Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Droge Film elektrochemische Microfluidic Biosensor fotoresist gebaseerde Platform: Apparaat Fabrication, On-chip Assay voorbereiding en werking van het systeem

doi: 10.3791/56105 Published: September 19, 2017
* These authors contributed equally

Summary

Een microfluidic biosensor platform is ontworpen en vervaardigd met behulp van goedkope droge film fotoresist technologie voor snelle en gevoelige kwantificering van verschillende analyten. Deze eenmalig gebruik-systeem zorgt voor de elektrochemische uitlezing van enzyme-linked tests aan-chip-geïmmobiliseerd door middel van de techniek van de stop-flow.

Abstract

In de afgelopen jaren werd biomerker diagnostiek een onmisbaar instrument voor de diagnose van ziekten bij de mens, met name voor de point-of-care-diagnostiek. Een eenvoudig te gebruiken en low cost sensor-platform is zeer gewenst voor het meten van verschillende soorten analyten (bijvoorbeeld biomarkers, hormonen en drugs) kwantitatief en specifiek. Om deze reden, werd droge film fotoresist technologie - waardoor goedkoop, facile en high-throughput fabricage - gebruikt voor de vervaardiging van de microfluidic biosensor hier gepresenteerd. Afhankelijk van de bioassay gebruikt daarna, is het veelzijdige platform voor het opsporen van verschillende soorten biomoleculen van. Voor de fabrikatie van het apparaat, zijn platina-elektroden gestructureerd op een flexibele polyimide (PI) folie in de processtap die alleen schoon-kamer. De PI-folie dient als een substraat voor de elektroden, die zijn geïsoleerd met een epoxy gebaseerde fotoresist. Het microfluidic-kanaal wordt vervolgens gegenereerd door de ontwikkeling en lamineren van droge film fotoresist (DFR) folie op de PI wafer. Met behulp van een hydrofobe stoppen belemmering in het kanaal, het kanaal is onderverdeeld in twee specifieke gebieden: een immobilisatie sectie voor de enzym-verbonden bepaling en een meting van de elektrochemische cel voor de amperometrische signaal uitlezing.

De op de chip bioassay immobilisatie wordt uitgevoerd door de adsorptie van de biomoleculen aan de oppervlakte van het kanaal. Het enzym glucose oxidase wordt gebruikt als een transducer voor elektrochemische signaal generatie. In aanwezigheid van het substraat, glucose, wordt waterstofperoxide geproduceerd, die wordt gedetecteerd bij het platina werken-elektrode. De stop-flow-techniek is toegepast om te verkrijgen signaal versterking samen met snelle detectie. Verschillende biomoleculen kunnen kwantitatief worden gemeten door middel van het geïntroduceerde microfluidic systeem, geven een indicatie van verschillende soorten ziekten, of, met betrekking tot de therapeutische drug monitoring, een gepersonaliseerde therapie te vergemakkelijken.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

In de afgelopen twee decennia geworden diagnostische toepassingen voor elementaire voor diepgaande studies over de ontwikkeling van de wereldwijde volksgezondheid. Traditioneel worden laboratorium diagnostische hulpprogramma's gebruikt voor het opsporen van ziekten. Hoewel ze nog steeds een belangrijke rol bij het diagnosticeren van ziekten spelen, point-of-care testen (POCT) uitgevoerd in de buurt van de patiënt of door de patiënt zelf is in de afgelopen jaren meer en meer gemeengoed geworden. Met name in dergelijke gevallen die onmiddellijke behandeling, zoals acuut myocardinfarct of diabetes controle, vereisen is de snelle bevestiging van een klinische bevinding essentieel. Vandaar, is er een groeiende behoefte aan POCT apparaten dat kan worden bediend door niet-deskundigen en die kunnen in het gelijktijdig uitvoeren van nauwkeurige in vitro diagnostische tests in een korte tijd1,2,3,4 .

Opmerkelijke verbeteringen hebben reeds bereikt op het gebied van POCT. Er zijn echter nog veel uitdagingen te overwinnen van5,6,7,8. Voor een POCT platform te worden met veel succes gelanceerd op de markt en te kunnen concurreren met laboratorium diagnostiek, het apparaat moet strikt voldoen aan de volgende eisen voldoen: (i) bieden nauwkeurige en kwantitatieve testresultaten die consistent met laboratorium zijn bevindingen; (ii) hebben korte monster-naar-result tijden, waardoor de onmiddellijke behandeling van de patiënt; (iii) functie ongecompliceerd en gemakkelijk behandeling, zelfs wanneer die worden geëxploiteerd door ongeoefende personen, en vereist de tussenkomst van de geminimaliseerde gebruiker; en (iv) bestaan uit een low cost sensor-eenheid ontworpen voor eenmalig gebruik toepassingen. Bovendien zijn diagnose apparatuur-vrij gunstig, voornamelijk in resource-poor omgevingen3,4,6.

Als gevolg van deze strenge eisen, hebt slechts twee POCT systemen op basis van elektrochemische detectie (bijvoorbeeld bloed glucose test strips) en laterale-flow-immunoassay (bijvoorbeeld thuis zwangerschapstesten) is gestart op de markt dus veel. Maar beide systemen lijdt aan nadelen zoals slechte prestaties (dat wil zeggen bloed glucose monitoring heeft onjuiste testresultaten en laterale stroom testen alleen kwalitatieve (positief of negatief) meetresultaten)4, 6. Deze nadelen van conventionele POCT systemen hebben geleid tot een toenemende vraag over het verkennen van nieuwe technologieën die snelle, goedkope en kwantitatieve detectie op het punt van zorg4,5 bieden.

Om te voldoen aan deze uitdagingen POCT apparaten, heeft DFR technologie onlangs gewerkt voor de fabricage van biosensoren besteedbaar en goedkope9,10,11,12, 13 , 14. in vergelijking met zachte en vloeibare lithografische materialen, zoals PDMS of SU-8, DFRs presenteren veel voordelen: ze (i) zijn verkrijgbaar in een verscheidenheid aan composities en diktes (van een paar microns tot enkele millimeters); (ii) hebben een zeer ruwe oppervlakte, dat vergemakkelijkt de hechting aan diverse materialen; (iii) functie uitstekende dikte uniformiteit; (iv) bieden goedkope facile en high-throughput fabricage voor massaproductie; (v) zijn gemakkelijk te snijden met verschillende laaggeprijsde hulpmiddelen, zoals een eenvoudige paar van schaar; en (vi) toestaan voor het creëren van driedimensionale structuren, zoals microfluidic kanalen, door het stapelen van meerdere DFR lagen op elkaar.

Aan de andere kant, hebben DFRs in het algemeen een relatief lage resolutie ten opzichte van vloeibare photoresists, die voornamelijk veroorzaakt wordt door de laagdikte en door de grotere afstand tussen het masker en de DFR als gevolg van de beschermende folie, waarmee bovendien licht verstrooiing. Toch, voor de vervaardiging van geïntegreerde microfluidic biosensoren, DFRs zijn zeer geschikt voor goedkope massaproductie.

Daarom werken we aanwezig in dit de fabricage en de toepassing van een elektrochemische microfluidic DFR gebaseerde biosensor. Het gedetailleerd protocol beschrijft elke stap van de productie van de biosensor platform, de immobilisatie op de chip van een model op basis van DNA-test en de elektrochemische uitlezing met behulp van de stop-flow-techniek. Deze universele platform laat de opsporing van talrijke soorten biomoleculen, met behulp van verschillende assay technologieën (b.v., genomics, cellomics en proteomics) of assay formaten (bijvoorbeeld, concurrerende, sandwich, of direct). Gebaseerd op een dergelijke DFR platform, onze fractie eerder succesvol gebleken de snelle en gevoelige kwantificering van verschillende analyten, met inbegrip van antibiotica13,15,16 (tetracycline, pristinamycin, en ß-lactam antibiotica), troponine ik17, en stof P18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. fabricage van de Microfluidic Biosensor met behulp van DFR technologie

  1. voorbereiding van de PI wafeltjes.
    1. Gesneden een PI substraat in 6 - in ronde plaatjes. De PI-wafer zet in een oven bij 120 ° C gedurende ongeveer 1 uur voor het bakken van een uitdroging.
  2. Eerste fotolithografie stap voor het proces van de astronauten.
    1. Program van de spin-coater naar een tijd van 30-s spinnen op 3000 toeren per minuut, met een versnelling van 2.000 rpm/s. plaats het zegel van de PI op de spin-coater en repareren, toepassing van een vacuüm. Afzien van 2 mL van een weerstaan, waardoor het proces van de astronauten, en start het programma van de spin-coater. Het zegel van de spin-coater verwijderen en soft-bak het zegel van de PI op een hete plaat gedurende 2 minuten bij 100 ° C.
    2. Aanpassen de gewenste masker voor de patronen van de elektroden op de PI wafer met het blote oog en worden blootgesteld aan 400 mJ/cm 2 UV-licht (365 nm). Plaats de wafer in een kom met een ontwikkelaar resist-matching op een roteerschudapparaat gevuld en laat het schudden iets voor 1 min.
    3. Nadat het overtollige weerstaan is verwijderd, gebruikt u een douche te spoelen van de PI wafer met gedeïoniseerd water (DI-water) op een natte bank en droog het daarna met behulp van perslucht.
  3. Afzetting van platina voor de vorming van de elektroden.
    1. Gebruik van een standaard fysieke damp afzetting aan borg 200 nm platina op de wafer 19.
    2. Plaats de wafer in een kom. De overeenkomende remover toevoegen aan de kom en verwijder de lift-off weerstaan terwijl het lichtjes schudden het zegel op een roteerschudapparaat totdat alle overtollige platina is verwijderd. Spoel en droog de PI wafer zoals beschreven in stap 1.2.3.
  4. Tweede fotolithografie stap: vorming van de isolatielaag.
    1. Zet het zegel van de PI in een oven tot 120 ° C gedurende 5 minuten aan het uitdrogen it. voorverwarmd
    2. De eerste stap van een spin-coater tot en met 5 programma s van spinnen tijd bij 500 omwentelingen per minuut. De tweede stap voor 30 Program s bij 4000 rpm, met een versnelling van de 700 rpm/s.
    3. Plaats van het zegel van de PI op de spin-coater en repareren, toepassing van een vacuüm. Afzien van 4 mL van een geschikte epoxy gebaseerde fotoresist voordat het programma van de spin-coater.
    4. Soft-bak de gecoate wafer voor 3 min bij 95 ° C op een warmhoudplaat.
    5. Aanpassen het masker voor de isolatielaag op de wafer met behulp van de merken van de respectieve uitlijning en een oogbeschadigingen en/of lens. Bloot de wafer aan 100 mJ/cm 2 UV-licht (365 nm).
    6. Voor een post-exposure bak, plaatst u het zegel op een voorverwarmde warmhoudplaat voor 2 min op 95 ° C.
    7. Plaats van de wafer in een kom en ontwikkelen de weerstaan met een geschikt ontwikkelaar (bijvoorbeeld 1-methoxy-2-propyl-acetat gedurende 2 minuten, in het geval van SU-8) op een roteerschudapparaat.
    8. De PI wafer eerst spoelen met isopropanol en dan afspoelen en droog het zoals beschreven in stap 1.2.3.
    9. Vaste-bak de fotoresist in een oven gedurende 3 uur bij 150 ° C.
  5. Plasma-bijgewoonde reiniging van de elektroden.
    1. Te verwijderen van de fotoresist residuen, gebruik van zuurstof plasma met een standaard plasma-eenheid. Het schoonmaak programma start, met behulp van 200-W lagefrequentie-kracht met 100% O 2 stroom, een tarief van 250 sccm en een tijd van 3 min.
    2. Plaats van de PI-wafer in de bedwelmingsruimte plasma, fix het zegel op de geaarde plaat met glazen deksels en het plasma-proces starten.
  6. Zilver en de afzetting van zilverchloride: maken van de op de chip referentie-elektrode.
    1. Passivate de platina contactpersoon pads van de wafer met een UV-gevoelige plakband. 5 mm brede en 11 cm lange strepen de folie gesneden en deze koppelen aan de wafer, bescherming van de delen niet te worden nedergelegd bij zilver.
    2. Voor de zilveren afzetting, een sonische bad (35 kHz) gestoken in een zuurkast en invoegen van een container van zilveren elektrolyt oplossing (100 g/L Ag, pH 12,5) in het bad. Het sonic Bad ingesteld op kamertemperatuur en de macht tot 10%.
      Let op: Zilveren elektrolyt oplossingen zijn zeer giftig en moeten met uiterste zorg worden behandeld. De rook moeten nooit worden ingeademd.
    3. Sluit het contact van de bulk van de referentie-elektroden aan een constante stroombron. De teller-elektrode, een zilveren draad die wordt ondergedompeld in de zilveren elektrolyt oplossing, de huidige bron met behulp van standaard aansluitende kabels verbinden.
    4. De huidige bron instellen DC en een stroomdichtheid van-4.5 mA/cm 2, resulterend in een zilver depositie tarief van ongeveer 0,3 µm/min. Start het sonic bad en laat de huidige bron uitvoeren gedurende 10 minuten spoelen de wafer met DI-water
    5. Voor de chlorering van de referentie-elektrode, een schip van 0,1 M kaliumchloride (KCl) oplossing in de sonic Bad invoegen. Verbinding maken met de contactpersoon van de bulk van de wafel en een platina-elektrode dat is ondergedompeld in de KCl oplossing met de constante stroombron.
    6. De huidige bron instellen DC en een stroomdichtheid van +0.6 mA/cm 2, resulterend in een depositie tarief van ongeveer 0.075 µm/min. Start het sonic bad en laat de huidige bron voor 7,5 min. lopen
    7. Rinse en droog de PI schijven (wafers), zoals beschreven in stap 1.2.3.
    8. Verwijderen van de tape UV-gevoelige na een UV (365 nm) blootstelling van 300 mJ/cm 2 en spoel en droog de PI wafer, opnieuw als beschreven in stap 1.2.3.
  7. Derde fotolithografie stap: gebruik maken van de microfluidic kanalen DFRs.
    1. Snijden de benodigde DFR lagen tot een grootte vergelijkbaar met die van de wafer (20 x 20 cm 2). Los van het gewenste masker op de eenheid van de blootstelling en uitlijnen van de DFR-laag op het masker met het blote oog. Verlichten van de weerstaan met 250 mJ/cm 2 UV-licht (365 nm).
    2. Verwijderen van de beschermfolie van de fotoresist en ontwikkelen de weerstaan voor ongeveer 2 minuten (afhankelijk van de structuren) in een 1%-oplossing van natriumcarbonaat (nb 2 CO 3) met behulp van een standaard sonic bad (35 kHz) voorverwarmd tot 42 ° C en een sonische macht van 100%. Om te stoppen met de reactie onmiddellijk, schud de weerstaan voor 1 min in een 1% HCl bad op een roteerschudapparaat. Spoel en droog van elke DFR-laag, zoals beschreven in stap 1.2.3.
      Opmerking: In totaal vier DFR lagen moeten worden verwerkt zoals vermeld in stap 1.7: één kanaal laag, een afdekhoes laag, en twee lagen van de achterkant (het voorkomen van de biosensor van het buigen aan het einde).
  8. Lamineren van de DFR lagen op het PI-substraat.
    1. Plaats van het zegel van de PI op een transparantie overhead folie en repareren met behulp van standaard plakband. Aanpassen van het kanaal DFR laag op de PI wafer onder een Microscoop, met behulp van de structuren van de respectieve uitlijning.
    2. Voor het lamineren, gebruik een standaard hete roll laminator en verwarm de bovenste roll tot 100 ° C en het onderste broodje tot 60 ° C. de druk ingesteld op 3 bar, met een voorwaartse snelheid van 0,3 m/min. plaats het zegel met de vaste DFR-laag in het midden van de laminator en Start het DFR wordt geduwd door de laminator. Herhaal de stap na het draaien van de wafer door 180°.
    3. Om te voorkomen dat het buigen van de biosensor, laminaat de twee lagen van het ontwikkelde achterzijde naar de wafer na stappen 1.8.1-1.8.2.
  9. Met een hydrofobe stoppen barrière en afdichten van de chip.
    1. Verwijderen de beschermende laag van de voorzijde van het kanaal DFR leggenTranslator door te plaatsen standaard plakband aan het ene uiteinde van de DFR en omhoog te trekken. Gebruik een hand dispenser met buizen-0.004-in kleine druppeltjes van opgeloste polytetrafluorethyleen afzien in de putten van de isolatielaag. Om de microfluidic-chip, laminaat de cover DFR laag op de laag van het kanaal, zoals beschreven in stap 1.8.
  10. Vaste-bakken de microfluidic biosensor.
    1. Verwijderen alle beschermende folies op de cover en de achterkant DFR lagen. Snijd de biosensoren in reepjes met behulp van een gewone paar van schaar. Genezen van de chips in een oven op 160 ° C gedurende 3 h.

2. Op de chip Assay immobilisatie Procedure

  1. adsorptie van avidin op het gebied van de immobilisatie van het kanaal.
    1. Bereid een oplossing van de avidin, 100 µg/mL in een 10 mM met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) op een pH van 7,4.
    2. 2 afzien µL van de oplossing van de avidin op de inlaat van de biosensor.
      Opmerking: Het kanaal wordt opgevuld door capillaire krachten totdat de vloeistof de hydrofobe stoppen barrière bereikt.
    3. Om ervoor te zorgen dat de fluidic op de barrière tijdens de hele incubatietijd afgebroken steeds, afzien 2 µL van DI-water op de uitlaat van de chip. Incubeer de chip bij 25 ° C gedurende 1 uur in een gesloten container.
    4. Verwijder overtollige reagentia via de inlaat van de chip door toepassing van een vacuüm. Wassen van het kanaal met 50 µL van was buffer (PBS met 0,05% Tween-20), verdeelde op het stopcontact terwijl het vacuüm wordt toegepast. Droog het kanaal voor 30 s terwijl het vacuüm wordt toegepast.
  2. Blokkeren van het oppervlak van het kanaal om te remmen aspecifieke bindende.
    1. Bereid een 1% bovien serumalbumine (BSA) oplossing in 10 mM PBS op een pH van 7,4.
    2. Pipetteer 2 µL van de 1% BSA oplossing op de inlaat- en 2 µL van DI-water op de uitlaat van het kanaal. Incubeer de chip bij 25 ° C gedurende 1 uur in een gesloten container. Verwijderen van de overtollige reagentia en droog het kanaal zoals beschreven in stap 2.1.4.
  3. Incubatie van DNA oligos aangeduid met biotine en 6-FAM.
    1. Bereiden van verschillende concentraties (0,001-5 µM) van de DNA-oplossing in 10 mM PBS op een pH van 7,4.
    2. 2 afzien µL van een concentratie van de oplossing van de DNA op de inlaat- en 2 µL van DI-water op het stopcontact. Incubeer de chip bij 25 ° C gedurende 15 min. in een ongeopende verpakking.
    3. Herhaal stap 2.3.2 voor de andere concentraties DNA met behulp van extra biosensor chips.
    4. Verwijderen van de overtollige reagentia en droog het kanaal zoals beschreven in stap 2.1.4.
  4. 6-FAM antilichamen immobilisatie van GOx-geëtiketteerden.
    1. Formuleren van een concentratie van 5 µg/mL van 6-FAM antilichamen in 10 mM PBS op een pH van 7,4.
    2. Voeren 2 µL van de antilichaam-oplossing voor de inlaat- en 2 µL van DI-water aan de uitlaat van het kanaal. Incubeer de gelabelde antilichamen bij 25 ° C gedurende 15 min. in een gesloten container. Verwijder de overtollige reagentia, zoals beschreven in stap 2.1.4.

3. Amperometrische signaal detectie met behulp van de techniek van de Stop-flow

  1. bereiding van het substraat oplossing elektrochemische detectie.
    1. Formuleren van een 40-mM glucose oplossing 0,1 M PBS op een pH van 7,4 in ultra pure water.
    2. Voor de voorbehandeling, bereid een 0,1 M PBS-oplossing bij een pH van 7,4 in ultra pure water.
  2. Voorbehandeling van de werken-elektroden.
    1. Gebruik van de op maat gemaakte chip houder te maken voor de eenvoudige plaatsing van de chip en een fluidic en elektrische verbinding.
    2. Elektrisch de biosensor verbinding te maken met de potentiostaat. Controleer het fluidic contact van het microfluidic-kanaal aan een spuitpomp en het reagens reservoir met behulp van de op maat gemaakte adapter en buizen. De laptop die is aangesloten op de potentiostaat en de spuit pomp controller, beheersen de fluidic stroom door de chip begindatum.
    3. Start de spuitpomp handmatig, met 0,1 M PBS op een debiet van 20 µL/min. Toepassing op de werkende elektrode ten opzichte van de op de chip referentie-elektrode, een afwisselend spanning van 0,8 en-0.05 V voor 5 s elk voor 30 cycli. Na dit, oxideren de elektrode werken door het toepassen van een spanning van 0,8 V voor 60 s.
  3. Assay uitlezing met behulp van de stop-flow techniek.
    1. Om te beginnen de assay signaal uitlezing, wachten tot het gemeten stroomsignaal stabiliseert. De spuitpomp stoppen en schakelen het reagens van 0,1 M PBS aan de 40-mM glucose-oplossing en start de software op de injectiespuit pomp controller; het stopt automatisch de stroom voor 1, 2 of 5 minuten en zal vervolgens opnieuw de stroom. Observeren van de resulterende huidige piek.
      Opmerking: Voor de analyse van de gegevens, de huidige piek of de lading van de piek worden beschouwd, zoals wordt beschreven in het model van een elektrochemische signaal uitlezing ( Figuur 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ontwerp en fabricage van de Microfluidic Biosensor Platform:

De fabricage van de microfluidic biosensor chips wordt gerealiseerd op de wafer-niveau door photolithographic standaardtechnieken dienst meerdere DFR lagen. Deze productie-strategie, is afhankelijk van het lamineren van ontwikkelde lagen van DFRs op een platina-patroon PI substraat, vorming van de microfluidic kanalen. Een korte samenvatting beeltenis van de verschillende productie-stappen is gegeven in Figuur 1. Een enkel 6 - in-wafer bestaat uit 130 microfluidic biosensoren, elk met een afmeting van 8 × 10 mm2.

Figure 1
Figuur 1. Grafische afbeelding van de fabricage van de verschillende stappen van de microfluidic biosensor platform. a) knippen de PI substraat in 6 - in ronde plaatjes. b) blootstelling van een mogelijke spin beklede lift-off weerstaan met behulp van de respectieve masker voor platina patronen. c) substraat na blootstelling, post-exposure terug en ontwikkelen van de fotoresist. d) physical vapor deposition platina op de drager vervagen. e) lift-off proces voor het verwijderen van de overtollige fotoresist. f) spin-coating voor SU-8, vormt een isolatielaag. g) O2 plasma proces te verwijderen van de residuen van de SU-8 op de elektroden van de Pt. h) galvanische afzetting van de Ag/AgCl-elektrode. i) UV-blootstelling en ontwikkeling van verschillende DFR lagen. j) lamineren DFR lagen op de PI wafer. k) Dispensing opgelost polytetrafluorethyleen, vormen een hydrofobe stoppen barrière tussen het capillair immobilisatie en de elektrochemische cel. l) definitieve elektrochemische microfluidic biosensor. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Elke biosensor bestaat uit één microfluidic kanaal, onderverdeeld in twee afzonderlijke gebieden door de barrière van een hydrofobe stoppen: een sectie immobilisatie en een elektrochemische cel, gemarkeerd in rood en blauw, respectievelijk in Figuur 2. Het deel van de immobilisatie van de microchannel heeft een oppervlakte volume van 10.34 mm2 en een volume van 580 nL, wat resulteert in een hoge oppervlakte-naar volumeverhouding van 155 cm-1. De elektrochemische cel bevat een op-Spaander zilver/zilverchloride referentie-elektrode en een teller en werkende platina elektrode. Deze scheiding van de immobilisatie-gebied en de elektrochemische uitlezing van de bepaling voorkomt besmetting van de elektroden met biomoleculen en dus remt elektrode aangroei. Het maakt bovendien de nauwkeurige meting van de reagentia immobilisatie door capillaire vulling.

Figure 2
Figuur 2. Illustratie van het werkingsprincipe van het platform van elektrochemische microfluidic. a) schema van een bepaling van de model gebaseerd op avidin. b) foto van de microfluidic biosensor toont de belangrijkste elementen, met inbegrip van de teller-elektrode (CE), de referentie-elektrode (RE), de werkende elektrode (WE) en het stoppen-barrière (SB). De immobilisatie-gebied is gemarkeerd in het rood, en de elektrochemische cel is gemarkeerd in blauw. c) Schematische reactie van de oxidatie van de geproduceerde waterstofperoxide op de werkende Pt-elektrode voor amperometrische detectie in de elektrochemische cel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Door gebruik te maken DFRs voor de fabricage van de sensor, zorgt het productieproces voor high-throughput op de wafer-niveau. Daarom kunnen de kosten naar beneden tot een minimum beperkt worden gehouden. De ontwikkeling van alle DFR lagen is gedaan met behulp van eenvoudige en goedkope folie maskers en een vacuüm blootstelling-eenheid, in plaats van dure chrome maskers en een masker aligner. Bovendien, snijdt de vermindering van de noodzakelijke stappen voor schoon-kamer tot een minimum de kosten voor de fabrikatie zelfs meer. In totaal duurt de fabricage-procedure een werklast van ongeveer 10 h, met uitzondering van de bakken tijden en de fysieke damp afzetting van de platinum.

On-chip Assay incubatie:

De op de chip assay incubatie gebeurt alleen door capillaire krachten. Door pipetting druppels van verschillende reagentia op de inlaat van het microfluidic-kanaal, worden de vloeistoffen gedreven door het kanaal door capillariteit actie totdat ze de hydrofobe stoppen barrière. Steady-state omstandigheden, worden de reagentia vervolgens geïncubeerd verschillend tijd. Deze passieve systeem kan de capillaire vulling van het kanaal, zonder de noodzaak van eventuele externe instrumenten zoals een spuitpomp, en maakt het mogelijk voor de nauwkeurige meting van de reagentia, als de vloeistof automatisch bij de grens stoppen stopt. Ook de werkstroom is consistent met die van een conventionele ELISA en het werkt met dikvloeibaar vloeistoffen zoals bloed of serum.

Voor de toepassing van dit experiment, wordt de werking van de chip aangetoond door een eenvoudige test test de avidin-Biotine interactie, met zoals afgebeeld in Figuur 2. De op-chip assay incubatie begint met de adsorptie van de avidin naar de capillaire oppervlakte voor 1 uur, gevolgd door een blokkerende stap met BSA voor een andere 1 h. 6-FAM/Biotine-geëtiketteerden DNA is vervolgens geïncubeerd in de capillaire gedurende 15 minuten, waar het zich aan de avidin moleculen bindt immobilisatie. Tussen elke stap van de incubatie, worden een niet-afhankelijke biomoleculen verwijderd door een wassen stap. De wash-buffer wordt toegepast via het stopcontact van de kanaal met behulp van een op maat gemaakte vacuüm adapter. In de laatste stap, worden glucose oxidase-label antifluorescein antilichamen voorgesteld aan het kanaal voor 15 min. Na dat is de biosensor klaar voor de elektrochemische uitlezing, met behulp van een 40-mM glucose oplossing als het substraat.

Amperometrische signaal uitlezing met behulp van de Stop-flow techniek:

Voor de uitlezing van het signaal van de geïmmobiliseerdet bepaling, kan de enzymen product (hier, H2O2), geproduceerd in het bijzijn van zijn substraat, glucose, elektrochemisch worden gedetecteerd op de elektrode van de werken in de elektrochemische cel. Om te bereiken snelle detectie samen met signaal versterking, is de zogenaamde stop-flow techniek gebruikte13. Bij deze methode wordt wordt de stroom van het substraat gestopt, wat leidt tot een accumulatie van het product binnen het capillair. De hoeveelheid geproduceerde H2O2 Daarom hangt af van de hoeveelheid gebonden glucose-oxidase en is afhankelijk van de hoeveelheid afhankelijke biotinyleerd DNA. Door de stroom opnieuw op te starten, wordt de concentratie verbeterde H2O2 vervolgens geleegd via de meting van de elektrochemische cel, wat resulteert in een stroomsignaal van de piek, zoals geïllustreerd in Figuur 3.

Voor data-analyse, de stop-flow techniek biedt twee verschillende parameters: de maximumhoogte en de lading (dat wil zeggen, de integraal) van het signaal van de piek. Beide parameters zijn recht evenredig met de tijd van de stoppenen kan daarom worden gebruikt voor het analyseren van de gegevens. Gezien de evaluatie van de gegevens, bij het gebruik van de piekhoogte, de signaal-hoogte hangt af van de H2O2 maximumconcentratie en dus de coëfficiënt van de verspreiding en de toegepaste stoptijd. Hoe langer de tijd van de stoppen, hoe hoger de respons van de gemeten signaal. Om deze reden blijft de gepeilde piekhoogte ongewijzigd, tot een minimale lengte van de capillaire immobilisatie. Deze speciale functie van de stop-flow-techniek zorgt voor een drastische afname van de chip dimensies, met name in de capillaire lengte, met behoud van de gevoeligheid van de sensor.

Figure 3
Figuur 3. Model van een typisch verkregen elektrochemische signaal uitlezing van een enzyme-linked bepaling met behulp van de stop-flow techniek. a) een stroom van 40-mM glucose oplossing met een snelheid van 20 µL/min werd toegepast. Tijdens de stop-fase (1, 2 of 5 min), de productie van de enzymen van de H2O2 blijft. Door het herstarten van de stroom, wordt de geaccumuleerde H2O2 geleegd via de elektrochemische cel, waar de waterstofperoxide elektrochemisch wordt gedetecteerd. Door het herhalen van de meting meerdere malen (foutbalken; SEM), een op de chip kalibratie kromme b) wordt verkregen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De ontwikkeling van een goedkope, compact en eenvoudig te gebruiken platform voor de detectie van biomoleculen kunnen via het protocol hier gepresenteerd voor de fabrikatie van een elektrochemische biosensor van microfluidic. Afhankelijk van de bepaling op de biosensor daarna gebruikt, kunnen verscheidene verschillende biomerkers worden gedetecteerd. Dit maakt het platform zeer veelzijdig en biedt brede toegang tot verschillende toepassingsgebieden, van standaard diagnostische tests (bijvoorbeeld bepalen van de aanwezigheid van specifieke ziekten op het kantoor van de dokter) naar point-of-care toepassingen (b.v., de therapeutische drug monitoring van een patiënt voor geïndividualiseerd medicamenteuze therapie). Vooral in point-of-care diagnostiek, verkleinde biosensoren hebben veel voordelen boven conventionele methoden, die meestal vereist uitgebreide laboratoriumapparatuur, gespecialiseerde medewerkers, en grote reagens en monster volumes en lange doorlooptijd tijden.

De fabricage van deze biosensor vereist strikt na het protocol; anders, productie problemen kan optreden. Een van de meest vaak waargenomen problemen is de afwijking van de verschillende lagen. Dit kan gemakkelijk worden opgelost met behulp van een meer geavanceerde apparatuur voor de productie-procédé, waarmee het gemakkelijker en nauwkeuriger uitlijning van de verschillende lagen.

Het DFR-technologie biedt de mogelijkheid om snel en tegen lage kosten fabricage. Aan de andere kant, is de technologie beperkt in termen van resolutie. Bijvoorbeeld, kunnen niet microfluidic kanalen van zeer kleine structuren (minder dan 100 µm) worden gerealiseerd met behulp van het protocol hier gepresenteerd. In dat geval moet de fotolithografie worden uitgevoerd door een hoge-precisie masker aligner met glas fotomaskers. Bovendien, kan een kanaal te bestrijkende ook problematisch, aangezien het kanaal bukken kon, vermindering van de hoogte van het kanaal en het beïnvloeden van het gedrag van de microfluidic van de chip.

Wij zijn van mening dat DFR technologie meer aanwezig in toekomstige toepassingen zijn zal, omdat het gemakkelijk kan worden opgeschaald voor commercieel gebruik. De massaproductie van DFR gebaseerde microfluidic sensoren zal geen belemmering zijn als het hits de markt omdat de techniek goed ingeburgerd in andere toepassingsgebieden (bijv, flexibele elektronica is).

In termen van vermindering van de complexiteit van het hele systeem, onze toekomstige werkzaamheden zullen zich toespitsen op het ontwerp en de uitvoering van een wegwerp microfluidic patroon waarin de biosensor chip; een afval reservoir; en vooraf geladen reagentia, zoals was buffer en andere onderdelen van de test. Voor de meting van de amperometrische, kan de levering van het monster en andere reagentia vervolgens worden verstrekt door Pneumatische bediening. Dit zal worden uitgevoerd door de handheld lezer en gaan via de chip microfluidic biosensor tot een afval reservoir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs bedank het Duitse Research Foundation (DFG) voor gedeeltelijk financiering dit werk onder Grant nummers UR 70/10-01 en UR 70/12-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Pyralux DuPont AP8525R Used as polyimide substrate
MA-N 1420 Micro Resist Technology MA-N1420 Lift-off resit to define the platinum depostion
Ma-D 533s Micro Resist Technology MaD533S Developer for MA-N1420
Platinum - - Electrode and contact pad material
Ma-R 404s Micro Resist Technology MaR404S Remover for MA-N1420
SU-8 3005 MicroChem Corp. SU-8-3005 Photoresist to define the electrode area and as insulation
1-methoxy-2-propanol acetate Sigma-Aldrich 108-65-6 Developer for SU-8 3005
2-Propanol VWR 8.18766.2500 Removing of the SU-8 developer
1020R Ultron Systems Inc. 1020R UV sensitive adhesive tape for protection of contact pads
Arguna S Degussa 1935 For Silver depostion on reference electrode
KCl Methrom 62308.020 For chloridation of the silver reference electrode
Pyralux DuPont PC1025 Dry film photoresist
Sodium carbonat Fluka 71352 Developer for Pyralux PC1025
Hydrogen chloride Sigma-Aldrich 30720 To top the development of the DFR
Teflon AF 1600 DuPont AF1600 For employing the stopping barrier
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
PA104 Mega Electronics - Bubble etch tank
FED 53 Binder 9010-0018 Oven
SPIN150 APT - Spin coater
Präzitherm Harry Gestigkeit GmbH PZ 28-2 Hot plate
Hellas Bungard Elektronik 40000 Exposure unit
Tetra30-LF-PC Diener - Plasma unit
Univex 500 Leybold - Physical vapor deposition unit
Shaker S4 ELMI - Orbital shaker
Sonorex Super 10 P Bandelin 783 Sonic bath
6221 DC and AC Keithley - Current source
HRL 350 Ozatec - Laminator unit
Vaccum pen EFD - Vacuum pen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spindel, S., Sapsford, K. E. Evaluation of optical detection platforms for multiplexed detection of proteins and the need for point-of-care biosensors for clinical use. Sensors (Basel). 14, (12), 22313-22341 (2014).
  2. Luppa, P. B., Bietenbeck, A., Beaudoin, C., Giannetti, A. Clinically relevant analytical techniques, organizational concepts for application and future perspectives of point-of-care testing. Biotechnol Adv. 34, (3), 139-160 (2016).
  3. Gauglitz, G. Point-of-Care Platforms. Annu Rev Anal Chem. 7, (1), 297-315 (2014).
  4. Jung, W., Han, J., Choi, J. W., Ahn, C. H. Point-of-care testing (POCT) diagnostic systems using microfluidic lab-on-a-chip technologies. Microelectron Eng. 132, 46-57 (2014).
  5. Yager, P., et al. Microfluidic diagnostic technologies for global public health. Nature. 442, (7101), 412-418 (2006).
  6. Fu, E., Yager, P., Floriano, P. N., Christodoulides, N., McDevitt, J. T. Perspective on diagnostics for global health. IEEE Pulse. 2, (6), 40-50 (2011).
  7. Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Ann Rev Biomed Eng. 10, 107-144 (2008).
  8. Dincer, C., Bruch, R., Kling, A., Dittrich, P. S., Urban, G. A. Multiplexed point-of-care testing - xPOCT. Trends Biotechnol. 35, (2017).
  9. Horak, J., Dincer, C., Bakirci, H., Urban, G. A disposable dry film photoresist-based microcapillary immunosensor chip for rapid detection of Epstein-Barr virus infection. Sens Actuators B Chem. 191, 813-820 (2014).
  10. Method for the fabrication of a "lab on chip" from photoresist material for medical diagnostic applications. US patent. Jobst, G., Gamp, T. 7,691,623 (2010).
  11. Kling, A., Dincer, C., Armbrecht, L., Horak, J., Kieninger, J., Urban, G. Electrochemical microfluidic platform for simultaneous multi-analyte detection. Procedia Eng. 120, 916-919 (2015).
  12. Armbrecht, L., Dincer, C., Kling, A., Horak, J., Kieninger, J., Urban, G. Self-assembled magnetic bead chains for sensitivity enhancement of microfluidic electrochemical biosensor platforms. Lab Chip. 15, 4314-4321 (2015).
  13. Dincer, C., et al. Designed miniaturization of microfluidic biosensor platforms using the stop-flow technique. Analyst. 141, 6073-6079 (2016).
  14. Weltin, A., Kieninger, J., Enderle, B., Gellner, A. K., Fritsch, B., Urban, G. A. Polymer-based, flexible glutamate and lactate microsensors for in vivo applications. Biosens Bioelectron. 61, 192-199 (2014).
  15. Kling, A., et al. Multianalyte Antibiotic Detection on an Electrochemical Microfluidic Platform. Anal Chem. 88, (20), 10036-10043 (2016).
  16. Bruch, R., et al. Clinical on-site monitoring of ß-lactam antibiotics for a personalized antibiotherapy. Sci Rep. (2017).
  17. Horak, J., Dincer, C., Qelibari, E., Bakirci, H., Urban, G. Polymer-modified microfluidic immunochip for enhanced electrochemical detection of troponin i. Sens Actuators B Chem. 209, 478-485 (2015).
  18. Horak, J., Dincer, C., Bakirci, H., Urban, G. Sensitive, rapid and quantitative detection of substance P in serum samples using an integrated microfluidic immunochip. Biosens Bioelectron. 58, 186-192 (2014).
  19. Mattox, D. M. Handbook of Physical Vapor Deposition (PVD) Processing. Elsevier Inc. (2010).
Droge Film elektrochemische Microfluidic Biosensor fotoresist gebaseerde Platform: Apparaat Fabrication, On-chip Assay voorbereiding en werking van het systeem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bruch, R., Kling, A., Urban, G. A., Dincer, C. Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation. J. Vis. Exp. (127), e56105, doi:10.3791/56105 (2017).More

Bruch, R., Kling, A., Urban, G. A., Dincer, C. Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation. J. Vis. Exp. (127), e56105, doi:10.3791/56105 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter