere fluorescens mikroskop.
    4. Placere en 22 mm x 22 mm coverslip i glas diaset; lad det forsigtigt bosætte sig på fedt cirkel.
      Bemærk: Må ikke anvendes nogen fysisk pres på de coverslip, som kan skade canal morfologi, især i mutanter eller RNAi behandlet orme med canal og eventuelt andre fænotyper. Det er derfor vigtigt at undgå en tyk fedt cirkel; ideelt dyr forsigtigt er klemt inde mellem glas og cover slip.
    5. Skriver navnet på prøven i matteret side af glas dias. Straks tage diaset til Konfokal mikroskop til analyse af canal fænotype og at erhverve billeder.
      Bemærk: Forsinkelser kan resultere i beskadigelse af kanalen cyster eller ændre i kanalen lumen morfologi.
  2. Acquiring Konfokal billeder
    1. placere diasset på prøve scenen af en Konfokal mikroskop, fokusere orme på lav forstørrelse (10 X).
    2. View og vælg dyr under 60 X og/eller 100 X mål, undersøge ekskretionsorganerne kanalen ’ s cellulære og subcellulært fænotyper, fx, lumen form og diameter, størrelse og form af cyster; eller komponenterne subcellulært mærket for analyse, f.eks., apikale/lumenal membran, basal membran, cytoplasma, endosomal versus kanalikulær vesikler, andre organeller (Se diskussion, figur 2 og figur 4).
    3. Erhverve billeder af den specifikke Fænotypen af interesse.
      Bemærk: Denne protokol beskriver brugen af laser scanning Konfokal mikroskop (Tabel af materialer). Du kan løse subcellulært komponenter i den tynde C. elegans er ekskretionsorganerne kanaler, højere forstørrelse mål (60 X 100 X) påkrævet. Spinning-disk Konfokal mikroskop kan bruges til at erhverve tid lapse billeder men giver mindre confocality (Se diskussion).
      1. For at erhverve Konfokal billeder, tænde computeren, dobbeltklik på Konfokal mikroskop software, og vælg laseren ved at klikke på et ikon for specifikke laser.
      2. Klik på den “ scan ” ikon at visualisere ormen fokuseret på computerskærmen, justere laser intensitet gennem den software, og klik igen på “ Skan ” ikonet for at stoppe scanningen, så klik på “ fange ” ikonet for at fange et billede og derefter klikke på “ Spar ” ikon.
      3. Gemme billeder med korrekte filnavn og omfatter RNAi klon navn, stamme-navn og dato.
        Bemærk: Billeder kan erhverves som enkelt og flere sektioner (fx 10 – 15 sektioner langs z-aksen). Skæring kan 3D visualisering. Erhverve projektion billeder og gemme separat hvis påkrævet (afhængigt af mikroskop). Optimal opløsning, at bruge laser indstillinger med lav gevinst, ikke åbne pinhole for meget, og tilføje flere gennemsnit pr. billede (Se referencer 23 , 24 for generel diskussion af Konfokal imaging). Vær omhyggelig med at erhverve billeder på en lysstyrke under mætning niveau at tillade ændring af imaging software, hvis påkrævet (helst bruge uændrede billeder).
      4. Opnå billeder af dobbelt - eller formere mærket kanaler (f.eks. grønne, røde og blå) på samme måde, ved at klikke på flere laser ikoner, men bruge sekventielle scanning for at undgå gennemblødning mellem kanaler (kritisk for Co lokalisering undersøgelser).
        Bemærk: Man kan være nødvendigt at tage hensyn til den nødvendige tid til sekventielle scanning (som også resultater i en tilsvarende stigning i foto blegning) og ændre scannerindstillingerne. Lave ikke skanne dyr fra ét dias til mere end 30 min maksimale at undgå uspecifik virkninger på canal morfologi. Montere nyt dias, hvis længere scanning kræves.
      5. Erhverve tilsvarende differential interferens optik (DIC) / Nomarski billeder, især hvis kvantificere kanalen længde og lumen diameter i forbindelse med ormen ’ s længde og diameter. Overlay fluorescens og Nomarski billeder ved at klikke på “ overlay ” ikonet for at vise vartegn ( fig. 1 d og figur 4A – D).
    4. For kvantificering, måle fluorescens intensiteten af en mærket komponent af interesse ved ImageJ software 25 ( figur 5 c).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokol beskriver hvordan man bruger C. elegans ekskretionsorganerne kanaler til visuelt og molekylært analysere encellede tubulogenesis og intracellulære lumen morfogenese i en enkelt celle. Under deres udvidelse fra tidspunktet for midten embryogenese til voksenalderen, de fire ekskretionsorganerne kanaler fortsætter med at udvide deres basolateral og apikale/lumenal membraner sammen med deres kanalikulær og endosomal endomembrane system, der giver en enestående model for i vivo -analyse af de novo polariseret membran Biogenese (figur 1). Subcellulært komponenter såsom apikale membraner, cytoplasma og endosomal versus kanalikulær blærer kan visualiseres ved at udtrykke specifikke fluorescerende fusion proteiner (beskrevet i protokollen afsnit 1), og de kan skelnes fra hinanden ved fordoble eller tredoble mærkning i en enkelt transgene dyr (figur 2). En unik ekskretionsorganerne canal fænotype (figur 3A-B) genereret af overekspression en apikale membran forbundet molekyle (ERM-1), der bruges til at vise, hvordan man udfører en målrettet RNAi skærmen for at identificere gener funktion i apikale membran og lumen Biogenese; Dette tjener som et eksempel på en molekylær og visuel analyse af polariseret membran Biogenese i denne model (beskrevet i protokollen afsnit 2). Denne ERM-1 [++] kanalen fænotype bruges til at demonstrere hvordan man visuelt evaluere og score suppression (figur 3 c-D) og enhancement (figur 3E-F) af dissekere Fluorescens mikroskopi (beskrevet i afsnit 3-protokollen) . Canal fænotyper induceret af graduering af ERM-1-niveauer tjene til at vise hvordan man kan løse fejl på subcellulært niveau af Konfokal mikroskopi (figur 4) (beskrevet i protokollen afsnit 4), og hvordan at kvantificere simpel canal fænotyper (canal længde og cyste størrelse) og apikale membran Biogenese defekter (figur 5).

Figure 1
Figur 1 : Morfogenese af C. elegans Excretory kanalen og subcellulært Canal strukturer
(A) skematisk gengivelse af ekskretionsorganerne canal forlængelse (blå linje) i udviklingen af embryoner og larver. Cellen ekskretionsorganerne når dens endelige placering på den venstre ventro-laterale side af den bageste svælg pære på stadiet komma embryoets (ikke vist). Som fosteret elongates, udvider det første to arme sideværts mod venstre og højre side; derefter tveger hver arm i en anterior og posterior gren. Disse anteriore og posteriore grene udvide hele strækning af dyret under fire larve faser, først at indhente dyrets vækst på stadiet L2, så ledsager dens yderligere vækst, indtil voksenalderen. De novo polariseret membran Biogenese understøtter denne udvidelse op til voksenalderen. (B) i de voksne dyr, den forreste canal grene nå næsetip, og de posteriore grene, hale (blå linjer). Ekskretionsorganerne cellen kroppen er vist nær den bageste svælg pære (blå). Polariseret membran domæner vedligeholdes i voksenalderen. (C) udvidet udsigt over en kanal arm sektion. Venstre: 3D-visning af kanalen viser: basal membran (sort), cytoplasma (blå), lumenal membran (grøn) og lumen (hvid). Højre: inde udsigt over kanalen og dets membraner: basal membran (sort), cytoplasma (blå), endosomes (gule ovaler), kanalikulær vesikler (hvide kugler, forbundet med hinanden, forbundet til lumen, eller isolerede enkelt vesikler), apikale membran (grøn) og lumen (hvid). (D) Confocal/DIC overlay micrographs af ekskretionsorganerne cellen i et foster og ekskretionsorganerne kanaler i en larve, mærket af lumenal versus cytoplasmatisk normal god landbrugspraksis, henholdsvis. Venstre billede: ekskretionsorganerne celle (grøn, pil) i en 1.5-fold embryo, med canal lumen visualiseres ved at udtrykke apikale ERM-1::GFP under erm-1 promotor. Højre billede: fire ekskretionsorganerne canal grene (grøn, pil) i L3 larver, visualiseret af cytoplasmatisk vha-1 p:: normal god landbrugspraksis. Skalere barer = 20 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Visualisere subcellulært komponenter i Wild-type ekskretionsorganerne Canal arme ved dobbelt mærkning med fluorescerende Fusion proteiner
(A) adskiller cytoplasma fra den apikale membran. Udtryk for normal god landbrugspraksis sulp-5 promotor visualiserer canal cytoplasma (grøn, top); udtryk for ERM-1::mCherry sin egen promotor visualiserer den apikale membran (rød, midterste); flette disse billeder (nederst) skelner mellem cytoplasma og den apikale membran, der ellers ville være umulig at skelne ved enkelt mærkning selv ved høj forstørrelse. Skalalinjen = 5μm. (B) fastlæggelse af de rumlige forhold af endosomal vesikler til lumen. Visualisering af lumen af en apikale membran-associerede normal god landbrugspraksis fusion protein (pseudo farvet til rød, top); visualisering af endosomal blærer ved at udtrykke mCherry::RAB-7 (pseudo farvet til blå, midterste); flette disse billeder (nederst) viser de relative rumlige positioner af endosomal vesikler til lumen. Skalalinjen = 5μm. (C og D) Løsning af kanalen røret figurer versus subcellulært canal komponenter i forskellige forstørrelser. Cytoplasma af L1 larver er mærket af udtryk for normal god landbrugspraksis under sulp-5 promotor og cytoplasmatisk kanalikulær vesikler udtrykke vand kanal AQP-8::mCherry aqp-8 promotor. (C) billeder erhvervet ved lavere forstørrelse løse en "perler-på-en-streng" mønster svarende til fase-specifikke varicosities (varicosities er reservoirer rigelige i kanalikulær vesikler og andre komponenter, der kræves for kanalen vækst), men gøre ikke løse cytoplasmatisk AQP-8 puncta. (D) billeder erhvervet ved højere forstørrelse løse AQP-8 puncta i kanalen cytoplasma, svarende til kanalikulær vesikler. Skala barer: 20 μm i C og 5 μm i D. Alle paneler viser Konfokal fremskrivninger af 10-15 dele hver. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Scoring smagsforstærkere og Suppressors af en cystisk kanalen fænotype (ERM-1[++]) af dissekere mikroskopi
(A) ERM-1 [++]; ROL-6(su1006) ekskretionsorganerne kanaler er visualiseret give udtryk for normal god landbrugspraksis en vha-1 promotor. Bageste kanaler udvide op til vulva eller midten af kroppen af dyr (pile; betragtes som 1/2 udvidelse) ved lavere forstørrelse (1.5 X mål og lav zoom). (B) ved højere forstørrelse, signatur ERM-1 [++] lille-cystisk krympede Kanalen kan løses, med spidsen af de bageste kanaler (ene arm angivet med lille pil) udvidelse op til vulva eller lidt længere (vulva angivet med stor pil; canal lumen i panelet D kan betragtes som vildtype for sammenligning). (C) undertrykkelse, lav forstørrelse: aflange og tynde kanaler i RNAi behandlede ERM-1 [++] dyr. (D) ved højere forstørrelse, bageste kanaler kan ses næsten fuldt udvide til hale (små pile; Sammenlign end forældregenerationen, vist i panelet B); stor pil angiver placeringen af vulva. (E) ekstraudstyr: yderligere forkortet kanaler med større cyster i RNAi behandlede ERM-1 [++] dyr; lav forstørrelse, ingen zoom. (F) ved højere forstørrelse, bageste kanalen udvidelse kan bestemmes som mindre end 1/2 (lille pil) eller ikke forlænges op til vulva (angivet med stor pil) og cyste størrelse som overstiger 1/3 af dyrets bredde (bredere end den forældredyr, som vist i B). Skalere barer = 400 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Visuel analyse af ekskretionsorganerne Canal morfologi og subcellulært Canal komponenter i Mutant/RNAi dyr af Konfokal mikroskopi
(A-D) Skelne mellem en vakuolære fra en cystisk kanalen fænotype (Konfokal/DIC overlay micrographs er vist). (A) cytoplasma af et wild-type kanalen er visualiseret give udtryk for normal god landbrugspraksis sulp-5 promotor (pseudo-farvet blå i sondring fra apikale membran mærkning, vist i grøn i panelet B). (B) den apikale membran af et wild-type kanalen er visualiseret ved at udtrykke ERM-1::GFP; Bemærk at lumen er ikke synlig på denne forstørrelse og at enkelt mærkning kan ikke skelne cytoplasmatisk fra membran mærkning. (C) ekskretionsorganerne canal fænotype induceret af RNAi: cytoplasmatisk mærkning kan ikke skelne cytoplasmatisk vacuoles fra intralumenal cyster. (D) ekskretionsorganerne canal fænotype induceret af RNAi: apikale ERM-1::GFP mærkning registrerer væskeophobning inde i lumen, identificere (lumenal) cyster i stedet (cytoplasmatisk) vacuoles (Sammenlign figur 4I for cytoplasmatisk vacuoles). Skalalinjen = 40 μm for A-D, vist i A. (E-J) analysere tab og gevinst-af-funktion effekter på subcellulært canal komponenter (Konfokal billeder af enkelt canal arme er vist). (E-G) Effekten af erm-1 RNAi på subcellulært lokaliseringen af canaliculi. (E) vildtype canal cytoplasmaet; Bemærk normal god landbrugspraksis udstødelse angivelse lumen. (F) vildtype cytoplasmatisk AQP-8::GFP puncta, svarende til kanalikulær vesikler. (G) Cytoplasmic og basal fordrivelse af AQP-8::GFP puncta i erm-1(RNAi) dyr. (H) diskontinuert lumen og detaljer af lumen tip patologi (curling og tab af lumen centrering) i erm-1(mildRNAi) dyr Se (3 for modulerende RNAi styrke); Bemærk, at kanalen cytoplasma strækker sig ud over spidsen af lumen, her angivet små cyster. (I) cytoplasmatisk vacuoles i ekskretionsorganerne canal krop uden nogen canal udvidelse i stærkt påvirket erm-1(RNAi) dyrs3; Bemærk, at akt-5::GFP ikke er ansat til lumen (undtagen flere små pletter omkring nogle vacuoles). (J) rekruttering af overskydende ACT-5::GFP og AQP-8::mCherry til lumen i tredobbelt transgene dyr overekspression ERM-1 (Bemærk tykt bælte af ACT-5::GFP og overlappende AQP-8::mCherry klumper omkring cystisk lumen). Skalalinjen = 5 μm for E-J, vist i E. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Eksempler på kvantificering af Canal defekter af dissekere og konfokal mikroskopi,
(A) skematisk gengivelse af vildtype (øverste panel) og mutant cystisk (lavere paneler) ekskretionsorganerne kanaler til kvantificering af canal længde og cyste størrelse. Bageste kanalen længde er talbestemt på 0, 1/4, 1/2, 3/4 og 1. Canal længde «0» angiver ingen udvidelse og '1' angiver fuld længde udvidelse. Cyste størrelse er talbestemt < 1/3 (lille) og > 1/3 (store) med en diameter på kroppen. (B) kvantificering af brutto canal morfologi i kontrol og ERM-1 [++](RNAi) dyr af fluorescerende dissekere mikroskopi. I mock(RNAi) ERM-1 [++] dyr er den bageste kanal længde omkring 1/2 udvidet i 95% dyr (referenceafbildning, figur 3A-B). I suppressor ERM-1 [++](RNAi) dyr, er den bageste kanalen længde næsten fuldt udbygget i 80-90% dyr (referenceafbildning, figur 3 c-D). I enhancer ERM-1 [++](RNAi) dyr, ca 60-70% kanaler har store cyster og kortere længde (< 1/2) (referenceafbildning, figur 3E-F). Data præsenteres som betyder ± SD (n > 3). (C) kvantificering af fluorescens-intensiteten af den apikale/lumenal canal cytoskeleton af ImageJ fra Konfokal billeder. Kanalens apikale membran er mærket af loven-5::GFP, wild-type kanalen arm er vist til venstre, ERM-1 [++] kanalen arm, til højre. Paneler til venstre: intensitet af ACT-5::GFP i vildtype membran ærme er omkring 50 (grå værdi/membran, angivet med sort og rød pil), plot vist nedenunder billedet. Lige paneler: intensiteten af ACT-5::GFP i ERM-1 [++] er over 100 (grå værdi af dorsale membran er omkring 110 (sort pil), og ventrale membran er omkring 140 (rød pil)), plot vist under billedet. Skalere barer = 5 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1: eksempler på markører for den C. elegans Ekskretionsorganerne Canal membran System
Protein navn Sub
cellulære lokalisering Funktion Eksempler på tilgængelige stammer Referencer ERM-1 apikale domæne membran-cytoskeleton linker VJ402 (fgEx13 [erm-1p::erm-1::gfp, rol-6p::rol-6(su1006)]) Ref (13) ACT-5 apikale domæne apikalt lokaliserede actin VJ268 (fgEx12[(act-5p::act-5::gfp), unc-119 (+), unc-119 (ed3) III]) Ref (13) ABTS-2 Basolateral Anion/bikarbonat transporter ABTS-2::GFP Ref (42) SULP-8 Basolateral Sulfatepermease SULP-8::GFP Ref (42) VHA-1 kanalikulær vesikler V-ATPase VJ535 (fgEx35 (vha-1p::vha-1::gfp, rol - 6p:: rol-6(su1006))) Ref (9) VHA-5 kanalikulær vesikler V-ATPase ML846 (vha-5(mc38) IV; mcEx337 [vha-5 (+):: normal god landbrugspraksis + rol-6(su1006)]) Ref (10) AQP-8 kanalikulær vesikler aquaporin, vand kanal VJ533 (fgEx33 (aqp-8p::aqp-8::gfp)) Ref (9) RAB-5 endosomal blærer handel BK209 (qpIs99 (exc9p::mCherry::rab-5)) Ref (36) RAB-7 endosomal blærer handel BK210 (qpIs100 [Pexc-9::mCherry::rab-7]) Ref (36) RAB-11 endosomal blærer handel BK205 (qpIs97 (exc9p::mCherry::rab-11)) Ref (36) 1 Eksempler er valgt fra ressourcer, der er anført i tabel 3.

Tabel 2: eksempler på C. elegans Excretory Canal-specifikke initiativtagere
initiativtagere Udtrykket fase
ERM-1 komma fase embryo
sulp-5 3-fold embryo
vha-1 2-fold embryo
vha-5 2-fold embryo
aqp-8 2-fold embryo
GLT-3 sen embryo
1 Eksempler er valgt fra ressourcer, der er anført i tabel 3.

Tabel 3: ressourcer
Ressourcer til at identificere C. elegans ekskretionsorganerne canal-specifikke molekyler, mærkning reagenser/stammer og antistoffer
1. Caenorhabditis genetik Center (CGC)43 til rådighed reagenser og stammer
2. Wormbase44 oplysninger om ekskretionsorganerne canal-specifikke molekyler, stammer og antistoffer
3. oplysninger om ekskretionsorganerne canal-specifikke molekyler: Se reference6
4. Transgeneome hjemmeside45 for Translationel normal god landbrugspraksis fusion konstruktioner
5. C.elegans udtryk mønster46 for transcriptional normal god landbrugspraksis fusion konstruktioner
6. de nationale BioResource projektet (NBRP)::C.elegans47 for oplysninger om C. elegans mutanter og projektledere
7. Fluorophores: Se reference48,49
Web-baserede ressourcer for at samle molekyler til en målrettet RNAi bibliotek
1. GeneMANIA50
2. AceView51
3. iHOP52
4. Wormbase44
5. saccharomyces genom Database53
6. Flybase54
7. mus genom Database55
8. menneskelige genom Database56
9. BLAST57

Tabel 4: Eksempel på simpel fænotype Scoring ark
RNAi bibliotek Stamme General fænotype (% total) Canal fænotype
Canal længde < 1/2 (% L4) Canal længde > 1/2 (% L4) Andre Canal fænotype Samlede antal dyr tælles
Plade nr. Godt nummer
I-1 A1 ERM-1 [++]; vha-1 p:: normal god landbrugspraksis CLR (30) 80 20 100
X-5 B12 samme ingen 30 70 100
III-10 C5 samme UNC (54) 70 30 store cyster 100

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

C. elegans genetiske alsidighed, gennemsigtighed, enkel krop plan og invariante celle lineage gør det en fremragende model for analyse af morfogenese. Denne protokol beskriver hvordan man kombinerer standard genetiske manipulationer og billedbehandling undersøgelser for at drage fordel af 2 micron tynd C. elegans ekskretionsorganerne kanaler for at studere polariseret membran og intracellulære lumen Biogenese i en enkelt celle tube.

Mærkning
C. elegans ekskretionsorganerne kanaler kan mærkes ved ekspression af fluorescerende fusion proteiner, tillader live analyse (beskrevet her), eller af antistof eller kemisk farvning (Se ledsager papir på tarm tubulogenesis for antistoffarvning 3). udtrykket af to eller flere forskellige fluorophores, eller en kombination af disse forskellige mærkning teknikker, giver mulighed for en høj opløsning visual dissektion af disse tynde tubuli (figur 2). Fluorescerende fusion proteiner til kanaler, instrueret af en canal specifikke promotor er det første valg til ekskretionsorganerne canal mærkning af flere årsager, blandt dem: (1) lave udtryk niveauer af mange canal proteiner, og (2) kanalen fine struktur, der er let overvældet af farvning uden for de kanaler hvor protein af interesse kan også udtrykkes. På den anden side kanaler er følsomme over for eksogene proteiner og nemt udvikler uspecifik fænotyper (f.eks.forlængelse fejl og cyster eller endda dødelighed) når disse proteiner er stærkt udtrykt. Dette bør afvejes i beslutningen, når du vælger mellem forskellige måder at generere transgene dyr. I princippet kan transgener indføres som extrachromosomal arrays (f.eks.ved direkte injektion af plasmid DNA i gonade for kønscelleoverførsel transformation, som beskrevet her), som typisk genererer høj-kopi nummer arrays (ofte med høje udtryk), eller integreret i genomet, typisk på lavt eller enkelt kopi nummer (f.eks.ved bombardement26 eller via en Mos1-medieret enkelt kopi indsættelse [MosSCI]27). Extrachromsomal arrays kan også integreres i genom i et andet trin (stadig, dog på en høj eksemplarnummer)18. På den anden side, når injiceres kønscelleoverførsel ved lav koncentration (f.eks.1 – 2 ng/µL DNA, kombineret med en højere koncentration af markør DNA), kan lav (selv enkelt) kopi nummer arrays være let genererede28. Dette scenario har den fordel at DNA koncentrationer kan varieres, hvilket kan hjælpe med at finde det bedste udtryk niveau for kanalen mærkning, hverken for lavt eller for højt (toksisk). Forholdet mellem injiceres DNA koncentration og udtryk niveau er afhængig af flere faktorer (f.eks., promotoren), og dermed skal fastlægges empirisk. Alternativt, gen af interesse kan være direkte mærket med en fluorophore i germline grupperet jævnligt afbrudt kort palindromiske gentager (CRISPR) baseret mærkning procedurer29,30. Selv om denne tilgang placerer fluorophore i sin mest fysiologiske genomisk sammenhæng, er det ikke altid nødvendigt eller endog ønskeligt (f.eks., når proteinet er udtrykt på et meget lavt niveau). Det kan dog være den bedste løsning, for eksempel hvis gen af interesse er meget stor.

Canal visualisering kan opnås ved at dirigere transcriptional konstruktioner ind i kanalen, der vil fremhæve canal cytoplasma ved en fluorophore. Derimod kræver mærkning subcellulært canal komponenter en translationel fusion hvor fuld længde-genet er forbundet i rammen til fluorophore gen-kodning. Når du bruger en canal specifikke promotor for udtryk (i stedet for gen egen promotor), bør dens valg baseres på arrangørens styrke og for den udviklingsmæssige analyse, tidspunktet for dens udtryk. Mange ekskretionsorganerne canal specifikke gener udtryk ikke før larve scenen når kanalens osmotisk funktion bliver kritisk. for sent til analyse af sin aktive udvidelse fase (erm-1 og pros-1 er tidlige udtrykte gener)10,13. Eksempler for markører af ekskretionsorganerne canal endo- og plasma membraner og canal specifikke initiativtagere er givet i tabel 1 og 2, henholdsvis, og ressourcer for at finde yderligere canal-specifikke molekyler i tabel 3. Disse ressourcer kan også bruges til at finde en allerede foretaget passende fluorescerende fusion protein, som kan være tilgængeligt via Caenorhabditis genetik Center (CGC; Se også tabel 1). For at konstruere rekombinant plasmider for udtryk for sådanne protein fusioner, kan man bruge forskellige kloning metoder, hver med specifikke fordele og ulemper (diskuteret andetsteds14). Disse omfatter konventionelle begrænsning enzym baseret kloning tilgange, beskrevet her, modulære kloning ved hjælp af flere lokationer Gateway system31, Gibson forsamling32eller reporter gen konstruktion af metoden "PCR syning"14 ,33. Disse forskellige tilgange kan tilpasses til den valgte for deres indførelse i germline metode og/eller andre specifikke behov (for eksempel, alsidige Gateway system letter blander af initiativtagerne og cDNAs for større skala mærkning tilgange) . Pleje skal tages for at vælge den korrekte indføringsstedet for fluorophore (forbinder det på N-versus C-terminalen af proteinet), under hensyntagen til funktionen af proteinet af interesse.

Interferens med genfunktion
Som en af mange mulige måder at forurolige genfunktion i C. elegans, beskriver denne protokol en målrettet RNAi interaktion skærm designet til at ændre en cystisk kanalen lumen fænotype, fremkaldt ved overekspression en lumenal membran komponent. I dette specifikke tilfælde overekspression en apikale/lumenal membran forbundet markør, såsom ERM-1 har fordel af direkte ledende undersøgelsen til de ønskede mål: analyse af intracellulære apikale/lumenal membran Biogenese. En gevinst af funktion fænotype genereret af overekspression også giver visse fordele, når det kombineres med et tab af funktion (RNAi) interaktion skærm som beskrevet her (Se34 for diskussion af tab og vinding-af-funktion analyser og de design af genetiske skærme). ERM-1 selv er desuden et godt undersøgte "lumen morfogenese" og apikale membran identitet molekyle12. Derfor, i dette tilfælde en målrettet (snarere end objektiv) skærm er tilbøjelige til at være direkte informativ for lumen morfogenese mens samtidig yderligere kendetegner ERM-1's særlige funktion i denne proces. Men en uvildig ikke-øremærket skærmen kunne gennemføres på en lignende måde, starter enten med en wild type dyr, en transgene dyr med fluorescently mærket ekskretionsorganerne kanaler, eller med nogen canal mutant. Generelle fordele og ulemper af RNAi (fxversus mutagenese) for generation af tab af funktion fænotyper, og overledning og diskussion af forskellige typer genetiske skærme i C. elegans er diskuteret andetsteds 34. RNAi producerer et spektrum af fænotyper, herunder mildere fænotyper, en specifik fordel for analysen af de ofte dødelige tubulogenesis gener. Dette er beskrevet og drøftes i det ledsagende dokument på tarm tubulogenesis3. Forskellige tilgange til at generere gevinst og tab af funktion mutanter og klassisk genetiske procedurer såsom Kors, er detaljeret og drøftet i almen genetik metoder litteratur20.

Mikroskopi og evaluering af tubulogenesis fænotyper
Visuelt evaluering og scoring ændring af en veldefineret canal fænotype under en fluorescerende dissekere mikroskop ved hjælp af simple scoring parametre (som kanalen længde og lumen diameter), som beskrevet her, kan opnås i en kort periode selv når behandling større antal dyr i en målrettet eller systematisk genetiske eller RNAi skærmen. Der er derimod en lignende skærmen søger efter romanen canal morfogenese fænotyper i en stamme wild-type (undtagen sin canal-mærkning transgen), er mere tidskrævende, men kan i princippet udføres på samme måde (vi har udført sådan en skærmen på en genome-wide basis i flere måneder). Sådanne skærme vil identificere flere forskellige canal fænotyper (ikke vist her) og derfor skal udvikle tilsvarende forskellige scoring parametre, f.eks., en kvalitativ klassificering ordning (Se 9,11, 35,36,37,38 for forskellige måder at score canal fænotyper af dissekere mikroskopi). Ved fortolkningen af enhver canal fænotype, er det vigtigt at huske at cystedannelse kan være en uspecifik effekt af mange forskellige fornærmelser mod denne tynde rørformet struktur, og det er ofte en mindre informativ terminal fænotype. Cyste størrelse og placering, på den anden side kan være oplysende, f.eks., en cyste tæt på canal celle (starten af canal forlængelse), cyster langs kanalens længde eller cyster på canal tips, give et fingerpeg til den underliggende mekanisme af fejl. Kanalen cyster (her defineret som intra-lumenal væskefyldte spheroids omgivet af en apikale/lumenal membran) bør skelnes fra vesikler (lille cytoplasmatisk membran-bundet væske fyldte spheroids) eller vacuoles (udvidede cytoplasmatisk membran-bundet væske fyldte spheroids), ikke omgivet af en lumenal membran, der kan alle Se overfladisk identisk (figur 4A-D). Cytoplasmatisk vacuoles kan ligeledes opstå sekundært, fxvia toksiske effekter af montering solutions (natriumazid). Både store cyster og cytoplasmatisk vacuoles kan tage op næsten størrelsen på dyret, og skal der yderligere skelnes fra den klassiske "clear (Clr)" canal fænotype, der er forårsaget af ophobning af væske i kroppen hulrum. Endelig, canal længde er næsten altid sekundært kompromitteret i cystisk kanaler, en sand canal udvidelse defekt skal derfor påvises i cyste frie omgivelser.

På trods af deres lille diameter, subcellulært komponenter af ekskretionsorganerne kanaler, såsom apikale versus basale membraner, intracellulære endosomal versus kanalikulær vesikler, intracellulære organeller og cytoskeletal komponenter, kan visualiseres ved højere forstørrelse, fxKonfokal mikroskopi (figur 2, figur 4). Af Konfokal imaging er en normal god landbrugspraksis positive canal cytoplasma alene tilstrækkeligt til at skelne lumen fra canal cytoplasma via en ikke-fluorescerende linje (figur 2A, figur 4E). Identiteten af markører bidrager til at løse kanalikulær fra endosomal vesikler (også påfaldende forskellige i størrelse), selv om endelige fordeling vil kræve immunoelectronmicroscopy39. Dobbelt og tredobbelt mærkning kan bestemme den subcellulært lokalisering af et molekyle af interesse og forholdet mellem subcellulært komponenter til hinanden (figur 2). Enkelt mærket lumenal canal membraner producere den samme dobbelte streg som cytoplasmaet eller den basale membran, men kan skelnes via dobbelt eller tredobbelt mærkning. For Konfokal analyse, korrekt montering er vigtig, givet skrøbelighed canal struktur, dens følsomhed over for osmotisk ændringer og sårbarhed af dens mest hyppige cystisk fænotype. Cyster brast nemt med osmotisk ændringer eller fysisk pres, er følsomme over for membran toksiner som natriumazid og er også følsomme over for nogle anæstetika anvendes for immobilisering (der kan også producere cytoplasmatisk vacuoles). I vores hænder virker 5% lidocain i M9 buffer bedst for mest ekskretionsorganerne canal assays. Imaging procedurer og alle håndtering bør være blid, som beskrevet. For at undgå artefakter, der efterligner fænotyper (fx, cyster og vacuoles), er det bedst at straks får billeder efter montering. Hvis det ikke er muligt, skal cyste billeder erhverves først, før imaging andre fænotyper. Denne protokol beskriver standard scanning Konfokal mikroskopi, der giver overlegne confocality, i forhold til spinning disk Konfokal mikroskopi, som til gengæld reducerer fototoksicitet og mikroskopi af valg til analyse af dynamiske ændringer af subcellulært komponenter over tid. Sådanne spørgsmål om subcellulært dynamik kan også behandles ved hjælp af photobleaching teknikker eller mærkning fusion proteiner med foto-omstillelig fluorophores, der ændrer farve40. Endelig, vifte af opløsning kan øges yderligere ved at tilføje transmissions elektronmikroskopi (TEM, giver den højeste strukturelle men ikke molecular løsning), super-resolution mikroskopi (giver molecular løsning i området nanometer); eller immunoelectronmicroscopy (giver begge)39,41. 3D tomografi kan kombineres med TEM seriel afsnit og er især nyttigt for analyse af grænsefladen kanalikulær plasmamembran af ekskretionsorganerne kanaler9,10. Forbedrede teknikker til disse forskellige typer af mikroskopi og kombinationer af disse forskellige Billeddannende metoder fortsætte at blive udviklet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker M. Buechner (University of Kansas, Kansas, USA), K. Nehrke (University of Rochester Medical Center, Rochester, New York, USA) og byens Caenorhabditis genetik, finansieret af National Institutes of Health, kontoret for forskningsinfrastruktur Programmer (P40 OD010440). Dette arbejde blev støttet af tilskud NIH GM078653, MGH er 224570 og SAA 223809 at V.G.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cloning
Plasmid pPD95.75 Addgene Cat. No. 37464
PCR Kit Qiagen Cat. No. 27106
Ligation kit New England Biolabs Cat. No. E2611L
DNA marker Thermo Scientific Cat. No. SM1331
Agarose DNA grade Fisher Scientific Cat. No. BP164-100
Competent cells New England Biolabs Cat. No. C2987H
Tris Fisher Scientific Cat. No. BP154-1
EDTA Sigma Cat. No. ED-1KG
Acetic acid Fisher Scientific Cat. No. A38S-500
Ethidium bromide Fisher Scientific Cat. No. BP1302-10
Equipments
PCR machine  MJ Research Cat. No. PTG-200 
Centrifuge Eppendorf  Cat. No. 5415C
Water Bath Precision Scientific  Cat. No. 666A3 
Gel running instrument Fisher Scientific Cat. No. 09-528-165
Gel running power supply Fisher Scientific Cat. No. 45-000-465
Molecular Imager Gel Doc XR System Bio-Rad Cat. No. 1708195EDU
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific Cat. No. ND1000
C. elegans related1 1see reference19 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates2 2see reference19 for protocols.
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Yeast Extract BD Biosciences Cat. no. 212750
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
Ampicillin Sigma Cat. no. A0116
Tetracycline Fisher Scientific Cat. no. BP912
M9 Medium2 2see reference19 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
Na2HPO4 Sigma Cat. no. S7907
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
NGM plates 2 2see reference19 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Peptone  BD Biosciences Cat. no. 211677
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
CaCl2 Sigma Cat. no. C3881
Cholesterol  Sigma Cat. no. C8667
K2HPO4  Sigma Cat. no. P3786
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
RNAi plates3 3see reference21 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Peptone  BD Biosciences Cat. no. 211677
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
CaCl2 Sigma Cat. no. C3881
Cholesterol  Sigma Cat. no. C8667
K2HPO4  Sigma Cat. no. P3786
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
IPTG  US Biological Cat. no. I8500
Carbenicillin Fisher Scientific Cat. no. BP2648
NaOH Fisher Scientific Cat. no. SS266-1
Sodium hypochlorite Fisher Scientific Cat. no. 50371500
Bacteria
OP50 bacteria CGC
HT115 bacteria CGC
Genome-wide RNAi libraries
Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref21,58,59) Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref60) Source BioScience
Imaging related
Lidocaine MP Biomedicals,LLG Cat. no. 193917
Materials
Vacuum Grease Silicone Beckman Cat. no. 335148
Microscope slides  Fisher Scientific Cat. no. 4448
Tissue culture plate, 6 well  Corning Inc. Cat. no. 08-772-33
Equipment
SMZ-U dissecting microscope (Nikon)
SZX12 dissecting microscope (Olympus), equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions).
TCS SL Laser-scanning confocal microscope (Leica Microsystem)
C2 laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope (Nikon)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lubarsky, B., Krasnow, M. A. Tube morphogenesis: making and shaping biological tubes. Cell. 112 (1), (2003).
  2. Sundaram, M. V., Cohen, J. D. Time to make the doughnuts: Building and shaping seamless tubes. Semin. Cell Dev. Biol. S1084-9521, 30130-30136 (2016).
  3. Zhang, N. The C. elegans intestine as a model for intercellular lumen morphogenesis and in vivo polarized membrane biogenesis at the single-cell level. JoVE. , (2017).
  4. Andrew, D. J., Ewald, A. J. Morphogenesis of epithelial tubes: Insights into tube formation, elongation, and elongation. Dev. Biol. 341 (1), 34-55 (2010).
  5. Nelson, F. K., Albert, P. S., Riddle, D. L. Fine structure of the Caenorhabditis elegans secretory-excretory system. J. Ultrastruct. Res. 82 (2), 156-171 (1983).
  6. Sundaram, M. V., Buechner, M. The Caenorhabditis elegans Excretory System: A Model for Tubulogenesis, Cell Fate Specification, and Plasticity. Genetics. 203 (1), 35 (2016).
  7. Altun, Z. F., Hall, D. H. Excretory system. WormAtlas. , (2009).
  8. Buechner, M. Tubes and the single C. elegans excretory cell. Trends Cell Biol. 12 (10), 479-484 (2002).
  9. Khan, L. A. Intracellular lumen extension requires ERM-1-dependent apical membrane expansion and AQP-8-mediated flux. Nat. Cell Biol. 15 (2), 143-156 (2013).
  10. Kolotuev, I., Hyenne, V., Schwab, Y., Rodriguez, D., Labouesse, M. A pathway for unicellular tube extension depending on the lymphatic vessel determinant Prox1 and on osmoregulation. Nat. Cell Biol. 15 (2), 157-168 (2013).
  11. Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Dev. Biol. 214 (1), 227-241 (1999).
  12. Fehon, R. G., McClatchey, A. I., Bretscher, A. Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11 (4), 276-287 (2010).
  13. Gobel, V., Barrett, P. L., Hall, D. H., Fleming, J. T. Lumen morphogenesis in C. elegans requires the membrane-cytoskeleton linker erm-1. Dev. Cell. 6 (6), 865-873 (2004).
  14. Boulin, T., et al. Reporter gene fusions, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. , April 5, 2006 http://www. wormbook.org (2006).
  15. Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. Sambrook, J., DW, R. ussell , Cold Spring Harbor Laboratory Press . (2006).
  16. Fire, A., Harrison, S. W., Dixon, D. A modular set of lacZ fusion vectors for studying gene expression in Caenorhabditis elegans. Gene. 93 (2), 189-198 (1990).
  17. Ahringer, J. Reverse genetics, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. 6, April 6, 2006 http://www. wormbook.org (2006).
  18. Transformation and microinjection, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. Evans, T. C. , April 6, 2006 http://www.wormbook.org (2006).
  19. Maintenance of C. elegans, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. Stiernagle, T. , February 11, 2006 http://www.wormbook.org (2006).
  20. Genetic mapping and manipulation: Chapter 7-Making compound mutants, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. Fay, D. , February 17, 2006 http://www.wormbook.org (2006).
  21. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  22. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  23. Pawley, J. B. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , Springer. (2006).
  24. Hibbs, A. R. Confocal Microscopy for Biologists. , Springer. US. (2004).
  25. Bankhead, P. Analyzing fluorescence microscopy images with ImageJ. , (2014).
  26. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157 (3), 1217-1226 (2001).
  27. Frøkjaer-Jensen, C. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nat. Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).
  28. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).
  29. Barrangou, R. Cas9 Targeting and the CRISPR Revolution. Science. 344 (6185), 707-708 (2014).
  30. Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).
  31. Esposito, D., Garvey, L. A., Chakiath, C. S. Gateway cloning for protein expression. Methods Mol. Biol. 498, 31-54 (2009).
  32. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  33. Hobert, O. PCR fusion-based approach to create reporter gene constructs for expression analysis in transgenic C. elegans. Biotechniques. 32 (4), 728-730 (2002).
  34. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat. Rev. Genet. 3 (5), 356-369 (2002).
  35. Berry, K. L., Bulow, H. E., Hall, D. H., Hobert, O. A. C. elegans CLIC-like protein required for intracellular tube formation and maintenance. Science. 302 (5653), 2134-2137 (2003).
  36. Mattingly, B. C., Buechner, M. The FGD homologue EXC-5 regulates apical trafficking in C. elegans tubules. Dev. Biol. 359 (1), 59-72 (2011).
  37. Shaye, D. D., Greenwald, I. The disease-associated formin INF2/EXC-6 organizes lumen and cell outgrowth during tubulogenesis by regulating F-actin and microtubule cytoskeletons. Dev. Cell. 32 (6), 743-755 (2015).
  38. Lant, B. CCM-3/STRIPAK promotes seamless tube extension through endocytic recycling. Nat. Commun. 6 (6), 6449 (2015).
  39. Paupard, M. C., Miller, A., Grant, B., Hirsh, D., Hall, D. H. Immuno-EM localization of GFP-tagged yolk proteins in C. elegans using microwave fixation. J. Histochem. Cytochem. 49 (8), 949-956 (2001).
  40. Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Photoactivatable fluorescent proteins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 885-891 (2005).
  41. Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).
  42. Sherman, T. The abts and sulp families of anion transporters from Caenorhabditis elegans. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 289 (2), C341-C351 (2005).
  43. Caenorhabditis Genetics Center (CGC). , http://cbs.umn.edu/cgc/home (2017).
  44. Wormbase. , http://www.wormbase.org/ (2017).
  45. Transgeneome website. , https://transgeneome.mpi-cbg.de/transgeneomics/index.html (2017).
  46. C. elegans expression pattern. , http://gfpworm.org/ (2017).
  47. National BioResource Project (NBRP)::C. elegans. , https://shigen.nig.ac.jp/c.elegans/ (2017).
  48. Heppert, J. K. Comparative assessment of fluorescent proteins for in vivo imaging in an animal model system. Mol. Biol. Cell. 27 (22), 3385-3394 (2016).
  49. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  50. GeneMANIA. , http://genemania.org/ (2017).
  51. AceView. , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ieb/research/acembly/ (2017).
  52. iHOP. , http://www.ihop-net.org/UniPub/iHOP / (2017).
  53. Saccharomyces Genome Database. , http://www.yeastgenome.org (2017).
  54. Flybase. , http://www.flybase.org (2017).
  55. Mouse Genome Database. , http://www.informatics.jax.org (2017).
  56. Human Genome Database. , http://www.gdb.org (2017).
  57. BLAST. , https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (2017).
  58. Kamath, R. S., Martinezcampos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), RESEARCH0002 (2001).
  59. Kamath, R. S. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  60. Rual, J. F. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome research. 14 (10B), 2162-2168 (2004).

Tags

Udviklingsmæssige biologi spørgsmålet 128 encellede tubulogenesis intracellulære lumen morfogenese enkelt celle i vivo analyse udviklingsmæssige genetik dissekere Fluorescens mikroskopi konfokalmikroskopi
<em>C. elegans</em> Excretory kanalen som en Model for intracellulære Lumen morfogenese og <em>In Vivo</em> polariseret membran Biogenese i en enkelt celle: mærkning af normal god landbrugspraksis-fusioner, RNAi interaktion skærm og billedbehandling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, N., Membreno, E., Raj, S.,… More

Zhang, N., Membreno, E., Raj, S., Zhang, H., Khan, L. A., Gobel, V. The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging. J. Vis. Exp. (128), e56101, doi:10.3791/56101 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter