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Bioengineering

Feuil sec axée sur la résine photosensible de biocapteurs microfluidiques électrochimiques plate-forme : Fabrication de dispositifs, préparation de dosage sur puce et fonctionnement du système

doi: 10.3791/56105 Published: September 19, 2017
* These authors contributed equally

Summary

Une plateforme de biocapteurs microfluidiques a été conçue et fabriqué en utilisant la technologie de résine photosensible feuil sec peu coûteux pour la quantification rapide et sensible des analytes différents. Ce système à usage unique permet la lecture électrochimique du-puce-immobilisé les dosages-enzymatique au moyen de la technique d’arrêt de débit.

Abstract

Ces dernières années, diagnostic biomarqueur est devenu un outil indispensable pour le diagnostic de la maladie humaine, en particulier pour les diagnostics de point-of-care. Une plateforme facile à utiliser et peu coûteux de capteur est hautement souhaitée pour mesurer différents types d’analytes (p. ex., biomarqueurs, hormones et des médicaments) quantitativement et spécifiquement. Pour cette raison, la technologie de résine photosensible feuil sec - permettant pas cher, fabrication facile et haut débit - servait à fabriquer les biocapteurs microfluidiques présentées ici. Selon l’essai biologique utilisé par la suite, la plate-forme polyvalente est capable de détecter différents types de biomolécules. Pour la fabrication de l’appareil, les électrodes de platine sont articule autour d’une feuille souple polyimide (PI) dans l’étape du processus de salle blanche seulement. La feuille PI sert de substrat pour les électrodes, qui sont isolés avec un photosensible à base d’époxy. Le canal microfluidique est ensuite généré par le développement et le laminage de feuilles de résine photosensible (DFR) feuil sec sur la plaquette de la PI. En utilisant une barrière hydrophobe s’arrêter dans le canal, le canal est divisé en deux domaines spécifiques : une section d’immobilisation pour le dosage immunoenzymatique et une cellule de mesure électrochimique pour la lecture du signal ampérométrique.

L’immobilisation de l’essai biologique sur puce est interprétée par l’adsorption de la biomolécules à la surface du canal. L’enzyme oxydase de glucose est utilisé comme un capteur pour la génération de signaux électrochimiques. En présence du substrat, glucose, peroxyde d’hydrogène est produit, qui est détecté à l’électrode de travail platine. La technique de coule-stop est appliquée pour obtenir l’amplification du signal avec une détection rapide. Biomolécules différent peut être mesurée quantitativement au moyen du système microfluidique introduite, ce qui donne une indication des différents types de maladies, ou, en ce qui concerne les drogues thérapeutiques surveillance, facilitant une thérapie personnalisée.

Introduction

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Pendant les deux dernières décennies, les applications diagnostiques sont devenus élémentaires pour des études approfondies sur le développement de la santé publique mondiale. Traditionnellement, les outils de diagnostic de laboratoire sont utilisées pour la détection des maladies. Même s’ils jouent encore un rôle essentiel dans le diagnostic des maladies, point-of-care test (FAOP) effectué à proximité du patient ou par le patient lui-même est devenu de plus en plus monnaie courante ces dernières années. Surtout dans de tels cas nécessitant un traitement immédiat, tels que l’infarctus aigu du myocarde ou de suivi de diabète, la confirmation rapide d’une constatation clinique est indispensable. Par conséquent, il y a un besoin croissant de dispositifs FAOP qui peut être utilisé par des non-spécialistes et qui sont en même temps capables d’effectuer des tests de diagnostic précis en vitro dans un court laps de temps1,2,3,4 .

Des améliorations remarquables ont été accomplis dans le domaine de la FAOP. Cependant, il existe encore de nombreux défis à surmonter5,6,7,8. Pour une plate-forme de FAOP qui sera lancé avec succès sur le marché et d’être compétitifs avec les diagnostics de laboratoire, l’appareil doit strictement remplir les exigences suivantes : (i) fournir des résultats précis et quantitatives qui sont en accord avec le laboratoire constatations ; (ii) avoir court échantillon-à-résultat fois, ce qui permet le traitement immédiat du patient ; (iii) disposent d’une manipulation simple et facile, même lorsque utilisé par des personnes inexpérimentées et nécessitent l’intervention de l’utilisateur réduite ; et (iv) comprennent un détecteur de faible coût conçu pour les applications à usage unique. En outre, exempte d’équipement diagnostic est favorables, principalement dans des environnements pauvres en ressources3,4,6.

En raison de ces exigences sévères, que deux systèmes FAOP basés sur détection électrochimique (p. ex., bandelettes de test glycémique) et sur les immuno-essais écoulement latéral (p. ex., les tests de grossesse maison) ont été lancés avec succès sur le marché ainsi jusqu'à maintenant. Cependant, les deux systèmes souffrent de désavantages comme mauvaises performances (c'est-à-dire sang surveillance du glucose a résultats inexacts et essais d’écoulement latéral fournissent seulement des résultats de mesure qualitative de (positifs ou négatifs))4, 6. Ces inconvénients des systèmes conventionnels de FAOP ont conduit à une demande croissante sur l’exploration de nouvelles technologies qui offrent une détection rapide, peu coûteux et quantitative au point de soins4,5.

Pour relever ces défis de dispositifs FAOP, technologie DFR a été récemment employée pour la fabrication de biocapteurs jetables et low-cost9,10,11,12, 13 , 14. par rapport aux matériaux lithographiques mou et liquides, comme le PDMS ou SU-8, DRJ présente de nombreux avantages : (i) sont disponibles dans une variété de compositions et d’épaisseurs (de quelques microns à quelques millimètres) ; (ii) ont une surface très rugueuse, qui facilite l’adhérence aux différents matériaux ; (iii) uniformité d’épaisseur excellente fonctionnalité ; (iv) offrir à peu de frais, facile et haut débit de fabrication pour la production de masse ; (v) sont facile à couper avec divers outils de faible coût, comme une simple paire de ciseaux ; et (vi) permettent la création de structures tridimensionnelles, comme canaux microfluidiques, par empilement des couches multiples de DFR uns sur les autres.

En revanche, DRJ ont en général une résolution relativement faible par rapport aux résines photosensibles liquides, qui sont principalement causés par l’épaisseur du film et de la distance accrue entre le masque et la DRF en raison de la pellicule protectrice, ce qui permet en outre de lumière diffusion. Pourtant, pour la fabrication de biocapteurs microfluidiques intégrée, DRJ est parfaitement adapté à la production de masse de faible coût.

Donc, nous présentons dans ce travail la fabrication et l’application d’un biocapteur axée sur la DFR électrochimique microfluidiques. Le protocole détaillé décrit chaque étape de production de la plateforme de biocapteurs, l’immobilisation sur puce d’un essai de modèle basé sur l’ADN et sa lecture électrochimique en utilisant la technique d’arrêt de débit. Cette plateforme universelle permet la détection de nombreuses sortes de biomolécules, utilisant des technologies de test différents (p. ex., génomique, cellomics et la protéomique) ou formats de test (p. ex., concurrentiel, sandwich ou direct). Basé sur une telle plate-forme DFR, notre groupe précédemment démontré avec succès la quantification rapide et sensible des analytes différents, y compris les antibiotiques13,15,16 (tétracycline, pristinamycine et ß-lactamines), troponine j’ai17et18de la substance P.

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Protocol

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1. fabrication de la microfluidique biocapteur utilisant la technologie DFR

  1. gaufrettes de préparation de la PI. Substrat de couper un PI
    1. in 6 - autour de gaufrettes. Mettre la plaquette de la PI dans un four à 120 ° C pendant environ 1 h pour une cuisson au four déshydratation.
  2. Pour le processus de décollage, première étape de photolithographie.
    1. Programme l’essorage-coater à une heure de spinning de 30 s à 3 000 tr/min, avec une accélération de 2 000 tr/min/s. Place la plaquette PI sur le spin-coater et résoudre ce problème, appliquer le vide. Verser 2 mL d’une résistance, permettant le processus de décollage et démarrer le programme d’essorage-coater. Enlever la plaquette de l’essorage-coater et soft-cuire la gaufrette PI sur une plaque chauffante pendant 2 min à 100 ° C.
    2. Ajuster le masque souhaité pour les électrodes sur la plaquette de PI à le œil nu le patterning et l’exposer à la lumière de 2 UV 400 mJ/cm (365 nm). Place la plaquette dans un bol rempli d’un développeur de filtrage de résister dans un agitateur orbital et laissez-le agiter légèrement pendant 1 min.
    3. Après avoir retiré l’excédent resist, utiliser une douche pour rincer la gaufrette de PI à l’eau désionisée (DI-eau) sur un banc humide et ensuite à l’aide d’air comprimé sec.
  3. Dépôt de platine pour la formation des électrodes.
    1. Utilise un procédé de déposition de vapeur physique standard de dépôt 200 nm de platine la gaufrette 19.
    2. Dans un bol, mettre la plaquette. Ajouter le solvant correspondant dans le bol et enlevez la resist déjaugeage et en agitant légèrement la plaquette dans un agitateur orbital jusqu'à ce que tous les excès platine est supprimé. Rincez et séchez la gaufrette PI tel que décrit à l’étape 1.2.3.
  4. Deuxième étape de photolithographie : formant la couche d’isolation.
      ,
    1. Mettre la plaquette de la PI dans un four préchauffé à 120 ° C pendant 5 min déshydrater les it.
    2. Programme de la première étape d’un spin-coater à 5 s de la filature de temps à 500 tr/min. Programme de la deuxième étape de 30 s à 4 000 tr/min, avec une accélération de 700 tr/min/s.
    3. Placer la plaquette PI sur le spin-coater et résoudre ce problème, appliquer le vide. Verser 4 mL d’une photorésine de base d’époxy approprié avant de démarrer le programme d’essorage-coater.
    4. Soft-cuire la gaufrette couchée pendant 3 min à 95 ° C sur une plaque chauffante.
    5. Ajuster le masque pour la couche d’isolation sur la plaquette en utilisant les repères respectifs et une lentille de l’oculaire. Exposer la gaufrette à 100 mJ/cm 2 UV light (365 nm).
    6. Pour une cuisson au four après l’exposition, placer les tranches sur une plaque chauffante préchauffée pendant 2 minutes à 95 ° C.
    7. Placer les tranches dans un bol et développer la résistance avec un développeur approprié (par exemple, 1-méthoxy-2-propyle-acetat pendant 2 min, dans le cas de SU-8) dans un agitateur orbital.
    8. Rincer la gaufrette PI d’abord avec de l’isopropanol et puis rincer et sécher comme indiqué au point 1.2.3.
    9. Dur-cuire la résine photosensible dans une étuve pendant 3 h à 150 ° C.
  5. Assisté par plasma nettoyage des électrodes.
    1. Pour enlever les résidus de résine photosensible, utiliser le plasma d’oxygène avec une unité de plasma standard. Démarrez le programme de nettoyage, à l’aide de puissance de 200 W basse fréquence avec un temps total de 3 min. 100 % O 2 flux et un taux de 250 sccm
    2. Placer la plaquette de la PI dans la chambre de plasma, fixer la plaquette sur la plaque de mise à la terre à l’aide de couvercles en verre et démarrer le processus de plasma.
  6. Argent et dépôts de chlorure d’argent : création de l’électrode de référence sur puce.
    1. Passivation le contact platine tampons de la plaquette avec un ruban adhésif de sensibles aux UV. Couper la feuille à 5 mm de largeur et 11 cm de long rayures et joignez-les à la plaquette, en protégeant les parties ne pas à déposer d’argent.
    2. Pour le dépôt d’argent, mettre un bain à ultrasons (35 kHz) dans une hotte et insérez un conteneur de solution d’électrolyte argent (100 g/L Ag, pH 12,5) dans la baignoire. Mettre le bain à ultrasons à température ambiante et la puissance de 10 %.
      ATTENTION : Solutions électrolytiques argent sont très toxiques et doivent être manipulées avec précaution. Les fumées ne devraient jamais être inhalées.
    3. Connecter le contact en vrac les électrodes de référence à une source de courant constant. Connecter l’électrode du compteur, un fil d’argent qui est immergé dans la solution d’électrolyte argent, à la source de courant à l’aide de câbles de raccordement standards.
    4. Définir la source de courant DC et une densité de courant de -4,5 mA/cm 2, soit un taux de dépôt argent d’environ 0,3 µm/min. commencer le bain à ultrasons et laisser la source actuelle tourner pendant 10 min. Rincer la gaufrette à DI-eau
    5. Pour la chloration de l’électrode de référence, insérez un navire de solution de chlorure de potassium (KCl) 0,1 M dans le bain à ultrasons. Raccorder le contact en vrac de la plaquette et une électrode de platine qui est immergée dans la solution de KCl avec la source de courant constant.
    6. Définir la source de courant DC et une densité de courant de + 0,6 mA/cm 2, soit un taux de dépôt d’environ 0,075 µm/min. commencer le bain à ultrasons et laissez la source de courant pour 7,5 min.
    7. Rincer et sécher le PI de wafer, tel que décrit à l’étape 1.2.3.
    8. Enlever le ruban de sensibles aux UV après un UV (365 nm) exposition de 300 mJ/cm 2 et de rincer et de sécher la gaufrette de PI, à nouveau, comme décrit dans étape 1.2.3.
  7. Troisième étape photolithographie : DRJ aide à créer des canaux microfluidiques.
    1. Coupe les couches DFR nécessaires à une taille similaire à celle de la plaquette (20 x 20 cm 2). Fixer le masque désiré sur l’Exposeur et aligner la couche DFR sur le masque en utilisant l’oeil nu. Illuminer la resist avec 250 mJ/cm 2 UV light (365 nm).
    2. Retirer le film protecteur de la résine photosensible et développer la résistance pendant environ 2 minutes (selon les structures) dans une solution de carbonate de sodium (Na 2 CO 3) de 1 % à l’aide d’un bain à ultrasons standard (35 kHz) préchauffé à 42 ° C et une puissance sonore de 100 %. Pour arrêter la réaction immédiatement, secouez la résister pendant 1 min dans un bain d’HCl 1 % dans un agitateur orbital. Rincer et sécher chaque couche DFR, tel que décrit à l’étape 1.2.3.
      Remarque : Au total, quatre couches DFR doivent être traités comme indiqué dans l’étape 1.7 : couche un canal, un couvre couche et deux couches de dos (empêchant le biocapteur de plier à la fin).
  8. Des couches de stratification de la DRF sur le substrat PI.
    1. Placer la plaquette PI sur une feuille de frais généraux de transparence et fixez-le à l’aide d’un ruban adhésif standard. Ajuster la couche de canal DFR sur la plaquette PI sous un microscope, en utilisant les structures respectives alignement.
    2. Pour la stratification, utiliser une plastifieuse standard de pain chaud et préchauffer le rouleau supérieur à 100 ° C et le rouleau inférieur à 60 ° C. régler la pression à 3 bars, avec une vitesse de 0,3 m/min. Place la gaufrette avec la couche DFR fixe au milieu de la plastifieuse et Démarrez-le ; la DRF est poussée par la plastifieuse. Répétez l’étape après avoir tourné la gaufrette de 180°.
    3. Pour éviter la flexion du biocapteur, stratifié les deux couches de dos développés sur la plaquette suivant étapes 1.8.1-1.8.2.
  9. Employant une barrière hydrophobe s’arrêter et la puce d’étanchéité.
    1. Enlever la couche protectrice de la face avant du chenal DFR laycateur en plaçant un ruban adhésif standard à une extrémité de la DRF et en tirant vers le haut. Utiliser un distributeur de main avec tubes de 0,004 composant logiciel enfichable pour distribuer des petites gouttelettes de polytétrafluoroéthylène dissous dans les puits de la couche d’isolation. Pour sceller la puce microfluidique, laminé la pellicule protectrice DFR sur la couche de canal, tel que décrit à l’étape 1.8.
  10. Dur la cuisson les biocapteurs microfluidiques.
    1. Supprimer tous les protecteur feuilles sur la couverture et le dos de couches DFR. Couper les biocapteurs en lanières à l’aide d’une paire de ciseaux d’ordinaire. Guérir les puces dans un four à 160 ° C pendant 3 h

2. MODE OPERATOIRE immobilisation sur puce

  1. Adsorption d’avidine dans le domaine de l’immobilisation de la chaîne.
    1. Préparer une solution d’avidine 100 µg/mL en 10 mM tampon phosphate salin (PBS) à un pH de 7.4.
    2. Distribuer 2 µL de la solution de l’avidine à la prise du biocapteur.
      Remarque : Le canal est rempli par des forces capillaires jusqu'à ce que le liquide atteigne la barrière hydrophobe arrêt.
    3. Pour s’assurer que la fluidique continue d’arrêt à la barrière pendant le temps entier d’incubation, administrer 2 µL de DI-l’eau à la sortie de la puce. Incuber la puce à 25 ° C pendant 1 h dans un récipient fermé.
    4. Supprimer excès réactifs grâce à l’entrée de la puce en appliquant un vide. Laver le canal avec 50 µL de tampon de lavage (PBS avec 0,05 % Tween 20), distribué à la sortie alors que le vide est appliqué. Sécher le canal pendant 30 s, tandis que le vide est appliqué.
  2. Bloquer la surface du canal pour inhiber la liaison non-spécifique.
    1. Préparer une solution d’albumine sérique bovine (BSA) de 1 % en 10 mM PBS à un pH de 7.4.
    2. Pipette 2 µL de la solution de BSA 1 % sur l’entrée et 2 µL de DI-l’eau à la sortie du canal. Incuber la puce à 25 ° C pendant 1 h dans un récipient fermé. Retirez l’excès réactifs et sécher le canal comme indiqué au point 2.1.4.
  3. Oligos d’incubation de l’ADN marqué avec biotine et 6-Fam.
    1. Préparer à différentes concentrations (0,001-5 µM) de la solution d’ADN en 10 mM PBS à un pH de 7.4.
    2. Distribuer 2 µL d’une concentration de la solution d’ADN sur l’entrée et 2 µL de DI-l’eau à la sortie. Incuber la puce à 25 ° C pendant 15 minutes dans un récipient fermé.
    3. Répéter l’étape 2.3.2 pour les autres concentrations d’ADN à l’aide de jetons supplémentaires biocapteur.
    4. Enlever les excès réactifs et sécher le canal comme indiqué au point 2.1.4.
  4. Anticorps marqués immobilisation de GOx de 6-FAM.
    1. Formuler une concentration de 5 µg/mL d’anticorps 6-FAM en 10 mM PBS à un pH de 7.4.
    2. Introduire 2 µL de la solution d’anticorps à l’entrée et 2 µL de DI-l’eau à la sortie du canal. Incuber les anticorps marqués à 25 ° C pendant 15 minutes dans un récipient fermé. Retirez l’excès réactifs, comme indiqué au point 2.1.4.

3. Ampérométrique Signal Detection Using la Technique coule-Stop

  1. préparation de la solution de substrat pour la détection électrochimique.
    1. Formuler une solution de glucose de 40 mM dans du PBS de 0,1 M à un pH de 7,4 à ultra-pures.
    2. Pour le traitement préliminaire, préparer une solution de PBS de 0,1 M à pH 7,4 dans ultra-pures.
  2. Traitement préliminaire des électrodes travail.
    1. Utiliser le support de la puce sur mesure afin de permettre la mise en place facile de la puce et un lien fluidique et électrique.
    2. Connecter électriquement le biocapteur au potentiostat. Assurer le contact fluidique du canal microfluidique un pousse-seringue et le réservoir de réactif à l’aide de l’adaptateur sur mesure et les tubes. Démarre l’ordinateur portable qui est connecté à la potentiostat et démarrer le contrôleur de pompe seringue, contrôle de la circulation fluidique grâce à la puce.
    3. Démarrer manuellement, le pousse-seringue avec du PBS de 0,1 M à un débit de 20 µL/min. À l’électrode de travail par rapport à l’électrode de référence sur puce, appliquer une tension alternative de 0,8 et de -0,05 V pour 5 s chaque 30 cycles. Suite à cela, s’oxydent l’électrode de travail en appliquant une tension de 0,8 V pendant 60 s.
  3. Lecture de test en utilisant la technique d’arrêt de débit.
    1. Pour commencer la lecture du signal test, attendez jusqu'à ce que le signal mesuré actuel se stabilise. Arrêter la pompe de seringue et basculer le réactif de PBS de 0,1 M à la solution de glucose de 40 mM et démarrez le logiciel sur le contrôleur de pompe seringue ; Il s’arrête automatiquement l’écoulement pour 1, 2 ou 5 min et va redémarrer puis le débit à nouveau. Observez la pointe de courant qui en résulte.
      Remarque : Pour l’analyse des données, la pointe de courant ou de la charge du PIC sont envisageables, comme décrit dans le modèle d’un affichage de signal électrochimique ( Figure 2).

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Representative Results

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Conception et Fabrication de la plate-forme de biocapteurs microfluidiques :

La fabrication des puces microfluidiques biocapteur est réalisée sur le wafer-niveau par des techniques photolithographiques standard utilisant des couches multiples de DFR. Cette stratégie de fabrication repose sur la stratification de couches développés de DRJ sur un substrat de PI platine à motifs, formant des canaux microfluidiques. Un bref résumé décrivant les étapes de fabrication différente est donné à la Figure 1. Une plaquette simple 6 po comprend 130 biocapteurs microfluidiques, chacun avec une dimension de 8 × 10 mm2.

Figure 1
Figure 1. Une illustration graphique des étapes différentes de fabrication de la plateforme de biocapteurs microfluidiques. a) substrat coupe le PI dans 6 pouces autour de gaufrettes. b) l’exposition d’un décollage possible de spin-enduit résiste en utilisant le masque respectif pour platine structuration. c) substrat après exposition, dos après l’exposition et l’élaboration de la résine photosensible. d) dépôt de vapeur physique de platine sur le substrat. e) processus de décollage pour enlever la résine photosensible excès. f) spin-revêtement de SU-8, formant une couche d’isolation. g) O2 procédé plasma pour éliminer les résidus de SU-8 sur les électrodes de Pt. h) les dépôts galvanique de l’électrode de référence Ag/AgCl. i) exposition aux UV et le développement des différentes couches DFR. j) stratification des couches DFR sur la plaquette de la PI. polytétrafluoroéthylène distribution résolu de k), formant une barrière hydrophobe s’arrêter entre le capillaire de l’immobilisation et la cellule électrochimique. l) biocapteurs microfluidiques électrochimique final. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Chaque biocapteur se compose d’un microfluidique canal, deux zones distinctes séparée par une barrière hydrophobe s’arrêter : une section d’immobilisation et une cellule électrochimique, marqués en rouge et bleu, respectivement, à la Figure 2. La partie de l’immobilisation de la microchannel a une surface de 10,34 mm2 et un volume de 580 nL, ayant pour résultat un surface volume ratio / élevé de 155 cm-1. La cellule électrochimique comprend une électrode de référence sur puce argent/chlorure d’argent et un compteur et l’électrode de travail platine. Cette séparation de la zone d’immobilisation et la lecture électrochimique du dosage empêche toute contamination des électrodes avec les biomolécules et inhibe donc l’encrassement des électrodes. En outre, il permet la mesure précise des réactifs immobilisation de remplissage capillaire.

Figure 2
Figure 2. Illustration du principe d’exploitation de la plate-forme microfluidique électrochimique. a) schémas d’un dosage de modèle basée sur l’avidine. b) photo de la microfluidique biocapteur montrant ses principaux éléments, y compris la contre-électrode (EC), l’électrode de référence (RE), l’électrode de travail (WE) et la barrière d’arrêt (SB). La zone d’immobilisation est surlignée en rouge, et la cellule électrochimique est marquée en bleu. c) schématique réaction d’oxydation du peroxyde d’hydrogène produite à l’électrode de travail Pt pour détection ampérométrique à l’intérieur de la cellule électrochimique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

En employant DRJ pour la fabrication du capteur, le procédé de fabrication permet à haut débit sur le wafer-niveau. Par conséquent, les coûts peuvent être réduites vers le bas au minimum. Le développement de toutes les couches DFR est fait en utilisant des masques de papier simple et peu coûteuse et une unité d’exposition sous vide, plutôt que de coûteux chrome masques et un aligneur de masque. En outre, la réduction des étapes des processus de salle blanche nécessaire au minimum réduit les coûts de fabrication encore plus. Au total, la procédure de fabrication prend une charge de travail d’environ 10 h, sauf les temps de cuisson et le dépôt de vapeur physique de la platine.

On-chip test d’Incubation :

L’incubation sur puce dosage est effectuée par des forces capillaires. Pipetage de gouttes de réactifs différents sur l’entrée du chenal de la microfluidique, les fluides sont conduits par la voie par action de capillarité jusqu'à ce qu’ils atteignent la barrière hydrophobe arrêt. Dans des conditions stationnaires, les réactifs sont ensuite incubées pendant un certain temps distinct. Ce système passif permet le remplissage capillaire de la manche, sans besoin de n’importe quel instrumentation externe comme un pousse-seringue et permet la mesure précise des réactifs, comme le fluide automatiquement s’arrête à la barrière de s’arrêter. En outre, le flux de travail est conforme à celle d’un ELISA classique et il fonctionne avec des liquides de grande viscosité comme le sérum ou le sang.

Dans le but de cette expérience, le fonctionnement de la puce est démontré par un test simple de dosage utilisant l’interaction de l’avidine-biotine, comme illustré à la Figure 2. L’analyse de sur-puce d’incubation commence avec l’adsorption de l’avidine à la surface capillaire pendant 1 h, suivie d’une étape de blocage avec BSA pour encore 1 h. Par la suite, 6-FAM/biotine-étiquetée d’ADN est incubé dans l’immobilisation capillaire pendant 15 min, où il se lie aux molécules avidine. Entre chaque étape d’incubation, les biomolécules indépendants sont enlevés par une étape de lavage. Le tampon de lavage est appliqué par l’intermédiaire de la prise du canal à l’aide d’un adaptateur vide sur mesure. Dans la dernière étape, anticorps antifluorescein de glucose oxydase-marqués sont introduits dans le canal pendant 15 min. Après cela, le biocapteur est prêt pour la lecture électrochimique, en utilisant une solution de 40 mM de glucose comme substrat.

Lecture d’ampérométrique Signal en utilisant la Technique d’arrêt de débit :

Pour la lecture du signal du dosage immobilisée, l’enzymes produit (ici, H2O2), en présence de son substrat, glucose, peut être détecté par voie électrochimique à l’électrode de travail dans la cellule électrochimique. Pour réaliser une détection rapide ainsi que de l’amplification du signal, la technique dite de la coule-stop est utilisé13. Dans cette méthode, le flux du substrat est arrêté, ce qui conduit à une accumulation du produit à l’intérieur du capillaire. Donc, la quantité de produit H2O2 dépend de la quantité de glucose lié oxydase et dépend de la quantité de lié biotinylé ADN. En redémarrant le débit, la concentration de2 H2O améliorée est rincée à travers la cellule de mesure électrochimique, résultant en un signal de crête courant, tel qu’illustré à la Figure 3.

Pour l’analyse des données, la technique coule-stop offre deux différents paramètres : la hauteur maximale et la charge (c'est-à-dire, l’intégrale) du signal maximum. Les deux paramètres sont directement proportionnels au temps d’arrêtet peut donc être utilisé pour analyser les données. Compte tenu de l’évaluation des données, lorsque vous utilisez la hauteur du pic, la hauteur du signal dépend de la concentration de2 H2O maximum et donc son coefficient de diffusion et de l’heure d’arrêt appliquée. Plus le temps de s’arrêter, plus la réponse du signal mesuré. Pour cette raison, la hauteur du pic jaugés reste constante, jusqu'à une longueur minimale de l’immobilisation capillaire. Cette particularité de la technique coule-stop permet une diminution drastique de dimensions de puce, en particulier dans la longueur capillaire, tout en préservant la sensibilité du capteur.

Figure 3
Figure 3. Modèle d’une lecture du signal électrochimique généralement obtenus d’un dosage immunoenzymatique utilisant la technique d’arrêt de débit. un) un flux d’une solution de glucose de 40 mM à raison de 20 µL/min a été appliqué. Au cours de la phase d’arrêt (1, 2 ou 5 min), la production de l’enzyme de H2O2 se poursuit. En redémarrant le flux, le cumul H2O2 s’écoule dans la cellule électrochimique, où l’eau oxygénée est électrochimiquement détectée. En répétant la mesure plusieurs fois (barres d’erreur ; SEM), un étalonnage sur puce courbe b) est obtenue. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

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Le protocole présenté ici pour la fabrication d’un Biocapteur électrochimique microfluidique permet le développement d’une plate-forme abordable, compact et facile à utiliser pour la détection des biomolécules. Selon le test utilisé par la suite sur le biocapteur, plusieurs différents biomarqueurs peuvent être détectées. Cela rend la plate-forme très polyvalent et fournit un accès étendu à divers domaines d’application, des tests de diagnostic standards (p. ex., déterminer la présence de certaines maladies chez le médecin) aux applications de point-of-care (par exemple, le suivi thérapeutique pharmacologique d’un patient pour individualisé pharmacothérapie). En particulier diagnostic point-of-care, biocapteurs miniaturisés ont beaucoup d’avantages par rapport aux méthodes conventionnelles, qui habituellement nécessite des équipements de laboratoire, employés spécialisés et grand réactif et volume des échantillons et ont long délai d’exécution fois.

La fabrication de ce biocapteur nécessite strictement à la suite du protocole ; Sinon, des problèmes de fabrication peut se produire. Une des questions plus souvent observées est le désalignement des différentes couches. Cela peut être facilement résolu en utilisant un appareil plus avancé pour le processus de fabrication, ce qui permet l’alignement plus facile et plus précise des différentes couches.

La technologie DFR offre la possibilité de fabrication rapide et peu coûteuse. En revanche, la technologie est limitée en termes de résolution. Par exemple, les canaux microfluidiques de très petites structures (moins de 100 µm) ne peut être réalisé en utilisant le protocole présenté ici. Dans un tel cas, la photolithographie doit être effectuée par un aligneur de masque de haute précision avec verre photomasks. En outre, un canal de trop à l’échelle peut être également problématique, puisque le canal pourrait plier vers le bas, réduisant la hauteur du canal et qui influencent le comportement de microfluidique de la puce.

Nous croyons que la technologie DFR sera plus présente dans les futures applications car il peut facilement être transposé à usage commercial. La production en série de capteurs de microfluidique DFR-basé ne sera aucune entrave lorsqu’il arrive sur le marché parce que la technique est bien établie dans d’autres domaines d’application (par exemple, l’électronique flexible).

En termes de réduction de la complexité de l’ensemble du système, notre futur travail portera sur la conception et la mise en œuvre d’une cartouche jetable microfluidique qui comprend la puce de biocapteurs ; un réservoir de déchets ; et pré-chargé réactifs, tels que le tampon de lavage et autres éléments d’analyse. Pour la mesure ampérométrique, la livraison de l’échantillon et les autres réactifs peut ensuite être fournie par actionnement pneumatique. Cela sera interprété par le lecteur de l’ordinateur de poche et se déplace grâce à la puce de biocapteurs microfluidiques à un réservoir de déchets.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier la Fondation allemande de la recherche (DFG) pour financer partiellement cette œuvre sous Grant Numbers UR 70/10-01 et UR 70/12-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Pyralux DuPont AP8525R Used as polyimide substrate
MA-N 1420 Micro Resist Technology MA-N1420 Lift-off resit to define the platinum depostion
Ma-D 533s Micro Resist Technology MaD533S Developer for MA-N1420
Platinum - - Electrode and contact pad material
Ma-R 404s Micro Resist Technology MaR404S Remover for MA-N1420
SU-8 3005 MicroChem Corp. SU-8-3005 Photoresist to define the electrode area and as insulation
1-methoxy-2-propanol acetate Sigma-Aldrich 108-65-6 Developer for SU-8 3005
2-Propanol VWR 8.18766.2500 Removing of the SU-8 developer
1020R Ultron Systems Inc. 1020R UV sensitive adhesive tape for protection of contact pads
Arguna S Degussa 1935 For Silver depostion on reference electrode
KCl Methrom 62308.020 For chloridation of the silver reference electrode
Pyralux DuPont PC1025 Dry film photoresist
Sodium carbonat Fluka 71352 Developer for Pyralux PC1025
Hydrogen chloride Sigma-Aldrich 30720 To top the development of the DFR
Teflon AF 1600 DuPont AF1600 For employing the stopping barrier
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
PA104 Mega Electronics - Bubble etch tank
FED 53 Binder 9010-0018 Oven
SPIN150 APT - Spin coater
Präzitherm Harry Gestigkeit GmbH PZ 28-2 Hot plate
Hellas Bungard Elektronik 40000 Exposure unit
Tetra30-LF-PC Diener - Plasma unit
Univex 500 Leybold - Physical vapor deposition unit
Shaker S4 ELMI - Orbital shaker
Sonorex Super 10 P Bandelin 783 Sonic bath
6221 DC and AC Keithley - Current source
HRL 350 Ozatec - Laminator unit
Vaccum pen EFD - Vacuum pen

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References

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Feuil sec axée sur la résine photosensible de biocapteurs microfluidiques électrochimiques plate-forme : Fabrication de dispositifs, préparation de dosage sur puce et fonctionnement du système
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Bruch, R., Kling, A., Urban, G. A., Dincer, C. Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation. J. Vis. Exp. (127), e56105, doi:10.3791/56105 (2017).More

Bruch, R., Kling, A., Urban, G. A., Dincer, C. Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation. J. Vis. Exp. (127), e56105, doi:10.3791/56105 (2017).

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