Summary
軸索興奮性のテクニックは、病態と不可逆的な変性イベントの前に生体の変化を調べるための強力なツールを提供します。この原稿は、麻酔下ラットの尺骨神経のこれらのテクニックの使用方法を示します。
Abstract
電気生理学末梢神経機能のin vivoの客観的な評価ができます。潜時や振幅検出慢性軸索損失と脱髄、それぞれなど伝統的な神経伝導を測定します。イオン チャンネル、ポンプ、急性機能に関連し、退化的なイベントの前にことがあります交換のアクティビティに関する情報を提供することによってこれらの措置により軸索興奮性技術"しきい値を追跡"を展開します。そのため、神経疾患の動物モデルにおける軸索興奮性の使用新しい治療的介入を評価するために有用な生体内測定があります。ここでラットの尺骨神経で運動軸索興奮性技術の複数の措置の実験装置について述べる。
動物はイソフルラン麻酔、麻酔の定数と十分な深さを確保するため慎重に監視します。体温、呼吸、心拍数、血液中の酸素の飽和を継続的に監視します。軸索興奮性の研究は、尺骨神経と前肢足の研究筋から記録の経皮的刺激を使用して実行されます。正しい電極配置、刺激強度の増加とともに振幅の増加明確な複合筋活動電位が記録されます。自動化されたプログラムを利用する一連の次の順序で 5 特定の興奮性対策を生成する電気パルスを提供する: 刺激応答性状、強度期間時定数、しきい値 electrotonus、電流しきい値関係と回復のサイクル。
ここで表示されるデータは、これらの措置を繰り返し同じ日に評価すると左と右尺骨神経との間の類似性を示すを示します。この設定にこれらの手法の制限は、投与量と麻酔時間の効果です。慎重に監視し、これらの変数の記録は、解析時に考慮のため行わなければなりません。
Introduction
電気生理学的技術の使用は神経疾患における末梢神経機能の生体内で調査のために不可欠なツールです。従来神経伝導メソッドは、潜時や振幅運動の活動電位を記録する激刺激を利用します。これらの技術は、繊維の実施数と最速の線維の伝導速度したがって有用な情報を提供します。貴重な相補的なツールは、軸索興奮性のテストのことです。この手法は、イオン チャネル、エネルギー依存性ポンプ、イオン交換プロセス、膜電位の活性などの末梢神経の生物物理学的プロパティを直接評価する洗練された電気生理学的刺激のパターンを使用してください。1。
病態生理学的プロセスと様々 な脳神経疾患の治療介入の効果を検討する臨床場面における軸索興奮性テストを利用して一般的。重要なは、軸索興奮性対策2静脈内の免疫グロブリン (IVIg) 療法など末梢神経機能に影響を与える治療に敏感である化学療法3カルシニューリン阻害剤 (CNI) 治療4. 臨床研究がこれらの研究は、重要な洞察を提供している、初期の病の特徴と治療の新しい選択肢5の調査を排除する頻繁。したがって、神経疾患の動物モデルでこれらのメソッドの使用は最近トラクション6,7,8,9を得ています。確かに、これらのメソッドは、トランスレーショナル ・ リサーチを推進したがって、これらの疾患に関連付けられている特定の神経の興奮性の変化を理解する機会を提供します。
ここで説明する手順は、そのままのラットの尺骨神経にレコードの軸索興奮性対策にシンプルで信頼性の高い方法です。
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Protocol
ここで説明したすべての実験手順は動物愛護及びシドニー ニューサウス ウェールズ大学の倫理委員会に適合し、国民の健康と動物実験のためのオーストラリアの規則の医学研究評議会 (NHMRC) に従い行った。
1. 実験のセットアップ
注: この手順では 12 週齢、女性のロング ・ ラットが使用されました。
- 分 O2流量あたり 4% イソフルランと 1 L を用いた誘導室でラットを麻酔します。立ち直り反射テストにより十分な麻酔を確認し、誘導室から動物を削除する前にその不在を確認します。様々 な麻酔薬が神経興奮性10差動効果を持っていることに注意してください。
- 安全に鼻の円錐形のアタッチメントで動物の鼻を配置および分 O2流量当たり 2.5% イソフルランと 1 L の維持投与量を提供します。
- 動物の足の指をつまんで、目に優しく触れによってペダル撤退および角膜反射の両方をチェックするには、適切な麻酔を確認します。
注: 麻酔、乾燥を防ぐための目に獣医軟膏のアプリケーションは推奨されるが、必須ではありません、通常動物あたり 30 分を要します。 - フィードバック制御を用いた暖房のマットの直腸体温計プローブ使用で 37 ° C でラットの体温を維持します。40 の ° C より高い温度で発生する皮膚損傷を防ぐために暖房のマットと統合的な温度センサーを設定します。
注: お勧め (心拍数、酸素飽和度、体温、呼吸数) の監視と記録の生理対策に動物の生理学的モニタリング システムを使ってすべての 10 秒。周辺の温度はコア温度11 (図 1) のそれよりも寒いことがあるので、最適なレコーディング手順は下肢の温度のローカル測定を含める必要があります。 - 防腐剤の手袋を着用し、常にプロシージャ全体で病原体フリーの環境を維持するために 70% エタノールで洗浄されている楽器を使用します。
2 電気生理学的設定
- この手順で低インピー ダンス プラチナ脳波 (EEG) 針電極を使用します。
- 研究筋と 4 桁の背側面を介して参照電極を記録電極 (図 1; で示された紫色) を挿入することによって記録針電極を準備 (図 1で示されている;オレンジ) 複合筋活動電位 (概念地図) を記録します。
- 刺激電極 (図 1; 緑で示されている) と前腕の優れた側面に皮膚を通して接地電極を配置します。筋肉組織を避けるために電極を挿入するときに注意します。
- 経皮的刺激的な針の電極を陰極 (図 1; のラベル青) を挿入することによって準備約 4 mm、肘への遠位肘トンネルします。挿入 (図 1; のラベル付き赤) 陽極腋窩領域の皮膚を通して近位約 1 cm。
図 1: ラットの前肢の針電極配置の図。陰極 (青) が約 4 mm 肘肘部管の遠位に挿入され、陽極 (赤色) を挿入腋窩領域の皮膚を通して近位約 1 cm。刺激電極を記録と前腕の優れた側面に皮膚を通して地面針電極 (緑) が挿入されます。研究筋と 4番目の桁の背側面を通して記録 (紫) と参照 (オレンジ) 針電極が挿入されます。温度プローブ (グレイ) は、母指球筋の優れた側面に配置されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
3. 軸索興奮性の手順
- 齧歯動物の運動神経による半自動 TRONDNF プロトコルを実行、コンピューター制御された軸索興奮性プログラムは一定の電流刺激装置とアンプにリンク (材料の表を参照してください)。50/60 Hz ノイズ除去を使用して余分な 50 Hz 電気的なノイズを削除します。
- 同時に CMAP 形態を可視化し、1 を適用することによって研究筋から CMAP を記録電極針で尺骨神経に ms 矩形波パルス。
- 最適な録音を達成するため、振幅が一定の最適な相性の応答曲線になるまで慎重に角度や陰極の位置を調整するには、(図 2 a.) を達成しました。最適な位置を決定すると、一度変え電極ホルダーに陰極を安定させます。
注: 自動的に使用されるソフトウェア、下記テスト刺激を提供し増加またはしきい値を達成するために必要な電流を減少します。
- 最適な録音を達成するため、振幅が一定の最適な相性の応答曲線になるまで慎重に角度や陰極の位置を調整するには、(図 2 a.) を達成しました。最適な位置を決定すると、一度変え電極ホルダーに陰極を安定させます。
- 1 の刺激強度を段階的に増加して刺激-反応曲線を記録 1 ms インパルス mA 最大応答が達成されるまで。
注: 図 2 b および 2 C の紫と緑の線はそれぞれ刺激強度と自動化されたシステムの増分増加を表します。追跡のしきい値のターゲットの振幅は刺激-反応曲線の急勾配法面の面積に対応する最大振幅の 40% に自動的に設定されます。「しきい値」に変更 (40% を引き出すために必要な刺激すなわち CMAP) による各種テスト刺激はの変数プロトコルの残りを得た。 - しきい値 electrotonus (TE) を含む複数の軸索興奮性パラメーターを記録電流しきい値 (私/V) 関係回復サイクル (RC) 参照に従って12。
注: コンピューター制御軸索興奮性プログラム評価閾値 (TE) を 100 ms の脱分極と過分極電流、サブスレッショルド電流制御しきい値の ± 40% と ± 20% で設定されています。後脱分極と過分極電流しきい値の変更は、自動的に偏光現在後現在偏光 100 ms と 12 ポイントの間に 14 の時点で記録されます。間接的しきい値 electrotonus 節間のコンダクタンスを評価、膜電位のマーカーです。私 V 関係が交互に +50 から強度 200 ms サブスレッショルド エアコン電流評価/-100% 10% ごとの増減制御しきい値の %。I/V の関係とは異なり、TE に電流が期間の長い、偏波の強度は 50 から変更徐々 に-100% % としきい値の変更は各強度 1 で評価は偏光の現在がなくなった後 ms。I/V の関係軸索1の整流特性への洞察力を提供します。対パルス パラダイム、初期の激刺激が適用されるこのパラメーター結節で発生するイベントの明確に定義された一連のテスト 200 さんに、2.5 ms から特定の間隔でテスト刺激のシリーズに続くと RC を評価します。激刺激軸索の領域。これらのイベントは、その後の応答を引き出すことが難しく、不応期と相対不応期1定量化している電位依存性の Na+チャネルの不活性化を含みます。これは節間と高速カリウム チャネル、superexcitability によって定量化による高められた興奮性の期間の充電が続きます。最後に、ゆっくり活性化カリウム チャネルは、subexcitability として定量化の減らされた興奮の後期を仲介します。
- 同時に CMAP 形態を可視化し、1 を適用することによって研究筋から CMAP を記録電極針で尺骨神経に ms 矩形波パルス。
図 2: 軸索興奮性テストから Raw データパネル A は、尺骨神経への刺激の増分増加後 abiphasic CMAP 応答曲線を示します。パネル B と C は、それぞれ刺激強度 (mA) と CMAP (mV) の振幅を表します。B と C の緑のコンポーネントは、刺激強度の自動増分減少と追跡のしきい値に必要な CMAP で関連付けられているシグモイド形減少を示しています。
4. ポスト電気生理学手続き
- それは胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻したまで別々 のケージにラットを転送します。動物は、無人と他の動物の会社で、それは完全に麻酔から回復するまでには、放置しないでください。ラットは完全に麻酔から回復、かつては、その元のケージに戻って転送します。
- 調査の完了時に、バルビツール酸塩 (例えば lethabarb) の動物、例えば致命的な腹腔内注入の痛みを伴わないラットを安楽死させます。
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Representative Results
ラットの尺骨神経の電気生理学的措置は、この議定書が得られました。図 3は、12 週齢雌長いエバンス ラットの左尺骨神経から記録担当者を示します。複合筋活動電位は、同時にアクティブになっている繊維を導電性の数に関連します。激ピーク応答 (mV) (図 3 a) は、(図 2 b) 応答の変化がないまで刺激を段階的に増加するときに達成ピーク応答を示します。
図 3 bは、電流電圧を表します (私/V) 長い期間 (200 ms) とその強度の電流によって生成される関係は、50 から 10% 単位で変更-100% しきい値の %。I/V 関係脱分極と過分極電流に対する電流の違いを調べることによって内側と外側の整流を評価します。左下のセクションは、内向き整流収容過分極し、内向き整流性コンダクタンス1活性化を反映しています。右上の象限は、高速と低速の K+チャネル活性化と脱分極現在まで利用可能な外へ向かう整流に反映されます。
節間のコンダクタンスは、長いサブスレッショルド脱分極と過分極電流に応答しきい値 electrotonus 波形 (図 3) を使用して調べることができます。過分極と TE を脱分極性しきい値変更特定の時間ポイント 10-20 ms、20-40 ms と 90-100 ms 間の平均として計算することができます変数があります。
ケガや治療上の介在のアプリケーションのための時間の経過とともに変更は、神経興奮性パラメーターに固有の変更を引き起こす可能性があります。これは病態生理的変化、早期疾患特性と神経疾患の動物モデルで治療効果に関する有用な生体内情報を提供可能性があります。
図 3: 代表的な軸索興奮性プロットします。(A) 刺激-反応曲線八田ピーク応答 (mV) を描いたします。(B) 電流-電圧 (私/V) +50 に至る 200 ms 偏光刺激によって生成される関係-100% しきい値電流 %。(しきい値 C) electrotonus 長期サブスレッショルド偏光現在 20%、40% が (上記の y 軸上の 0) 脱分極と (以下 y 軸の 0) 過分極電流によって誘発されるへの応答波形を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
N の左し、右前肢で行われた連続した軸索興奮性テスト 4 ラット (12 週齢) を =。左と右の両方の録音は、ペダルの逃避反射の損失の後 35 分以内完了しました。対非パラメトリック ウィルコクソン符号付き順位検定を用いて分析を行った。これらの分析は、左と右尺骨神経軸索興奮性変数のいずれかの間に有意差を認めなかった。標準的な神経伝導パラメーター、CMAP 振幅遅延 (図 4 a と B) と superexcitability、しきい値 electrotonus (話した) 過分極を含む神経興奮性変数の一貫性を示した90-100 (図 4 および D)。しかし、以前の研究10はイソフルラン麻酔下でパラメーターを時間の経過とともに大きな変化が発生する示されている (ディスカッションを参照してください)。
図 4: 録音を意味 (n = 4) (A) ピーク応答の待ち時間 (B) superexcitability (C) と (D) 過分のしきい値の electrotonus (90-100 ms) 左 (赤) と右 (青) 尺骨神経の両方で取得します。誤差範囲 (SEM) 平均値の標準誤差を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
記載された手順を示します、シンプルで信頼性の高い、低侵襲技術ができる生物物理物性評価および軸索の膜電位時間の短い期間でです。神経の露出を必要とする他のより侵襲的な技術と比較して軸索興奮性のテスト法誘導の生理状態を維持する体内の評価ができ最小限の組織損傷、興味の神経、繰り返し測定が可能します。
確実に一貫性のある結果が、対処する必要がありますいくつかの方法論的考察です。このような要因の一つは、濃度と麻酔薬の種類です。それは以前、イソフルランは過分極作動した循環ヌクレオチド ゲート チャネル10の効果実証されています。また、メデトミジン、ミダゾラム、ブトルファノールの注射麻酔薬の混合物は調べたし、も10時間以上神経の興奮性に及ぼす影響を実証します。メデトミジン/ミダゾラム/フェンタニル (MMF) は神経の興奮性にはほとんど影響を持っているが表示され、正常にされている神経に時間をかけてもその効果、多く神経興奮性研究7,13,14使用興奮は体系的に解明されていません。注記のうち、この麻酔薬はフェンタニルは厳格な輸入規制に規制物質として米国とオーストラリアで入手が困難。関係なく、選択した麻酔投与量と麻酔下に注意深く監視する必要解析において考慮のため。
考慮する別の要因は、電極の品質です。強くて長時間過分極・脱分極電流軸索興奮性の適用のための研究高品質電極が必要です。本研究では低インピー ダンス プラチナ脳波 (EEG) 針電極が使用されました。低インピー ダンス電極通常キロ オームの範囲内であり、プラチナの脳波電極従来作動する - 0.5 内低インピー ダンス電極との資格を 5 k ω の範囲。軸索興奮性プログラム電流出力を記録し、ターゲット out の電圧とインピー ダンスを計算して現在は、このプロトコルは15の典型的な長さは、30 分間安定それ既に確立されています。さらに、これらの電極は、最近マウス16で導入されているし、偏光効果14,15を受けないことがわかった。したがって、偏波が実験プロシージャの間に問題になりません。
興味の神経を公開プロトコルとは対照的は、これらの研究は、刺激的な電極のおおよその位置になりますそのままモデルを利用します。したがって、縦断研究に電極配置の正確な複製は難しいかもしれません。これにもかかわらず、異なる麻酔と以前の研究は脛骨と仙骨神経13に見られるように 3 別々 の研究で 30/34 尺骨神経興奮性パラメーターの良い再現性を実証しました。さらに、この研究では、右と左の概念地図の比較は一貫性 (図 4)、この限界を相殺するために十分な正確かつ適切な電極配置を示唆を示した。
CMAP 応答を取得中にいくつかの重要な手順があります。刺激針電極の適切な一貫した配置は、振幅の再現性のある測定に不可欠です。さらに、バック グラウンド ノイズを最小限に抑えるための針電極の適切な配置を確保するため不可欠です。したがって、同時に応答曲線に視覚化する刺激の針電極を配置することが一貫性のある配置を確認することが重要です。
神経疾患の動物モデルのこの低侵襲技術の使用は病態生理学的変化と早期の疾患特性を調査するための貴重なツールにあります。これらはバイオ マーカーとして機能し、手の機能の行動対策と連携して新しい治療的介入の検討を容易にする可能性があります。また、齧歯動物、これらのテクニックの検証は、新規化合物の薬物動態および薬力学的関係の調査を有効にできます。これがフェーズ 1 および 2 の臨床試験前に治療化合物のよりよい翻訳を有効にします。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
プロジェクトは、ルンドベック財団、ノボ ノルディスク財団、デンマークの医学研究評議会、Ludvig とサラ Elsass 財団、イテ ・神経研究財団とカイ Dahlboms 財団によって支えられました。R.A 国立保健医療研究評議会のオーストラリア (#1091006) の初期のキャリア ドクトラル交わりに支えられて
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QTracS Program | Digitimer Ltd. | Axonal excitability program | |
| AM-Systems 2200, Analog Stimulus Isolator, 2200V/50Hz | SDR Scientific | 850005 | Stimulator |
| High Performance AC Amplifier Model LP511 | Grass Technologies | Amplifier | |
| Humbug 50/60Hz Noise eliminator | Quest Scientific Instruments | 726310 | Noise eliminator |
| Low Impedance Platinum Monopolar Subdermal Needle Electrodes | Grass Technologies | F-E2-24 | Recording electrodes, 10 mm length, 30 gauge |
| Low Impedance Platinum Electroencephalography Needle Electrodes | Cephalon | 9013L0702 | Stimulating electrodes, 10 mm length, 30 gauge |
| Multifunction I/O Device Model USB-6341 | National Instruments | Multifunction input/output device | |
| Iron Base Plate IP | Narishige Scientific Instrument Laboratory | Used for holding stimulating needle electrode in place | |
| Rotating X-block X-4 | Narishige Scientific Instrument Laboratory | Used for holding stimulating needle electrode in place | |
| Magnetic Stand GJ-8 | Narishige Scientific Instrument Laboratory | Used for holding stimulating needle electrode in place | |
| Micromanipulator M-3333 | Narishige Scientific Instrument Laboratory | Used for holding stimulating needle electrode in place |
References
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