Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

פלטפורמה מבוססת Photoresist ביוסנסור אלקטרוכימי Microfluidic הסרט יבש: ייצור המכשיר, הכנה על שבב Assay, ותפעול המערכת

doi: 10.3791/56105 Published: September 19, 2017
* These authors contributed equally

Summary

פלטפורמה ביוסנסור microfluidic תוכנן של מפוברק בטכנולוגיית photoresist הסרט יבש בעלות נמוכה עבור כימות מהיר ורגיש של analytes שונים. מערכת זו לשימוש יחיד מאפשרת מדידה אלקטרוכימי של--צ'יפ-משותק מבחני מקושרים-אנזים באמצעות הטכניקה להפסיק זרימה.

Abstract

בשנים האחרונות, סמן אבחון הפך כלי הכרחי לאבחון של מחלות אנושיות, במיוחד עבור האבחון בשלב של טיפול. פלטפורמה נוחה לשימוש, בעלות נמוכה חיישן רצוי מאוד למדוד סוגים שונים של analytes (למשל, סמנים ביולוגיים, הורמונים ותרופות) באופן כמותי, במיוחד. מסיבה זו, הסרט יבש photoresist טכנולוגיה - הפעלת זול, ייצור נתיישב, תפוקה גבוהה - שימש לייצור את החיישן microfluidic המוצג כאן. בהתאם התכולה יוצאת משמש לאחר מכן, פלטפורמה תכליתי היא מסוגלת לאתר סוגים שונים של מולקולות. עבור ייצור של המכשיר, אלקטרודות הפלטינה בנויות על רדיד גמיש פוליאימיד (PI) שלב תהליך רק חדר. מסכל PI משמש מצע עבור האלקטרודות, אשר הם מבודדים עם photoresist על בסיס אפוקסי. ערוץ microfluidic נוצר לאחר מכן על ידי פיתוח, למינציה של הסרט יבש foils photoresist (DFR) על גבי כשהפחד PI. באמצעות מחסום לעצור הידרופובי בערוץ, הערוץ מחולק לשני אזורים ספציפיים: מקטע הנייח וזמינותו מקושרים-אנזים, תא אלקטרוכימי מדידה לבדיקה האות amperometric.

הנייח על שבב bioassay מתבצע על ידי ספיחה של מולקולות השטח ערוץ. האנזים גלוקוז אוקסידאז משמש מתמר לדור אות אלקטרוכימי. בנוכחות המצע, גלוקוז, מופק מימן על-חמצני, אשר זוהה על האלקטרודה עבודה פלטינה. הטכניקה להפסיק זרימה מוחל לקבל הגברה של האות יחד עם זיהוי מהיר. מולקולות שונות ניתן למדוד באופן כמותי באמצעות מערכת microfluidic הציג, נותן אינדיקציה של סוגים שונים של מחלות, או, לענין הסמים טיפולית ניטור, דבר המקל על טיפול אישי.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בשני העשורים האחרונים, הפכו יישומים אבחון יסודי ללימודים מעמיקים על הפיתוח של בריאות הציבור הכללית. באופן מסורתי, כלי אבחון מעבדה משמשים לאיתור מחלות. למרות שהם עדיין משחקת תפקיד מפתח באבחון של מחלות, בדיקות בשלב של טיפול (הדגימה) ביצע ליד החולה או על ידי המטופל עצמו הפך יותר ויותר שגרתי בשנים האחרונות. במיוחד במקרים כאלה הדורשים טיפול מיידי, כגון אוטם אקוטי או סוכרת ניטור, אישור מהיר של ממצא קליני הוא חיוני. לפיכך, יש צורך הולך וגדל עבור התקנים הדגימה. זה יכול להיות מופעל על ידי שאינם מומחים, במקביל שמסוגלים ביצוע מדויק במבחנה בדיקות אבחון בלה זמן קצר1,2,3,4 .

השיפורים המדהימים שכבר הושגו בתחום של הדגימה. עם זאת, יש עדיין אתגרים רבים להתגבר על5,-6,-7,-8. עבור פלטפורמה הדגימה. להיות משוגר בהצלחה בשוק וכדי להיות תחרותי עם בדיקות מעבדה, המכשיר חייב בתכלית האיסור למלא את הדרישות הבאות: (i) לספק תוצאות מבחן כמותי ומדויק עקביים עם מעבדה הממצאים; (ii) יש קצר לדוגמה-כדי-תוצאה פעמים, המאפשרים טיפול מיידי של החולה; (iii) כוללים טיפול מסובך ולא קל, אפילו כאשר מופעלים על ידי יחידים מיומנת, ודורשים התערבות משתמש הממוזערת; ו- (ד) מהווים יחידה נמוכים חיישן תוכנן עבור יישומים לשימוש יחיד. יתר על כן, ללא ציוד דיאגנוסטיקה הם חיוביים, בעיקר ב משאב מסכן סביבות3,4,6.

עקב דרישות חמורות אלה, רק שתי מערכות הדגימה. מבוסס על זיהוי אלקטרוכימי (למשל, דם גלוקוז לבדוק רצועות) ועל זרימה לרוחב immunoassays (למשל, בדיקות הריון ביתית) בהצלחה שוגרו בשוק כל כך עד עכשיו. עם זאת, שתי מערכות סובלים חסרונות כגון ביצועים ירודים (קרי, ניטור גלוקוז בדם יש תוצאות הבדיקה אינה מדויקת, מבחני לרוחב זרימה רק מספקים תוצאות המדידה (חיובי או שלילי) איכותי)4, 6. אלה החסרונות של מערכות הדגימה קונבנציונאלי הובילו לדרישה גוברת על חקר טכנולוגיות חדשות מציעים זיהוי מהיר בעלות נמוכה, כמותיים בנקודת הטיפול4,5.

כדי לענות על האתגרים הללו מול התקנים הדגימה., טכנולוגיה DFR לאחרונה ננקטה להרכבת ביולוגיים חד פעמיות, בעלות נמוכה9,10,11,12, 13 , 14. לעומת חומרים ליטוגרפית נוזלי ורכים, כגון PDMS או סו-8, DFRs להציג יתרונות רבים: הם (i) זמינים במגוון רחב של יצירות, עוביים (מתוך כמה מיקרון עד כמה מילימטרים); (ii) יש פני שטח קשה מאוד, המאפשרת הדבקה על חומרים שונים; (iii) אחידות עובי מצוינת תכונה; (iv) מציעים ייצור זול נתיישב, תפוקה גבוהה לייצור המוני; (v) הם קל לחתוך עם כלים שונים בעלות נמוכה, כמו זוג פשוט מספריים; ו (vi) לאפשר את הקמת מבנים תלת-ממדיים, כגון ערוצי microfluidic, על-ידי סידור בערימה שכבות מרובות DFR אחד על גבי השני.

מצד שני, DFRs באופן כללי יש רזולוציה הדלה יחסית בהשוואה photoresists נוזלי, אשר נגרמת בעיקר על ידי עובי הסרט על ידי המרחק גדל בין המסכה את DFR עקב מסכל מגן, המאפשרת בנוסף אור פיזור. עדיין, על הייצור של microfluidic משולב ביולוגיים, DFRs מתאימים מאוד לייצור המוני בעלות נמוכה.

לכן, נוכח זה אנחנו עובדים על ייצור ויישום של ביוסנסור מבוססי DFR microfluidic אלקטרוכימי. פרוטוקול מפורט מתאר כל שלב בייצור של פלטפורמת ביוסנסור, את הנייח על שבב של וזמינותו של מודל המבוסס על ה-DNA, שלה readout אלקטרוכימי בטכניקה להפסיק זרימה. פלטפורמה אוניברסלית זו מאפשרת הגילוי של סוגים רבים של מולקולות, באמצעות טכנולוגיות שונות assay (למשל, גנומיקה, cellomics ו פרוטאומיקס) או תבניות assay (למשל, תחרותי, כריך או ישיר). מבוסס על פלטפורמה DFR כזה, הקבוצה שלנו בהצלחה הפגינו בעבר כימות מהיר ורגיש של analytes שונים, כולל אנטיביוטיקה13,15,16 (טטרציקלין, pristinamycin, אנטיביוטיקה ß lactam), טרופונין אני17, וחומר P18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1-ייצור של Microfluidic ביוסנסור באמצעות טכנולוגיית DFR

  1. הכנה של החוקר וופלים.
    1. המצע גזור פאי לתוך 6 - ב סיבוב ופלים. לשים כשהפחד PI בתנור ב 120 ° C עבור בערך 1 h על אופים התייבשות-
  2. צעד ראשון פוטוליתוגרפיה עבור תהליך ההמראה.
    1. לתכנת את הספין-coater בזמן ספינינג 30-s ב- 3000 סל ד, עם האצה של 2,000 סל"ד/s. המקום כשהפחד PI-הספין-coater, לתקן את זה, החלת ואקום. לוותר על 2 מיליליטר להתנגד, הפעלת תהליך ההמראה, ולהתחיל את התוכנית ספין-coater. הסר את לחם הקודש של הספין-coater ואופים רך-PI כשהפחד על פלטה חמה למשך 2 דקות ב-100 מעלות צלזיוס
    2. להתאים את מסיכת הרצוי עבור תכנים האלקטרודות על כשהפחד PI בעין בלתי מזוינת, לחשוף אותם לאור 2 UV 400 mJ/cm (365 ננומטר). המקום כשהפחד בקערה מלא עם מפתח תואם להתנגד על תפקודי לב / נשימה ולתת לו לנער מעט דק 1
    3. לאחר להתנגד עודף מוסר, להשתמש מקלחת כדי לשטוף את PI וופל עם מים יונים (DI-מים) על ספסל רטובה ויבשה אותו לאחר מכן באמצעות אוויר דחוס.
  3. בתצהיר של פלטינה להיווצרות האלקטרודות.
    1. להשתמש בתהליך התצהיר אדי פיזי רגיל עד יבש 200 ננומטר פלטינה על וופל 19.
    2. מניחים את פרוסת סיליקון בקערה. להוסיף החולף התאמת לקערה ולהסיר את ההמראה להתנגד תוך מעט רועד כשהפחד על תפקודי לב / נשימה עד להסרת כל פלטינה עודף. שוטפים ומייבשים את וופל PI כפי שמתואר בשלב 1.2.3.
  4. פוטוליתוגרפיה השלב השני: ויוצרים את שכבת הבידוד.
    1. לשים כשהפחד PI בתנור טרופה 120 מעלות למשך 5 דקות מייבשים את זה
    2. תוכנית בשלב הראשון ספין-coater 5 s של ספינינג זמן במהירות של 500 סל ד. תוכנית השלב השני ב-30 s ב- 4,000 סל ד, עם האצה של 700 סל ד/ס
    3. במקום כשהפחד PI על הספין-coater ולתקן, החלת ואקום. לוותר על 4 מיליליטר photoresist על בסיס אפוקסי המתאימה לפני שמתחילים את התוכנית ספין-coater.
    4. רך-אופים וופל מצופה למשך 3 דקות ב 95 מעלות צלזיוס על פלטה חמה.
    5. להתאים את המסיכה לשכבה בידוד על כשהפחד בעזרת הסימנים יישור בהתאמה של עינית העדשה. לחשוף כשהפחד לאור 2 UV 100 mJ/cm (365 nm).
    6. על אופים לאחר חשיפה, מקום כשהפחד על פלטה preheated למשך 2 דקות ב- 95 מעלות צלזיוס
    7. מקום כשהפחד לתוך קערה ולפתח את להתנגד עם מפתח מתאים (למשל, 1-מתוקסי-2-propyl-acetat למשך 2 דקות, במקרה של סו-8)-תפקודי לב / נשימה.
    8. לשטוף את וופל PI קודם עם אלכוהול איזופרופיל, ואז לשטוף, לייבש אותו כפי שמתואר בשלב 1.2.3.
    9. קשיח-אופים photoresist בתנור במשך 3 שעות ב 150 מעלות צלזיוס
  5. בסיוע פלזמה ניקוי של האלקטרודות.
    1. כדי להסיר את שאריות photoresist, להשתמש בחמצן פלזמה עם יחידת פלאזמה סטנדרטי. הפעלת התוכנית הניקיון, באמצעות כוח בתדר נמוך 200-W עם 100% O 2 זרימה, בשיעור של 250 sccm הזמן הכולל של לפחות 3
    2. מקום כשהפחד PI לתא פלסמה, לתקן את לחם הקודש על הצלחת מוארק באמצעות זכוכית עפעפיו, להתחיל בתהליך פלזמה.
  6. כסף ומשקעים כלוריד כסף: יצירת האלקטרודה הפניה על שבב-
    1. Passivate הקשר פלטינה רפידות הנגדי של דבק UV-רגיש. לחתוך את נייר הכסף 5 פסים ברוחב מ מ ו- 11 ס מ באורך וחבר אותם כשהפחד, הגנה על החלקים לא למוסרם עם כסף-
    2. לתצהיר כסף, להכניס אמבטיה סוניק (35 kHz) ארון fume ולהוסיף מכולה של פתרון אלקטרוליט כסף (100 גרם/ליטר Ag, pH 12.5) לתוך האמבט. הגדר האמבט סוניק בטמפרטורת החדר ואת הכוח 10%-
      התראה: פתרונות אלקטרוליט כסף הם רעילים מאוד ויש לטפל בזהירות מרבית. לא צריך להיות בשאיפה מהאדים.
    3. להתחבר המגע בצובר של האלקטרודות התייחסות רציפה הנוכחי. חיבור האלקטרודה מונה, חוט כסף כי הוא שקוע הפתרון אלקטרוליט כסף, אל המקור הנוכחי באמצעות כבלי חיבור רגיל.
    4. להגדיר את מקור זרם DC, צפיפות זרם של-4.5 מא/cm 2, וכתוצאה מכך קצב התצהיר כסף של 0.3 מיקרומטר לדקה תמלא. את האמבטיה סוניק ותן מקור הנוכחי לרוץ במשך 10 דקות יש לשטוף לחם הקודש במים-DI
    5. הכלרה של האלקטרודה הפניה, להוסיף כלי קיבול של 0.1 M אשלגן כלורי (אשלגן) פתרון לאמבטיה סוניק. חיבור הקשר בצובר של כשהפחד, אלקטרודת פלטינה זה הוא שקוע הפתרון אשלגן כלורי עם מקור זרם קבוע.
    6. להגדיר את מקור זרם DC, צפיפות זרם של +0.6 מא/cm 2, וכתוצאה מכך קצב התצהיר של בערך 0.075 ק מיקרומטר לדקה תמלא. את האמבטיה סוניק ותן מקור הנוכחי רוצי מינימלית 7.5
    7. שטיפה ויבש החוקר וופל, כפי שמתואר בשלב 1.2.3.
    8. להסיר את הקלטת UV רגיש לאחר אולטרה (365 ננומטר) חשיפה של 300 mJ/cm 2, שטיפה יבש כשהפחד PI, שוב כפי שמתואר בשלב 1.2.3.
  7. בצעד פוטוליתוגרפיה השלישי: שימוש DFRs כדי ליצור את ערוצי microfluidic.
    1. לחתוך את השכבות DFR הדרוש לגודל דומה לזה של כשהפחד (20 x 20 ס מ 2). לתקן את המסכה הרצוי על גבי יחידת חשיפה ויישר את השכבה DFR על גבי המסכה באמצעות בעין בלתי מזוינת. להאיר את להתנגד עם 250 mJ/cm 2 UV אור (365 nm).
    2. להסיר את נייר הכסף מגן של photoresist ולפתח את להתנגד למשך בערך 2 דקות (בהתאם המבנים) בתמיסה נתרן פחמתי (נה 2 CO 3) 1% באמצעות תקן סוניק אמבט (35 kHz) טרופה 42 ° C, כוח סוניק של 100%. כדי להפסיק באופן מיידי את התגובה, לנער את להתנגד עבור 1 דקות באמבט HCl 1% על תפקודי לב / נשימה. שוטפים ומייבשים כל שכבה DFR, כפי שמתואר בשלב 1.2.3.
      הערה: בסך הכל, ארבע שכבות DFR צריך להיות מעובד כפי שהוזכר בשלב 1.7: ערוץ אחד שכבה שכבה כריכה, שתי שכבות הישבן (מונע את החיישן כיפוף בקצה).
  8. למינציה של DFR שכבות על המצע PI.
    1. מקום כשהפחד PI אל תשובה מכשילה תקורה של שקיפות ותקן אותה באמצעות דבק רגיל. התאם את השכבה DFR ערוץ ב- PI כשהפחד תחת מיקרוסקופ, באמצעות המבנים יישור בהתאמה.
    2. רבוד, להשתמש מניילן רגיל רול חם ומחממים את הגליל העליון עד 100 ° C ואת גליל תחתון ל-60 מעלות צלזיוס להגדיר הלחץ בר 3, עם מהירות העברה של 0.3 m/הגבלת מקום כשהפחד עם השכבה DFR קבוע באמצע המרבד, להפעיל אותו; DFR הוא דחף את. המרבד. חזור על השלב אחרי סיבוב כשהפחד ב- º 180.
    3. כדי למנוע כיפוף של החיישן, למינציה שתי השכבות הישבן מפותחת על גבי כשהפחד בעקבות צעדים 1.8.1-1.8.2.
  9. העסקת מחסום לעצור הידרופובי ואיטום השבב.
    1. להסיר שכבת הגנה מהצד הקדמי של הערוץ DFR שכבהמיון על-ידי הצבת סטנדרטיים דבק בקצה אחד של DFR משיכתו כלפי מעלה. השתמש מתקן יד עם צינורות 0.004-אין כדי לשלול טיפות קטנות של טפלון המומס לתוך הבארות של שכבת בידוד. כדי לחתום את השבב microfluidic, למינציה השכבה DFR כיסוי על גבי השכבה ערוץ, כפי שמתואר בשלב 1.8.
  10. קשיח-אפייה החיישן microfluidic. Foils
    1. הסר הכל כדי להגן. על כיסוי ואת הישבן DFR שכבות חותכים את ביולוגיים לרצועות בעזרת זוג מספריים רגילים. לרפא את הצ'יפס בתנור ב 160 ° C עבור ה 3

