Summary
線虫 c. エレガンスの排泄管はde novo偏光膜生合成の視覚的生体内解析のためのユニークな単一細胞モデルです。このプロトコルでは、標準的な遺伝学的/RNAi とアプローチ、同定と解析分子単細胞 tubulogenesis と頂端膜と内腔を演出するための適応をイメージングの組み合わせについて説明します。
Abstract
4 つのc. の elegans排泄管が狭い管とほぼ同等にまで拡張の細胞内 endotubes を構築し、膜と submembraneous ルーメンの安定化の 1 つのセルから動物の長さまで延長根尖部の文字の骨格。排泄の細胞拡大その長さ約 2,000 倍・ デ ・ ノボ偏光膜器官、細胞内腔の形態形成の生体内評価のためユニークなこのモデルを作るこれらの運河を生成して単細胞tubulogenesis。ここで提示されたプロトコルは、標準のラベル付け、利得と損失-の機能遺伝子や RNA 干渉 (RNAi) を結合する方法を示しています-とこのモデルを使用して視覚的に解剖し、機能分子レベルでこれらのプロセスを分析するミクロ アプローチ。ラベルをつける方法の例としては、プロトコルは、tubulogenesis のライブ解析用蛍光融合タンパク質を持つトランスジェニック動物の世代をについて説明します。遺伝的アプローチの例としてそれは利得関数の嚢胞性の管の表現型を変更するのには設計されています visual RNAi ベース対話画面の重要なポイントを強調表示します。説明する方法がどのようにする: ラベルし、蛍光蛋白質を表現することによって運河を可視化対象となる RNAi ライブラリを構築し、RNAi スクリーニング運河の形態形成の分子分析のための戦略を練る運河の表現の変更を視覚的に評価します。蛍光顕微鏡の解剖によってそれらを獲得します。共焦点顕微鏡から高い解像度で細胞レベル下の運河のコンポーネントを特徴します。視覚パラメーターを定量化します。アプローチは調査官と遺伝子細胞内腔の系統保存のプロセスに関与する、単細胞を定量化のc. の elegans排泄管の活用に興味のある人の役に立つ管形成。
Introduction
すべての臓器は、チューブ、輸送、ガス、液体、栄養素の交流と老廃物の排泄などの彼らの多くの異なる機能のために重要ので構成されます。異なる腔と頂端膜の偏光文字はこれらの特定の機能に適応、遠藤・膜システムの器官の欠陥人間の病気1,2が頻繁に発生。管血管・臓器の大半は多細胞と、内腔を形成する intercellularly;ただし、単細胞のチューブ内腔を細胞内に形成することができます、人間の毛管ベッド2の 30-50% と同じくらい表すなど。マルチと単細胞チューブの偏光膜のミクロ相分離構造は管の特定の機能 (例えば、線虫の腸絨毛と排泄管細管に基づいて異なる場合がありますが構成で類似しています。線虫;c. の elegans腸 tubulogenesis の紙を伴う参照)3。偏光膜生合成と tubulogenesis の原則は、後生動物の間で維持され、類似分子機械は1,2,4を導きます。
線虫 c. エレガンスの排泄システムは、5 つのセルで構成されています: 排泄細胞 (EC)、管細胞 (DC)、細孔セル (PC) と 2 つの腺細胞。EC、DC、または PC のアブレーションは、体腔と初期の幼虫のステージ5で、動物が死亡の体液貯留を引き起こします。興味を持って、これらの 3 つの単細胞の管は 3 つの異なる方法でそのルーメンを作成: 細胞 (EC) を空洞化。セルの折り返し結合 autocellular 接合の形成 (PC);セルの折り返しによって autofusion (DC); と相まって、すべての系統保存6,7は、内腔の形態の異なるメカニズム。後部咽頭電球の左の側面に位置する EC を送信 2 つ横の拡張 4 つの運河が前方を拡張する進出するからと後方 (両方の左右側) にワームの鼻と尻尾の先端に、それぞれ (図 1)5,6,8。EC は、それに動物の最大のセル 2 x 1,000 μ m に約 1 μ m から延びて.細胞内レベル排泄管基底膜、pseudocoelom に向けて、内腔の膜 (endotube) によるトンネルから生成された、シンプルなチューブです。そののみ細胞間のジャンクション; 管腔膜に接続する管腔膜運河は、それ以外の場合 (図 1) の長さに沿って junctionless。アピカル膜の組成と、腸管などの多細胞管の submembraneous 骨格のような分子構成によって定義された、排泄管腔膜とその submembraneous 骨格が頂、その他 (例えば、フラット) 上皮細胞の。細胞質細胞器官、エンドソーム小胞およびその他 (例えばゴルジ) 運河の長さに沿って分布している膜を含みます。さらに、複数の小管小胞の内腔の膜に接続または相互接続、または分離 - 運河細胞質7,8,9,10 通したか.この動的プラズマ膜/小管接続はさらに運河の膜システムを展開し、形態形成と浸透圧10をルーメンと両方に貢献します。排泄の運河従ってほぼ完全に遠藤と原形質膜、偏光膜生合成の解析と遠藤-膜インターフェイスへの調節のエクセレント モデルを提供することで構成されます。内腔拡張-と一致する単一細胞システム - 運河の形態形成における頂端膜の劇的な拡張も安定化し、細胞内腔側膜を中心に必要性によって生じる建築の問題を分析することができます。.このプロトコルは、EC の位置を生成する細胞の運動を直接信号ではなく管チューブとルーメンの構造形態の創生とこのプロセスに必要な細胞内膜動態の解析に焦点を当てて、排泄システム (文献6) 他の細胞成分との複雑な接続を構築します。
偏光膜と内腔の細胞内器官の分析のためc. の elegans単一セル管システムのそれ以上の利点は発達の時間を通じて、その膜のさまざまなコンポーネントの生成を分離する能力接合します。EC は腹側の閉鎖の時間に生まれ、半ば胚5,6,8延長横方向の運河と分岐が発生する期間中に、咽頭の頬骨横方向に落ち着きます。これが前後運河拡張後期胚形成、L1 - 幼虫 (図 1) に続くプロセス中に続きます。孵化幼虫で後部運河先端にワームのほぼ真ん中、ワーム8と共に延長完全に伸びる尾 L1 ステージの終わり時間後運河。従って動物の成長を上回る速度でアクティブな運河成長終了最初の幼虫の段階で、しかし、さらに成長は、追加幼虫段階 (L2-4) で全体の動物の成長と並行して行われます。この設定は、偏光の細胞分裂または移行の独立したde novo偏光膜器官の異なるステップを分析する機会を提供します。さらに、それは (ルーメン開始前に胚発生) する接合のアセンブリからこのプロセスの分離を許可します。膜の分極を彼らの正確な要件はまだ極性において未解決の問題です。最後に、それは一意に基底膜の拡張、後者の過程は排泄管10の元の前から頂分離します。線虫 c. エレガンスの排泄管モデルが偏光膜生合成の分析のためのこれらの利点の多数を共有するが、多細胞の設定 (参照の実行腸管モデルに特に有益な補完それに伴う紙腸 tubulogenesis3)。
そのルーメンが vi をすることができますこの小さなワームの極薄の細管が野生型運河、この透明な動物にノマルスキー光学系による直接 sualized。実際には、変異の嚢胞性の管の形態解剖顕微鏡前方遺伝スクリーンで大きな効果を tubulogenesis11に関与する遺伝子を識別するために使用されている低倍率を使用してラベルのない動物で特徴付けられます。運河の形態とその偏光膜、骨格成分、異なる細胞内小器官、他の細胞レベル下の構造の違いの改善された可視化ラベリングが必要ですし、高い電力蛍光解離および共焦点の顕微鏡検査。運河の微細構造は、ラベリングと顕微鏡のための困難の数ポーズ、各コンパートメントに固有の特定の分子を介して膜と細胞レベル下のコンポーネントを区別できるし、動物が安全に場合は、マウント顕微鏡用特定のアーティファクト (プロトコルおよび議論を参照) を導入することを避けるために予防措置を。ラベリングを行う固定標本の免疫組織化学によってまたは彼らの自身の制御の下で蛍光融合蛋白質を表現する遺伝子組換えのワームを生成することによってまたは生体内イメージングの排泄管特異的発現プロモーター。このプロトコルを記述する後者のラベリング手法 (抗体染色3腸 tubulogenesis の付属の紙を参照)。
生体内でイメージ投射単一細胞解析と体内の損失または利得-の機能研究を結合する能力はc. の elegansの排泄管分子に特に強力なモデル開発作る全体レベルと単細胞の tubulogenesis の細胞の解析。運河の形態表現型 (例えば、嚢胞) を識別するために野生型またはラベル付けの遺伝子組換え動物から始まる前方または逆引き遺伝子スクリーニングを行うことが、その基になる遺伝子欠陥。また、このような画面 (例えば、嚢胞性の管) の突然変異形質を開始し、抑制やエンハンサーこの表現型の突然変異体の表現型の原因遺伝子をもつ遺伝子機能的相互作用を識別する識別。突然変異体の表現型を引き起こす遺伝的欠陥は、(例えば遺伝子の欠失を経由) の損失または利得を引き起こすことができる (例えば、を介して活性化突然変異か余分な遺伝子のコピーの導入を通した) 調査関数の。前方変異または体系的な RNAi 画面は遺伝子機能に先入観なしであり、公平な関心の機能に関与する遺伝子同定を許可します。ゲノムワイド RNAi ライブラリを供給の可用性、与えられたほとんどすべての遺伝子を簡単に倒す方法線虫、RNAi による興味の単一の遺伝子または遺伝子 (例えば、対象となる画面) のグループも急速に検出できるように逆遺伝学アプローチの影響。アプローチの可能な組み合わせを示すためには、ここで述べる対象 RNAi 操作画面では、機能獲得の嚢胞性の排泄管の突然変異から始まる細胞質管緑色蛍光タンパク質 (GFP) が付いた。突然変異体の表現型は、 erm 1、非常に節約された線虫の過剰発現によって生成された膜アクチン リンカー家族・ エズリン ラデキシン モエシン (ERM) は、膜と内腔の形態形成に関与しているのオーソログ多くの種12組織。C. の elegans ERM 1 排泄管や腸などの内臓の内腔の膜に局在する、両方の13の管腔形成に必要です。ERM 1 過剰発現は、余分なアクチンおよび管の内腔側膜内腔量の増加、短い嚢胞性の管と肥厚したアクチン下塗り9圧着内腔の膜を生成する小胞を募集します。プロトコルは、融合蛋白質 (または他の蛋白質) というラベルの付いた排泄運河発現トランスジェニック系統を生成する方法をについて説明しますこのようなひずみは、運河の表現型; の修飾子を識別するで始まるターゲットの RNAi 画面を実行する方法有益な tubulogenesis の表現型を定量化するための簡単な方法を含め、蛍光解離性と共焦点顕微鏡によるこのような画面の結果を視覚的に分析する方法。腸 tubulogenesis3に付属の紙の代わりにラベリング技術および RNAi、しばしば致命的な tubulogenesis 遺伝子の調整の詳細を見つけることができます。すべてのメソッドは、運河 tubulogenesis の他の質問の調査のためのさまざまな組み合わせで使用できます。
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Protocol
1 蛍光融合タンパク質 14 c. の elegans 排泄運河をラベリング
注: 腸内 tubulogenesis に付属のペーパーを参照してください 3。 その場で 抗体染色法を排泄管に適応によって分類するため。C. の elegans 排泄運河遠藤 - と原形質膜、プロモーターの排泄管式を運転の例について 表 2 を可視化できる便利な分子の例については 表 1 を参照してくださいと 表 3 マーカーとプロモーターのより包括的なコレクションのためのリソースなど異なった fluorophores の選択を議論の参照
。- 制限の酵素によって組織特異的蛍光マーカー プラスミッドの構造ベースのクローン作成 15
注: 代替技術を構築するため の議論 を参照してください蛍光融合タンパク質。- (転写融合) のプロモーターまたは WormBase 44 (並進融合) のためのプロモーターと関心の全遺伝子のシーケンスを識別します
。 注: のプロモーター、約 1 – 3 プラスミド (kb) は、ほとんどの c. の elegans 遺伝子だけで十分です。並進の融合蛋白質は、排泄管特異的プロモーターの下で興味の遺伝子を配置することで構築できます (表 2 を参照). - (並進融合) のプロモーター (転写融合) のプロモーターによる遺伝子の増幅の前方および逆のプライマーを設計します。5 制限の酵素リンカーを追加 ’、3 ’ プライマーの端です
。 注: は、ベクトル (例えば pPD95.79) プラスミド 16 に存在する制限酵素を選択します。並進の融合、3 の ’ リンカーは制限の酵素の消化力、ベクターを使用して結紮後挿入コドン フレームが蛍光体 など GFP のコドンと連続になりますように設計する必要があります。1 つは典型的な制限酵素リンカー 14; に 1 または 2 の基地を追加する必要があります。終止コドンを作成しないように注意してください 。
- 実行ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) プロモーターまたはテンプレート 15 ライブ ワームまたは野生型 DNA または cDNA を用いたフルレングスの遺伝子を増幅するため
。 注: テンプレートとしてワームを使用する場合、換散バッファー (PCR バッファー プラス プロティナーゼ K) 17 でワームを最初溶解します。混合段階ワームは、テンプレートとして使用することができます。細菌の DNA の混入を避けるために飢えたワームを使用できます 。
増幅産物の正しいサイズを識別するために PCR 産物の電気泳動のゲルの - の実行 agarose (1%) です
。 メモ: バンドのサイズが正しい場合は、次の手順に進みます。複数のバンドを生成している場合は、単一のバンドを生成する増幅条件を改善します。これが動作しない場合ゲルから正しいバンドをカット、標準的な方法 15 DNA を浄化し、次の手順に進みます 。
- PCR の製品の標準的な方法 15 の個別のチューブの蛍光体 (例えば pPD95.79) を含むベクトル プラスミド実行制限のダイジェストします 。
- 消化の Dna をゲル電気泳動分離し、溶出が PCR の製品の個別のチューブ内の DNA バンドをベクトルします 。
- は、標準的な方法 15 ゲルのスライスから Dna を浄化します。分光光度計によって DNA の濃度を測定します 。
- PCR の製品を縛ると標準的な方法で DNA をベクターし、有能なセルの標準的な方法 15 組換え Dna に変換します 。
- 広がる 10 μ、50 μ L、100 μ L の 50 μ g/mL アンピシリンと補われる 3 つの個々 のルリア スープ (LB) プレートに変換されたセル
。 注: 変換効率のスペクトルの異なるプレートの上に細胞の量が異なるを広めます。例えば、メッキがあまりにも密集が許さないコロニーの分離変換が効率的な場合 。
- は、37 ° C でプレートを一晩インキュベートします。次の朝、インキュベーターからプレートを取り出す
。 注: 植民地が非常に小さい場合孵化させなさいいくつかのより多くの時間 。
- 準備プラスミド Dna 標準方法 15 シングル コロニーから。テンプレート DNA とプライマーを混合し、シーケンス (通常コア サービス センターで実行されます) のために送信します 。
- シーケンスを読むし、融合の構造の整合性を検証します
。 注: 重要: 挿入された遺伝子と蛍光マーカー遺伝子翻訳の融合のための正しいコドン フレームを確認します。理想的には、シーケンス全体の遺伝子 PCR および結紮処置中に導入された変異がないことを確認します 。
- ステップ 1.2 注射に、(ステップ 1.1.11 を使用して) より多くのプラスミッド DNA を生成します 。
- (転写融合) のプロモーターまたは WormBase 44 (並進融合) のためのプロモーターと関心の全遺伝子のシーケンスを識別します
- 世代 生殖変換のための DNA の微量注射によるトランスジェニック動物の 18
注: 遺伝子を導入するための代替技術の議論を参照してください。輪郭を描かれたプロシージャは、蛍光融合タンパク質または興味の他の蛋白質を運ぶトランスジェニック動物を生成する使用できます。例えば、外因性タンパク質が新たに導入された (例えば、異種のオーソログ) することができます。 または内因性のタンパク質を (例えば、救助の対応する生殖細胞系列変異体) に再導入または過剰に発現して (例えば、射出表現型を生成することができます。erm 1 のによって使用された変更のためのターゲットとして機能する過剰発現嚢胞性の管の表現型を生成する RNAi 相互作用の画面が以下に説明)。- ミックス構築 DNA (1 – 50 ng/μ L) マーカー プラスミッド DNA (通常 100 ng/μ L)、例えば支配的なマーカーの rol-6 (su1006) と (1.2.3 マーカーのオプションを参照してください).
注: 重要な: 注入された DNA の濃度は、経験的とき artefactual 表現型 (嚢胞、拡張欠陥、致死) の導入を避けるために決定する必要がある特に排泄管での遺伝子発現遺伝子発現に敏感。1 つは例えばと実行可能なひずみの生成を濃度の範囲をテストする 1 ng/μ L、10 ng/μ L、50 ng/μ L、100 ng/μ L の rol-6(su1006) の 100 ng/μ L の濃度でプラスミドのいくつかの混合物をすることも、目的の式または表現型 (高濃度非具体的運河の形態形成のため有毒であることが多い、致命的な場合があります). - 0.22 μ m (マイクロ メートル) 細孔サイズ スピン x 遠心チューブ フィルターを介して DNA 混合物をフィルタ リングします
。 注: を放置しないでください、チューブの蓋マイクロインジェクション針をブロックすることができますほこりを避けるためにオープンします 。
- は、生殖細胞への変換のための標準的な方法で野生型と変異体のワームの生殖腺に組換えのプラスミッドを microinject (詳細については手順参照 18 を参照してください).
注: 標準的なマーカーのプラスミドは、例えば: rol-6(su1006)、使う 20、unc 119、pha 1。救出 transgenes は彼らのそれぞれの変異体に導入されるに対し、rol-6(su1006) のような支配的な遺伝子が野生型のワームに導入されます。マーカー プラスミッド、遺伝子組換えのラインのメンテナンスが容易な co 注入した染色体外遺伝子は細胞分裂の中にランダムに失われますので (1.2.8 を参照)。蛍光融合の遺伝子を注入すると、いずれかを使用できます GFP、fluorophore マーカーとしての地位。rol 6 誘導の形態形質の評価のために有利であることが多い自分の周りロールバックするワームです 。
- 大腸菌 に注入伝虫シード線虫成長媒体 (NGM) 板 (例えば、5 ワーム/プレート) (参照してください参照 19 標準的な c. の elegans 文化とメンテナンスの手順と材料のテーブル).
- プレートをインキュベートし、約 20 ° C で開発の子孫 d.
- は、Rol (ローリング) ワーム (または、その他特定の噴射のマーカー、例えば GFP) の解剖顕微鏡の下で F1 子孫を調べるし、ローラ t を選択o 個々 のプレートします 。
- F2 動物を圧延板を選択し、解離蛍光顕微鏡下で蛍光性の存在を確認 (通常はローラのすべての動物、GFP 陽性).
注: F2 ローラーはトランスジェニック ラインの成功の世代を示しています。個々 の行が異なる、ことがあります 例えば、transgene 伝送速度に関して。したがってを維持し、いくつかの行を保存すると便利です 。
- マーカー陽性動物のための新しい板を富ませることによって形質転換線を維持します
。 注: 挿入された DNA は、染色体外配列として生殖細胞に組み込まれます。染色体外配列の伝送速度は、一般的に周り 〜 50% が変数です。緊張を失わない、それは手動で (例えば、負の淘汰によってセキュリティ保護されていない線) 支配的なマーカーでラインを豊かにする重要なためです 。
- は-80 ° C 19 で長期的な保存のための標準の凍結技術で形質転換線を凍結します
。 注: 染色体外配列に Transgenes もに統合できます生殖均質な線 18 を生成するための追加の手順で UV 照射による。たとえば、erm 1 は ERM 1 + [+] ひずみ UV 照射による生殖細胞に統合された fgIs2[erm-1p::erm-1;rol-6p::rol-6(su1006)] 場所すべての動物を運ぶ遺伝子、RNAi ベースでの使用のための要件下記操作画面。この株はさらに vha 1 p を含むひずみの交差点を介して細胞質の排泄管 GFP による標識された:: GFP 遺伝子 (上記で説明したのと同じ手順によって生成される; 基本的な遺伝的参照 20 を参照してください十字架などのプロシージャ) ERM 1 + [+]; といいますとvha 1 p:: GFP ひずみ以下 。
- ミックス構築 DNA (1 – 50 ng/μ L) マーカー プラスミッド DNA (通常 100 ng/μ L)、例えば支配的なマーカーの rol-6 (su1006) と (1.2.3 マーカーのオプションを参照してください).
2。対象とした RNAi ライブラリと運河の表現型を変更するのには RNAi の操作画面のデザインの構築
注: 対象となる RNAi ベース遺伝的相互作用画面説明に過剰発現嚢胞性の管の表現型を使用します。相互作用排泄管の形態形成遺伝子の探索。ERM 1 + [+] ひずみは、例 9 として機能 (1.2.9 の手順を参照してください)。このアプローチは排泄管内腔の形態形成の遺伝学的解析のための多くの可能なアプローチの 1 つだけをプレゼント (他の遺伝的アプローチの 導入 および 議論 を参照)。腸 tubulogenesis 3 と参照 17 , 21 , 22 の RNAi、RNAi の詳細については付属の紙を見る手順、(しばしば致命的な tubulogenesis 遺伝子調整) RNAi 強度変調と技術的な問題の議論は、RNAi に接続されています。標準的なワーム文化とメンテナンスおよび 材料のテーブル のための参照 19 を参照してください
。- ERM 1 (または興味の他の遺伝子) の検索データベースで公開された記事相互作用する分子
。 注: 潜在的な ERM 1 インターアクターがどんな種の ERM 蛋白質と相互作用機能、遺伝的にまたは物理的にことが示された実験的および/または任意 インシリコ、高スループットによってそうために予測されたすべての分子が含まれてまたはシステム生物学のアプローチ (データベースおよびリソースの例については 表 3 を参照してください). - はすべての遺伝子の一覧を生成し、線虫 ホモログを見つける必要
。 注: 興味の遺伝子の機能を考慮し、インターアクターを識別するためネットを広げる遺伝子のクラスに識別された遺伝子のリストの展開を検討してください (例えば、膜アクチン リンカー ERM-1、すべてアクチンを選択し、アクチン関連分子). - 識別対応する RNAi バクテリアのすべての遺伝子のために市販のゲノム細菌 RNAi ライブラリ内のクローンを供給 (例えば、Ahringer ゲノム 線虫 RNAi ライブラリ 21 を供給;材料表)
- すべての遺伝子および対応する RNAi プレートおよび井戸のためのスプレッドシートを作成します 。
- ピックアップ LB/アンピシリン/テトラサイクリン プレート (抗菌薬の選択は図書館の建設によって決まります) 1 日あたりの ~ 50 の RNAi のクローンを連勝し、続行まで対象とした RNAi ライブラリが生成されます
。 注: 投影されたワークフローのライブラリのサイズ、に応じて完全なライブラリを生成を省略し、直接バッチ分析を続行します。プレートは、もはや (必要な場合、再新しいプレートの上にその後連勝) 約 2 週間以上のための 4 ° C で保存できます。逆に、1 つは-80 で長期保管のため複製 96 または 384 ウェル フォーマットの大きい冷凍ライブラリを生成できます ° C - は、37 ° C でプレートを一晩インキュベートします。次の朝、削除板インキュベーターと店から 4 ° C
- 選択 RNAi 細菌によって生殖不能のつまようじ板から 1.5 mL マイクロ チューブの LB/アンピシリン (50 ng/μ L) スープ 600 μ L と細菌をミックス、37 ° C でチューブを孵化させなさい、6 h に振る
注: は、チューブの側面に沿ってピックアップ (つまようじまたはピペットの先端) をこすることによってスープに RNAi 細菌を接種する 。
- シード 70 μ L は、帳票の写しセットで 6 ウェル RNAi プレートの各ウェルに細菌を培養しました。22 ° C で RNAi プレートを一晩インキュベートします
。 注: RNAi 板は標準的な手順 (テーブルの材料 と参照 3 , 17 , 21) によって生成され、ここで 6 も組織で使用でき、プレート上の生きている動物の運河の形態形成の微視的評価高いスループットのアプローチ文化プレート形式 。
- 次の朝、ピック 3 L4 段階 ERM 1 + [+];vha 1 p:: GFP の RNAi プレートの各ウェルにワームします。
- (参照 19 参照) 最初 RNAi を妨げる OP50 細菌汚染を避けるため細菌なし NGM プレート上にワームをシードし、約 10 分間クロール動物。健康な動物の非餓死をのみ使用します 。
- 子孫を生産する動物を許可する 3 d の 22 ° C でプレートをインキュベートします 。
- 解離性蛍光顕微鏡下で F1 子孫で調べる運河表現します 。
3。生体内で蛍光を解剖顕微鏡および Tubulogenesis の表現型の得点による 線虫 の排泄管のイメージング
- 準備表現型スコアリング シート (表 4 に示す例と 図 5).
- 蛍光 dissectin の直下にワームと寒天プレートを配置します。g 顕微鏡、評価、プレートのオープン蓋使用集中する低倍率
。 注: このプロトコルは 1.5 倍と 10 倍目標と 3.5 から 45 (材料表) のズーム範囲を使用するスコープの使用を説明します 。
- も別にそれぞれに焦点を当て、よく 1 から始まる動物を評価し、プレートを動作します
。 注意: は、常にコントロールの評価から始まります。例えば、モック (空のベクター) コントロール (HT115 RNAi 細菌 (を参照してください参照 17 , 21) なし、または無関係遺伝子挿入) を負し、正の適切な制御、例えば でこの相互作用の画面、erm 1 (ERM 1 + [+] 表現型は抑制される) RNAi と sma 1/スペクトリン (ERM 1 + [+] 運河の表現を高める) RNAi 。
- に、まず一般的な表現型の明るい光の下で目に見える (たとえば: Clr/クリアしましょう/致死、Emb/胚致死、Ste/滅菌、Unc/まとまりのない、使う/みすぼらしい、等)、動物および数の合計数をカウントすることによって表現型を定量化表現型を持つ動物、レコード番号 (表 4 参照).
注: 運河の表現型 (例えば、組込みシステム、Ste) の評価に影響を与える可能性があります欠陥を原因となる遺伝子のノックダウンを検討する条件で実験を繰り返し、投稿胚性 RNAi (手順 3 の紙を添付参照してください). - 第二に、蛍光灯の光の下での排泄管の表現型を調べる、定量化可能な表現型 (例えば 運河の長さ、嚢胞腔の幅) をスコア、番号を記録、スコアリング シートの表現型を記述する (表 4 を参照してください <。強いクラス ="xfig"> 図 5).
注: 高倍率ズームの範囲より多くの微妙な運河の表現型を評価する必要です。低と高倍率運河を慎重に評価する間、前後移動 ’ s の長さおよび幅と任意の他の運河の形態の表現型。定量化または単純な表現型の半定量化、カウント 100 動物 (例えば、この対象となる RNAi スクリーニングに L4s; 表現型: 運河の 1/4、1/2、3/4 長さと完全な後部運河の拡張と後部運河の内腔径小嚢胞 (< 動物に幅の 1/3)、大きな嚢胞 (> 動物に幅の 1/3);表 4 を参照してください). - 顕微鏡によって少なくとも 3 の異なる動物から支配的な表現型の取得イメージ マウント デジタル電荷結合素子 (CCD) カメラと対応する画像処理ソフトウェア (材料表 参照)
- 画像、
- カメラの電源、オンに接続されているコンピューター、イメージ キャプチャ ソフトウェア アイコンをダブルクリックして、低倍率の下で手動でワーム プレートの領域に焦点を当てるとカメラのシャッターを開く最初 。 クリックして
- 、“ ライブ プレビュー ” イメージ キャプチャ ソフトウェア コンピューターの画面上のワームを視覚化するためのコンピューターの画面上のアイコンは、明らかに画面で、ワームを視覚化しをクリックして手動でフォーカスを調整、“ スナップ ” アイコン、し、クリックして、“ 保存 ” アイコン
。 動物は、蛍光灯の光の下で高速移動したがって注意: 1 つの手コンピューターのマウスを準備ができている一方で関心のある領域にプレートを移動しながら。速やかにクリックして、“ スナップ ” アイコン画像が取得できます。それは通常いくつかの試行で良好な画像を得ることが可能です 。
- は、適切なファイル名で取得した画像を保存 (緊張の名前、RNAi クローン名、日付を含む).
注: 細くて長い運河と高速移動の野生型ワームは突然変異体のよりも画像より困難です。嚢胞性の管および/または他の表現型の突然変異体は、イメージングを進め、ゆっくりと動く可能性があります。Rol などマーカー プラスミッドは動物を保つことによってイメージングのために便利することができます “ スポット ” はなく、転送、移動、動物自体の周りにローリングと表現型に改良されたビューもあります 。
4。レーザー走査型共焦点顕微鏡による高解像度で c. の elegans の排泄管のイメージング
の先端、または綿棒の先端で- の 生きている動物をマウント
- グリスまたはワセリンの少量を配置、指をインデックスし、の直径の極薄円を生成するグリースを広める 〜 6 – きれいなガラス スライドの真ん中に 8 mm です 。
- マイクロ ピペットによる円に場所 6 μ L 5% リドカイン液 (麻酔).
注: リドカインの原液は水でリドカイン粉末を溶解することにより可能です。M9 バッファー 19 (材料表) で 5% に希釈します。破裂する嚢胞が発生して、運河の表現型を誘発する (アジ化ナトリウム) など一般的な固定化ソリューションを避けるために排泄管の分析が重要です 。
- RNAi プレートからいくつかの動物を選択し、ソリューションにワーム選択 19 を immerging でリドカイン液にそれらを配置します
。 注: できればステージ固有動物均一の太さによっても取付を容易にするを選択します。動物は、解離性の蛍光顕微鏡で事前に選択できます 。
- スライド ガラス上に 22 mm × 22 mm coverslip の場所; せて優しくグリース円に落ち着く
。 注: は運河形態、特に変異体や運河とおそらく他の表現型 RNAi 扱われるワームに損傷を与える可能性があります、上の任意の物理的な圧力を適用されません。そのため厚いグリース円を避けるために重要です。理想的に、動物には優しくスライド ガラスとカバーガラスの間が挟まれています 。
- は、スライド ガラスの霜で覆われた側のサンプルの名前を書きます。すぐに運河の表現型解析画像を取得する共焦点顕微鏡スライドを取る
。 メモ: 遅延は管嚢胞の損傷の結果、管腔の形態を変更します 。
- 獲得共焦点画像
- 共焦点顕微鏡の試料ステージにスライドを配置、低倍率 (10 倍) でワームに焦点を当てるです 。 下 60 X および/または 100 X の目標、
- ビューと選択動物を調べる排泄管 ’ s 携帯と細胞の表現型、例えば、内腔形状と直径、サイズと形状の嚢胞; またはというラベルの付いた解析、細胞レベル下のコンポーネント 例えば、頂/内腔の膜基底膜、細胞質、毛細小胞とエンドソーム、他の細胞内小器官 (ディスカッション 図 2、および 図 4 を参照).
- 興味の特定の表現型の画像を取得します
。 注: このプロトコルでは、走査型レーザー共焦点顕微鏡 (材料表) の使用について説明します。細い 線虫 の細胞レベル下のコンポーネントを解決するには、排泄運河、高い倍率の目的 (100 X 60 X) が必要です。回転ディスク共焦点顕微鏡時間経過画像を取得する使用できますが、以下の confocality を提供しています (説明 を参照)。- 共焦点画像を取得するコンピューターの電源を共焦点顕微鏡のソフトウェアをダブルクリックして、特定のレーザーのアイコンをクリックして、レーザーを選択します 。
- をクリックして、“ スキャン ” コンピューターの画面に焦点を当てたワームを視覚化するアイコンを通してレーザー強度を調整、ソフトウェア、およびにもう一度クリック “ スキャン ” アイコンをクリックして、スキャンを停止する “ キャプチャ ” アイコンをクリックして、イメージをキャプチャを “ 保存 ” アイコン 。
- は、適切なファイル名で画像を保存、RNAi クローン名、緊張の名前と日付
。 注: 画像は、単一および複数のセクションとして得ることができる (例えば、10 – z 軸に沿って 15 セクション)。断面には、3次元可視化することができます。投影像を取得し、(顕微鏡) に応じて必要な場合、個別に保存します。最適な解像度は、低利得とレーザー設定を使用して、ピンホールをあまりにも多く、オープンしていない画像ごといくつか平均を追加 (を参照してください参照 23 , 24 共焦点イメージングの一般的な議論のため)。(できればそのまま使用画像) を必要な場合は、画像処理ソフトでの変更許可に飽和レベル以下の明るさで画像を取得する注意してください 。
- ダブルの画像を取得または複数のレーザーのアイコンをクリックして同じ方法でラベル付けされた運河 (例えば 緑、赤と青) を乗算が写り (共局在の研究重要) チャンネル間を避けるためにシーケンシャル スキャンを使用します
。 注: 1 つは (これも対応する結果の増減写真漂白) 順次スキャンに必要な時間を考慮し、スキャナーの設定を変更する必要があります。30 分以上運河形態に非特異的効果を避けるために最大 1 つのスライドから動物をスキャンしません。長いスキャンが必要な場合は、新しいスライドをマウントします 。
- 取得対応する微分干渉光学系 (DIC)/ノマルスキー画像、特に場合は、定量化運河ワームに関連して長さと内腔の直径 ’ s 体の長さと直径です。クリックしてオーバーレイ蛍光とノマルスキー画像 “ オーバーレイ ” ランドマークを示すアイコン ( 図 1 および 図 4 a – D).
- 定量化, ImageJ ソフトウェア 25 ( 図 5) で関心のラベル付きコンポーネントの蛍光強度を測定します 。
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Representative Results
このプロトコルでは、単細胞の tubulogenesis と単一セルの細胞内腔の形態を視覚的に分子解析線虫排泄運河を使用する方法について説明します。成人中期胚発生の時から内線中に排泄運河の 4 つの基底、小管とエンドソーム内システム、ユニークなモデルを提供すると共に頂/内腔の膜を拡大し続けるde novoの生体内解析の偏光膜器官 (図 1)。特定の蛍光融合タンパク質 (プロトコル セクション 1 で説明) を表現することで目視できる細胞膜などの細胞レベル下のコンポーネント、細胞質、毛細小胞とエンドソームと彼らによって互いから区別することができます。ダブルまたはトリプル単一遺伝子組換え動物 (図 2) でラベル付けします。アピカル膜の機能遺伝子を識別するために対象となる RNAi スクリーニングを実行する方法を示す関連付けられている頂端膜分子 (ERM-1) を過剰発現によって生成された一意の排泄管表現型 (図 3 a-B) を使用し、腔器官;これは、(プロトコル セクション 2 で説明) このモデルの偏光膜生合成の分子的解析の一例として提供しています。この ERM 1 + [+] 運河の表現型を使用して蛍光顕微鏡 (プロトコル セクション 3 で説明します) の解剖によって強化 (図 3E– F) とスコア抑制 (図 3– D) 視覚的に評価する方法を示します.ERM 1 レベルの変調による運河の表現型 (プロトコル セクション 4 で説明)、共焦点顕微鏡 (図 4) によって細胞内レベルでの不具合を解決する方法と簡単な運河表現型 (運河の長さと嚢胞を定量化する方法を表示するサービスを提供します。サイズ) と管腔膜器官の欠陥 (図 5)。
図 1: C. の elegans排泄運河と運河の細胞レベル下の構造の形態形成
(A)胚幼虫の開発中に排泄運河拡張機能 (青線) のスケマティック表現。排泄のセル (非表示) 胚のコンマ段階で後部咽頭電球の左側頬骨横に最終的な場所に達する。胚の伸長とそれはまず横方向に向かって、左側と右側の 2 本の腕を拡張します。その後、各アームの前部と後部の枝に分割を実行します。これらの前部と後部の枝を拡張さらに 4 つの幼虫の段階で動物の伸び、全体最初に追いついて L2 段階で動物の成長し、成人期まで、さらなる成長を伴います。De novo偏光膜器官が成人期までこの延長をサポートしています。(B)大人の動物で前方運河枝に達する鼻の先端と後枝尾 (青い線)。排泄の細胞体 (青) 後部咽頭電球付近に表示されます。偏光膜ドメインは、成人期に維持されます。(C)は、運河の腕のセクションのビューを拡大しました。左: 運河ショーの 3D ビュー: 基底膜 (黒)、細胞質 (青) (緑) 内腔の膜と内腔 (白)。右: 運河と膜の内面: 基底膜 (黒)、細胞質 (青)、エンドソーム (黄色い楕円)、毛細小胞 (白球、それぞれ他、内腔への接続や分離に接続されている単一の小胞)、頂端膜 (緑)ルーメン (白)。(D)共焦点/DIC オーバーレイ顕微鏡胚の排泄のセルとでラベル付け、幼虫の排泄管の内腔細胞質 GFP とそれぞれ。左の画像: 頂 ERM-1::GFP erm 1プロモーターを表現で可視化した運河ルーメンと、1.5 倍の胚の排泄セル (緑の矢印)。右の画像: 運河 L3 幼虫、細胞質vha 1 pで可視化した枝 (緑の矢印) の 4 つの排泄:: GFP。スケール バー = 20 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 二重蛍光融合タンパク質ラベリングによる野生型の排泄管の腕で細胞レベル下のコンポーネントを可視化
(A)は、頂側膜と細胞質を区別します。Sulp 5プロモーター GFP 発現を可視化する運河の細胞質 (緑、上)。独自のプロモーター発現 ERM 1::mCherry 視覚化頂端膜 (赤、中間);これらの画像 (下) を結合して細胞質とそうでなければ区別がつかないでしょう高倍率でも単一ラベル頂端膜を区別します。スケール バー 5 μ m を =。(B)は、内腔にエンドソーム小胞の空間的関係を決定します。頂端膜準 GFP 融合タンパク質 (擬似赤、トップにカラー); ルーメンの可視化mCherry::RAB-7 (擬似色の青、中間に); を表現することによってエンドソーム小胞の可視化これらの画像 (下) を結合してエンドソーム小胞内腔への相対的な空間位置を示しています。スケール バー 5 μ m を =。(C と D)管管の形状と異なる倍率で細胞レベル下の運河コンポーネントを解決します。L1 幼虫の細胞質sulp 5プロモーターと毛細小胞の細胞質下アクアポリン 8プロモーター下の水チャネル アクアポリン 8::mCherry を表現することによって gfp でラベル付けします。(C)低倍率で画像 (下肢が毛細小胞と運河の成長に必要な他のコンポーネントの豊富な貯水池) ステージ固有の下肢に対応する「ビーズ-に-は-文字列」パターンを解決するが行う細胞のアクアポリン 8 点を解決できません。(D)高倍率で画像は毛細小胞に対応する管細胞のアクアポリン 8 点を解決します。縮尺記号: C で 20 μ m と D で 5 μ mすべてのパネルは 10-15 のセクションの共焦点の予測を表示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: エンハンサーとサプレッサーの得点嚢胞性の管の表現型 (解剖顕微鏡による ERM-1[++]) の s
(A) ERM 1 + [+];rol-6(su1006)排泄運河にvha 1プロモーター gfp によって視覚化されます。外陰部まで延長後部運河または中央の動物の体 (矢; 1/2 拡張機能として考慮される) 低倍率 (1.5 倍目標と低ズーム) で。(B)高倍率で署名 ERM 1 + [+] 小嚢胞圧着運河解決できる、後部運河 (片腕小さな矢印によって示されます) の先端で外陰部や若干の外を拡張する (外陰部が大きな矢印で示される運河パネル D の内腔となりうる野生型の比較のため)。(C)抑制、低倍率: RNAi の細長いと細い運河扱われる ERM 1 + [+] 動物。(D)高倍率で後部運河見ることができる尾 (小さな矢印; パネル B に示すように、親動物の比較) にほぼ完全に拡張するには大きな矢印は、外陰部の位置を示します。(E)促進: RNAi の大きな嚢胞をさらに短くされた運河扱われる ERM 1 + [+] 動物;低倍率、ズームなし。(F)高倍率で後部運河拡張未満 1/2 (小さな矢印) として決定したり外陰部 (大きな矢印で示されます) と (表示されている親動物のより広い動物の幅の 1/3 を超えると嚢胞サイズまで拡張されていません。B)。スケール バー = 400 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 排泄管の形態と共焦点顕微鏡による変異/RNAi 動物の細胞レベル下の運河コンポーネントの視覚的な分析
(A – D)嚢胞性の管の表現型 (共焦点/DIC オーバーレイ顕微鏡写真が表示されます) から、液胞を区別します。(A) sulp 5プロモーター (青のラベル、パネル B に示すように緑頂端膜から区別する擬似塗装) gfp による野生型の管の細胞質を視覚化します。(B)野生型管の管腔膜は ERM-1::GFP; を表現することにより可視化します。ルーメンがこの拡大率で表示されていない単一ラベル分類の膜から細胞質を区別できないことに注意してください。(C) RNAi による排泄管表現型: 細胞質ラベリング ブイヨン嚢胞から細胞質の空胞を区別できません。(D) RNAi による排泄管表現型: 識別 (図 4I 細胞質空胞の比較) (細胞質) の液胞ではなく、(内腔) 嚢胞腔内の流体の蓄積を検出し頂 ERM 1::GFP ラベルします。スケール バー A – D A. (E – J)分析と利得の-機能喪失に及ぼす細胞内運河コンポーネント (単一運河腕の共焦点画像が表示されます) に示すように = 40 μ m。(E ・ G)Erm 1細管の細胞レベル下のローカリゼーションの RNAi の効果。(E)野生型管細胞質;GFP の除外を示すルーメンに注意してください。(F)野生型細胞質アクアポリン 8::GFP 涙点、毛細小胞に対応します。(G)細胞質とerm-1(RNAi)動物におけるアクアポリン 8::GFP 涙点の基底の変位。(H)不連続ルーメンとerm-1(mildRNAi)動物のルーメン先端病理学 (カーリングと内腔の中心の損失) の詳細 (参照3 RNAi 強度を調整するため)。その運河の細胞質を越える小さな嚢胞によってここに示される、内腔のヒントに注意してください。(I)細胞質空胞で運河拡張子を付けず排泄管体で強く影響をerm-1(RNAi)動物3(いくつかの液胞の周りのいくつかの小さな斑点) を除くルーメンと法 5::GFP は募集されていないことに注意してください。過剰行為 5::GFP の ERM-1 (注法 5::GFP および重複の AQP 8::mCherry 群生嚢胞腔の周りの太いベルト) を過剰発現トリプル トランスジェニック動物のルーメンにアクアポリン 8::mCherry (J)募集。スケール バー E-J、e. に示すように 5 μ m =この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 解離性と共焦点顕微鏡による運河欠陥の定量化の例
野生型 (上部パネル) 及び変異体嚢胞 (下のパネル) の模式図(A)運河の長さと嚢胞のサイズの定量化のための排泄の運河。後部運河の長さは 0、1/4、1/2、3/4、および 1 として定量化されます。運河の長さ '0' は拡張子なし、'1' は、フルレングス拡張を示します。嚢胞のサイズとして量を示される < 1/3 (小) と > 体直径の 1/3 (大)。(B)コントロールと ERM-1 [+ +](RNAi)動物解剖顕微鏡蛍光によって総管形態の定量化。モック(RNAi) ERM 1 + [+] 動物の後部運河長さは 1/2 95% 動物 (参照画像、図 3 a– B) の拡張です。サプレッサー ERM-1 [+ +](RNAi)動物の後部運河の長さは 80-90% の動物 (参照イメージ、図 3は、– D) でほぼ完全に拡張されます。エンハンサー ERM-1 [+ +](RNAi)動物の約 60-70% 運河がある大きな嚢胞と長さが短い (< 1/2) (参照イメージ図 3E– F)。平均 ± SD を提示されたデータ (n > 3)。(C)共焦点画像から ImageJ で頂/内腔側の運河の骨格の蛍光強度の定量化。運河の頂端膜法 5::GFP でラベル付け、野生型運河腕が、ERM 1 + [+] 運河、左腕を右に表示されます。パネルを左: 野生型膜スリーブ法 5::GFP の強度は約 50 (グレーの値/膜; 黒と赤の矢印によって示されます)、プロットを画像の下に示します。パネルを右: ERM - 1 + [+] 法 5::GFP の強度は 100 を超える (背側膜のグレー値が約 110 (黒い矢印) と腹側の膜は約 140 (赤矢印))、プロット イメージの下に表示されます。スケール バー = 5 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 表 1: マーカーの例、C. の elegans 排泄管膜システム | ||||
| タンパク質名 | サブ | |||
| 表 2: の例C. の elegans 排泄管特異的発現プロモーター | ||
| プロモーター | 式ステージ | |
| erm 1 | コンマ期胚 | |
| sulp 5 | 3 倍の胚 | |
| vha 1 | 2 倍の胚 | |
| vha 5 | 2 倍の胚 | |
| アクアポリン 8 | 2 倍の胚 | |
| glt 3 | 後期胚 | |
| 1例は、表 3 に示されているリソースから選択されます。 | ||
| 表 3: リソース | |||||
| C. の elegans 排泄管特異的分子、ラベリング試薬/系統および抗体を識別するリソース | |||||
| 1. 利用可能な試薬および系統の線虫の遺伝学センター (CGC)43 | |||||
| 2. Wormbase44排泄管特異的分子、系統と抗体について | |||||
| 3. 排泄管特異的分子に関する情報: 参照6参照 | |||||
| 4. Transgeneome ウェブサイト45並進 GFP 融合コンストラクト | |||||
| 5. C.elegans 式パターン46転写 GFP 融合コンストラクト | |||||
| 6. ナショナルバイオ リソース プロジェクト (NBRP)::C.elegans47 線虫変異体とプロモーターに関する情報 | |||||
| 7. Fluorophores: 参照48、49を参照してください。 | |||||
| 対象となる RNAi ライブラリの分子を組み立てるための web ベースのリソース | |||||
| 1. GeneMANIA50 | |||||
| 2. AceView51 | |||||
| 3. アイホップ52 | |||||
| 4. Wormbase44 | |||||
| 5. 酵母ゲノム データベース53 | |||||
| 6. Flybase54 | |||||
| 7. マウスのゲノム データベースの55 | |||||
| 8. 人間のゲノム データベース56 | |||||
| 9. 爆発57 |
| 表 4: 単純な表現型スコアリング シートの例 | |||||||
| RNAi ライブラリ | ひずみ | 一般的な表現型 (合計の %) | 運河の表現型 | ||||
| 運河の長さ < 1/2 (%l4) | 運河の長さ > 1/2 (%l4) | 他の運河の表現型 | 動物のカウントの合計数 | ||||
| プレートなし | よく数 | ||||||
| I-1 | A1 | ERM 1 + [+];vha 1 p:: GFP | Clr (30) | 80 | 20 | 100 | |
| X-5 | ビタミン B12 | 同じ | どれも | 30 | 70 | 100 | |
| III 10 | C5 | 同じ | Unc (54) | 70 | 30 | 大きな嚢胞 | 100 |
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Discussion
線虫の遺伝的多様性、透明性、シンプルなボディ計画、不変の細胞系譜が形態形成の解析のための優れたモデルを作る。このプロトコル記述する標準的な遺伝的操作とイメージングを組み合わせる方法を 2 ミクロンの活用研究薄い偏光膜と単一細胞管の内腔の細胞内器官を検討する線虫排泄運河。
ラベリング
ライブ解析 (ここを参照)、許可の蛍光融合蛋白質の表現によって、抗体または化学染色 (見なさい腸 tubulogenesis 抗体の汚損のための紙を伴うc. の elegansの排泄管がラベル付けできます3). 2 つ以上の異なる蛍光物質、またはこれらの組み合わせの式別ラベリング技術では、これらの薄い尿細管 (図 2) の高解像度視覚的郭清。運河に運河の特異的プロモーター監督蛍光融合タンパク質は排泄管のそれらの間のいくつかの理由の分類のための最初の選択: (1) 低発現レベルの多くの運河蛋白質と (2) 運河の微細構造は簡単ですが興味の蛋白質が表すことも運河の外の汚損によって圧倒されます。運河の外因性タンパク質に敏感であるし、不明確な表現型 (例えば拡張機能の欠陥と嚢胞の、またはも致死) を簡単に開発、その一方で、そのような蛋白質が厳密に表現されます。これはトランスジェニック動物を生成するさまざまな方法を選択するとき、決定に重量を量るべきであります。原則として、transgenes できますとして導入される染色体外配列 (例えば、生殖変換、ここで説明のための生殖腺にプラスミド DNA の直接注入によって)、通常 (頻繁に高高コピー数の配列を生成します。式)、または低いまたはシングル コピー数 (例えばMos1 を介した単一コピー挿入 [MosSCI]27もしくは砲撃26 ) で通常のゲノムに統合。Extrachromsomal 配列を (ただし、高コピー数でまだ) の 2 番目のステップでゲノムに統合もできます18。その一方で、低濃度 (例えば1-2 の ng/μ L の DNA マーカー DNA の濃度が高く) 生殖細胞に注入する、低 (単一) コピー番号配列は簡単に生成された28をすることができます。このシナリオには、レベルを見つけるベスト式ラベルの運河、低すぎるも高すぎる (毒性) 役立つことがあります、DNA の濃度を変えることができる、利点があります。注入された DNA 濃度と表現レベルの関係 (例えばプロモーター)、複数の要因に依存しています、したがって経験的決定する必要があります。また、興味の遺伝子クラスター定期的に散在している短い回文を繰り返す (CRISPR) 基づくラベリング手順29,30直接生殖細胞の蛍光を標識できます。ただし、このアプローチは、最も生理ゲノム コンテキストに蛍光体を配置、これは常に必要あるいは望ましい (例えば蛋白質は非常に低いレベルで表現した場合) ではありません。、ただし、ことがあります最高のオプションでは、例えば興味の遺伝子が非常に大きい場合。
運河の可視化は、fluorophore によって運河細胞質を強調する運河に転写構造を演出で実現できます。対照的に、運河の細胞レベル下のコンポーネントをラベル付けフルレングスの遺伝子が遺伝子をエンコーディング fluorophore のフレームで接続されている医療の融合が必要です。(遺伝子のプロモーターではなく) 式運河の特異的プロモーターを使用する場合その選択する必要があります基づいているプロモーターの強度と、発達の分析のためその表現の時間。多くの排泄管の特定の遺伝子は、運河の浸透機能がクリティカルである幼虫のステージの前に表現しません。あまりにそのアクティブな拡張機能相の解析 (erm 1とプロ-1が早期発現遺伝子)10,13。テーブル 1と2、それぞれ、排泄管遠藤 - および血しょう膜のマーカーおよび運河特定プロモーターは具体例を挙げて、表 3に追加管特異的分子を見つけるための資源。これらのリソースは、線虫の遺伝学センターを通じて可能性がありますすでに作られた適切な蛍光融合タンパク質を見つけるためにも使用できます (シージーシー; また表 1を参照してください)。このようなタンパク質の融合の表現のためのプラスミドを構築する 1 つは様々 なクローン作成の方法は、それぞれ固有の長所と短所を使用できる (他の場所で説明した14)。基づく従来の制限酵素が含まれますここで説明したアプローチをクローニング、「PCR ステッチ"法14 によるマルチサイト ゲートウェイ システム31、ギブソン アセンブリ32、またはレポーター遺伝子構造を使用してモジュラー クローニング ,33。これらの異なるアプローチは、生殖細胞に導入の選択方法および/またはその他の固有のニーズ (たとえば、システムを容易にシャッフルするプロモーターとラベリングのアプローチに大きな規模の Cdna の汎用性の高いゲートウェイ) に合わせることができます。.注意は興味の蛋白質の機能を考慮した蛍光 (タンパク質の C 末端と N-リンク) の正しい挿入部位を選択する必要があります。
遺伝子機能との干渉
線虫の遺伝子機能を混乱させる多くの可能な方法のひとつとして、このプロトコルは、内腔の膜成分を過剰発現による嚢胞性の管腔表現の変更対象となる RNAi 相互作用画面について説明します。この特定のケースで頂/内腔の膜を過剰発現関連するマーカー ERM 1 直接お問い合わせを目的のターゲットに導くという利点があります: 頂/内腔の細胞膜生合成の解析。過剰発現によって生成された関数のゲイン表現型も機能喪失 (RNAi) 操作画面と組み合わせると前述のようにいくつかの利点を提供します (34損失と利得-の機能解析についての議論を見ると、遺伝的画面のデザイン)。また、ERM 1 自体はよく調査「内腔の形態形成」と頂端膜アイデンティティ分子12。したがって、この場合、(公平ではなく) 対象となる画面はこのプロセスに付随してさらに特徴の ERM-1 の特定の機能、内腔の形態形成の直接形成する可能性があります。しかし、公平な非対象画面を実施して野生型動物、f 遺伝子組換え動物のいずれかを開始、同様の方法でいるluorescently 排泄運河をラベルまたは任意の運河の変異体。一般の長所と短所 (例えば、突然変異誘発対) RNAi 機能喪失の表現型、および伝導の世代や線虫の遺伝子スクリーニングの異なる種類の議論のため、他の場所で説明します。34. RNAi は、しばしば致命的な tubulogenesis 遺伝子の解析のための特定の利点など穏やかな表現型の表現型のスペクトルを生成します。これは説明は、腸 tubulogenesis3に付属のペーパーで説明。利得と損失の機能突然変異体との交差など古典的な遺伝的手続きを生成する別のアプローチは詳細な一般的な遺伝方法文学20で説明。
顕微鏡と tubulogenesis の表現型の評価
視覚的に評価・ スコアリング (運河の長さ、内腔の直径) など単純な得点パラメーターを使用して顕微鏡を切り裂く前述のように、蛍光灯の下で明確に定義された運河の表現型変更を短時間で実現できます。動物対象または体系的な遺伝や RNAi スクリーニングのより大きな数を処理する場合でも。対照的に、緊張で新規運河の形態形成表現型の類似画面検索野生型である (その運河ラベリング遺伝子) を除いては、同様に実行、原則としてことができますより多くの時間のかかる (そのようなを行った、数ヶ月でゲノムワイドに画面)。このような画面 (ここでは示しません) 複数の管の違いの表現型は、識別し、スコアリングの異なるパラメーター、例えば、定性的な分類対応して開発する必要があります ( 9,11、参照スキーム 35,36,37,38さまざまな解剖顕微鏡によって運河の表現型を獲得)。すべての運河の表現型を解釈するときそれは嚢胞形成はこの薄肉の管状構造に多くの異なる侮辱の非特異的効果をすることができ、それはより少なく有益なターミナルの表現型ではしばしば注意して重要です。嚢胞のサイズと場所、その一方で、参考となる、例えば、嚢胞 (運河の拡張子の先頭) 運河の細胞に近い、運河の長さに沿って嚢胞または運河のヒントで嚢胞は、欠陥の根本的なメカニズムに手がかりを提供します。(ここでの定義は頂/内腔の膜に囲まれた内内腔の液体で満たされたスフェロイド) 管嚢胞は小胞から区別されなければならない (小さな細胞質膜結合流体充填回転楕円体) または空胞 (拡大された細胞質膜区切なさい流体充填回転楕円体)、すべて表面的に同一に見る (図 4 a– D) をすることがでく内腔の膜に囲まれていません。細胞質の空胞同様に生じる第二に、例えば毒性の取付ソリューション (アジ) を経由。大きな嚢胞と細胞質の空胞の両方が動物のサイズほぼ取るし、さらに「クリア (Clr)」古典から区別される必要がある運河の体腔内の流体の蓄積によって引き起こされる表現型。最後に、管長が嚢胞性の管での危険にさらされてほとんど常に第二したがって真の運河拡張欠陥必要があります嚢胞自由設定で示されます。
自分の小さな直径にもかかわらず排泄の細胞レベル下のコンポーネント、運河など、基底膜、細胞内と根尖部小管小胞、細胞内オルガネラ、細胞骨格成分とエンドソームで目視できる高い倍率、例えば、共焦点顕微鏡 (図 2、図 4)。共焦点イメージングによる GFP 陽性管細胞質だけで (図 2 a、図 4E) 非蛍光性線経由運河細胞質から内腔を区別するために十分です。マーカーの id は、決定的な割り当ての電顕観察法39が必要になりますが (また著しく異なるサイズ)、エンドソーム小胞から小管の解決に貢献します。ダブル、トリプルがラベル付け興味の分子と互いに (図 2) に細胞レベル下のコンポーネントの関係の局在を決定できます。単一ラベル内腔運河膜細胞質または基底膜と同じ二重ライン生産しますが、ダブルで区別することができますやラベリングをトリプルします。共焦点の分析のため適切に取り付けるには、重要な運河の構造、浸透圧変化に対する感度とその最も頻繁に嚢胞性の表現型の脆弱性の脆弱性を与えられました。嚢胞は、浸透圧の変更や物理的な圧力によって簡単にバースト、アジ化ナトリウムなどの膜の毒素に敏感、(細胞質内空胞が生じるも) 固定に使用されるいくつかの麻酔薬に敏感であるも。私たちの手で M9 バッファーで 5% リドカイン最も排泄管の試金のための最高を作品します。イメージング手順とすべての処理は、前述の穏やかな、する必要があります。(例えば、嚢胞や空胞) の表現型を模した人工物を避けるためには、装着後すぐに画像を取得することをお勧めします。できない場合嚢胞画像は他の表現型をイメージングする前に最初に、取得する必要があります。このプロトコルでは、対照的に、光毒性を低減し、変化の動的解析に最適な顕微鏡をディスク共焦点顕微鏡を回転と比較して、優れた confocality を提供する標準的な顕微鏡を説明します時間の経過とともに細胞レベル下のコンポーネント。細胞内動態に関する質問は、光技術を使用してまたは分類変更色40写真切替 fluorophores が付いている融合蛋白質で対処できます。透過型電子顕微鏡 (TEM、最高の構造がない分子の解像度を提供する) を追加することによって解像度の範囲をさらに増加することができます最後に、超解像顕微鏡法 (ナノメートルの範囲の分子分解能を提供する);または、(提供する) の電顕観察法39,41。3 D 断層撮影法電子顕微鏡の連続切片と組み合わせることができます、排泄運河9,10の毛細細胞膜界面の解析の場合に特に便利です。顕微鏡のこれらの種類とこれらさまざまなイメージング手法の組み合わせで改善された技術は開発されていきます。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
我々 は感謝 m. ビュークナー (カンザス大学、カンザス、米国)、k. Nehrke (ロチェスター大学医療センター、ロチェスター、ニューヨーク、米国)、および健康の国民の協会、事務所の研究基盤出資線虫遺伝学センタープログラム (P40 OD010440)。この作品は、英領バージン諸島に SAA 223809、MGH は 224570 NIH の GM078653 の助成金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cloning | |||
| Plasmid pPD95.75 | Addgene | Cat. No. 37464 | |
| PCR Kit | Qiagen | Cat. No. 27106 | |
| Ligation kit | New England Biolabs | Cat. No. E2611L | |
| DNA marker | Thermo Scientific | Cat. No. SM1331 | |
| Agarose DNA grade | Fisher Scientific | Cat. No. BP164-100 | |
| Competent cells | New England Biolabs | Cat. No. C2987H | |
| Tris | Fisher Scientific | Cat. No. BP154-1 | |
| EDTA | Sigma | Cat. No. ED-1KG | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | Cat. No. A38S-500 | |
| Ethidium bromide | Fisher Scientific | Cat. No. BP1302-10 | |
| Equipments | |||
| PCR machine | MJ Research | Cat. No. PTG-200 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Cat. No. 5415C | |
| Water Bath | Precision Scientific | Cat. No. 666A3 | |
| Gel running instrument | Fisher Scientific | Cat. No. 09-528-165 | |
| Gel running power supply | Fisher Scientific | Cat. No. 45-000-465 | |
| Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | Cat. No. 1708195EDU | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | Cat. No. ND1000 | |
| C. elegans related1 | 1see reference19 for standard C. elegans culture and maintenance procedures. | ||
| LB Medium and plates2 | 2see reference19 for protocols. | ||
| Tryptone | Acros Organics | Cat. no. 611845000 | |
| Yeast Extract | BD Biosciences | Cat. no. 212750 | |
| NaCl | Sigma | Cat. no. S7653 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | Cat. no. 214040 | |
| Ampicillin | Sigma | Cat. no. A0116 | |
| Tetracycline | Fisher Scientific | Cat. no. BP912 | |
| M9 Medium2 | 2see reference19 for protocols. | ||
| NaCl | Sigma | Cat. no. S7653 | |
| KH2PO4 | Sigma | Cat. no. P0662 | |
| Na2HPO4 | Sigma | Cat. no. S7907 | |
| MgSO4 | Sigma | Cat. no. M2773 | |
| NGM plates 2 | 2see reference19 for protocols. | ||
| NaCl | Sigma | Cat. no. S7653 | |
| Peptone | BD Biosciences | Cat. no. 211677 | |
| Tryptone | Acros Organics | Cat. no. 611845000 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | Cat. no. 214040 | |
| MgSO4 | Sigma | Cat. no. M2773 | |
| CaCl2 | Sigma | Cat. no. C3881 | |
| Cholesterol | Sigma | Cat. no. C8667 | |
| K2HPO4 | Sigma | Cat. no. P3786 | |
| KH2PO4 | Sigma | Cat. no. P0662 | |
| RNAi plates3 | 3see reference21 for protocols. | ||
| NaCl | Sigma | Cat. no. S7653 | |
| Peptone | BD Biosciences | Cat. no. 211677 | |
| Tryptone | Acros Organics | Cat. no. 611845000 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | Cat. no. 214040 | |
| MgSO4 | Sigma | Cat. no. M2773 | |
| CaCl2 | Sigma | Cat. no. C3881 | |
| Cholesterol | Sigma | Cat. no. C8667 | |
| K2HPO4 | Sigma | Cat. no. P3786 | |
| KH2PO4 | Sigma | Cat. no. P0662 | |
| IPTG | US Biological | Cat. no. I8500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | Cat. no. BP2648 | |
| NaOH | Fisher Scientific | Cat. no. SS266-1 | |
| Sodium hypochlorite | Fisher Scientific | Cat. no. 50371500 | |
| Bacteria | |||
| OP50 bacteria | CGC | ||
| HT115 bacteria | CGC | ||
| Genome-wide RNAi libraries | |||
| Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref21,58,59) | Source BioScience | ||
| C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref60) | Source BioScience | ||
| Imaging related | |||
| Lidocaine | MP Biomedicals,LLG | Cat. no. 193917 | |
| Materials | |||
| Vacuum Grease Silicone | Beckman | Cat. no. 335148 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | Cat. no. 4448 | |
| Tissue culture plate, 6 well | Corning Inc. | Cat. no. 08-772-33 | |
| Equipment | |||
| SMZ-U dissecting microscope (Nikon) | |||
| SZX12 dissecting microscope (Olympus), equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions). | |||
| TCS SL Laser-scanning confocal microscope (Leica Microsystem) | |||
| C2 laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope (Nikon) |
References
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