Summary
Techniques de l’excitabilité axonale fournissent un outil puissant pour étudier la physiopathologie et les changements biophysiques qui précèdent les événements dégénératives irréversibles. Ce manuscrit illustre l’utilisation de ces techniques sur le nerf cubital de rats anesthésiés.
Abstract
Électrophysiologie permet l’évaluation objective des nerfs périphériques fonction in vivo. Conduction nerveuse traditionnelle des mesures telles que l’amplitude et la latence détectent perte axonale chronique et la démyélinisation, respectivement. Techniques de l’excitabilité axonale « par seuil de suivi » étoffer ces mesures en fournissant des informations concernant l’activité des canaux ioniques, pompes et échangeurs se rapportant à la fonction aiguë et peuvent précéder les manifestations dégénératives. Par conséquent, l’utilisation de l’excitabilité axonale dans des modèles animaux de troubles neurologiques peut-être prévoir une mesure utile en vivo pour évaluer les nouvelles interventions thérapeutiques. Nous décrivons ici un montage expérimental pour plusieurs mesures techniques moteur excitabilité axonale dans le nerf cubital du rat.
Les animaux sont anesthésiés à l’isoflurane et soigneusement surveillés pour s’assurer une profondeur constante et adéquate de l’anesthésie. Température corporelle, rythme respiratoire, rythme cardiaque et la saturation d’oxygène dans le sang sont surveillés en permanence. Études d’excitabilité axonale sont effectuées en utilisant une stimulation percutanée du nerf ulnaire et enregistrement des muscles de la patte de la patte avant hypothénarien. Avec électrodes correct, un potentiel d’action musculaire clair composé qui augmente en amplitude avec l’intensité de la stimulation est enregistré. Un programme automatisé est ensuite utilisé pour offrir une série d’impulsions électriques qui génèrent 5 mesures d’excitabilité spécifiques dans l’ordre suivant : comportement de stimulus réponse, constante de temps de durée force, electrotonus seuil seuil courant la relation et le cycle de régénération.
Les données présentées ici indiquent que ces mesures sont répétables et voir la similitude entre les nerfs cubital droit et gauche sur le même jour. Une limitation de ces techniques dans ce paramètre est l’effet de la dose et l’heure sous anesthésie. Attention de surveillance et d’enregistrement de ces variables devraient être entrepris aux fins d’examen au moment de l’analyse.
Introduction
L’utilisation de techniques électrophysiologiques est un outil essentiel pour l’étude in vivo de la fonction de nerf périphérique dans les troubles neurologiques. Méthodes de conduction nerveuse classiques utilisent stimuli supramaximal enregistre la latence et l’amplitude des potentiels d’action moteur. Ces techniques fournissent donc des informations utiles sur le nombre des fibres et sur la vitesse de conduction des fibres plus rapide. Un outil complémentaire précieux est celle du test d’excitabilité axonale. Cette technique utilise des modèles de stimulation électrophysiologique sophistiqués pour évaluer indirectement les propriétés biophysiques des nerfs périphériques, tels que l’activité des canaux ioniques, de pompes à dépendant de l’énergie, de processus d’échange d’ions et de potentiel de membrane 1.
Test d’excitabilité axonale est couramment utilisé dans le contexte clinique pour étudier les processus physiopathologiques et les effets des interventions thérapeutiques sur divers troubles neurologiques. Ce qui est important, mesures d’excitabilité axonale sont sensibles aux interventions thérapeutiques qui affectent la fonction des nerfs périphériques tels que les immunoglobulines intraveineuses (IgIV) thérapie2, chimiothérapie3 et la calcineurine inhibiteur (CNI) 4. bien que ces études ont fourni des renseignements importants, les études cliniques empêchent souvent enquête de caractères juvénile de la maladie et de nouvelles options thérapeutiques5. Par conséquent, l’utilisation de ces méthodes dans des modèles animaux des troubles neurologiques a récemment obtenu de traction6,7,8,9. En effet, ces méthodes fournissent une occasion de comprendre les changements d’excitabilité nerveuse spécifiques associés à ces troubles, ainsi faire avancer la recherche translationnelle.
La procédure décrite ici est une méthode simple et fiable aux mesures d’excitabilité axonale record sur les nerfs cubital du rat intact.
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales décrites ici respectée l’éthique Comité de l’UNSW Sydney et animalier et ont été effectuées conformément à la santé nationale et du Medical Research Council (NHMRC) du règlement de l’Australie à l’expérimentation animale.
1. expérimental mis en place
NOTE : les rats Long-Evans âgés de 12 semaines, les femmes ont été utilisés dans cette procédure.
- Anesthésier le rat dans une chambre d’induction à l’aide de 4 % isoflurane et 1 L par min O2 débit. Confirmer l’anesthésie suffisante en vérifiant le réflexe de redressement et d’assurer son absence avant de retirer l’animal de la chambre de l’induction. Notez que plusieurs agents anesthésiques ont des effets différents sur d’excitabilité nerveuse10.
- Placez le museau de l’animal dans la fixation de la coiffe et administrer une dose d’entretien de 2,5 % isoflurane et 1 L par min O2 débit en toute sécurité.
- Confirmer anesthésie adéquate en vérifiant pour retrait pédale et réflexes cornéens en pinçant ses orteils de l’animal et toucher doucement ses yeux.
Remarque : L’Application d’une pommade vétérinaire sur les yeux, pour prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie, est recommandée mais pas indispensable car la procédure prend généralement de 30 min par animal. - Maintenir la température corporelle du rat à 37 ° C à l’aide d’un tapis chauffant de rétroaction contrôlée et d’une sonde thermomètre rectal. Définir la trame chauffante et le capteur de température intégré à 40 ° C pour empêcher des dommages de la peau qui se produit avec des températures plus élevées.
Remarque : Il est recommandé de surveiller et enregistrer les mesures physiologiques (fréquence cardiaque, saturation en oxygène, température corporelle et fréquence respiratoire) toutes les 10 secondes à l’aide d’un système de surveillance physiologique animal. Procédures d’enregistrement optimale devraient inclure la mesure locale de la température de la branche car la température périphérique peut être plus froide que celle de la base température11 (Figure 1). - Porter des gants antiseptiques et utilisez toujours des instruments qui ont été nettoyés avec l’éthanol à 70 %, de maintenir un environnement exempt d’agents pathogènes dans l’ensemble de la procédure.
2. électrophysiologiques mis en place
- Utilisez les électrodes aiguilles de basse impédance platine électroencéphalogramme (EEG) pour cette procédure.
- Préparer les électrodes d’aiguille enregistrement en insérant l’électrode à aiguille d’enregistrement (Figure 1; indiqué en violet) à travers le muscle hypothénarien et l’électrode de référence par le biais de l’aspect dorsal du chiffre 4 (Figure 1, il est indiqué au orange) pour enregistrer les potentiels d’action composé de muscle (CMAPs).
- Placer l’électrode de terre à travers la peau sur l’aspect supérieur de l’avant-bras entre stimulant et enregistrement des électrodes (Figure 1; indiquée en vert). Faites attention lorsque vous insérez les électrodes afin d’éviter les tissus musculaires.
- Préparer les électrodes d’aiguille stimulant percutanée en insérant la cathode (Figure 1; marquées en bleu) environ 4 mm de distal de la cubitale tunnel au niveau du coude. Insérer l’anode (Figure 1; marqués en rouge) environ 1 cm proximalement par la peau de la région d’axillaires.
Figure 1 : un diagramme schématique le positionnement d’électrode aiguille dans le membre antérieur de rat. La cathode (bleu) est insérée environ 4 mm de distal du tunnel cubital au coude et l’anode (rouge) est inséré environ 1 cm proximalement par la peau de la région d’axillaires. L’électrode à aiguille au sol (vert) est inséré à travers la peau sur l’aspect supérieur de l’avant-bras entre stimulant et électrodes d’enregistrement. L’enregistrement (violet) et les électrodes de référence (orange) aiguilles sont insérées par le biais du muscle hypothénarien et l’aspect dorsal du 4ème chiffre. La sonde de température (gris) est placée sur l’aspect supérieur du muscle thénar. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
3. axones excitabilité procédures
- Effectuer le nerf moteur rongeur protocole TRONDNF utilisant un semi-automatique, ordinateur contrôlé excitabilité axonale programme (voir la Table des matières) lié à un stimulateur de courant constant et un amplificateur. Retirez l’excès bruit électrique de 50 Hz à l’aide d’un éliminateur de bruit 50/60 Hz.
- Enregistrer la CMAP du muscle hypothénarien en simultanément visualiser la morphologie de la CMAP et en appliquant un 1 impulsion d’ondes carrées ms pour le nerf cubital avec l’électrode à aiguille cathode.
- Pour réaliser des enregistrements optimales, ajuster soigneusement l’angle et/ou la position de la cathode, jusqu'à ce qu’une courbe de réponse optimale biphasique avec amplitude constante est obtenue (Figure 2 a.). Une fois la position optimale a été déterminée, stabiliser la cathode avec un porte-électrode repositionnables.
Remarque : Le logiciel utilisé automatiquement délivre les stimuli de l’épreuve, décrits ci-dessous et augmente ou diminue l’intensité nécessaire pour atteindre le seuil.
- Pour réaliser des enregistrements optimales, ajuster soigneusement l’angle et/ou la position de la cathode, jusqu'à ce qu’une courbe de réponse optimale biphasique avec amplitude constante est obtenue (Figure 2 a.). Une fois la position optimale a été déterminée, stabiliser la cathode avec un porte-électrode repositionnables.
- Enregistrer une courbe de stimulus / réponse en augmentant progressivement l’intensité de la stimulation d’un 1 impulsion de ms par 1 mA jusqu'à l’obtention d’une réponse maximale.
Remarque : La ligne pourpre et verte dans la figure 2 b et 2C représente respectivement l’augmentation progressive de l’intensité de la stimulation et l’automatisme. L’amplitude de la cible pour seuil de suivi est automatiquement définie à 40 % de l’amplitude maximale correspondant à la superficie de la pente plus raide sur la courbe de stimulus / réponse. Le changement de « seuil » (c'est-à-dire les stimulus requis pour obtenir 40 % CMAP) induite par différents stimuli de test est la variable d’obtenus dans le reste du protocole. - Enregistrer plusieurs paramètres d’excitabilité axonale, y compris electrotonus de seuil (TE), courant-seuil (I / V) relation et rétablissement du cycle (RC) tel que décrit dans référence12.
NOTE : Le programme informatique de l’excitabilité axonale contrôlé évalue le seuil (TE) avec un 100 ms une dépolarisation et hyperpolarisant courants qui est fixé à ±20 % et ± 40 % du seuil de contrôle actuel. Le changement de seuil après les dépolarisants et hyperpolarisants courants est automatiquement enregistré à 14 points de temps pendant les 100 ms courant de polarisation et de 12 points après le courant de polarisation. Electrotonus de seuil indirectement évalue les conductances internodales et est un marqueur du potentiel de membrane. L’I / V relation est évaluée avec les courants d’une climatisation 200 ms qui alternent en intensité de + 50 % à -100 % du seuil de contrôle par incréments de 10 %. I / relation V diffère de TE parce que les courants sont plus longues dans la durée, l’intensité de la polarisation est progressivement modifiée par rapport à + 50 % à -100 % et le changement de seuil est évaluée à chaque intensité 1 ms après que le courant de polarisation a cessé. I / relation V donne un aperçu des propriétés rectification de l' axone1. Le RC est évaluée avec un paradigme d’impulsions jumelés, où un stimulus de conditionnement initial supramaximal est appliqué suivi d’une série de stimuli d’essai à des intervalles spécifiques de 2,5 ms à Mme 200 ce paramètre teste une série bien définie des événements qui se produisent dans le nodal région de l’axone après stimulation supramaximal. Ces événements incluent, l’inactivation de voltage-dépendant des canaux Na+ , ce qui rend plus difficile à obtenir une réponse ultérieure et est quantifiée par la période réfractaire et de la relative période réfractaire 1. Il est suivi par une imputation de l’entre-nœud et une période d’excitabilité accrue véhiculée par les canaux potassium rapide, quantifiées par superexcitability. Enfin, lentement activateur des canaux potassiques véhiculent une fin de la période de l’excitabilité réduite, quantifiée comme subexcitability.
- Enregistrer la CMAP du muscle hypothénarien en simultanément visualiser la morphologie de la CMAP et en appliquant un 1 impulsion d’ondes carrées ms pour le nerf cubital avec l’électrode à aiguille cathode.
Figure 2 : données brutes d’un test d’excitabilité axonale. Paroi A montre la courbe de réponse abiphasic CMAP après augmentation de la stimulation du nerf cubital. Groupes B et C représentent l’intensité de stimulation (mA) et l’amplitude de la CMAP (mV), respectivement. La composante verte de B et C représente la diminution incrémentielle automatique dans l’intensité de la stimulation et la baisse de forme sigmoïde associée CMAP requis pour seuil de suivi.
4. appliquer les procédures d’électrophysiologie
- Transférer le rat dans une cage séparée jusqu'à ce qu’il a repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus sternal. Ne pas laisser un animal sans surveillance et en compagnie d’autres animaux jusqu'à ce qu’il a pleinement récupéré de l’anesthésie. Une fois que le rat a complètement récupéré de l’anesthésie, transférez-le dans sa cage originale.
- À la fin de l’étude, euthanasier le rat sans douleur pour l’animale, par exemple létale injection intrapéritonéale d’un barbiturique (p. ex. lethabarb).
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Representative Results
Des mesures électrophysiologiques du nerf cubital rat ont été obtenus avec le présent protocole. La figure 3 montre un représentant d’enregistrement du nerf cubital gauche d’un rat Long Evans femelle de 12 semaines. Potentiel d’action musculaire composé désigne le nombre des fibres qui sont activés en même temps. La réponse de crête supramaximal (mV) (Figure 3 a) montre la réponse de crête atteinte en augmentant progressivement le stimulus jusqu'à ce que l’il n’y a aucun changement dans la réaction (Figure 2 b).
Figure 3 b représente le courant-tension (I / V) relation produite par les courants de plus longues durée (200 ms) et leurs intensités passée par incréments de 10 % + 50 % à -100 % du seuil. I / relation V évalue rectification entrant et sortant en examinant les différences de seuil actuel en réponse à dépolariser et hyperpolarisant courants. Le quadrant gauche bas reflète la rectification intérieure pouvant accueillir à hyperpolarisation et l’activation de conductances1vers l’intérieur le. Le quadrant supérieur droit reflète l’activation de canal K+ rapide et lente et la rectification extérieur pouvant accueillir à la dépolarisation actuel.
Les conductances internodales peuvent être examinés à l’aide de formes d’ondes electrotonus de seuil (Figure 3) en réponse à la longue une dépolarisation et hyperpolarisant courants. Les deux hyperpolarisant et dépolarisantes T’ont variables qui peuvent être calculés par le changement de seuil entre les points dans le temps spécifique ms 10-20, 20-40 ms et 90-100 ms en moyenne.
Changements au fil du temps en raison de la blessure ou l’application d’interventions thérapeutiques peuvent provoquer des changements spécifiques aux paramètres d’excitabilité nerveuse. Cela peut fournir utile en vivo renseignements au sujet des changements pathophysiologiques, caractères juvénile de la maladie et l’efficacité thérapeutique dans des modèles animaux de troubles neurologiques.
Figure 3 : un tracé représentant excitabilité axonale. (A) courbe de stimulus-réponse représentant la réponse de crête supermaximal (mV). (B) la courant-tension (I / V) relation produite par un stimulus polarisant 200ms allant de + 50 % à -100 % du seuil actuel. (C) electrotonus seuil illustrant des formes d’ondes en réponse à prolongée une polarisation actuelle a suscité de 20 % et 40 % de dépolarisation (supérieur à 0 sur l’axe des y) et courant hyperpolarisant (au-dessous de 0 sur l’axe des y). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Test d’excitabilité axonale séquentielle a été entrepris sur la patte gauche puis à droite avant de n = 4 rats (12 semaines). Enregistrements de gauche et de droite ont été réglées dans 35 min après la perte du réflexe de retrait pédale. L’analyse a été effectuée en utilisant le paires non paramétrique signé rang test de Wilcoxon. Ces analyses ont révélé aucune différence significative entre les nerfs cubital droit et gauche pour toutes les variables de l’excitabilité axonale. Cohérence a été démontrée dans les paramètres de conduction nerveuse standard, amplitude CMAP et latence (Figure 4 a et B) ainsi que des variables d’excitabilité nerveuse dont superexcitability et electrotonus de seuil hyperpolarisant (TEh) 90-100 (figure 4 et D). Cependant, les précédentes études10 ont indiqué se produit-elle un changement significatif au fil du temps dans les paramètres sous anesthésie isoflurane (Voir discussion).
Figure 4 : moyenne des enregistrements (n = 4) obtenue pour pic (A) réponse de latence (B) (C) superexcitability et (D) hyperpolarisant seuil electrotonus (90-100 ms) dans les gauchers (rouge) et les nerfs cubital droit (bleu). Les barres d’erreur indiquent l’erreur-type de la moyenne (SEM). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La procédure décrite montre un simple et fiable, technique mini-invasive qui permet l’évaluation des propriétés biophysiques et potentiel de la membrane de l’axone dans un court laps de temps. Par rapport aux autres techniques plus invasives, qui exigent l’exposition du nerf, la présente méthode d’essai d’excitabilité axonale induit des lésions des tissus minimal permettant ainsi l’évaluation in vivo qui préserve les conditions physiologiques de la nerf d’intérêt et permet des mesures répétées.
Pour garantir des résultats cohérents sont quelques considérations méthodologiques qui doivent être abordées. Un de ces facteurs est la concentration et le type d’anesthésie. Il a été précédemment démontré qu’isoflurane influe sur activés par une hyperpolarisation cyclique nucléotides canaux10. Sinon, un mélange anesthésique injectable de la médétomidine, midazolam et butorphanol a été l’objet d’une enquête et a également démontré des effets sur l’excitabilité nerveuse au fil du temps10. Médétomidine/midazolam/fentanyl (MMF) semble avoir peu d’effet sur l’excitabilité nerveuse et a été utilisée dans plusieurs nerf excitabilité études7,13,14, bien que ses effets au fil du temps sur les nerfs excitabilité n’ont pas été systématiquement étudiés. Noter, cette anesthésie est difficile à obtenir dans les États-Unis et l’Australie comme le fentanyl est une substance contrôlée aux règlements d’importation strictes. Quel que soit l’anesthésie choisie, posologie et heure sous anesthésie doivent être surveillés attentivement pour examen à l’analyse.
Un autre facteur à considérer est la qualité de l’électrode. En raison de la forte et prolongée hyperpolarisant et dépolarisantes courants appliqués dans l’excitabilité axonale électrodes de haute qualité d’études sont nécessaires. Dans cette étude, des électrodes aiguilles de basse impédance platine électroencéphalogramme (EEG) ont été utilisés. Électrodes de faible impédance sont typiquement dans la gamme de kilo-ohms et les électrodes de l’EEG platine conventionnellement respectent le 0.5 - 5 gamme kilohm qui est considéré comme électrodes de faible impédance. Le programme de l’excitabilité axonale peut enregistrer la sortie courant et calculer l’impédance par rapport à la cible hors tension, et il a déjà été établie que le courant est stable pendant 30 min, qui est la durée habituelle de ce protocole15. En outre, ces électrodes ont été récemment introduites dans la souris16 et trouvées pour ne pas être soumis à polarisant effets14,15. Par conséquent, polarisation ne serait pas un problème au cours de la procédure expérimentale.
Contrairement aux protocoles qui exposent le nerf d’intérêt, ces études utilisent un modèle intact qui rend le positionnement des électrodes stimulants approximatives. Ainsi, la réplication exacte du placement des électrodes dans des études longitudinales peut être difficile. Malgré cela, une étude antérieure avec l’anesthésie différent démontré bonne répétabilité des paramètres excitabilité de 30/34 nerf cubital dans 3 études distinctes similaires à celle observée dans les nerfs tibial et caudale13. En outre, dans cette étude, comparaison des CMAPs droite et gauche montre cohérence (Figure 4), suggérant de placement des électrodes précise et correcte ne suffit pas à compenser cette limitation possible.
Il y a plusieurs étapes critiques en train d’acquérir des réponses de la CMAP. Correctement et systématiquement mise en place de l’électrode à aiguille stimulant est crucial pour les mesures reproductibles de l’amplitude. En outre, il est essentiel d’assurer un positionnement correct des électrodes aiguilles pour minimiser le bruit de fond d’enregistrement. Par conséquent, en même temps visualiser la courbe de réponse tandis que placer l’électrode à aiguille stimulant est indispensable confirmer le placement cohérent.
L’utilisation de cette technique mini-invasive sur des modèles animaux de troubles neurologiques peut-être être un outil précieux pour étudier les changements pathophysiologiques et caractères juvénile de la maladie. Ceux-ci peuvent servir de biomarqueurs et faciliter les recherches de nouvelles interventions thérapeutiques en conjonction avec des mesures comportementales de la fonction main. En outre, la validation de ces techniques chez les rongeurs peut permettre l’étude des relations pharmacocinétiques et pharmacodynamiques de nouveaux composés. Cela pourrait permettre la meilleure traduction de composés thérapeutiques avant la Phase 1 et 2 essais cliniques
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Le projet a été soutenu par la Fondation de Lundbeck, le Novo Nordisk Foundation, le Conseil danois de la recherche médicale, le Ludvig et Sara Elsass Foundation, la Fondation pour la recherche en neurologie et Jytte et Kaj Dahlboms. Rachid est pris en charge par un début de carrière Post-Doctoral Fellowship de la National Health and Medical Research Council of Australia (#1091006)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QTracS Program | Digitimer Ltd. | Axonal excitability program | |
| AM-Systems 2200, Analog Stimulus Isolator, 2200V/50Hz | SDR Scientific | 850005 | Stimulator |
| High Performance AC Amplifier Model LP511 | Grass Technologies | Amplifier | |
| Humbug 50/60Hz Noise eliminator | Quest Scientific Instruments | 726310 | Noise eliminator |
| Low Impedance Platinum Monopolar Subdermal Needle Electrodes | Grass Technologies | F-E2-24 | Recording electrodes, 10 mm length, 30 gauge |
| Low Impedance Platinum Electroencephalography Needle Electrodes | Cephalon | 9013L0702 | Stimulating electrodes, 10 mm length, 30 gauge |
| Multifunction I/O Device Model USB-6341 | National Instruments | Multifunction input/output device | |
| Iron Base Plate IP | Narishige Scientific Instrument Laboratory | Used for holding stimulating needle electrode in place | |
| Rotating X-block X-4 | Narishige Scientific Instrument Laboratory | Used for holding stimulating needle electrode in place | |
| Magnetic Stand GJ-8 | Narishige Scientific Instrument Laboratory | Used for holding stimulating needle electrode in place | |
| Micromanipulator M-3333 | Narishige Scientific Instrument Laboratory | Used for holding stimulating needle electrode in place |
References
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