2. הליך הנייח Assay על שבב

  1. ספיחה של אבידין באזור הנייח של הערוץ-
    1. להכין פתרון אבידין 100 µg/mL ב- 10 מ מ באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) ב- pH של 7.4.
    2. µL 2 מדבקות/ברקודים של הפתרון אבידין אל הים של החיישן.
      הערה: הערוץ מלא על-ידי כוחות נימי עד הנוזל מגיע המכשול עצירה הידרופובי.
    3. על מנת להבטיח כי fluidic כל הזמן עוצר על המכשול בזמן הדגירה שלם, לוותר על 2 µL DI-מים בשקע של השבב. דגירה השבב 25 ° c עבור h 1 במיכל סגור.
    4. להסיר עודפי נוגדנים דרך הים של השבב על-ידי החלת ואקום. לשטוף את הערוץ עם 50 µL שטיפת מאגר (PBS עם 0.05% Tween 20), ויתרו בשקע בזמן הריק היא מיושמת. יבש את הערוץ ב-30 s ואילו שואב האבק מוחל.
  2. חוסם השטח ערוץ כדי לעכב את הכריכה לא ספציפי-
    1. להכין פתרון אלבומין שור (BSA) 1% ב- 10 מ מ PBS ב- pH של 7.4.
    2. פיפטה 2 µL של הפתרון BSA 1% על הים ו- 2 µL DI-מים בשקע של הערוץ. דגירה השבב 25 ° c עבור h 1 במיכל סגור. להסיר את עודף ריאגנטים ויבשה הערוץ כפי שמתואר בשלב 2.1.4.
  3. Oligos דגירה של DNA המסומנת ביוטין ו- 6-FAM.
    1. להכין ריכוזים שונים (0.001-5 מיקרומטר) של הפתרון DNA ב- 10 מ מ PBS ב- pH של 7.4.
    2. µL 2 מדבקות/ברקודים של ריכוז אחד של פתרון ה-DNA על הים ו- 2 µL DI-מים בשקע. דגירה השבב 25 ° c למשך 15 דקות בתוך מיכל סגור.
    3. חזור על צעד 2.3.2 ריכוז ה-DNA אחרים באמצעות שבבי ביוסנסור נוספים-
    4. להסיר את עודף ריאגנטים ויבשה הערוץ כפי שמתואר בשלב 2.1.4.
  4. נוגדנים 6-FAM התווית על-ידי קיבעון של GOx.
    1. לגבש ריכוז µg 5/mL של נוגדנים 6-FAM ב- 10 מ מ PBS ב- pH של 7.4.
    2. µL 2 להציג את הפתרון נוגדן אל הים ו-2 µL DI-מים שקע של הערוץ. דגירה הנוגדנים שכותרתו 25 ° c למשך 15 דקות בתוך מיכל סגור. להסיר את עודף ריאגנטים, כפי שמתואר בשלב 2.1.4.

3. Amperometric אות זיהוי בטכניקה להפסיק זרימה

  1. הכנה של הפתרון המצע לגילוי אלקטרוכימי.
    1. לגבש פתרון גלוקוז 40 מ מ ב- PBS 0.1 M ב- pH של 7.4 במים טהורים אולטרה-
    2. לטיפול ראשוני, להכין פתרון PBS 0.1 M ב- pH של 7.4 במים טהורים אולטרה-
  2. טיפול ראשוני של האלקטרודות עבודה.
    1. להשתמש בעל שבב בהזמנה אישית כדי לאפשר מיקום קל השבב וחיבור fluidic וחשמליים.
    2. חשמלית לחבר את החיישן potentiostat. ודא הקשר fluidic של התעלה microfluidic משאבת מזרק, המאגר ריאגנט באמצעות מתאם מחוייט צינורות. מפעיל את המחשב הנייד מחובר אליו potentiostat ולהתחיל הבקר משאבת מזרק, שליטה בזרימת fluidic באמצעות השבב.
    3. להתחיל את משאבת מזרק באופן ידני, עם 0.1 M PBS בספיקה של µL 20/min. על האלקטרודה עבודה לעומת האלקטרודה בשבב הפניה, להחיל על מתח לסירוגין של 0.8,-0.05 V 5 s 30 מחזורים. בעקבות זאת, נישחק האלקטרודה עבודה על-ידי החלת מתח של 0.8 V 60 ס
  3. Readout assay בטכניקה להפסיק זרימה.
    1. להתחיל את המדידה אות assay, המתן עד האות הנוכחית נמדד מייצבת. להפסיק את משאבת מזרק לעבור הכימית מהערוץ 0.1 M לפתרון של גלוקוז 40 מ מ. ולהתחיל התוכנה הבקר משאבת מזרק; הוא יעצור אוטומטית את זרימת 1, 2 או 5 דקות, יופעל מחדש ואז הזרם שוב. לצפות לשיא הנוכחי וכתוצאה מכך.
      הערה: עבור הניתוח של הנתונים, השיא הנוכחי או את המטען של הפסגה יכול להיחשב, כמתואר בדגם הבדיקה אות אלקטרוכימי ( איור 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

עיצוב, ייצור של פלטפורמת ביוסנסור Microfluidic:

הזיוף של chips ביוסנסור microfluidic ממומש על פני רקיק בטכניקות photolithographic סטנדרטי, העסקת DFR שכבות מרובות. אסטרטגיה פבריקציה נוספת זו מסתמכת על הדבקת שכבות מפותחת של DFRs על מצע בדוגמת פלטינה PI, ויוצרים את ערוצי microfluidic. סיכום קצר המתארים את השלבים השונים פבריקציה נוספת ניתנת באיור1. יחידה 6 - ב רקיק מונה 130 ביולוגיים microfluidic, כל אחד עם ממד של 8 × 10 מ מ2.

Figure 1
איור 1. איור גרפי של השלבים ייצור שונים של פלטפורמת ביוסנסור microfluidic. a) לחתוך PI המצע לתוך 6 - ב סיבוב ופלים. ב) חשיפה רשאים להמריא אפשרי מצופים ספין להתנגד באמצעות המסכה בהתאמה עבור המתבנת פלטינה. ג) המצע לאחר החשיפה, חזרה לאחר חשיפה, ופיתוח של photoresist. ד) בתצהיר אדים הפיזי של פלטינה על המצע. e) תהליך ההמראה כדי להסיר את עודף photoresist. f) ספין-ציפוי של סו-8, ויוצרים שכבת בידוד. g) O2 תהליך פלזמה כדי להסיר שאריות SU-8 ב- Pt האלקטרודות. ח) בתצהיר גלווני של האלקטרודה הפניה Ag/AgCl. i) חשיפה UV ופיתוח של שכבות DFR שונות. j) למינציה של השכבות DFR אל כשהפחד PI. טפלון Dispensing נפתר k), ויוצרים מחסום לעצור הידרופוביות בין נימי הנייח של תא אלקטרוכימי. l) ביוסנסור microfluidic אלקטרוכימי הסופי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

ביוסנסור כל מורכב ערוץ אחד microfluidic, המופרדים לשני אזורים נפרדים מחסום לעצור הידרופובי: מקטע הנייח של תא אלקטרוכימי, מסומן אדום וכחול, בהתאמה, באיור2. החלק הנייח של microchannel היקף השטח 10.34 מ מ2 ובעל נפח של 580 nL, וכתוצאה מכך יחס נפח גבוה משטח-כדי של 155 ס מ-1. תא אלקטרוכימי כוללת אלקטרודה הפניה על שבב כסף/כסף כלוריד ו מונה עובד פלטינה אלקטרודה. ההפרדה הזאת של האזור הנייח מדידה אלקטרוכימי של וזמינותו מניעת זיהום כלשהו האלקטרודות עם מולקולות, ולכן מעכב אלקטרודה עכירות. יתר על כן, הוא מאפשר מדידה מדויקת של ריאגנטים הנייח על ידי מילוי קפילרי.

Figure 2
באיור 2. איור של עיקרון הפעולה של פלטפורמת אלקטרוכימי microfluidic. a) השרטוטים של וזמינותו מודל המבוסס על אבידין b) תצלום של החיישן microfluidic מציג רכיביו העיקריים, כולל האלקטרודה מונה (CE), האלקטרודה הפניה (RE), האלקטרודה עבודה (WE) של המכשול עצירה (SB). האזור הנייח מסומן באדום, תא אלקטרוכימי מסומן בכחול. ג) תגובת סכמטי של החמצון של חמצן המיוצר על האלקטרודה עבודה Pt לגילוי amperometric בתוך התא אלקטרוכימי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

על ידי שימוש DFRs על הזיוף של החיישן, מאפשר תהליך הייצור תפוקה גבוהה על פני רקיק. לכן, ניתן לשמור את העלויות עד למינימום. ההתפתחות של כל השכבות DFR הוא נעשה שימוש בנייר כסף ופשוט נמוכים ומסיכות יחידת חשיפה ואקום, ולא יקר כרום ומסיכות aligner של המסכה. בנוסף, הפחתת השלבים הדרושים תהליך חדר למינימום חותך העלויות עבור הזיוף אפילו יותר. בסך הכל, ההליך פבריקציה נוספת מקבל עומס עבודה של בערך 10 h, למעט הפעמים אפייה ויש בתצהיר אדים הפיזי של פלטינה.

על שבב Assay דגירה:

הדגירה על שבב assay נעשית רק על ידי כוחות נימי. על-ידי pipetting טיפות ריאגנטים שונים אל הים של התעלה microfluidic, הנוזלים המניעות דרך הערוץ פעולה קפילריות עד שיגיעו עצירה הידרופובי המכשול. בתנאים מצב יציב, ריאגנטים ואז מודגרת למשך זמן נפרדות. מערכת פסיבית זו מאפשר מילוי קפילרי של הערוץ, ללא הצורך של כל מיכשור חיצוני כמו מזרק משאבה, ושל המאפשר דיוק מדידה של ריאגנטים, כמו הנוזל באופן אוטומטי עוצר מחסום לעצור. כמו כן, זרימת העבודה עולה בקנה אחד עם זו של אליסה קונבנציונאלי וזה עובד עם צמיגות גבוהה נוזלים כמו סרום או דם.

לצורך הניסוי הזה, הפעולה שבב מומחש assay בדיקה פשוטה העסקת את האינטראקציה אבידין-ביוטין, כמוצג באיור2. על השבב assay מתחיל אינקובציה ספיחה של אבידין השטח נימי עבור h 1, ואחריו צעד חסימת עם BSA לשעה נוספת. לאחר מכן, דנ א 6-FAM/ביוטין-שכותרתו מודגרת ב הנייח נימי למשך 15 דקות, איפה זה נקשר אבידין מולקולות. בין כל שלב הדגירה, יוסרו כל מולקולות לא מאוגד על-ידי צעד כביסה. המאגר שטיפת מוחל דרך שקע הערוץ באמצעות מתאם ואקום בהזמנה אישית. בשלב האחרון, התווית על-ידי אוקסידאז נוגדנים antifluorescein גלוקוז הם הציגו לערוץ למשך 15 דקות. לאחר מכן, החיישן הוא מוכן לבדיקה אלקטרוכימי, באמצעות פתרון מ מ 40 גלוקוז כמו המצע.

Amperometric אות Readout בטכניקה להפסיק זרימה:

לבדיקה האות של קיבוע וזמינותו, המוצר אנזימים (כאן, H2O2), מיוצר בנוכחות המצע שלה, גלוקוז, ניתן להבחין electrochemically על האלקטרודה עבודה בתא אלקטרוכימי. כדי להשיג זיהוי מהיר יחד עם הגברה של האות, הטכניקה להפסיק זרימה כביכול היא בשימוש13. בשיטה זו, הזרימה של המצע מופסק, מה שמוביל הצטברות של המוצר בפנים נימי. הסכום של2O H המיוצר2 לכן תלוי כמות מאוגד גלוקוז אוקסידאז, תלויה מידת מאוגד biotinylated DNA. על-ידי הפעלה מחדש של הזרם, משופרת2H ריכוז O2 התרוקן לאחר מכן דרך התא מדידה אלקטרוכימי, וכתוצאה מכך אות השיא הנוכחי, כמופיע באיור3.

עבור ניתוח נתונים, הטכניקה להפסיק זרימה מציע שני פרמטרים שונים: הגובה המרבי של המטען (קרי, האינטגרל) של האות שיא. שני הפרמטרים הם ביחס ישר לעצור את הזמןולכן יכול לשמש לניתוח הנתונים. בהתחשב נתוני ההערכה, בעת שימוש שיא הגובה, גובה אות תלוי את הריכוז המרבי של2 2O H ובכך מקדם דיפוזיה שלה והן לזמן העצירה יישומית. ככל הזמן לעצור, גבוה יותר את התגובה האות נמדד. מסיבה זו, גובה שיא רק לפני ימים ספורים נשארת קבועה, עד אורך מינימלי של קיבעון נימי. זו תכונה מיוחדת של הטכניקה להפסיק זרימה מאפשר ירידה דרסטית בממדים שבב ובמיוחד האורך נימי, תוך שמירה על רגישות החיישן.

Figure 3
איור 3. מודל של האות אלקטרוכימי שהושג בדרך כלל מפרט. של החלקים assay מקושרים-אנזים בטכניקה להפסיק זרימה. a) זרם של תמיסת גלוקוז 40 מ מ בשיעור של µL 20/min הוחל. במהלך שלב להפסיק (1, 2 או 5 דקות), ממשיך ייצור האנזים H2O2 . על-ידי הפעלה מחדש של הזרם,2O שהצטברו H2 התרוקן דרך תא אלקטרוכימי, היכן מזוהה electrochemically מימן על-חמצני. חוזרת המדידה מספר פעמים (קווי שגיאה; SEM), עקומת כיול על שבב b) מתקבל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פרוטוקול המובאת כאן להרכבת ביוסנסור אלקטרוכימי microfluidic מאפשר ההתפתחות של פלטפורמה נמוכים, קומפקטי, קל לשימוש עבור הגילוי של מולקולות. בהתאם וזמינותו להשתמש לאחר מכן החיישן, ניתן להבחין מספר סמנים ביולוגיים שונים. זה הופך את הפלטפורמה מאוד תכליתי ומספק גישה רחבה לתחומים שונים של יישומים, בדיקות אבחון סטנדרטי (למשל, קביעת הנוכחות של מחלות ספציפיות במשרד של הרופא) ליישומים בשלב של טיפול (למשל, סמים טיפולית הפיקוח על מטופלת פרטנית טיפול תרופתי). במיוחד בשלב של טיפול אבחון, ולמחקר ביולוגיים יש יתרונות רבים על פני שיטות קונבנציונליות, אשר בדרך כלל דורשים ציוד למעבדות נרחב, עובדים מיוחדים, ואת ריאגנט גדולים ואמצעי אחסון מדגם יש סבב ארוך פעמים.

הזיוף של ביוסנסור הזה דורש אך ורק בעקבות הפרוטוקול; אחרת, ייצור בעיות יכול להתרחש. אחת הסוגיות הנצפה לעתים קרובות הוא אי-התאמות של שכבות שונות. ניתן בקלות לפתור זאת באמצעות מנגנון מתקדם יותר עבור תהליך ייצור, מה שמאפשר עבור יישור קל יותר ומדויקת יותר של שכבות שונות.

DFR הטכנולוגיה מציעה את האפשרות של ייצור מהיר, בעלות נמוכה. מצד שני, הטכנולוגיה היא מוגבלת מבחינת רזולוציה. לדוגמה, microfluidic ערוצים של מבנים קטנים מאד (פחות מ-100 מיקרומטר) לא ניתן למימוש באמצעות פרוטוקול המוצג כאן. במקרה כזה, פוטוליתוגרפיה יבוצע ע י aligner מסיכה ברמת דיוק גבוהה עם זכוכית photomasks. בנוסף, ערוץ רחב מדי יכול להיות גם בעייתי, כיוון שהערוץ יכול להתכופף, להפחית את הגובה של הערוץ, השפעה על התנהגותם microfluidic של השבב.

אנו מאמינים כי טכנולוגיה DFR יהיה יותר נוכח יישומים עתידיים כי זה בקלות וניתן לשנותם לשימוש מסחרי. ייצור המוני של חיישנים מבוססי DFR microfluidic יהיה ללא מעצורים בעת יציאתו לשוק בגלל הטכניקה היא מבוססת היטב בתחומים אחרים של היישום (לדוגמה, אלקטרוניקה גמישה).

מבחינת הפחתת המורכבות של המערכת כולה, עבודתנו בעתיד יתמקד לצורך העיצוב והיישום של מחסנית חד פעמיות microfluidic הכולל את השבב ביוסנסור; מאגר פסולת; . ולשטוף ריאגנטים טעון מראש, כגון מאגר ורכיבים אחרים וזמינותו. עבור המידה amperometric, המסירה של המדגם וחומרים אחרים ואז ניתן לספק על ידי הופעה פנאומטיים. זה יבוצעו על ידי לקורא כף-יד, מעביר באמצעות השבב ביוסנסור microfluidic אל מאגר פסולת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים רוצה להודות את הגרמני מחקר קרן (DFG) למימון חלקית לזה לעבוד תחת גרנט מספרים UR 70/10-01 ו- UR 70/12-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Pyralux DuPont AP8525R Used as polyimide substrate
MA-N 1420 Micro Resist Technology MA-N1420 Lift-off resit to define the platinum depostion
Ma-D 533s Micro Resist Technology MaD533S Developer for MA-N1420
Platinum - - Electrode and contact pad material
Ma-R 404s Micro Resist Technology MaR404S Remover for MA-N1420
SU-8 3005 MicroChem Corp. SU-8-3005 Photoresist to define the electrode area and as insulation
1-methoxy-2-propanol acetate Sigma-Aldrich 108-65-6 Developer for SU-8 3005
2-Propanol VWR 8.18766.2500 Removing of the SU-8 developer
1020R Ultron Systems Inc. 1020R UV sensitive adhesive tape for protection of contact pads
Arguna S Degussa 1935 For Silver depostion on reference electrode
KCl Methrom 62308.020 For chloridation of the silver reference electrode
Pyralux DuPont PC1025 Dry film photoresist
Sodium carbonat Fluka 71352 Developer for Pyralux PC1025
Hydrogen chloride Sigma-Aldrich 30720 To top the development of the DFR
Teflon AF 1600 DuPont AF1600 For employing the stopping barrier
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
PA104 Mega Electronics - Bubble etch tank
FED 53 Binder 9010-0018 Oven
SPIN150 APT - Spin coater
Präzitherm Harry Gestigkeit GmbH PZ 28-2 Hot plate
Hellas Bungard Elektronik 40000 Exposure unit
Tetra30-LF-PC Diener - Plasma unit
Univex 500 Leybold - Physical vapor deposition unit
Shaker S4 ELMI - Orbital shaker
Sonorex Super 10 P Bandelin 783 Sonic bath
6221 DC and AC Keithley - Current source
HRL 350 Ozatec - Laminator unit
Vaccum pen EFD - Vacuum pen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spindel, S., Sapsford, K. E. Evaluation of optical detection platforms for multiplexed detection of proteins and the need for point-of-care biosensors for clinical use. Sensors (Basel). 14, (12), 22313-22341 (2014).
  2. Luppa, P. B., Bietenbeck, A., Beaudoin, C., Giannetti, A. Clinically relevant analytical techniques, organizational concepts for application and future perspectives of point-of-care testing. Biotechnol Adv. 34, (3), 139-160 (2016).
  3. Gauglitz, G. Point-of-Care Platforms. Annu Rev Anal Chem. 7, (1), 297-315 (2014).
  4. Jung, W., Han, J., Choi, J. W., Ahn, C. H. Point-of-care testing (POCT) diagnostic systems using microfluidic lab-on-a-chip technologies. Microelectron Eng. 132, 46-57 (2014).
  5. Yager, P., et al. Microfluidic diagnostic technologies for global public health. Nature. 442, (7101), 412-418 (2006).
  6. Fu, E., Yager, P., Floriano, P. N., Christodoulides, N., McDevitt, J. T. Perspective on diagnostics for global health. IEEE Pulse. 2, (6), 40-50 (2011).
  7. Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Ann Rev Biomed Eng. 10, 107-144 (2008).
  8. Dincer, C., Bruch, R., Kling, A., Dittrich, P. S., Urban, G. A. Multiplexed point-of-care testing - xPOCT. Trends Biotechnol. 35, (2017).
  9. Horak, J., Dincer, C., Bakirci, H., Urban, G. A disposable dry film photoresist-based microcapillary immunosensor chip for rapid detection of Epstein-Barr virus infection. Sens Actuators B Chem. 191, 813-820 (2014).
  10. Method for the fabrication of a "lab on chip" from photoresist material for medical diagnostic applications. US patent. Jobst, G., Gamp, T. 7,691,623 (2010).
  11. Kling, A., Dincer, C., Armbrecht, L., Horak, J., Kieninger, J., Urban, G. Electrochemical microfluidic platform for simultaneous multi-analyte detection. Procedia Eng. 120, 916-919 (2015).
  12. Armbrecht, L., Dincer, C., Kling, A., Horak, J., Kieninger, J., Urban, G. Self-assembled magnetic bead chains for sensitivity enhancement of microfluidic electrochemical biosensor platforms. Lab Chip. 15, 4314-4321 (2015).
  13. Dincer, C., et al. Designed miniaturization of microfluidic biosensor platforms using the stop-flow technique. Analyst. 141, 6073-6079 (2016).
  14. Weltin, A., Kieninger, J., Enderle, B., Gellner, A. K., Fritsch, B., Urban, G. A. Polymer-based, flexible glutamate and lactate microsensors for in vivo applications. Biosens Bioelectron. 61, 192-199 (2014).
  15. Kling, A., et al. Multianalyte Antibiotic Detection on an Electrochemical Microfluidic Platform. Anal Chem. 88, (20), 10036-10043 (2016).
  16. Bruch, R., et al. Clinical on-site monitoring of ß-lactam antibiotics for a personalized antibiotherapy. Sci Rep. (2017).
  17. Horak, J., Dincer, C., Qelibari, E., Bakirci, H., Urban, G. Polymer-modified microfluidic immunochip for enhanced electrochemical detection of troponin i. Sens Actuators B Chem. 209, 478-485 (2015).
  18. Horak, J., Dincer, C., Bakirci, H., Urban, G. Sensitive, rapid and quantitative detection of substance P in serum samples using an integrated microfluidic immunochip. Biosens Bioelectron. 58, 186-192 (2014).
  19. Mattox, D. M. Handbook of Physical Vapor Deposition (PVD) Processing. Elsevier Inc. (2010).
פלטפורמה מבוססת Photoresist ביוסנסור אלקטרוכימי Microfluidic הסרט יבש: ייצור המכשיר, הכנה על שבב Assay, ותפעול המערכת
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bruch, R., Kling, A., Urban, G. A., Dincer, C. Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation. J. Vis. Exp. (127), e56105, doi:10.3791/56105 (2017).More

Bruch, R., Kling, A., Urban, G. A., Dincer, C. Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation. J. Vis. Exp. (127), e56105, doi:10.3791/56105 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter