Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

C. elegans Excretory kanalen som en modell för intracellulära Lumen morfogenes och In Vivo polariserade membran biogenes i en enda Cell: märkning av GFP-fusions, RNAi interaktion skärm och Imaging

Published: October 3, 2017 doi: 10.3791/56101
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1,3, 1, 1
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Developmental Biology and Genetics Core, Massachusetts General Hospital for Children, Harvard Medical School, 2College of Life Sciences, Jilin University, 3Faculty of Health Sciences, University of Macau

Summary

C. elegans utsöndringsorganen kanalen är en unik single-cell modell för visuell i vivo analys av de novo polariserade membran biogenes. Det här protokollet beskriver en kombination av standard genetiska/RNAi och imaging metoder, anpassningsbar för identifiering och karakterisering av molekyler styra encelliga tubulogenesis och apikala membran och lumen biogenes.

Abstract

De fyra C. elegans utsöndringsorganen kanalerna är smala rör utvidgas genom längden på djuret från en enda cell, med nästan lika långt utökade intracellulära endotubes att bygga upp och stabilisera lumen med membran och submembraneous cytoskelettet apikala karaktär. Utsöndringsorganen cellen expanderar sin längd cirka 2.000 gånger för att generera dessa kanaler, vilket gör denna modell unika för i vivo bedömning av de novo polariserade membran biogenes, intracellulära lumen morfogenes och encelliga tubulogenesis. Det protokoll som presenteras här visar hur man kombinerar standard märkning, vinst - och förlust-av-funktion genetiska eller RNA-interferens (RNAi)-, och mikroskopiska metoder att använda denna modell att visuellt dissekera och funktionellt analysera dessa processer på molekylär nivå. Protokollet beskrivs som ett exempel på en märkning strategi, genereringen av transgena djur med fluorescerande fusionsproteinerna för levande analys av tubulogenesis. Som ett exempel på en genetisk metod belyser det viktiga punkter i en visuell RNAi-baserad interaktion skärm för att ändra en gain-of-function cystisk kanalen fenotyp. De särskilda metoder som beskrivs är hur man: etikett och visualisera kanalerna genom att uttrycka fluorescerande proteiner; konstruera ett riktade RNAi-bibliotek och upp strategier RNAi screening för molekylär analys av kanalen morfogenes; visuellt bedöma ändringar av kanalen fenotyper; Poäng dem genom att dissekera fluorescensmikroskopi; karakterisera subcellulär canal komponenter med högre upplösning av konfokalmikroskopi; och kvantifiera visuella parametrar. Metoden är användbar för utredaren som är intresserade i att utnyttja C. elegans utsöndringsorganen kanalen för att identifiera och karaktärisera gener inblandade i fylogenetiskt konserverade processer av intracellulära lumen och encelliga Tube morfogenes.

Introduction

Alla inre organ består av rör, avgörande för deras många olika funktioner, såsom transport och utbyte av gaser, vätskor och näringsämnen samt utsöndring av metabola avfall. Deras polariserade karaktär, med distinkta apikala och lumenal membran, är anpassad till dessa specifika funktioner och brister i biogenes av deras endo- och plasmamembranet system är en vanlig orsak till mänskliga sjukdomar1,2. Majoriteten av rören i kärlsystemet och inre organ är flercelliga och bildar en lumen intercellularly; dock kan, encelliga rör, som bilda lumen intracellulärt, exempelvis representerar så mycket som 30 – 50% av mänskliga kapillära sängar2. De polariserade membran av multi - encelliga rör har liknande sammansättning, även om deras microdomains kan variera beroende på rörets specifik funktion (t.ex., det utsöndringsorganen canal canaliculi kontra intestinal Mikrovilli i Caenorhabditis elegans; Se medföljande papper på C. elegans intestinal tubulogenesis)3. Principerna om polariserade membran biogenes och tubulogenesis bevaras bland metazoans, och en liknande molekylära maskineri dirigerar dem1,2,4.

C. elegans utsöndringar systemet består av fem celler: utsöndringsorganen cellen (EG), kanal-cellen (DC), pore cell (PC) och två körtelceller. Ablation av EG, DC eller PC orsakar vätskeansamling i kroppen hålighet och djur dö på en tidig larvstadium5. Spännande, dessa tre encelliga rör skapa deras lumen på tre olika sätt: genom cell urholkningen (EG); cell omslag tillsammans med autocellular junction bildandet (PC); och av cell omslag tillsammans med autofusion (DC); olika mekanismer av lumen morfogenes som är alla fylogenetiskt konserverade6,7. EG, ligger på den vänstra laterala sidan av den bakre svalget glödlampan, skickar ut två laterala tillägg från som de fyra kanalerna filial ut för att utöka anteriorly och posteriort (på både höger och vänster sida) till spetsen av maskens nose och tail , respektive (figur 1)5,6,8. EG sträcker sig från cirka 1 µm 2 x 1000 µm, vilket gör den till den största cellen i djuret. På en subcellulär nivå är utsöndringar kanalen en enkel tub, genereras från en basal membran riktad mot pseudocoelom och tunnel av ett lumenal membran (endotube). Canal lumenal membranet ansluts till kanal lumenal membranet på dess endast intercellulära korsning; kanalerna är annars junctionless längs deras längder (figur 1). Utsöndringsorganen canal lumenal membranet och dess submembraneous cytoskelettet är apikala, definieras av sin molekylära sammansättning som liknar sammansättningen av det apikala membranet och submembraneous cytoskelettet av flercelliga rör, till exempel tarmen, och andra (t.ex., platt) epitel. Cytoplasmiska organeller, inklusive endosomal vesikulär och andra (t.ex., Golgi) endomembranes är fördelade längs kanalen. Dessutom är flera canaliculära blåsor - antingen ansluten till det lumenal membranet, och/eller sammankopplade eller isolerade - gängade genom kanalen cytoplasman7,8,9,10 . Denna dynamiska plasma-membran/canaliculära anslutning ytterligare utökar kanalens membran system och bidrar till både lumen morfogenes och osmoregulation10. Utsöndringsorganen kanalen består således nästan helt av endo- och plasma membran, som ger en utmärkt modell för analys av polariserade membran biogenes och regleringen av de endo-till plasmamembranet gränssnitt. Den dramatiska expansionen av det apikala membranet under kanalen morfogenes - i detta encelliga system sammanfaller med lumen förlängning – kan också analysera de arkitektoniska problem som uppstår av behovet av att stabilisera och centrera en intracellulär lumenal membran . Detta protokoll fokuserar på analys av kanalen röret och lumen's strukturella morfogenes och intracellulära membran dynamiken krävs för denna process snarare än på de signaler som direkt cell rörelser som genererar EG: s ställning i den utsöndringar systemet och konstruera dess intrikata anslutningar till andra cellulära element (ses i6).

En ytterligare fördel med C. elegans encelliga kanalsystemet för analys av polariserade membran och intracellulära lumen biogenes är dess förmåga att avskilja, genom utvecklande tiden, generering av olika komponenter av dess membran och korsningar. EG är född på ventrala stängning och kvittar ventro-sido i svalget under mitten av embryogenes5,6,8, under vilken gången laterala canal förlängning och förgrening uppstå. Detta följs av främre-bakre kanalen förlängning under sena embryogenes, en process som fortsätter in på L1-larvstadium (figur 1). I en nykläckt larv, bakre kanalen spetsen når cirka mitten av masken, fullt förlänga till svansen slutet av L1 scenen, varefter kanalen förlänger tillsammans med den mask8. Aktiva kanalen tillväxt med en hastighet som överstiger djurets tillväxt således slutar vid den första larvstadium, men ytterligare tillväxt sker parallellt med tillväxten av hela djuret under ytterligare larval arrangerar (L2 – 4). Denna inställning ger möjlighet att analysera olika steg i de novo polariserade membran biogenes oberoende av polariserade celldelning eller migration. Dessutom tillåter det avskiljandet av denna process från montering av vägkorsningar (som förekommer i embryot innan lumen). deras exakta krav i membran polarisering är fortfarande en öppen fråga i fältet polaritet. Slutligen, den separerar unikt apikala från basal membran expansion, den senare processen som föregick tidigare i utsöndringsorganen kanaler10. C. elegans utsöndringsorganen canal modellen är därför ett särskilt informativt komplement på intestinal modell som delar ett antal dessa fördelar för analys av polariserade membran biogenes men körs det i en multicellulär inställning (se det medföljande papperet på intestinal tubulogenesis3).

Även om vildtyps-kanalerna är ultratunna tubuli i denna lilla mask, kan deras lumen vara visualized direkt av Nomarski optik i denna genomskinliga djur. I själva verket kan mutant cystisk kanalen morfologier karakteriseras i omärkta djur med låg förstoring dissekera mikroskopi, som har använts med stor framgång i framåt genetiska skärmar för att identifiera gener som är involverade i tubulogenesis11. Förbättrad visualisering av morfologi av kanaler och åtskillnad av membranen polariserade, cytoskeletal komponenter, olika intracellulära organeller och andra subcellulära strukturer, dock kräver märkning och högre makt lysrör dissekera och confocal microscopy. Även om kanalerna finstruktur utgör ett antal svårigheter för märkning och mikroskopi, membran och subcellulära komponenter kan särskiljas via de specifika molekylerna som är unika för varje fack, och djur kan monteras säkert för mikroskopi om vissa försiktighetsåtgärder vidtas för att undvika att införa artefakter (se protokollet och diskussion). Märkning kan göras av immunhistokemi i fasta prover, eller genom att generera transgena maskar uttrycker fluorescerande fusionsproteinerna under sin egen kontroll eller utsöndringar canal-specifika initiativtagare för i vivo imaging. Det här protokollet beskriver den sistnämnda märkning tekniken (se det medföljande papperet på intestinal tubulogenesis för färgning3-antikropp).

Möjligheten att kombinera i vivo förlust - eller gain-of-function studier med i vivo imaging analys på den enda cellen nivå under hela utvecklingen gör kanalen C. elegans utsöndringsorganen en särskilt stark modell för molekylära och cellulära analys av encelliga tubulogenesis. Framåt eller bakåt genetiska skärmar kan utföras med en vildtyp eller märkt transgena djur att identifiera canal morfogenes fenotyper (exempelvis cystor) och deras underliggande gen brister. Alternativt kan sådana skärmar starta med en mutant fenotyp (t.ex., en cystisk kanal) och identifiera dämpning eller förstärkare av denna fenotyp för att identifiera gener som funktionellt samverkar med den gen som orsakar den mutanta fenotypen. Den genetiska defekten orsakar den mutanta fenotypen kan inducera en förlust (t.ex., via gen radering) eller en vinst (t.ex. via en aktiverande mutation eller via införandet av överskjutande gen kopior) av den undersökta funktionen. Vidarebefordra mutagenes eller systematisk RNAi skärmar är utan förutfattade meningar på geners funktion och en opartisk bedömning av genernas funktion av intresse. Med tanke på tillgången av genome-wide RNAi utfodring bibliotek, kan nästan varje gen enkelt rivas av RNAi i C. elegans, sådan att någon enda gen av intresse eller någon grupp av gener (t.ex., i riktade skärmar) kan också vara snabbt utforskad för sin effekt i en omvänd genetik strategi. För att visa en möjlig kombination av metoder, vi här beskriver en riktade RNAi interaktion skärm, börjar med en gain-of-function cystisk utsöndringsorganen canal mutant, märkt med cytoplasmiska canal grönt fluorescerande protein (GFP). Den mutanta fenotypen genererades av överuttryck av erm-1, en mycket C. elegans ortholog membran-aktin linker familjen Ezrin-Radixin-Moesin (ERM), som har varit inblandade i lumen morfogenes och membran organisation i många arter12. C. elegans ERM-1 lokaliserar till lumenal membran av inre organ, till exempel utsöndringar kanalen och tarmen, och krävs för lumen bildas i båda13. ERM-1 överuttryck rekryterar överskott aktin och blåsor till canal lumenal membranet, öka flux in i lumen och generera en kort cystisk kanal och en krusad lumenal membran med förtjockad aktin underull9. Protokollet beskrivs hur du skapar transgena stammar med utsöndringar-canal-uttryckta märkt fusion proteiner (eller andra proteiner); hur du utför riktade RNAi skärmar börjar med sådana stammar, att identifiera modifierare av en canal fenotyp; och hur man visuellt analysera resultaten av sådana skärmar genom att dissekera och confocal fluorescensmikroskopi, inklusive enkla sätt att kvantifiera informativ tubulogenesis fenotyper. Alternativ märkning tekniker och detaljer av RNAi, anpassas till de ofta dödliga tubulogenesis generna, kan hittas i det medföljande papperet på intestinal tubulogenesis3. Alla metoder kan användas i olika kombinationer för utredning av andra frågor på kanalen tubulogenesis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. märkning C. elegans Excretory kanalen av fluorescerande fusionsproteinerna 14

Obs: se det medföljande papperet på intestinal tubulogenesis 3 för märkning av i situ antikropp färgning förfaranden anpassas till kanalen utsöndringar. Se tabell 1 för exempel på molekyler som visat sig användbar för att visualisera C. elegans utsöndringsorganen canal endo- och plasma membran, tabell 2 exempel på initiativtagare körning uttrycket att kanalen utsöndringar, och Tabell 3 för resurser för mer omfattande samlingar av markörer och initiativtagare, inklusive referenser diskutera val av olika fluorophores.

  1. Konstruktion av vävnad specifik fluorescerande markör plasmider av restriktionsenzym baserat kloning 15
    Obs: se diskussion för alternativa tekniker för att bygga fluorescerande fusionsproteinerna.
    1. Identifiera sekvensen av arrangören (för transkriptionell fusioner) eller hela genen av intresse med dess tillskyndare (för translationell fusioner) i WormBase 44.
      Obs: för projektansökare, ca 1 – 3 kilobase (kb) är tillräcklig för de flesta C. elegans gener. Translationell fusionsproteinerna kan också konstrueras genom att placera en gen av intresse under en utsöndringsorganen canal specifika promotorn (se tabell 2).
    2. Design framåt och bakåt primers för förstärkning av arrangören (för transkriptionell fusioner) eller en full gen med arrangören (för translationell fusioner). Lägg till restriktionsenzym linkers på 5 ’ och 3 ’ ändarna av primers.
      Obs: Välj restriktionsenzym som finns i vektor plasmid (t.ex., pPD95.79) 16. För translationell fusioner, 3 ’ linker bör utformas så att efter restriktionsenzym matsmältningen och ligatur med vektorn, infoga kodon ramen är kontinuerlig med codons av fluorophore, t.ex., GFP. Man kan behöva lägga till 1 eller 2 fler baser till typiska restriktionsenzym linkers 14; Se till att inte skapa ett stop-kodon.
    3. Utför polymeras-kedjereaktion (PCR) för att förstärka den arrangören eller fullängds gen använder levande maskar eller vildtyp genomiskt DNA eller cDNA som mall 15.
      Obs: När du använder maskar som mall, först lysera maskar i Lys buffert (PCR buffer plus proteinas K) 17. Blandad Stadium maskar kan användas som mall. Utsvultna maskar kan användas för att undvika kontaminering med bakteriell DNA.
    4. Utför agaros (1%) gel elektrofores på PCR-produkter att identifiera rätt storlek av amplifierad produkt.
      Obs: Om bandstorlek är korrekt, fortsätter du med nästa steg. Om flera band genereras, förbättra förstärkning villkoren att producera enda band. Om detta inte fungerar, skär rätt bandet från gelen och rena DNA genom standardmetoder 15 och fortsätt sedan med nästa steg.
    5. Utför begränsning sammanfattad på PCR-produkten och vektor plasmiden som innehåller fluorophore (t.ex., pPD95.79) i separat rör med standardmetoder 15.
    6. Separat de smält DNAs med gelelektrofores och eluera PCR-produkten och vektor-DNA band i separat rör.
    7. Renar de utsedda nationella myndigheterna från gel skivor av standardmetoder 15. Mäta DNA-koncentration av spektrofotometer.
    8. Ligera PCR-produkten och vektor-DNA av standardmetoder och omvandla de rekombinanta DNAs till behöriga celler av standardmetoder 15.
    9. Sprida 10 μL, 50 μL och 100 μL av de transformerade cellerna på tre enskilda Luria buljong (LB) tallrikar kompletteras med 50 μg/mL ampicillin.
      Obs: Sprida olika mängder av celler på olika plattor för ett spektrum av omvandling effektivitetsvinster. Exempelvis plätering alltför tätt får inte tillåta isolering av kolonier om omvandling är effektiv.
    10. Inkubera plattorna vid 37 ° C över natten. Nästa morgon, ta ut plattorna från inkubatorn.
      Obs: Om kolonierna är mycket små, inkubera i flera timmar.
    11. Förbered plasmid DNAs från enstaka kolonier av standardmetoder 15. Blanda mall DNA och primrar och skicka ut för sekvensering (vanligen utförs i ett core servicecenter).
    12. Läsa sekvenserna och verifiera integriteten hos den fusion konstruktion.
      Obs: kritisk: bekräfta rätt kodon ramen mellan fluorescerande markör och infogade genen för översättning fusioner. Idealiskt, sekvens hela genen för att bekräfta att ingen mutation infördes under PCR och ligatur förfaranden.
    13. Generera mer plasmid-DNA (med steg 1.1.11) för injektion i steg 1.2.
  2. Generation av transgena djur av Mikroskop av DNA för könsceller omvandling 18
    Obs: se diskussionen för alternativa tekniker för att införa transgener. Förfaranden som beskrivs kan användas för att generera transgena djur som bär ett fluorescens fusionsprotein eller något annat protein av intresse. Exempelvis ett exogent protein kan vara nyinförda (t.ex., en heterologa ortholog) eller en endogen protein kan återinföras (t.ex. in i dess motsvarande könsceller mutant för räddning) eller för att generera en fenotyp (t.ex. injektion i ökad utsträckning erm - 1 används för att generera den överuttryck cystiska kanalen fenotyp som fungerar som mål för modifiering av skärmen RNAi interaktion beskrivs nedan).
    1. Mix konstruera DNA (1 – 50 ng/μl) med markör plasmid DNA (vanligtvis 100 ng/μl), till exempel den dominerande markör rol-6 (su1006) (se 1.2.3 för alternativ för brytpunkt).
      Obs: kritisk: koncentration av injicerade DNA måste bestämmas empiriskt att undvika införandet av tingsliga fenotyper (cystor, förlängning defekter, dödlighet) när uttrycker gener i utsöndringsorganen kanaler som är särskilt känsliga för transgener uttryck. Man kan exempelvis göra flera blandningar av plasmider i koncentrationer på 1 ng/μl, 10 ng/μl, 50 ng/μl och 100 ng/μl med 100 ng/μl rol-6(su1006) att testa en serie koncentrationer för generering av en livskraftig stam med den önskat uttryck eller fenotyp (höga koncentrationer kan vara icke-specifikt toxiskt för kanalen morfogenes och kan vara dödlig).
    2. Filtrera DNA blandningen genom ett 0,22-μm (mikrometer) pore storlek spin-x Centrifugera röret filter.
      Obs: Lämna inte locket på röret öppet att undvika damm som kan blockera Mikroskop nålar.
    3. Microinject rekombinant plasmider in gonad av vildtyp eller muterade maskar av standardmetoder för könsceller omvandling (se referens 18 för förfarandet Detaljer).
      Obs: Standard markör plasmider är, till exempel: rol-6(su1006), dpy-20, unc-119, pha-1. Dominerande transgener som rol-6(su1006) införs i vildtyp maskar, medan räddande transgener införs i deras respektive mutanter. Markör plasmider är samtidig injicerade för enkelt underhåll av de transgena linjerna eftersom extrachromosomal transgener förloras slumpmässigt under celldelningen (se 1.2.8). När du injicerar gener som kodar för fluorophore fusioner, kan man också använda fluorophore, GFP, sig själv som markör. ROL-6 inducerar maskar att rulla runt själva som ofta är fördelaktigt för utvärdering av morfogenes fenotyper.
    4. Överföring injicerade maskar på Escherichia coli seedade Nematoden tillväxt Medium (NGM) plattor (t.ex., 5 maskar/platta) (se referens 19 för standard C. elegans kultur och underhåll förfaranden och Tabell över material).
    5. Inkubera plattorna och låta avkomma utveckla vid 20 ° C i ca 3 d.
    6. Undersöka på F1-avkomman under mikroskopet dissekera för Rol (rullande) maskar (eller någon annan specifik injektion markör, t.ex., GFP) och plocka valsar to enskilda plattor.
    7. Välj tallrikar med rullande F2 djur och bekräfta förekomsten av fluorescens i dissekera fluorescens Mikroskop (vanligtvis alla roller djur är GFP positiva).
      Obs: F2 rullarna ange framgångsrik generering av en transgen linje. Enskilda rader kan vara olika, t.ex., när det gäller transgenens överföringshastighet. Det är därför nyttigt att bevara och lagra flera rader.
    8. Upprätthålla de transgena linjerna genom att berika nya plåtar för markör-positiva djur.
      Obs: Är de injicerade DNA införlivas könsceller som en extrachromosomal matris. Överföringshastigheter för extrachromosomal arrayer är variabel men generellt runt ~ 50%. För att inte förlora stammen, är det därför viktigt att manuellt berika linjer med dominerande markörer (t.ex., linjerna inte säkras genom negativa urval).
    9. Frysa transgena linjerna av standard frysning tekniker för långtidsförvaring vid-80 ° C 19.
      Obs: Transgener på extrachromosomal matriser kan också integreras i könsceller genom UV-bestrålning i ett ytterligare steg att ge homogen linjer 18. Till exempel erm-1 integrerades könsceller av UV-bestrålning att erhålla ERM-1 [++] stammen fgIs2[erm-1p::erm-1;rol-6p::rol-6(su1006)] där varje djur bär på transgenens, ett krav för dess användning i den RNAi-baserade interaktion skärmen beskrivs nedan. Denna stam var dessutom märkt av cytoplasmisk utsöndringsorganen canal GFP via passage i en stam som innehåller en vha-1 p:: GFP transgenens (genereras av samma förfaranden som beskrivs ovan, se referens 20 för grundläggande genetiska förfaranden som korsar) och benämns som ERM-1 [++]; VHA-1 p:: GFP stam nedan.

2. Byggandet av riktade RNAi bibliotek och utformningen av en RNAi interaktion skärm för att ändra en Canal fenotyp

Obs: en riktad RNAi-baserad genetisk interaktion skärm beskrivs som använder en överuttryck cystisk kanalen fenotyp till Sök efter samverkande utsöndringsorganen canal morfogenes gener. ERM-1 [++] stammen fungerar (se steg 1.2.9) som exempel 9. Detta synsätt utgör bara en av många möjliga metoder för genetisk analys av utsöndringar canal lumen morfogenes (se Introduktion och diskussion för andra genetiska metoder). Se det medföljande papperet på intestinal tubulogenesis 3 och referenser 17 , 21 , 22 för bakgrunden på RNAi, detaljer av RNAi förfaranden, modulering av RNAi styrka (justerat till de ofta dödliga tubulogenesis generna) och diskussion av tekniska problem kopplad till RNAi. Se referens 19 för standard mask kultur och underhåll och tabell material.

  1. Sök för ERM-1 (eller andra gen av intresse) samverkande molekyler i databaser och publicerade artiklar.
    Obs: Potentiella ERM-1 interactmedlemmar skulle omfatta alla molekyler som experimentellt visade sig funktionellt, genetiskt eller fysiskt interagerar med ERM proteiner i alla arter eller förutspådde för att göra det av någon i silico, hög genomströmning eller systembiologi närma (se tabell 3 för exempel på databaser och resurser).
  2. Generera en lista över alla gener och hitta C. elegans homologs där så krävs.
    Obs: Överväga att utöka listan över identifierade gener till gen-klasser, som tar hänsyn till funktionen av genen av intresse och vidgar på nätet för att identifiera interactmedlemmar (t.ex., Välj alla actins för membran-aktin länkaren ERM-1, och aktin-relaterade molekyler).
  3. Identifiera den motsvarande RNAi bakteriell utfodring kloner i kommersiellt tillgängliga genome-wide bakteriell RNAi bibliotek för alla gener (t.ex., Ahringer genomisk C. elegans RNAi utfodring bibliotek 21; En tabell av)
  4. Generera ett kalkylblad för alla gener och deras motsvarande RNAi plattan och väl nummer.
  5. Plocka och streak ~ 50 RNAi kloner på LB/ampicillin/tetracyklin tallrikar (val av antibiotikum bestäms av bibliotek konstruktion) per dag och Fortsätt tills riktade RNAi bibliotek genereras.
    Obs: Beroende på bibliotek storlek och projicerade arbetsflöde, utelämna genererar en fullt bibliotek och fortsätta direkt med batch analys. Plattorna kan lagras vid 4 ° C, längre än ca 2 veckor (om det behövs, åter strimma på nya plattor efter det). Omvänt, en kan generera större frysta bibliotek i replikera 96 brunnar eller 384-väl format för långtidslagring vid -80 ° C.
  6. Inkubera plattorna vid 37 ° C över natten. Nästa morgon, ta bort plattor från inkubator och store vid 4 ° C.
  7. Plocka RNAi bakterier från en tallrik av en steril tandpetare, blanda bakterier med 600 μL LB/ampicillin (50 ng/μl) buljong i 1,5 mL mikrorör, inkubera rören vid 37 ° C, skaka för 6 h.
    Obs: Inokulera RNAi bakterier i buljongen genom att gnida plocka (tandpetare eller mikropipett spets) längs mikroröret.
  8. Utsäde 70 μL odlade bakterier till varje brunn av 6-väl RNAi plattor i dubbletter eller tre exemplar uppsättningar. Inkubera plattorna RNAi vid 22 ° C över natten.
    Obs: RNAi plattor är genereras av standardprocedurer (Tabell för material- och referenser 3 , 17 , 21) och här används i en 6-väl vävnad kultur plattan format för en högre genomströmning strategi som fortfarande tillåter för mikroskopiska utvärdering av kanalen morfogenes levande djur på plattorna.
  9. Nästa morgon, plocka 3 L4 scenen ERM-1 [++]; VHA-1 p:: GFP maskar på varje brunn av RNAi pläterar.
    1. Att undvika kontaminering med OP50 bakterier (se referens 19) som stör RNAi första frö maskar på NGM plåt utan bakterier och låt djuren krypa i ca 10 min. Använd endast icke-svalt friska djur.
  10. Inkubera plattorna vid 22 ° C i 3 d för att tillåta att djur att producera avkomma.
  11. Undersöka canal fenotyper i F1 avkommor under dissekera fluorescens Mikroskop.

3. In Vivo Avbildning av C. elegans Excretory kanalen genom att dissekera fluorescensmikroskopi och räknandet av Tubulogenesis fenotyper

  1. Förbered en fenotyp scoring ark (exempel visas i tabell 4 och figur 5 ).
  2. Placera agarplattan med maskar direkt under den fluorescens dissecting-Mikroskop, öppna locket på plattan för utvärdering, använda lägre förstoring till fokus.
    Obs: Det här protokollet beskriver användningen av ett scope med 1,5 X och 10 X mål och ett zoomomfång från 3,5 till 45 (Tabell för material).
  3. Utvärdera djur genom fokusering på varje väl separat, börjar med väl 1 och arbeta ner plattan.
    Obs: Börja alltid med utvärdering av kontroller. Exempelvis en mock (tom vektor) negativ kontroll (HT115 RNAi bakterier (se referenser 17 , 21) utan eller med en icke-närstående gen infoga) och lämpliga positiva kontroller, t.ex., i Denna interaktion skärm, erm-1 RNAi (undertrycker den ERM-1 [++] fenotypen) och sma-1 / spectrin RNAi (förbättrar ERM-1 [++] kanalen fenotypen).
  4. Först undersöka allmänna fenotyper synlig under starkt ljus (till exempel: låt/dödliga, Clr/klara, Emb/embryonala dödliga, Ste/sterila, Unc/okoordinerade, Dpy/dumpy, etc.), kvantifiera fenotypen genom att räkna antalet djur och antalet av djur med fenotypen, rekordet siffrorna (se tabell 4).
    Obs: För knockdowns av gener som orsakar defekter som kan påverka utvärderingen av kanalen fenotyper (t.ex., Emb, Ste), överväga upprepa experimentet med villkorad, bokför embryonala RNAi (Se medföljande papper för förfaranden 3 ).
  5. Andra undersöka utsöndringsorganen canal fenotyper under fluorescerande ljus, Poäng kvantifierbara fenotyper (t.ex., längden på kanalen, bredd av lumen, cystor), spela in siffrorna och beskriva fenotyper på en scoring blad (se tabell 4, < stark klass = ”xfig” > figur 5).
    Obs: Högre förstoring med zoomomfånget är nödvändigt att utvärdera mer subtila canal fenotyper. Flytta fram och tillbaka mellan låg och hög förstoring att noggrant utvärdera kanalen ’ s längd och bredd och alla andra canal morfogenes fenotyp. För kvantifiering eller semi kvantifiering av enkla fenotyper, räkna 100 djur (t.ex., L4s i denna riktade RNAi skärm; fenotyper: canal längden av 1/4, 1/2, 3/4 och full förlängning av bakre kanalerna och lumen diameter bakre kanalerna, liten cystor (< 1/3 av animaliskt bredd), stora cystor (> 1/3 av animaliskt bredd); Se tabell 4).
  6. Skaffa bilder av de dominerande fenotyperna från minst 3 olika djur genom ett Mikroskop monterad digital kostnad – tillsammans enhet (CCD) kamera och motsvarande bildprogram (se Tabell för material)
    1. att förvärva bilder, först slå på kameran, slå på anslutna datorn, dubbelklicka på ikonen image capture software, fokusera en området av worm plattan manuellt i låg förstoring och öppna kameran slutaren.
    2. Klicka på den “ direktförhandsvisning ” ikonen för bild ta till fånga mjukvaran på datorskärmen för att visualisera maskar på datorskärmen, justera fokus manuellt för att tydligt visualisera maskar på skärmen, klicka på den “ snap ” ikonen, sedan Klicka på den “ Spara ” ikon.
      Obs: Djur kommer att gå snabbare under fluorescerande ljus, därför hålla en hand på datormusen redo medan du flyttar plåten in i området av intresse med den andra handen. Klicka snabbt på “ snap ” ikonen att förvärva bilden. Det är oftast möjligt att förvärva en bra bild med flera försök.
    3. Spara de förvärvade bilderna med en ordentlig filnamn (inkludera stam namn, RNAi klon namn och datum).
      Obs: Snabbare rörelse vildtyp maskar med tunna och långa kanaler är svårare att bild än mutanter. Mutanter med cystisk kanaler och/eller andra fenotyper är benägna att flytta långsamt, vilket underlättar imaging. Markör plasmider såsom Rol kan vara användbar för avbildning genom att hålla djur “ på plats ” stället för att flytta framåt, och kan även ge en förbättrad syn på fenotypen djuret rullande runt sig.

4. Avbildning av C. elegans Excretory kanalen med hög upplösning av Laser Scanning konfokalmikroskopi

  1. montering levande djur
    1. Placera en liten mängd fett eller vaselin på spetsen på en bomullstuss eller på spetsen av den pekfingret, och sprids fettet för att generera en ultrathin cirkel med en diameter på ~ 6 – 8 mm mitt i en ren glasskiva.
    2. Plats 6 μL 5% lidokain lösning (bedövningsmedel) in i cirkla av en mikropipett.
      Obs: Lidokain stamlösning kan göras av upplösning lidokain pulvret i vatten. Späd till 5% med M9 buffert 19 (Tabell för material). Det är viktigt för analysen av utsöndringar kanalen för att undvika de vanliga immobilisering lösningar (t.ex. Natriumazid) som orsakar cystor att brista och som inducerar canal fenotyper.
    3. Plocka flera djur från en RNAi-plattan, och placera dem i lidokain lösningen av immerging mask plocka 19 i lösningen.
      Obs: Plocka helst skede-specifika djur som kommer att underlätta även montering av enhetlig tjocklek. Djur kan vara förvald på mikroskopet dissekera fluorescens.
    4. Placera ett 22 x 22 mm täckglas på en glasskiva, låt det försiktigt lösa till fett cirkeln.
      Obs: Gäller inte någon fysisk press på den täckglas som kan skada kanalen morfologi, speciellt i mutanter eller RNAi behandlas maskar med canal och eventuellt andra fenotyper. Det är därför viktigt att undvika en tjock fett cirkel; idealiskt djur försiktigt inklämt mellan objektglas och täckglas.
    5. Skriva namnet på provet på frostat sida av glasskiva. Omedelbart ta bilden till mikroskopet confocal för analys av kanalen fenotyp och att förvärva bilder.
      Obs: Förseningar kan resultera i skador på kanalen cystor eller ändra i kanalen lumen morfologi.
  2. Att förvärva confocal bilder
    1. placerar bilden på prov scenen av mikroskopet confocal, fokusera maskar i låg förstoring (10 X).
    2. Visa och välj djur under 60 X och/eller 100 X mål, undersöka utsöndringsorganen kanalen ’ s cellulär och subcellulär fenotyper, t.ex., lumen form och diameter, storlek och form av cystor, eller subcellulära komponenter märkta för analys, e.g., basal membran, endosomal kontra canaliculära blåsor, cytoplasman, apikala/lumenal membran, andra organeller (se diskussion, figur 2 och figur 4).
    3. Skaffa bilder av specifika fenotypen av intresse.
      Obs: Det här protokollet beskriver användningen av en laser skanning confocal Mikroskop (Tabell för material). Lös subcellulära komponenter i den tunna C. elegans krävs utsöndringsorganen kanaler, högre förstoringsgrad (60 X 100 X). Spinning-disk confocal Mikroskop kan användas för att förvärva tid bilder men ger mindre confocality (se diskussion).
      1. För att förvärva confocal bilder, slå på datorn, dubbelklickar du på confocal Mikroskop mjukvaran och välja lasern genom att klicka på en ikon för specifika laser.
      2. Klicka på den “ scan ” ikonen för att visualisera masken fokuserad på datorskärmen, justera laser intensitet genom den programvara och klicka igen på “ Skanna ” ikonen för att stoppa skanning, klicka på “ fånga ” ikonen för att ta en bild, klicka på “ Spara ” ikon.
      3. Spara bilder med rätt filnamn och inkludera RNAi klon namn, stam namn och datum.
        Obs: Bilder kan fås som enkel- och flera avsnitt (t.ex., 10 – 15 sektioner längs z-axeln). Snittning kan 3D-visualisering. Förvärva projektion bilder och spara separat om det behövs (beroende på Mikroskop). För optimal upplösning använder laser inställningar med låg vinst, inte öppna hål för mycket, och lägga flera snitt per bild (se referenser 23 , 24 för allmän diskussion confocal Imaging). Var noga med för att hämta bilder med en ljusstyrka på nedan mättnadsnivån till medger ändring genom bildprogram om det behövs (helst använda omodifierade bilder).
      4. Förvärvar bilder av dubbel - eller multiplicera märkt kanaler (t.ex. grön, röd och blå) på samma sätt, genom att klicka på flera laser ikoner, men Använd sekventiell skanning för att undvika genomlysningseffekten mellan kanaler (kritisk för samtidig lokaliseringsutredningar).
        Obs: Man kan behöva beakta den tid som krävs för sekventiell skanning (vilket också resulterar i en motsvarande ökning av foto blekning) och ändra skannerinställningar. Genomsök inte djur från en bild i mer än 30 min maximala att undvika ospecifika effekter på kanalen morfologi. Montera ny bild om längre skanning krävs.
      5. Förvärva motsvarande differentiell störningar optik (DIC) / Nomarski bilder, särskilt om kvantifiera kanalen längd och lumen diameter i förhållande till masken ’ s kroppslängd och diameter. Overlay fluorescens och Nomarski bilder genom att klicka på “ överlägg ” ikonen för att visa sevärdheter ( figur 1 d och figur 4A – D).
    4. För kvantifiering, Mät fluorescensintensiteten hos en märkt komponent av intresse av ImageJ programvara 25 ( figur 5 c).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det här protokollet beskriver hur du använder C. elegans utsöndringsorganen kanaler att visuellt och molekylärt analysera encelliga tubulogenesis och intracellulära lumen morfogenes i en enda cell. Under deras utvidgning från och med mitten av embryogenes till vuxen ålder fortsätter fyra utsöndringsorganen kanaler att expandera sin basolateral och apikala/lumenal membran tillsammans med deras canaliculära och endosomal endomembrane-system, vilket ger en unik modell för i vivo analys av de novo polariserade membran biogenes (figur 1). Subcellulära komponenter såsom apikala membran, cytoplasman och endosomal kontra canaliculära blåsor kan visualiseras genom att uttrycka särskilda fluorescerande fusionsproteiner (beskrivs i protokollet avsnitt 1), och de kan skiljas från varandra genom dubbla eller tredubbla märkning i ett enda transgena djur (figur 2). En unik utsöndringsorganen kanal fenotyp (figur 3A– B) genereras av överuttryck av en apikala membran associerade molekyl (ERM-1), används för att demonstrera hur du utför en riktade RNAi-skärm för att identifiera gener som fungerar i apikala membran och lumen biogenes; Detta tjänar som ett exempel på en molekylär och visuell analys av polariserade membran biogenes i denna modell (beskrivs i protokollet avsnitt 2). Detta ERM-1 [++] kanalen fenotyp används för att demonstrera hur man visuellt utvärderar och Poäng suppression (figur 3 c– D) och förstärkning (figur 3E– F) genom att dissekera fluorescensmikroskopi (beskrivs i protokollet avsnitt 3) . Canal fenotyper induceras av modulering av ERM-1 nivåer tjänar till att visa hur att lösa defekter på subcellulär nivå genom konfokalmikroskopi (figur 4) (beskrivs i protokollet avsnitt 4), och hur att kvantifiera enkla kanalen fenotyper (canal längd och cysta storlek) och apikala membran biogenes defekter (figur 5).

Figure 1
Figur 1 : Morfogenes av C. elegans Excretory Canal och subcellulär Canal strukturer
(A) Schematisk bild av utsöndringar canal förlängning (blå linjer) under utvecklingen av embryot och larv. Utsöndringsorganen cellen når sitt slutliga läge ventro-sido till vänster av bakre svalget glödlampan skede kommatecken embryot (visas inte). Som embryot förlänger, det första sträcker sig två armar sidled mot vänster och höger sida; sedan bifurcates varje arm i en främre och bakre gren. Dessa främre och bakre grenar förlänga ytterligare hela töjning av djuret under fyra larval arrangerar, först ikapp med djurets tillväxt i L2 skede, då medföljer dess vidare tillväxt, förrän i vuxen ålder. De novo polariserade membran biogenes stöder denna förlängning upp till vuxen ålder. (B) i det vuxna djuret, främre kanalen grenarna når näsan spetsen och den bakre grenar, svansen (blå linjer). Utsöndringsorganen cellkroppen visas nära bakre svalget lampan (blå). Polariserade membran domäner bibehålls under vuxenlivet. (C) förstorad utsikt över en kanal arm avsnitt. Vänster: 3D-vy av kanalen visar: basal membran (svart), cytoplasman (blå), lumenal membran (grön) och lumen (vit). Höger: inuti kanalen och dess membran: basal membran (svart), cytoplasman (blå), endosomes (gula ovaler), canaliculära blåsor (vit sfärer, anslutna till varje andra anslutna till lumen eller isolerade enstaka blåsor), apikala membran (grön) och lumen (vit). (D) Confocal/DIC overlay micrographs utsöndringar cellen i ett embryo och utsöndringsorganen kanaler i en larv, märkt av lumenal kontra cytoplasmiska GFP, respektive. Vänstra bilden: utsöndringsorganen cell (grön pil) i ett 1,5 embryo, med kanalen lumen visualiseras genom att uttrycka apikala ERM-1::GFP under erm-1 arrangören. Högra bilden: fyra utsöndringsorganen canal grenar (grön pil) i L3 larver, visualiseras av cytoplasmisk vha-1 p:: GFP. Skala barer = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Visualisera subcellulära komponenter i Wild-type utsöndringsorganen Canal armar genom dubbel märkning med fluorescerande fusionsproteinerna
(A) skilja cytoplasman från det apikala membranet. Uttryck för god Jordbrukarsed under sulp-5 arrangören visualiserar canal cytoplasman (grön, överst); uttryck för ERM-1::mCherry under dess egna tillskyndare visualiserar det apikala membranet (röd, mellersta); slå samman dessa bilder (nederst) skiljer mellan cytoplasman och den apikala membran som annars skulle vara omöjlig att skilja av enskild märkning även vid hög förstoring. Skalstapeln = 5μm. (B) fastställande av rumsliga förhållandet av endosomal blåsor till lumen. Visualisering av lumen av en apikala membran-associerade GFP fusionsprotein (pseudo färgade till röd, top); visualisering av endosomal blåsor genom att uttrycka mCherry::RAB-7 (pseudo färgade till blå, mellersta); slå samman dessa bilder (nederst) visar den relativa rumsliga placeringen av endosomal blåsor till lumen. Skalstapeln = 5μm. (C och D) Att lösa canal tube former kontra subcellulär canal komponenter vid olika förstoringar. Cytoplasman i L1 larver är märkt av uttrycker GFP under sulp-5 promotorn och cytoplasmiska canaliculära blåsor genom att uttrycka vattenledningen AQP-8::mCherry under promotorn aqp-8 . (C) bilder som förvärvats vid lägre förstoring lösa ett ”pärlor-på-en-string” mönster motsvarar Stadium-specifika varicosities (varicosities är reservoarer rikligt i canaliculära blåsor och andra komponenter som krävs för kanalen tillväxt), men gör inte lösa cytoplasmiska AQP-8 puncta. (D) bilder som förvärvats vid högre förstoring lösa AQP-8 puncta i kanalen cytoplasman, motsvarar canaliculära blåsor. Skala barer: 20 μm i C och 5 μm i D. Alla paneler visar confocal projektioner av 10 – 15 sektioner varje. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Scoring smakförstärkare och Suppressors av en cystisk kanalen fenotyp (ERM-1[++]) av dissekera mikroskopi
(A) ERM-1 [++]; ROL-6(su1006) utsöndringsorganen kanaler visualiseras av uttrycker GFP under en vha-1 arrangören. Bakre kanalerna sträcka sig upp till vulva eller mitten av kroppen av djuret (pilarna; betraktas som 1/2 förlängning) vid lägre förstoring (1,5 X mål och låg zoom). (B) vid högre förstoring, signatur ERM-1 [++] små-cystisk krusad kanalen kan lösas, med spetsen på de bakre kanalerna (en arm små riktningspilen) förlängning upp till vulva eller något bortom (vulva riktningspilen stora; canal lumen i panelen D kan betraktas som vildtyp för jämförelse). (C) dämpning, låg förstoring: långsträckt och tunna kanaler i RNAi behandlade ERM-1 [++] djur. (D) vid högre förstoring, bakre kanalerna kan ses nästan helt utvidga till svansen (små pilar, jämför med föräldragenerationen, visas i panelen B); stora pilen anger position i vulva. (E) förbättring: ytterligare förkortat kanaler med större cystor i RNAi behandlade ERM-1 [++] djur; låg förstoring, ingen zoom. (F) vid högre förstoring, bakre kanalen förlängning kan fastställas som mindre än 1/2 (lilla pilen) eller inte förlängas till vulva (indikeras av stora pilen) och cysta storlek som överstiger 1/3 av djurets bredd (bredare än den föräldradjur som visas i B). Skala barer = 400 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Visuell analys av utsöndringar Canal morfologi och subcellulär Canal komponenter i Mutant/RNAi djur av konfokalmikroskopi
(A – D) Skilja en vakuolär från en cystisk kanalen fenotyp (confocal/DIC overlay micrographs visas). (A) cytoplasman i en vildtyp kanal visualiseras av uttrycker GFP under sulp-5 arrangören (pseudo färgade till blå till skillnad från apikala membran märkning, visas i grönt i panelen B). (B) det apikala membranet en vildtyp kanal visualiseras genom att uttrycka ERM-1::GFP; Observera att lumen syns inte på denna förstoring och den enda märkning kan inte skilja cytoplasmiska från membran märkning. (C) utsöndringsorganen canal fenotyp induceras av RNAi: cytoplasmiska märkning kan inte skilja på cytoplasmiska vakuoler intralumenal cystor. (D) utsöndringsorganen canal fenotyp induceras av RNAi: apikala ERM-1::GFP märkning upptäcker vätskeansamling inuti lumen, identifiera (lumenal) cystor i stället för (Cytoplasmatisk) vakuoler (jämför figur 4I för cytoplasmiska vakuoler). Skalstapeln = 40 μm för A – D, visas i A. (E-J) analysera förlust - och gain-of-function effekter på subcellulär canal komponenter (confocal bilder enda kanal vapen visas). (E-G) Effekten av erm-1 RNAi på subcellulär lokalisering av canaliculi. (E) vildtyp canal cytoplasman; Observera GFP utslagning indikerande lumen. (F) vildtyp cytoplasmiska AQP-8::GFP puncta, motsvarar canaliculära blåsor. (G) Cytoplasmic och basala förskjutning av AQP-8::GFP puncta i erm-1(RNAi) djur. (H) diskontinuerlig lumen och detalj av lumen tip patologi (curling och förlust av lumen centrering) i erm-1(mildRNAi) djur se (3 för modulerande RNAi styrka); Observera att kanalen cytoplasman sträcker sig utanför spetsen av lumen, här anges med små cystor. (I) cytoplasmiska vakuoler i utsöndringsorganen canal kropp utan någon kanal förlängning i starkt påverkas erm-1(RNAi) djur3; Observera att ACT-5::GFP inte rekryteras till lumen (utom flera små fläckar runt vissa vakuoler). (J) rekrytering av överskjutande ACT-5::GFP och AQP-8::mCherry till lumen i trippel transgena djur överuttryck ERM-1 (Obs tjock bälte av ACT-5::GFP och överlappande AQP-8::mCherry klumpar runt cystisk lumen). Skalstapeln = 5 μm för E-J, visas i E. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Exempel på kvantifiering av Canal defekter av marknadshändelser och Confocal Microscopy
(A) Schematisk framställning av vildtyp (övre panelen) och mutant cystisk (lägre paneler) utsöndringsorganen kanaler för kvantifiering av kanalen längd och cysta storlek. Bakre kanalen längd kvantifieras som 0, 1/4, 1/2, 3/4 och 1. Canal längd '0' anger ingen förlängning och '1' anger fullängds filändelsen. Cysta storlek kvantifieras som < 1/3 (liten) och > 1/3 (stor) av kroppen diameter. (B) kvantifiering av brutto canal morfologi i kontroll och ERM-1 [++](RNAi) djur av fluorescerande dissekera mikroskopi. Mock(RNAi) ERM-1 [++] djur är bakre kanalen längd ca 1/2 extended i 95% djur (referens bild, figur 3A-B). Suppressor ERM-1 [++](RNAi) djur, är bakre kanalens längd nästan fullt utsträckt i 80 – 90% djur (referensbild, figur 3 c– D). Enhancer ERM-1 [++](RNAi) djur, cirka 60-70% kanalerna har stora cystor och kortare längd (< 1/2) (referensbild, figur 3E– F). Data presenteras som genomsnitt ± SD (n > 3). (C) kvantifiering av fluorescensintensiteten hos apikala/lumenal canal cytoskelettet av ImageJ från confocal bilder. Kanalens apikala membran är märkt av ACT-5::GFP, vildtyp canal arm visas till vänster, ERM-1 [++] kanalen arm, till höger. Lämnade paneler: intensiteten av ACT-5::GFP i vildtyp membran ärm är ca 50 (grå värde/membran, svarta och röda riktningspilen), tomt visas under bilden. Rätt paneler: intensiteten av ACT-5::GFP i ERM-1 [++] är över 100 (grå värdet av dorsala membran är omkring 110 (svart pil), och av ventrala membran är ca 140 (röd pil)), tomt visas under bilden. Skala barer = 5 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Tabell 1: exempel på markörer för den C. elegans Utsöndringsorganen kanalsystemet membran
Protein namn Sub
cellulär lokalisering Funktion Exempel på tillgängliga stammar Referenser ERM-1 apikala domän membran – cytoskelettet linker VJ402 (fgEx13 [erm-1p::erm-1::gfp, rol-6p::rol-6(su1006)]) Ref (13) ACT-5 apikala domän apikalt lokaliserade aktin VJ268 (fgEx12[(act-5p::act-5::gfp); unc-119 (+); unc-119 (ed3) III]) Ref (13) ABTS-2 Basolateral Anjon/bikarbonat transportör ABTS-2::GFP Ref (42) SULP-8 Basolateral Sulfatepermease SULP-8::GFP Ref (42) VHA-1 canaliculära blåsor V-ATPas VJ535 (fgEx35 (vha-1p::vha-1::gfp; rol - 6p:: rol-6(su1006))) Ref (9) VHA-5 canaliculära blåsor V-ATPas ML846 (vha-5(mc38) IV; mcEx337 [vha-5 (+):: GFP + rol-6(su1006)]) Ref (10) AQP-8 canaliculära blåsor akvaporin, vattenkanal VJ533 (fgEx33 (aqp-8p::aqp-8::gfp)) Ref (9) RAB-5 endosomal blåsor människohandel BK209 (qpIs99 (exc9p::mCherry::rab-5)) Ref (36) RAB-7 endosomal blåsor människohandel BK210 (qpIs100 [Pexc-9::mCherry::rab-7]) Ref (36) RAB-11 endosomal blåsor människohandel BK205 (qpIs97 (exc9p::mCherry::rab-11)) Ref (36) 1 Exempel är utvalda från resurser som anges i tabell 3.

Tabell 2: exempel på C. elegans Excretory Canal-specifika initiativtagare
initiativtagare Uttrycket scenen
ERM-1 kommatecken scenen embryo
sulp-5 3-faldig embryo
VHA-1 2-faldig embryo
VHA-5 2-faldig embryo
AQP-8 2-faldig embryo
GLT-3 sent embryo
1 Exempel är utvalda från resurser som anges i tabell 3.

Tabell 3: resurser
Resurser för att identifiera C. elegans utsöndringsorganen canal-specifika molekyler, märkning reagenser/stammar och antikroppar
1. Caenorhabditis genetik Center (CGC)43 för tillgängliga reagenser och stammar
2. Wormbase44 information om utsöndringar canal-specifika molekyler, stammar och antikroppar
3. information om utsöndringar canal-specifika molekyler: se referens6
4. Transgeneome hemsida45 för translationell GFP fusion konstruktioner
5. C.elegans uttryck mönster46 för transkriptionell GFP fusion konstruktioner
6. nationella BioResource Project (NBRP)::C.elegans47 för information på C. elegans mutanter och initiativtagare
7. Fluorophores: se referens48,49
Webbaserade resurser för montering av molekyler för en målinriktad RNAi-biblioteket
1. GeneMANIA50
2. AceView51
3. iHOP52
4. Wormbase44
5. saccharomyces genomet databas53
6. Flybase54
7. mus genomet databas55
8. mänskliga genomet databas56
9. BLAST57

Tabell 4: Exempel på enkla fenotyp Scoring ark
RNAi bibliotek Stam General fenotyp (% totalt) Canal fenotyp
Canal längd < 1/2 (% L4) Canal längd > 1/2 (% L4) Andra Canal fenotyp Totala antalet djur som räknas
Platta nr Väl nummer
-1 A1 ERM-1 [++]; VHA-1 p:: GFP CLR (30) 80 20 100
X-5 B12 samma ingen 30 70 100
III-10 C5 samma UNC (54) 70 30 stora cystor 100

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

C. elegans' genetisk mångsidighet, öppenhet, enkel kropp plan och invarianta cell härstamning alla gör det till en utmärkt modell för analys av morfogenes. Det här protokollet beskriver hur man kombinerar standard genetiska manipulationer och imaging studier för att dra nytta av de 2 micron tunn C. elegans utsöndringsorganen kanaler för att studera polariserade membran och intracellulära lumen biogenes i en enda cell tub.

Märkning
C. elegans utsöndringsorganen kanaler kan märkas av uttrycket av fluorescerande fusionsproteinerna, möjliggör levande analys (beskrivs här), eller antikropp eller kemisk färgning (Se medföljande papper på intestinal tubulogenesis för antikropp färgning 3). uttrycket av två eller flera olika fluorophores, eller en kombination av dessa olika märkning teknik, möjliggör en hög upplösning visuella dissektion av dessa tunna tubuli (figur 2). Fluorescerande fusionsproteinerna regi en canal specifika promotorn till kanalerna är det första valet för utsöndringsorganen canal märkning av flera skäl, bland dem: (1) låg uttrycksnivåerna för många canal proteiner och (2) kanalens finstruktur som är lätt överväldigad av färgning utanför kanalerna där proteinet av intresse kan också uttryckas. Å andra kanaler är känsliga för exogena proteiner och enkelt utveckla ospecifikt fenotyper (t.ex., förlängning defekter och cystor eller även dödlighet) när sådana proteiner uttrycks starkt. Detta bör väga in i beslutet när du väljer mellan olika sätt att generera transgena djur. I princip kan transgener införas som extrachromosomal matriser (t.ex., genom direkt injektion av Plasmiden DNA i gonad för könsceller omvandling, som beskrivs här), som vanligtvis genererar hög-kopia antal matriser (ofta med hög uttryck), eller integrerade i genomet, vanligtvis på låg eller enstaka exemplar nummer (t.ex., genom beskjutning26 eller via Mos1-medierad exemplar införande [MosSCI]27). Extrachromsomal matriser kan också integreras i genomet i ett andra steg (fortfarande, dock på en hög kopienummer)18. Däremot, när injiceras i könsceller vid låg koncentration (t.ex., 1 – 2 ng/µL DNA, kombinerat med en högre koncentration av markör DNA), kan låg (även enstaka) kopia nummer arrayer vara enkelt genererade28. Detta scenario har fördelen att DNA koncentrationer kan varieras, vilket kan bidra till att hitta den bästa uttryck nivån för kanalen märkning, varken för lågt eller för högt (giftigt). Relationen mellan injicerade DNA-koncentration och uttryck nivå är beroende av flera faktorer (t.ex., arrangören), och således måste bestämmas empiriskt. Alternativt kan gen av intresse vara direkt märkt med en fluorophore i könsceller av klustrade regelbundet varvas korta Palindromic upprepas (CRISPR) baserat märkning förfaranden29,30. Även om detta tillvägagångssätt förlägger fluorophore in i dess mest fysiologiska genomisk sammanhang, är detta inte alltid nödvändigt eller ens önskvärt (t.ex. när proteinet uttrycks på mycket låga nivåer). Det kan dock vara det bästa alternativet, till exempel om genen sevärdheter är mycket stor.

Canal visualisering kan åstadkommas genom att rikta transkriptionell konstruktioner in i kanalen som kommer att belysa canal cytoplasman av en fluorophore. Däremot kräver märkning subcellulär canal komponenter en translationell fusion där fullängds genen är ansluten i ram till fluorophore kodning genen. När du använder en kanal specifika promotorn för uttryck (i stället för genens egen arrangören), bör dess val baseras på arrangörens styrka och för utvecklingstoxicitet analysen, tiden av dess uttryck. Många utsöndringsorganen canal specifika gener uttrycker inte innan larvstadium när kanalens osmotisk funktion blir kritisk; för sent för analys av dess aktiva förlängningsfasen (erm-1 och proffsen-1 är tidig uttryckt gener)10,13. För markörer av utsöndringar canal endo- och plasma membran och canal specifika initiativtagare exemplen i tabellerna 1 och 2, respektive, och resurser för att hitta ytterligare canal-specifika molekyler i tabell 3. Dessa resurser kan också användas för att hitta en redan gjort lämpliga fluorescerande fusionsprotein, som kan finnas tillgänglig via Caenorhabditis genetik Center (CGC; Se även tabell 1). För att konstruera rekombinant plasmider för uttrycket av sådant protein fusioner, man kan använda olika kloning metoder, var och en med specifika fördelar och nackdelar (diskuteras någon annanstans14). Dessa inkluderar konventionella restriktionsenzym baserat kloning metoder, som beskrivs här, modulära kloning med multisite Gateway system31, Gibson församlingen32eller reporter gen konstruktion av metoden ”PCR sömmar”14 ,33. Dessa olika synsätt kan anpassas till vilken metod som valts för deras införande i könsceller eller andra specifika behov (till exempel den mångsidiga Gateway system underlättar omflyttning av projektansvariga och cDNAs för större skala märkning metoder) . Hand behöver vidtas att välja rätt insticksstället för fluorophore (länka den på N-kontra C-terminus av protein), med hänsyn till funktionen av proteinet av intresse.

Interferens med genfunktion
Som en av många möjliga sätt att störa geners funktion i C. elegans, beskriver det här protokollet en riktade RNAi interaktion skärm för att ändra en cystisk kanalen lumen fenotyp, inducerad av överuttryck beståndsdel lumenal membran. I detta specifika fall, överuttryck av en apikal/lumenal membran associerade markör som ERM-1 har fördelen att direkt styra utredningen till det önskade målet: analys av intracellulära apikala/lumenal membran biogenes. En gain-of-function fenotyp genereras av överuttryck ger också vissa fördelar i kombination med en förlust-av-funktion (RNAi) interaktion skärm som beskrivs här (se34 för diskussioner om förlust - och gain-of-function analyser och design av genetiska skärmar). ERM-1 själv är dessutom en väl undersökta ”lumen morfogenes” och apikala membran identitet molekyl12. I det här fallet därför en riktad (snarare än opartisk) skärm sannolikt att vara direkt informativ för lumen morfogenes medan samtidigt ytterligare kännetecknar ERM-1: s specifika funktion i denna process. Dock kunde en opartisk icke öronmärkt skärmen utföras på ett liknande sätt, börjar antingen med en vildtyp djur, en transgena djur med fluorescently märkt utsöndringsorganen kanaler, eller med någon canal mutant. Allmänna fördelar och nackdelar av RNAi (t.ex., kontra mutagenes) för generering av förlust-av-funktion fenotyper, och överledning och diskussion av olika typer av genetiska skärmar i C. elegans diskuteras på annat håll 34. RNAi producerar ett spektrum av fenotyper, inklusive mildare fenotyper, en särskild fördel för analys av de ofta dödliga tubulogenesis generna. Detta beskrivs och diskuteras i det medföljande papperet på intestinal tubulogenesis3. Olika metoder att generera vinst och förlust-av-funktion mutanter och klassiskt genetiska ingrepp såsom kors, är detaljerad och diskuterade i allmän genetik metoder litteraturen20.

Mikroskopi och utvärdering av tubulogenesis fenotyper
Visuellt utvärdera och scoring modifiering av en väldefinierad canal fenotyp under en fluorescerande dissekera Mikroskop med hjälp av enkla räknandet parametrar (såsom kanalen längd och lumen diameter), som beskrivs här, kan uppnås i en kort tidsperiod även när bearbetning större antal djur i en riktad eller systematisk genetiska eller RNAi skärm. Däremot en liknande skärm letar efter romanen canal morfogenes fenotyper i en stam som är vildtyp (utom dess canal-märkning transgenens), är mer tidskrävande, men kan i princip utföras på samma sätt (vi har genomfört sådana en skärmen på basis av genome-wide i flera månader). Sådana skärmar kommer att identifiera flera olika canal fenotyper (visas inte här) och därför måste utveckla motsvarande olika poängmönster parametrar, t.ex., en kvalitativ klassificering scheme (se 9,11, 35,36,37,38 för olika sätt Poäng canal fenotyper genom att dissekera mikroskopi). Vid tolkningen av alla canal fenotyp, är det viktigt att komma ihåg att cystbildning kan vara en ospecifik effekt av många olika förolämpningar mot denna tunna tubulär struktur, och det är ofta en mindre informativ terminal fenotyp. Cysta storlek och läge, däremot, kan vara informativ, t.ex., en cysta nära canal cellen (i början av kanalen förlängning), cystor längs kanalens längd eller cystor på kanalen tips, ge ledtrådar till bakomliggande mekanism av defekter. Canal cystor (definieras här som intra-lumenal vätskefyllda spheroids omges av ett membran i apikala/lumenal) bör särskiljas från blåsor (små cytoplasma membran-bundna vätskefyllda spheroids) eller vakuoler (utvidgade cytoplasma membran-bundna Fluid fyllda spheroids), som inte är omgiven av ett lumenal membran, som kan alla ser ytligt identiska (figur 4A– D). Cytoplasmiska vakuoler kan jämväl uppstår sekundärt, t.ex., via toxiska effekter av montering lösningar (natriumazid). Både stora cystor och cytoplasmiska vakuoler kan ta upp nästan storleken på djuret, och behöver ytterligare skiljer sig från den klassiska ”clear (Clr)” canal fenotyp som orsakas av ansamling av vätska i kroppen hålighet. Slutligen, canal längd äventyras nästan alltid sekundärt i cystisk kanalerna, en sann canal förlängning defekt behöver därför påvisas i en cysta fria inställning.

Trots sina små diametrar, subcellulära komponenter av utsöndringsorganen kanaler, såsom apikala kontra basal membran, intracellulära endosomal kontra canaliculära blåsor, intracellulära organeller och cytoskeletal komponenter, kan visualiseras genom högre förstoring, t.ex., konfokalmikroskopi (figur 2, figur 4). Av confocal imaging är en god Jordbrukarsed positiva canal cytoplasman ensam tillräcklig för att skilja lumen från canal cytoplasman via en icke-fluorescerande linje (figur 2A, figur 4E). Identiteten för markörer bidrar till att lösa canaliculära från endosomal blåsor (också påfallande olika i storlek), även om slutgiltig tilldelning kommer att kräva immunoelectronmicroscopy39. Dubbel- och Trebäddsrum märkning kan avgöra subcellulär lokalisering av en molekyl av intresse och förhållandet av subcellulära komponenter till varandra (figur 2). Enda märkta lumenal canal membran producera samma dubbel rad som cytoplasman eller basala membranet, men kan särskiljas via dubbla eller tredubbla märkning. För confocal analys, korrekt montering är viktigt, gett bräckligheten i kanalen struktur, dess känslighet för osmotiska förändringar och sårbarheten i dess mest frekventerar cystisk fenotyp. Cystor sprack lätt med osmotiska förändringar eller fysisk press, är känsliga för membran gifter såsom natriumazid, och är också känsliga för vissa bedövningsmedel som används för immobilisering (det kan också ge cytoplasmiska vakuoler). I våra händer fungerar 5% lidokain i M9 buffert bäst för mest utsöndringsorganen canal analyser. Imaging förfaranden och all hantering bör vara mjuk, som beskrivs. För att undvika artefakter som efterliknar fenotyper (t.ex., cystor och vakuoler), är det bäst att omedelbart hämta bilder efter montering. Om detta inte är möjligt, bör cysta bilder förvärvas först, innan imaging andra fenotyper. Detta protokoll diskuterar standard skanning konfokalmikroskopi som ger överlägsen confocality, jämfört med spinning disk konfokalmikroskopi som däremot minskar fototoxicitet och microscopyen val för analys av dynamiska förändringar av subcellulära komponenter över tid. Sådana frågor på subcellulär dynamics kan också ställas med hjälp av fotoblekning tekniker eller märkning fusionsproteinerna med foto-omkopplingsbar fluorophores som ändrar färg40. Slutligen, spänna av resolutionen kan ökas ytterligare genom att lägga till transmissionselektronmikroskopi (TEM, ge den högsta strukturella men inte molekylär lösning), super-resolution mikroskopi (ge molekylär lösning i intervallet nanometer); eller immunoelectronmicroscopy (som ger både)39,41. 3D tomografi kan kombineras med TEM seriell avsnitt och är speciellt användbar för analys av gränssnittet canaliculära-plasma-membran av utsöndringsorganen kanaler9,10. Förbättrade tekniker för dessa olika typer av mikroskopi och kombinationer av dessa olika bildgivande metoder fortsätter att utvecklas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Vi tackar M. Buechner (University of Kansas, Kansas, USA), K. Nehrke (University of Rochester Medical Center, Rochester, New York, USA) och stadens Caenorhabditis genetik, finansierad av National Institutes of Health, Office av infrastruktur för forskning Program (P40 OD010440). Detta arbete stöds av bidrag NIH GM078653, MGH är 224570 och SAA 223809 till V.G.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cloning
Plasmid pPD95.75 Addgene Cat. No. 37464
PCR Kit Qiagen Cat. No. 27106
Ligation kit New England Biolabs Cat. No. E2611L
DNA marker Thermo Scientific Cat. No. SM1331
Agarose DNA grade Fisher Scientific Cat. No. BP164-100
Competent cells New England Biolabs Cat. No. C2987H
Tris Fisher Scientific Cat. No. BP154-1
EDTA Sigma Cat. No. ED-1KG
Acetic acid Fisher Scientific Cat. No. A38S-500
Ethidium bromide Fisher Scientific Cat. No. BP1302-10
Equipments
PCR machine  MJ Research Cat. No. PTG-200 
Centrifuge Eppendorf  Cat. No. 5415C
Water Bath Precision Scientific  Cat. No. 666A3 
Gel running instrument Fisher Scientific Cat. No. 09-528-165
Gel running power supply Fisher Scientific Cat. No. 45-000-465
Molecular Imager Gel Doc XR System Bio-Rad Cat. No. 1708195EDU
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific Cat. No. ND1000
C. elegans related1 1see reference19 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates2 2see reference19 for protocols.
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Yeast Extract BD Biosciences Cat. no. 212750
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
Ampicillin Sigma Cat. no. A0116
Tetracycline Fisher Scientific Cat. no. BP912
M9 Medium2 2see reference19 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
Na2HPO4 Sigma Cat. no. S7907
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
NGM plates 2 2see reference19 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Peptone  BD Biosciences Cat. no. 211677
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
CaCl2 Sigma Cat. no. C3881
Cholesterol  Sigma Cat. no. C8667
K2HPO4  Sigma Cat. no. P3786
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
RNAi plates3 3see reference21 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Peptone  BD Biosciences Cat. no. 211677
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
CaCl2 Sigma Cat. no. C3881
Cholesterol  Sigma Cat. no. C8667
K2HPO4  Sigma Cat. no. P3786
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
IPTG  US Biological Cat. no. I8500
Carbenicillin Fisher Scientific Cat. no. BP2648
NaOH Fisher Scientific Cat. no. SS266-1
Sodium hypochlorite Fisher Scientific Cat. no. 50371500
Bacteria
OP50 bacteria CGC
HT115 bacteria CGC
Genome-wide RNAi libraries
Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref21,58,59) Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref60) Source BioScience
Imaging related
Lidocaine MP Biomedicals,LLG Cat. no. 193917
Materials
Vacuum Grease Silicone Beckman Cat. no. 335148
Microscope slides  Fisher Scientific Cat. no. 4448
Tissue culture plate, 6 well  Corning Inc. Cat. no. 08-772-33
Equipment
SMZ-U dissecting microscope (Nikon)
SZX12 dissecting microscope (Olympus), equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions).
TCS SL Laser-scanning confocal microscope (Leica Microsystem)
C2 laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope (Nikon)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lubarsky, B., Krasnow, M. A. Tube morphogenesis: making and shaping biological tubes. Cell. 112 (1), (2003).
  2. Sundaram, M. V., Cohen, J. D. Time to make the doughnuts: Building and shaping seamless tubes. Semin. Cell Dev. Biol. S1084-9521, 30130-30136 (2016).
  3. Zhang, N. The C. elegans intestine as a model for intercellular lumen morphogenesis and in vivo polarized membrane biogenesis at the single-cell level. JoVE. , (2017).
  4. Andrew, D. J., Ewald, A. J. Morphogenesis of epithelial tubes: Insights into tube formation, elongation, and elongation. Dev. Biol. 341 (1), 34-55 (2010).
  5. Nelson, F. K., Albert, P. S., Riddle, D. L. Fine structure of the Caenorhabditis elegans secretory-excretory system. J. Ultrastruct. Res. 82 (2), 156-171 (1983).
  6. Sundaram, M. V., Buechner, M. The Caenorhabditis elegans Excretory System: A Model for Tubulogenesis, Cell Fate Specification, and Plasticity. Genetics. 203 (1), 35 (2016).
  7. Altun, Z. F., Hall, D. H. Excretory system. WormAtlas. , (2009).
  8. Buechner, M. Tubes and the single C. elegans excretory cell. Trends Cell Biol. 12 (10), 479-484 (2002).
  9. Khan, L. A. Intracellular lumen extension requires ERM-1-dependent apical membrane expansion and AQP-8-mediated flux. Nat. Cell Biol. 15 (2), 143-156 (2013).
  10. Kolotuev, I., Hyenne, V., Schwab, Y., Rodriguez, D., Labouesse, M. A pathway for unicellular tube extension depending on the lymphatic vessel determinant Prox1 and on osmoregulation. Nat. Cell Biol. 15 (2), 157-168 (2013).
  11. Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Dev. Biol. 214 (1), 227-241 (1999).
  12. Fehon, R. G., McClatchey, A. I., Bretscher, A. Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11 (4), 276-287 (2010).
  13. Gobel, V., Barrett, P. L., Hall, D. H., Fleming, J. T. Lumen morphogenesis in C. elegans requires the membrane-cytoskeleton linker erm-1. Dev. Cell. 6 (6), 865-873 (2004).
  14. Boulin, T., et al. Reporter gene fusions, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. , April 5, 2006 http://www. wormbook.org (2006).
  15. Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. Sambrook, J., DW, R. ussell , Cold Spring Harbor Laboratory Press . (2006).
  16. Fire, A., Harrison, S. W., Dixon, D. A modular set of lacZ fusion vectors for studying gene expression in Caenorhabditis elegans. Gene. 93 (2), 189-198 (1990).
  17. Ahringer, J. Reverse genetics, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. 6, April 6, 2006 http://www. wormbook.org (2006).
  18. Transformation and microinjection, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. Evans, T. C. , April 6, 2006 http://www.wormbook.org (2006).
  19. Maintenance of C. elegans, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. Stiernagle, T. , February 11, 2006 http://www.wormbook.org (2006).
  20. Genetic mapping and manipulation: Chapter 7-Making compound mutants, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. Fay, D. , February 17, 2006 http://www.wormbook.org (2006).
  21. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  22. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  23. Pawley, J. B. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , Springer. (2006).
  24. Hibbs, A. R. Confocal Microscopy for Biologists. , Springer. US. (2004).
  25. Bankhead, P. Analyzing fluorescence microscopy images with ImageJ. , (2014).
  26. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157 (3), 1217-1226 (2001).
  27. Frøkjaer-Jensen, C. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nat. Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).
  28. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).
  29. Barrangou, R. Cas9 Targeting and the CRISPR Revolution. Science. 344 (6185), 707-708 (2014).
  30. Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).
  31. Esposito, D., Garvey, L. A., Chakiath, C. S. Gateway cloning for protein expression. Methods Mol. Biol. 498, 31-54 (2009).
  32. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  33. Hobert, O. PCR fusion-based approach to create reporter gene constructs for expression analysis in transgenic C. elegans. Biotechniques. 32 (4), 728-730 (2002).
  34. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat. Rev. Genet. 3 (5), 356-369 (2002).
  35. Berry, K. L., Bulow, H. E., Hall, D. H., Hobert, O. A. C. elegans CLIC-like protein required for intracellular tube formation and maintenance. Science. 302 (5653), 2134-2137 (2003).
  36. Mattingly, B. C., Buechner, M. The FGD homologue EXC-5 regulates apical trafficking in C. elegans tubules. Dev. Biol. 359 (1), 59-72 (2011).
  37. Shaye, D. D., Greenwald, I. The disease-associated formin INF2/EXC-6 organizes lumen and cell outgrowth during tubulogenesis by regulating F-actin and microtubule cytoskeletons. Dev. Cell. 32 (6), 743-755 (2015).
  38. Lant, B. CCM-3/STRIPAK promotes seamless tube extension through endocytic recycling. Nat. Commun. 6 (6), 6449 (2015).
  39. Paupard, M. C., Miller, A., Grant, B., Hirsh, D., Hall, D. H. Immuno-EM localization of GFP-tagged yolk proteins in C. elegans using microwave fixation. J. Histochem. Cytochem. 49 (8), 949-956 (2001).
  40. Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Photoactivatable fluorescent proteins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 885-891 (2005).
  41. Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).
  42. Sherman, T. The abts and sulp families of anion transporters from Caenorhabditis elegans. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 289 (2), C341-C351 (2005).
  43. Caenorhabditis Genetics Center (CGC). , http://cbs.umn.edu/cgc/home (2017).
  44. Wormbase. , http://www.wormbase.org/ (2017).
  45. Transgeneome website. , https://transgeneome.mpi-cbg.de/transgeneomics/index.html (2017).
  46. C. elegans expression pattern. , http://gfpworm.org/ (2017).
  47. National BioResource Project (NBRP)::C. elegans. , https://shigen.nig.ac.jp/c.elegans/ (2017).
  48. Heppert, J. K. Comparative assessment of fluorescent proteins for in vivo imaging in an animal model system. Mol. Biol. Cell. 27 (22), 3385-3394 (2016).
  49. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  50. GeneMANIA. , http://genemania.org/ (2017).
  51. AceView. , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ieb/research/acembly/ (2017).
  52. iHOP. , http://www.ihop-net.org/UniPub/iHOP / (2017).
  53. Saccharomyces Genome Database. , http://www.yeastgenome.org (2017).
  54. Flybase. , http://www.flybase.org (2017).
  55. Mouse Genome Database. , http://www.informatics.jax.org (2017).
  56. Human Genome Database. , http://www.gdb.org (2017).
  57. BLAST. , https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (2017).
  58. Kamath, R. S., Martinezcampos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), RESEARCH0002 (2001).
  59. Kamath, R. S. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  60. Rual, J. F. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome research. 14 (10B), 2162-2168 (2004).

Tags

Utvecklingsbiologi fråga 128 encelliga tubulogenesis intracellulära lumen morfogenes enda cell i vivo analys utvecklingsmässiga genetik dissekera fluorescensmikroskopi konfokalmikroskopi
<em>C. elegans</em> Excretory kanalen som en modell för intracellulära Lumen morfogenes och <em>In Vivo</em> polariserade membran biogenes i en enda Cell: märkning av GFP-fusions, RNAi interaktion skärm och Imaging
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, N., Membreno, E., Raj, S.,… More

Zhang, N., Membreno, E., Raj, S., Zhang, H., Khan, L. A., Gobel, V. The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging. J. Vis. Exp. (128), e56101, doi:10.3791/56101 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter