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Bioengineering

सूखी फिल्म Photoresist-विद्युत Microfluidic आधारित सेंसर मंच: उपकरण निर्माण, पर चिप परख तैयारी, और सिस्टम ऑपरेशन

doi: 10.3791/56105 Published: September 19, 2017
* These authors contributed equally

Summary

विभिंन analytes के तीव्र और संवेदनशील ठहराव के लिए कम लागत वाली शुष्क फिल्म photoresist प्रौद्योगिकी का उपयोग करते हुए एक microfluidic-संवेदी मंच डिजाइन और निर्मित किया गया । इस एकल उपयोग प्रणाली पर चिप के विद्युत readout के लिए अनुमति देता है-रोक-प्रवाह तकनीक के माध्यम से प्रमैटीरियल एंजाइम से जुड़े परख ।

Abstract

हाल के वर्षों में, विशेष रूप से बिंदु की देखभाल निदान के लिए, एक अपरिहार्य उपकरण निदान मानव रोग के निदान के लिए एक अनिवार्य साधन बन गया । एक आसान करने के लिए उपयोग और कम लागत संवेदक मंच अत्यधिक analytes के विभिंन प्रकार (जैसे, मार्क्स, हार्मोन, और दवाओं) मात्रात्मक और विशेष रूप से मापने के लिए वांछित है । इस कारण से, शुष्क फिल्म photoresist प्रौद्योगिकी-सक्षम करने के सस्ते, सतही, और उच्च प्रवाह निर्माण-microfluidic के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया गया था यहां प्रस्तुत सेंसर । बाद में इस्तेमाल किया परख पर निर्भर करता है, बहुमुखी मंच के लिए विभिंन प्रकार के अणुओं का पता लगाने में सक्षम है । उपकरण के निर्माण के लिए, प्लैटिनम इलेक्ट्रोड केवल स्वच्छ कमरे प्रक्रिया कदम में एक लचीला polyimide (PI) पंनी पर संरचित कर रहे हैं । PI पंनी इलेक्ट्रोड, जो एक epoxy आधारित photoresist के साथ अछूता रहे है के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में कार्य करता है । microfluidic चैनल बाद में PI वेफर पर सूखी फिल्म photoresist (डीएफआर) पंनी के विकास और फाड़ना द्वारा उत्पंन होता है । चैनल में एक hydrophobic रोक बाधा का उपयोग करके, चैनल दो विशिष्ट क्षेत्रों में अलग है: एंजाइम से जुड़े परख और amperometric संकेत readout के लिए एक विद्युत माप सेल के लिए एक स्थिरीकरण अनुभाग ।

पर चिप परख स्थिरीकरण के सोखना द्वारा किया जाता है चैनल की सतह के लिए अणुओं । ग्लूकोज oxidase एंजाइम विद्युत संकेत पीढ़ी के लिए एक transducer के रूप में प्रयोग किया जाता है । सब्सट्रेट की उपस्थिति में, ग्लूकोज, हाइड्रोजन पेरोक्साइड का उत्पादन किया है, जो प्लैटिनम काम इलेक्ट्रोड पर पाया जाता है. रोक प्रवाह तकनीक तेजी से पता लगाने के साथ संकेत प्रवर्धन प्राप्त करने के लिए लागू किया जाता है । विभिंन प्रकार के अणुओं को मात्रात्मक रूप से शुरू की गई microfluidic प्रणाली के माध्यम से मापा जा सकता है, जिसमें विभिंन प्रकारों के रोगों का संकेत दिया गया है, या चिकित्सीय औषधि की निगरानी के संबंध में, एक निजीकृत चिकित्सा की सुविधा है ।

Introduction

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पिछले दो दशकों में, नैदानिक अनुप्रयोगों में गहराई से अध्ययन के लिए प्राथमिक वैश्विक सार्वजनिक स्वास्थ्य के विकास पर बन गए हैं । परंपरागत रूप से, प्रयोगशाला नैदानिक उपकरण रोगों का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है । हालांकि वे अभी भी रोगों के निदान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, बिंदु की देखभाल परीक्षण (पाकट) रोगी के पास प्रदर्शन किया या रोगी खुद को हाल के वर्षों में अधिक से अधिक आम हो गया है । विशेष रूप से ऐसे मामलों में जो तत्काल उपचार की आवश्यकता होती है, जैसे तीव्र रोधगलन या मधुमेह की निगरानी, एक नैदानिक खोज के तेजी से पुष्टि आवश्यक है । इसलिए, गैर विशेषज्ञों द्वारा संचालित किया जा सकता है कि पाकट उपकरणों के लिए एक बढ़ती जरूरत है और जो समवर्ती इन विट्रो में सटीक प्रदर्शन करने में सक्षम हैं एक कम समय में नैदानिक परीक्षणों1,2,3,4 .

उल्लेखनीय सुधार पहले ही पाकट के क्षेत्र में हासिल किए जा चुके हैं. हालांकि, अभी भी कई चुनौतियां5,6,7,8को दूर कर रही हैं । एक पाकट मंच के लिए सफलतापूर्वक बाजार के लिए शुरू किया जा करने के लिए और प्रयोगशाला निदान के साथ प्रतिस्पर्धी होने के लिए, डिवाइस कड़ाई से निम्नलिखित आवश्यकताओं को पूरा करना होगा: (i) प्रयोगशाला के साथ संगत कर रहे हैं कि सटीक और मात्रात्मक परीक्षण परिणाम प्रदान निष्कर्षों; (ii) कम नमूना करने के लिए परिणाम समय है, रोगी के तत्काल उपचार को सक्षम करने; (iii) सुविधा सीधी और आसान हैंडलिंग, यहां तक कि जब अप्रशिक्षित व्यक्तियों द्वारा संचालित है, और उपयोगकर्ता के हस्तक्षेप की आवश्यकता है; और (iv) एक कम लागत संवेदक एकल उपयोग अनुप्रयोगों के लिए डिजाइन इकाई का समावेश । इसके अलावा, उपकरण मुक्त निदान अनुकूल हैं, मुख्य रूप से संसाधन में गरीब वातावरण3,4,6

इन गंभीर आवश्यकताओं के कारण, केवल दो पाकट सिस्टम विद्युत डिटेक्शन पर आधारित (उदा., रक्त ग्लूकोज परीक्षण स्ट्रिप्स) और पार्श्व प्रवाह immunoassays पर (जैसे, घर गर्भावस्था परीक्षण) सफलतापूर्वक बाजार के लिए शुरू किया गया है ताकि तक. हालांकि, दोनों प्रणालियों के खराब प्रदर्शन के रूप में नुकसान से पीड़ित (यानी, रक्त ग्लूकोज की निगरानी गलत परीक्षण के परिणाम और पार्श्व प्रवाह परख केवल गुणात्मक प्रदान (सकारात्मक या नकारात्मक) माप परिणाम)4, 6. पारंपरिक पाकट प्रणालियों की ये कमियां नई प्रौद्योगिकियों की खोज पर बढ़ती मांग के लिए प्रेरित करती है जो देखभाल4,5के बिंदु पर तेजी से, कम लागत, और मात्रात्मक पता लगाने की पेशकश करते हैं ।

इन चुनौतियों का सामना करना पड़ पाकट उपकरणों को पूरा करने के लिए, डीएफआर प्रौद्योगिकी हाल ही में डिस्पोजेबल और कम लागत वाले सेंसरों9,10,11,12के निर्माण के लिए नियोजित किया गया है, 13 , 14. शीतल और तरल lithographic पदार्थों की तुलना में, जैसे PDMS या एसयू-8, DFRs कई लाभ मौजूद हैं: वे (i) अनेक रचनाओं और मोटाई (कुछ माइक्रोन से कई मिलीमीटर तक) में उपलब्ध हैं; (ii) एक बहुत मोटा सतह क्षेत्र है, जो विभिन्न सामग्रियों के लिए आसंजन की सुविधा है; (iii) उत्कृष्ट मोटाई एकरूपता सुविधा; (iv) बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए सस्ते, सतही, और उच्च प्रवाह निर्माण की पेशकश; (v) कैंची की एक साधारण जोड़ी की तरह, विभिन्न कम लागत वाले उपकरणों के साथ कटौती करने के लिए आसान कर रहे हैं; और (vi) ऐसे microfluidic चैनल के रूप में तीन आयामी संरचनाओं के निर्माण के लिए अनुमति देते हैं, एक दूसरे के शीर्ष पर कई डीएफआर परतों स्टैकिंग द्वारा ।

दूसरी ओर, सामांय में DFRs एक अपेक्षाकृत गरीब तरल photoresists है, जो मुख्य रूप से फिल्म मोटाई के कारण होता है और मुखौटा और सुरक्षात्मक पंनी, जो इसके अलावा प्रकाश में सक्षम बनाता है डीएफआर के बीच की दूरी के बीच की वृद्धि हुई की तुलना में एक समाधान है कैटरिंग. फिर भी, एकीकृत microfluidic के विनिर्माण के लिए, DFRs कम लागत वाले बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए अत्यधिक उपयुक्त हैं ।

इसलिए, हम इस काम के निर्माण और एक डीएफआर आधारित विद्युत microfluidic के आवेदन में मौजूद है । विस्तृत प्रोटोकॉल, एक डीएनए के पर चिप स्थिरीकरण मॉडल परख आधारित है, और इसके विद्युत readout रोकने के प्रवाह तकनीक का उपयोग कर, एक सेंसर मंच के उत्पादन कदम का वर्णन करता है । इस सार्वभौमिक मंच के कई प्रकार के अणुओं का पता लगाने में सक्षम बनाता है, विभिंन परख प्रौद्योगिकियों का उपयोग (जैसे, जीनोमिक्स, cellomics, और प्रोटियोमिक्) या परख प्रारूपों (जैसे, प्रतिस्पर्धी, सैंडविच, या प्रत्यक्ष) । इस तरह के एक डीएफआर मंच के आधार पर, हमारे समूह पहले सफलतापूर्वक विभिंन analytes के तेजी से और संवेदनशील ठहराव, एंटीबायोटिक दवाओं सहित13,15,16 (टेट्रासाइक्लिन, प्रदर्शन pristinamycin, और अ ß य-लस्टम एंटीबायोटिक), ट्रोपोनिन I17, और पदार्थ पी18

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Protocol

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< p class = "jove_title" > 1. Microfluidic के निर्माण डीएफआर प्रौद्योगिकी का उपयोग कर संवेदक

  1. PI वेफर्स की तैयारी ।
    1. में एक PI सब्सट्रेट कट 6-दौर वेफर्स में । १२० & #176 पर एक ओवन में PI वेफर रखो; सी के लिए लगभग 1 एक निर्जलीकरण सेंकना के लिए एच ।
  2. पहला photolithography कदम उठाने की प्रक्रिया के लिए.
    1. कार्यक्रम स्पिन-कोट करने के लिए एक 30-एस कताई ३,००० rpm पर समय, २,००० rpm की एक त्वरण के साथ/स्पिन-कोट पर PI वेफर प्लेस और इसे ठीक करें, एक वैक्यूम लागू । एक प्रतिरोध के 2 मिलीलीटर वितरण, लिफ्ट बंद प्रक्रिया को सक्षम करने, और स्पिन-कोट कार्यक्रम शुरू करते हैं । स्पिन-कोट और नरम से वेफर निकालें-१०० & #176 पर 2 मिनट के लिए एक गर्म थाली पर PI वेफर सेंकना; C.
    2. नग्न आंखों के साथ PI वेफर पर इलेक्ट्रोड patterning के लिए वांछित मुखौटा समायोजित करें और यह ४०० एम एम/सेमी 2 यूवी लाइट (३६५ एनएम) के लिए बेनकाब । एक विरोध-एक कक्षीय शेखर पर मिलान डेवलपर के साथ भरा कटोरा में वेफर प्लेस और इसे 1 मिनट के लिए थोड़ा हिला ।
    3. के बाद अतिरिक्त विरोध हटा दिया जाता है, एक गीला बेंच पर पानी (DI-पानी) के साथ PI वेफर कुल्ला करने के लिए एक शॉवर का उपयोग करें और इसे बाद में संकुचित हवा का उपयोग कर सूखी ।
  3. इलेक्ट्रोड के गठन के लिए प्लैटिनम के
  4. साठा.
    1. एक मानक शारीरिक वाष्प जमाव की प्रक्रिया का उपयोग करने के लिए २०० पर प्लैटिनम की समुद्री मील दूर करने के लिए वेफर < सुप वर्ग = "xref" > १९ .
    2. एक कटोरी में वेफर प्लेस । कटोरा के लिए मिलान हटानेवाला जोड़ें और लिफ्ट बंद का विरोध करते हुए थोड़ा एक कक्षीय शेखर पर वेफर मिलाते हुए जब तक सभी अतिरिक्त प्लेटिनम हटा दिया जाता है । कुल्ला और चरण 1.2.3 में वर्णित के रूप में PI वेफर सूखी ।
  5. दूसरा photolithography कदम: इन्सुलेशन परत बनाने.
    1. एक ओवन में PI वेफर डाल १२० & #176; सी के लिए 5 मिनट के लिए यह निर्जलीकरण ।
    2. कार्यक्रम एक स्पिन के पहले कदम-५०० rpm पर कताई समय के एस 5 के लिए कोट । ४,००० rpm पर 30 एस के लिए दूसरा कदम कार्यक्रम, ७०० rpm की एक त्वरण के साथ/
    3. स्पिन-कोट पर PI वेफर जगह और यह तय है, एक वैक्यूम लागू । एक उपयुक्त epoxy के 4 मिलीलीटर-आधारित photoresist स्पिन-कोट कार्यक्रम शुरू करने से पहले बांटना ।
    4. नरम-3 मिनट के लिए लेपित वेफर सेंकना ९५ & #176 पर एक गर्म थाली पर सी ।
    5. संबंधित संरेखण के निशान और एक नेत्र लेंस का उपयोग कर वेफर पर इंसुलेशन परत के लिए मुखौटा समायोजित करें । १०० माइकल क्/cm 2 यूवी लाइट (३६५ एनएम) को वेफर से बेनकाब ।
    6. एक पोस्ट के लिए
    7. -जोखिम सेंकना, 2 मिनट के लिए एक गरम गरम थाली पर वेफर ९५ & #176 पर जगह; C.
    8. एक कटोरी में वेफर जगह और एक उपयुक्त डेवलपर के साथ विरोध विकसित ( जैसे, 1-methoxy-2-propyl-acetat 2 मिनट के लिए, एसयू के मामले में-8) एक कक्षीय शेखर पर ।
    9. isopropanol के साथ PI वेफर पहले कुल्ला और फिर कुल्ला और यह चरण 1.2.3.
    10. में वर्णित के रूप में सूखी
    11. हार्ड-सेंकना एक ओवन में photoresist के लिए 3 ज पर १५० & #176; ग.
  6. प्लाज्मा-इलेक्ट्रोड की सहायता से सफाई.
    1. photoresist अवशेषों को दूर करने के लिए, एक मानक प्लाज्मा इकाई के साथ ऑक्सीजन प्लाज्मा का उपयोग करें । सफाई कार्यक्रम शुरू, १००% O 2 प्रवाह, २५० sccm की दर के साथ २००-W कम आवृत्ति शक्ति का उपयोग कर, और 3 min.
    2. का कुल समय
    3. प्लाज्मा चैंबर में PI वेफर जगह, जमीन पर कांच के ढक्कन का उपयोग प्लेट पर वेफर तय है, और प्लाज्मा प्रक्रिया शुरू करो ।
  7. चांदी और चांदी क्लोराइड साठा: ऑन-चिप संदर्भ इलेक्ट्रोड बनाना.
    1. Passivate एक यूवी संवेदनशील चिपकने वाला टेप के साथ वेफर के प्लेटिनम संपर्क पैड । पन्ना 5 मिमी चौड़ा और 11 सेमी लंबी धारियों में कटौती और उन्हें वेफर के लिए संलग्न, भागों की रक्षा करने के लिए चांदी के साथ जमा नहीं किया जा.
    2. चांदी के जमाव के लिए
    3. , एक ध्वनि स्नान (३५ kHz) एक धुएं अलमारी में डाल दिया और स्नान में चांदी इलेक्ट्रोलाइट समाधान (१०० जी/एल एजी, पीएच १२.५) के एक कंटेनर डालें । कमरे के तापमान और 10% करने के लिए बिजली के लिए ध्वनि स्नान सेट करें.
      चेतावनी: चांदी इलेक्ट्रोलाइट समाधान अत्यधिक विषाक्त कर रहे है और चरम देखभाल के साथ नियंत्रित किया जाना चाहिए । धुएं से कभी श्वास नहीं लेना चाहिए ।
    4. एक निरंतर वर्तमान स्रोत के लिए संदर्भ इलेक्ट्रोड के बल्क संपर्क कनेक्ट करें । काउंटर इलेक्ट्रोड, एक चांदी के तार है कि चांदी इलेक्ट्रोलाइट समाधान में डूबे है कनेक्ट, मानक जोड़ने केबल का उपयोग कर वर्तमान स्रोत के लिए.
    5. डीसी को वर्तमान स्रोत सेट और के एक वर्तमान घनत्व के लिए-४.५ mA/cm 2 , जिसके परिणामस्वरूप चांदी का जमाव दर लगभग ०.३ & #181; मी/मिनट ध्वनि स्नान शुरू और 10 मिनट के लिए वर्तमान स्रोत चलाने दें । DI-पानी
    6. के साथ वेफर कुल्ला संदर्भ इलेक्ट्रोड के chlorination के लिए
    7. , ध्वनि स्नान में ०.१ एम पोटेशियम क्लोराइड (KCl) समाधान का एक पोत डालें । वेफर और एक प्लैटिनम इलेक्ट्रोड है कि लगातार वर्तमान स्रोत के साथ KCl समाधान में डूबे है के थोक संपर्क कनेक्ट ।
    8. डीसी को वर्तमान स्रोत सेट और + ०.६ mA/cm 2 के वर्तमान घनत्व के लिए, लगभग ०.०७५ & #181 की एक जमाव दर में जिसके परिणामस्वरूप, एम/ध्वनि स्नान शुरू करें और वर्तमान स्रोत ७.५ मिनट के लिए चलाने दें ।
    9. कुल्ला और PI वेफर, चरण 1.2.3.
    10. में वर्णित के रूप में सूखी
    11. एक यूवी (३६५ एनएम) के बाद यूवी के प्रति संवेदनशील टेप निकालें ३०० माइकल एम/सेमी 2 के जोखिम और कुल्ला और पीआई वेफर, फिर से चरण 1.2.3 में वर्णित के रूप में सूखी ।
  8. तेस्रो photolithography चरण: DFRs चैनल बनाने के लिए microfluidic का उपयोग करना.
    1. एक आकार के लिए आवश्यक डीएफआर परतों में कटौती की है कि वेफर (20 x 20 सेमी 2 ) के समान है । जोखिम इकाई पर वांछित मुखौटा फिक्स और नग्न आंखों का उपयोग मुखौटा पर डीएफआर परत संरेखित करें । २५० माइकल क्/cm 2 यूवी लाइट (३६५ एनएम) के साथ विरोध को रोशन करते हैं ।
    2. photoresist की सुरक्षात्मक पंनी को हटाने और लगभग 2 मिनट के लिए प्रतिरोध विकसित (संरचनाओं पर निर्भर करता है) में एक 1% सोडियम कार्बोनेट (न 2 CO 3 ) समाधान एक मानक ध्वनि स्नान का उपयोग (३५ kHz) ४२ & #176 के लिए कचौरी; सी और एक ध्वनि शक्ति १००% की । प्रतिक्रिया तुरंत बंद करने के लिए, एक कक्षीय शेखर पर 1% एचसीएल स्नान में 1 मिनट के लिए प्रतिरोध हिला । कुल्ला और प्रत्येक डीएफआर परत सूखी, के रूप में चरण 1.2.3.
      में वर्णित नोट: कुल में, चार डीएफआर परतों के रूप में कदम १.७ में वर्णित संसाधित होने की जरूरत है: एक चैनल परत, एक कवर परत, और दो पीठ परतों (अंत में झुकने से रोकने के सेंसर) ।
    3. पीआई सब्सट्रेट पर डीएफआर परतों के
  9. फाड़ना.
    1. एक पारदर्शिता उपरि पंनी पर PI वेफर जगह और यह मानक चिपकने वाला टेप का उपयोग कर ठीक है । एक खुर्दबीन के नीचे PI वेफर पर चैनल डीएफआर परत को समायोजित करें, संबंधित संरेखण संरचनाओं का उपयोग कर ।
    2. के लिए, एक मानक गर्म रोल फाड़ना का उपयोग करें और १०० & #176 करने के लिए शीर्ष रोल कचौरी; c और नीचे के रोल को ६० & #176; ग. ०.३ m/मिनट की एक आगे की गति के साथ 3 बार करने के लिए दबाव सेट करें, और फाड़ना के बीच में तय डीएफआर परत के साथ वेफर प्लेस इसे प्रारंभ करें; डीएफआर को फाड़कर धकेला जाता है । १८० & #176 द्वारा वेफर रोटेट करने के बाद कदम दोहराएं;.
    3. के झुकने को रोकने के लिए, दो फाड़ना के नीचे वेफर पर पीठ परतें विकसित कदम 1.8.1-1.8.2.
  10. एक hydrophobic रोकने बाधा और चिप सील ।
    1. डीएफआर चैनल के सामने की ओर से सुरक्षात्मक परत को दूर करनाडीएफआर के एक छोर पर मानक चिपकने वाला टेप रखकर एर और यह ऊपर की ओर खींच । ०.००४-में ट्यूबों के साथ एक हाथ मशीन का उपयोग करने के लिए इंसुलेशन परत के कुओं में भंग polytetrafluoroethylene की छोटी बूंदों के वितरण । microfluidic चिप सील करने के लिए, आवरण डीएफआर परत को चैनल परत पर, जैसा चरण १.८ में वर्णित है ।
  11. मेहनत-पाक द microfluidic.
    1. कवर और पीठ डीएफआर परतों पर सभी सुरक्षात्मक पन्नियों को हटा दें । कैंची के एक साधारण जोड़ी का उपयोग कर स्ट्रिप्स में कटौती । १६० पर एक ओवन में चिप्स का इलाज & #176; ग के लिए 3 ज.
< p class = "jove_title" > 2. पर चिप परख स्थिरीकरण प्रक्रिया
  • चैनल के स्थिरीकरण क्षेत्र में avidin के सोखना
      .
      1. तैयार एक १०० & #181; जी/एमएल avidin 10 मिमी फॉस्फेट में समाधान-बफर खारा (पंजाब) ७.४ के एक पीएच पर.
      2. औषधालय 2 & #181; avidin समाधान के एल के प्रवेश पर.
        नोट: चैनल केशिका बलों द्वारा भरा है जब तक द्रव hydrophobic रोक बैरियर तक पहुंचता है ।
      3. यह सुनिश्चित करने के लिए कि तरल पदार्थ पूरी मशीन समय के दौरान अवरोध पर रोक रखता है, वितरण 2 & #181; DI के एल-चिप के आउटलेट पर पानी । एक बंद कंटेनर में 1 ज के लिए 25 & #176; C पर चिप मशीन ।
      4. एक वैक्यूम लागू करने से चिप के प्रवेश के माध्यम से अतिरिक्त रिएजेंटों को हटा दें । चैनल धो के साथ ५० & #181; धो बफर के एल (०.०५% के बीच 20 के साथ पंजाब), आउटलेट पर तिरस्कृत जबकि निर्वात लागू किया जा रहा है । 30 एस के लिए चैनल शुष्क जबकि वैक्यूम लागू किया जा रहा है ।
    1. चैनल सतह अवरुद्ध करने के लिए विशिष्ट बाइंडिंग रोकना ।
      1. 10 mM पंजाब में ७.४ के एक पीएच पर 1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) समाधान तैयार करें ।
      2. पिपेट 2 & #181; क l द 1% BSA हल पर प्रवेश और 2 & #181; डि के एल-पानी चैनल के आउटलेट पर. एक बंद कंटेनर में 1 ज के लिए 25 & #176; C पर चिप मशीन । अतिरिक्त रिएजेंट निकालें और चरण 2.1.4 में वर्णित के रूप में चैनल को सुखाएं ।
    2. के डीएनए ओलिगोस्पर्मिया के साथ लेबल बायोटिन और 6-FAM.
      1. ७.४ के एक पीएच में 10 mM पंजाब में डीएनए समाधान के विभिंन सांद्रता (0.001-5 & #181; M) तैयार करें ।
      2. तिरस्कृत 2 & #181; एल के प्रवेश पर डीएनए समाधान की एक एकाग्रता और 2 & #181; एल के आउटलेट पर DI-पानी । एक बंद कंटेनर में 15 मिनट के लिए 25 & #176; C पर चिप मशीन ।
      3. दोहराएँ कदम 2.3.2 अन्य डीएनए सांद्रता अतिरिक्त सेंसर चिप्स का उपयोग कर के लिए.
      4. अतिरिक्त रिएजेंट निकालें और चरण 2.1.4 में वर्णित के रूप में चैनल को सुखाएं ।
    3. स्थिरीकरण GOx-त्यसपछि ६-FAM एंटीबॉडी.
      1. तैयार करना a 5 & #181; g/mL 6-FAM एंटीबॉडी के 10 एमएम पंजाबियों में ७.४ के पीएच.
      2. पर एकाग्रता
      3. परिचय 2 & #181; l के एंटीबॉडी समाधान के प्रवेश और 2 & #181; डि के-पानी चैनल के आउटलेट को. एक बंद कंटेनर में 15 मिनट के लिए 25 & #176; C पर लेबल एंटीबॉडी की मशीन । अतिरिक्त रिएजेंट, चरण 2.1.4 में वर्णित के रूप में निकालें ।
    < p class = "jove_title" > 3. Amperometric संकेत का पता लगाने के रोक प्रवाह तकनीक का उपयोग कर

    1. विद्युत पता लगाने के लिए सब्सट्रेट समाधान की तैयारी .
      1. एक ४० मिमी ग्लूकोज समाधान ०.१ एम पंजाबियों में अल्ट्रा शुद्ध पानी में ७.४ के एक पीएच में तैयार ।
      2. प्रारंभिक उपचार के लिए
      3. , अल्ट्रा शुद्ध पानी में ७.४ के एक पीएच में एक ०.१ मीटर पंजाबियों समाधान तैयार करते हैं ।
    2. कार्य इलेक्ट्रोड के प्रारंभिक उपचार.
      1. चिप और एक तरल पदार्थ और बिजली के कनेक्शन के आसान स्थान के लिए अनुमति देने के लिए कस्टम निर्मित चिप धारक का उपयोग करें ।
      2. विद्युत potentiostat के लिए सेंसर कनेक्ट । microfluidic चैनल के एक सिरिंज पंप करने के लिए और कस्टम बनाया अनुकूलक और ट्यूबों का उपयोग कर एजेंट जलाशय के लिए द्रवित संपर्क सुनिश्चित करें । लैपटॉप है कि potentiostat से जुड़ा है और सिरिंज पंप नियंत्रक शुरू, चिप के माध्यम से द्रवित प्रवाह को नियंत्रित ।
      3. सिरिंज पंप मैन्युअल रूप से शुरू करें, ०.१ मीटर पंजाबियों के साथ 20 & #181 के प्रवाह दर पर; L/ पर काम कर इलेक्ट्रोड बनाम चिप संदर्भ इलेक्ट्रोड पर, एक बारी वोल्टेज लागू करें ०.८ और-०.०५ वी के लिए 5 s प्रत्येक के लिए 30 चक्र. इसके बाद, ६० s.
      4. के लिए ०.८ वी की वोल्टेज को लागू करने के द्वारा काम इलेक्ट्रोड ऑक्सीकरण
    3. परख readout उपयोग रोक प्रवाह तकनीक ।
      1. परख संकेत readout शुरू करने के लिए, मापा वर्तमान संकेत स्थिर जब तक रुको । सिरिंज पंप बंद करो और ४०-mM ग्लूकोज समाधान करने के लिए ०.१ M पंजाबियों से रिएजेंट स्विच और सिरिंज पंप नियंत्रक पर सॉफ्टवेयर शुरू; यह स्वचालित रूप से 1, 2, या 5 मिनट के लिए प्रवाह बंद हो जाएगा और फिर प्रवाह फिर से पुनः आरंभ करेगा । परिणामस्वरूप वर्तमान चोटी का निरीक्षण ।
        नोट: डेटा के विश्लेषण के लिए, या तो वर्तमान पीक या पीक के प्रभारी पर विचार किया जा सकता है, जैसा कि किसी विद्युत सिग्नल के मॉडल में वर्णित है readout (< मज़बूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 ).
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    Representative Results

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    डिजाइन और Microfluidic के निर्माण सेंसर मंच:

    microfluidic का निर्माण संवेदी चिप्स मानक photolithographic कई डीएफआर परतों को रोजगार तकनीक द्वारा वेफर स्तर पर महसूस किया है । इस निर्माण रणनीति microfluidic चैनलों के गठन, एक प्लैटिनम नमूनों PI सब्सट्रेट पर DFRs के विकसित परतों के फाड़ना पर निर्भर करता है. एक लघु सारांश विभिंन निर्माण चरणों का चित्रण चित्रा 1में दिया जाता है । एक एकल 6-वेफर में १३० microfluidic शामिल हैं, प्रत्येक 8 × 10 मिमी2के एक आयाम के साथ ।

    Figure 1
    चित्र 1. microfluidic के विभिंन निर्माण कदम का चित्रमय चित्रण-संवेदी मंच । एक) 6-दौर वेफर्स में PI सब्सट्रेट में कटौती । ख) एक संभव स्पिन के जोखिम लेपित लिफ्ट बंद प्लैटिनम patterning के लिए संबंधित मुखौटा का उपयोग कर विरोध । ग) जोखिम के बाद सब्सट्रेट, वापस जोखिम के बाद, और photoresist विकासशील । घ) सब्सट्रेट पर प्लैटिनम की शारीरिक भाप जमाव । ई) लिफ्ट बंद प्रक्रिया अतिरिक्त photoresist को दूर करने के लिए । f) स्पिन-एसयू-8 की कोटिंग, एक इंसुलेशन परत बनाने । छ) हे2 प्लाज्मा पीटी इलेक्ट्रोड पर सु-8 अवशेषों को हटाने के लिए प्रक्रिया । एच) एजी/AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड के करनेवाली जमाव । मैं) यूवी एक्सपोजर और अलग डीएफआर परतों के विकास । जे PI वेफर पर डीएफआर परतों के फाड़ना) । कश्मीर) polytetrafluoroethylene हल, स्थिरीकरण केशिका और विद्युत सेल के बीच एक hydrophobic रोक बाधा बनाने । l) Final विद्युत microfluidic. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    प्रत्येक एक microfluidic चैनल के होते हैं, एक hydrophobic रोक बाधा द्वारा दो अलग क्षेत्रों में विभाजित: एक स्थिर अनुभाग और एक विद्युत सेल, लाल और नीले रंग में चिह्नित, क्रमशः, चित्रा 2में । microchannel के संघटन हिस्सा १०.३४ mm2 की सतह की मात्रा और ५८० nL की एक मात्रा है, एक उच्च सतह में जिसके परिणामस्वरूप १५५ सेमी-1की मात्रा के अनुपात के लिए । विद्युत सेल एक पर चिप चांदी/रजत क्लोराइड संदर्भ इलेक्ट्रोड और एक काउंटर और काम कर रहे प्लेटिनम इलेक्ट्रोड भी शामिल है । स्थिरीकरण क्षेत्र के इस जुदाई और विद्युत readout की परख के किसी भी दूषण को रोकता है इलेक्ट्रोड के साथ के अणुओं और इसलिए रोकता इलेक्ट्रोड जमता. इसके अलावा, यह केशिका भरने के द्वारा स्थिरीकरण एजेंट की सटीक पैमाइश सक्षम बनाता है ।

    Figure 2
    चित्र 2. विद्युत microfluidic प्लेटफ़ॉर्म के ऑपरेटिंग सिद्धांत का चित्रण. एक) avidin के आधार पर एक मॉडल परख के योजनाबद्ध । ख) काउंटर इलेक्ट्रोड (CE), संदर्भ इलेक्ट्रोड (आरई), काम इलेक्ट्रोड (हम), और रोक बाधा (SB) सहित अपने मुख्य तत्वों, दिखा microfluidic के फोटो. स्थिरीकरण क्षेत्र लाल रंग में प्रकाश डाला है, और विद्युत सेल नीले रंग में चिह्नित है । ग) विद्युत कक्ष के अंदर amperometric पता लगाने के लिए पीटी काम इलेक्ट्रोड पर उत्पादित हाइड्रोजन पेरोक्साइड के ऑक्सीकरण की योजनाबद्ध प्रतिक्रिया. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    संवेदक के निर्माण के लिए DFRs को रोजगार देकर, विनिर्माण प्रक्रिया वेफर स्तर पर उच्च प्रवाह के लिए अनुमति देता है । इसलिए, लागत कम करने के लिए नीचे रखा जा सकता है । सभी डीएफआर परतों का विकास सरल और कम लागत पंनी मास्क और एक वैक्यूम जोखिम इकाई, बजाय महंगा क्रोम मास्क और एक मुखौटा संरेखण का उपयोग किया जाता है । इसके अलावा, एक ंयूनतम कटौती के लिए आवश्यक साफ कमरे की प्रक्रिया के कदम की कमी भी अधिक निर्माण के लिए लागत । कुल में, निर्माण प्रक्रिया लगभग 10 घंटे का कार्यभार लेता है, पाक टाइंस और प्लेटिनम के शारीरिक वाष्प जमाव को छोड़कर ।

    पर चिप परख मशीन:

    पर चिप परख मशीन केशिका बलों द्वारा ही किया जाता है । microfluidic चैनल के प्रवेश पर विभिन्न रिएजेंटों की pipetting बूंदों द्वारा, तरल पदार्थ केशिका कार्रवाई द्वारा चैनल के माध्यम से संचालित कर रहे हैं जब तक वे hydrophobic रोक बैरियर तक पहुँचने. स्थिर राज्य की स्थिति के तहत, रिएजेंट तो एक अलग समय के लिए मशीन हैं । इस निष्क्रिय प्रणाली एक सिरिंज पंप की तरह किसी भी बाह्य उपकरण की आवश्यकता के बिना, चैनल के केशिका भरने में सक्षम बनाता है, और एजेंट की सटीक पैमाइश के लिए अनुमति देता है, के रूप में तरल पदार्थ स्वचालित रूप से रोक बैरियर पर बंद हो जाता है । इसके अलावा, कार्यप्रवाह एक पारंपरिक एलिसा के साथ संगत है और यह सीरम या रक्त की तरह उच्च चिपचिपापन तरल पदार्थ के साथ काम करता है ।

    इस प्रयोग के प्रयोजन के लिए, चिप आपरेशन एक सरल परीक्षण avidin-बायोटिन बातचीत को रोजगार परख द्वारा प्रदर्शन किया है, के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया । पर चिप परख मशीन 1 एच के लिए केशिका सतह के लिए avidin के सोखना के साथ शुरू होता है, एक और 1 ज के लिए BSA के साथ एक अवरुद्ध कदम के बाद । इसके बाद, 6-FAM/बायोटिन-लेबल डीएनए 15 मिनट, जहां यह avidin अणुओं को बांध के लिए स्थिरीकरण केशिका में मशीन है । प्रत्येक मशीन कदम के बीच, किसी भी असीम अणुओं एक धुलाई कदम से हटा रहे हैं । वॉश बफर एक कस्टम बनाया वैक्यूम अनुकूलक का उपयोग कर चैनल आउटलेट के माध्यम से लागू किया जाता है । अंतिम चरण में, ग्लूकोज oxidase-antifluorescein एंटीबॉडी लेबल 15 मिनट के लिए चैनल के लिए पेश कर रहे हैं. उसके बाद, विद्युत readout के लिए, एक ४० मिमी ग्लूकोज समाधान सब्सट्रेट के रूप में उपयोग करते हुए, के लिए तैयार है ।

    Amperometric सिग्नल स्टॉप-फ्लो तकनीक का उपयोग कर Readout:

    स्थिर परख के संकेत readout के लिए, एंजाइमों उत्पाद (यहां, एच22), इसके सब्सट्रेट, ग्लूकोज की उपस्थिति में उत्पादित, electrochemically विद्युत सेल में काम कर इलेक्ट्रोड पर पाया जा सकता है. संकेत प्रवर्धन के साथ तेजी से पता लगाने को प्राप्त करने के लिए, तथाकथित स्टॉप फ्लो तकनीक का उपयोग किया जाता है13. इस विधि में, सब्सट्रेट के प्रवाह को बंद कर दिया है, जो केशिका के अंदर उत्पाद का एक संचय करने के लिए सुराग । उत्पादित की राशि एच2हे2 इसलिए बाउंड ग्लूकोज oxidase की मात्रा पर निर्भर करता है और बाध्य biotinylated डीएनए की मात्रा पर निर्भर है । प्रवाह को पुनरारंभ करके, बढ़ाकर H2O2 एकाग्रता को बाद में विद्युत मापन कक्ष के माध्यम से फ्लश किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप वर्तमान पीक सिग्नल में, जैसा कि चित्र 3में सचित्र है ।

    डेटा विश्लेषण के लिए, स्टॉप-फ्लो तकनीक दो अलग पैरामीटर प्रदान करता है: अधिकतम ऊंचाई और चार्ज (यानी, पीक सिग्नल का अभिंन) । दोनों मापदंडों को रोकने के समय के लिए सीधे आनुपातिक हैंऔर इसलिए डेटा का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । डेटा मूल्यांकन पर विचार, जब पीक ऊंचाई का उपयोग करते हुए, संकेत ऊंचाई अधिकतम एच2हे2 एकाग्रता पर निर्भर करता है और इस प्रकार इसके प्रसार गुणांक और लागू रोक समय पर । अब रोक समय, उच्च मापा संकेत प्रतिक्रिया. इस कारण के लिए, गेज पीक ऊंचाई स्थिर रहता है, एक न्यूनतम लंबाई के लिए नीचे है । रोक प्रवाह तकनीक की यह विशेष सुविधा चिप आयाम में एक भारी कमी के लिए अनुमति देता है, विशेष रूप से केशिका लंबाई में, जबकि संवेदक की संवेदनशीलता के संरक्षण ।

    Figure 3
    चित्र 3. एक आम तौर पर प्राप्त विद्युत संकेत readout एक एंजाइम के मॉडल-रोक प्रवाह तकनीक का उपयोग कर परख से जुड़े । एक) 20 µ एल/मिनट की दर से ४० मिमी ग्लूकोज समाधान का एक प्रवाह लागू किया गया था । बंद चरण (1, 2, या 5 मिनट) के दौरान, एच22 के एंजाइम उत्पादन जारी है । प्रवाह को पुनरारंभ करके, संचित H2O2 विद्युत कक्ष के माध्यम से निकाली जाती है, जहां हाइड्रोजन पेरोक्साइड electrochemically पाया जाता है । माप को कई बार दोहराकर (त्रुटि पट्टियां; SEM), एक पर चिप अंशांकन वक्र बी) प्राप्त की है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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    Discussion

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    एक microfluidic विद्युत के निर्माण के लिए यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक कम लागत, कॉंपैक्ट के विकास में सक्षम बनाता है, और आसान करने के लिए उपयोग के लिए-अणुओं का पता लगाने के लिए मंच । पर निर्भर करता है परख बाद में इस्तेमाल किया पर, कई विभिंन प्रकार के उपचिह्न का पता लगाया जा सकता है । यह मंच बहुत बहुमुखी बनाता है और अनुप्रयोगों के विभिंन क्षेत्रों के लिए व्यापक पहुंच प्रदान करता है, मानक नैदानिक परीक्षणों से (जैसे, डॉक्टर के कार्यालय में विशिष्ट रोगों की उपस्थिति का निर्धारण) बिंदु की देखभाल अनुप्रयोगों (जैसे, व्यक्तिगत दवा चिकित्सा के लिए एक रोगी की चिकित्सीय दवा की निगरानी) । विशेष रूप से बिंदु की देखभाल निदान में, लघुकृत के लिए पारंपरिक तरीकों, जो आम तौर पर व्यापक प्रयोगशाला उपकरण, विशेष कर्मचारियों की आवश्यकता पर कई फायदे हैं, और बड़े एजेंट और नमूना मात्रा और लंबे समय बदलाव किया है बार.

    इस के निर्माण के सख्ती से प्रोटोकॉल निंनलिखित सेंसर की आवश्यकता है; अंयथा, विनिर्माण समस्याएं हो सकती हैं । सबसे अक्सर मनाया मुद्दों में से एक अलग परतों के ग़लत संरेखण है । यह आसानी से और अधिक विभिन्न परतों के सटीक संरेखण के लिए अनुमति देता है जो निर्माण प्रक्रिया के लिए एक और अधिक उन्नत उपकरण का उपयोग करके हल किया जा सकता है.

    डीएफआर प्रौद्योगिकी तेजी से और कम लागत निर्माण की संभावना प्रदान करता है । दूसरी ओर, तकनीक संकल्प की दृष्टि से सीमित है । उदाहरण के लिए, बहुत छोटी संरचनाओं के microfluidic चैनल (कम से १०० µm) यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग महसूस नहीं किया जा सकता । ऐसी स्थिति में, photolithography ग्लास photomasks के साथ एक उच्च परिशुद्धता मुखौटा संरेखण द्वारा किया जाना चाहिए । इसके अलावा, एक बहुत व्यापक चैनल भी समस्याग्रस्त किया जा सकता है, के बाद से चैनल नीचे झुकना, चैनल की ऊंचाई को कम करने और चिप के microfluidic व्यवहार को प्रभावित कर सकता है ।

    हमें विश्वास है कि डीएफआर प्रौद्योगिकी भविष्य अनुप्रयोगों में अधिक उपस्थित हो जाएगा, क्योंकि यह आसानी से वाणिज्यिक उपयोग के लिए बढ़ाया जा सकता है । डीएफआर-आधारित microfluidic सेंसरों का द्रव्यमान-उत्पादन कोई बाधा नहीं है जब यह बाजार हिट होगा क्योंकि तकनीक अच्छी तरह से आवेदन के अन्य क्षेत्रों में स्थापित है (जैसे, लचीला इलेक्ट्रॉनिक्स).

    पूरी व्यवस्था की जटिलता को कम करने के संदर्भ में, हमारे भविष्य के काम के डिजाइन और एक डिस्पोजेबल microfluidic कारतूस है कि शामिल है के कार्यांवयन पर ध्यान केंद्रित होगा कि सेंसर चिप; एक अपशिष्ट जलाशय; और पूर्व लोड रिएजेंट, जैसे धोने बफर और अंय परख घटकों के रूप में । amperometric माप के लिए, नमूना और अन्य रिएजेंट की डिलीवरी वायवीय एक्च्यूएशन द्वारा प्रदान किया जा सकता है । यह handheld पाठक द्वारा प्रदर्शन किया जाएगा और microfluidic के माध्यम से एक अपशिष्ट जलाशय को सेंसर चिप कदम होगा ।

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    Disclosures

    लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

    Acknowledgments

    लेखकों को आंशिक रूप से अनुदान संख्या उ० 70/10-01 और उ० 70/12-01 के तहत इस काम के वित्तपोषण के लिए जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (DFG) का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Material
    Pyralux DuPont AP8525R Used as polyimide substrate
    MA-N 1420 Micro Resist Technology MA-N1420 Lift-off resit to define the platinum depostion
    Ma-D 533s Micro Resist Technology MaD533S Developer for MA-N1420
    Platinum - - Electrode and contact pad material
    Ma-R 404s Micro Resist Technology MaR404S Remover for MA-N1420
    SU-8 3005 MicroChem Corp. SU-8-3005 Photoresist to define the electrode area and as insulation
    1-methoxy-2-propanol acetate Sigma-Aldrich 108-65-6 Developer for SU-8 3005
    2-Propanol VWR 8.18766.2500 Removing of the SU-8 developer
    1020R Ultron Systems Inc. 1020R UV sensitive adhesive tape for protection of contact pads
    Arguna S Degussa 1935 For Silver depostion on reference electrode
    KCl Methrom 62308.020 For chloridation of the silver reference electrode
    Pyralux DuPont PC1025 Dry film photoresist
    Sodium carbonat Fluka 71352 Developer for Pyralux PC1025
    Hydrogen chloride Sigma-Aldrich 30720 To top the development of the DFR
    Teflon AF 1600 DuPont AF1600 For employing the stopping barrier
    Name Company Catalog Number Comments
    Equipment
    PA104 Mega Electronics - Bubble etch tank
    FED 53 Binder 9010-0018 Oven
    SPIN150 APT - Spin coater
    Präzitherm Harry Gestigkeit GmbH PZ 28-2 Hot plate
    Hellas Bungard Elektronik 40000 Exposure unit
    Tetra30-LF-PC Diener - Plasma unit
    Univex 500 Leybold - Physical vapor deposition unit
    Shaker S4 ELMI - Orbital shaker
    Sonorex Super 10 P Bandelin 783 Sonic bath
    6221 DC and AC Keithley - Current source
    HRL 350 Ozatec - Laminator unit
    Vaccum pen EFD - Vacuum pen

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    References

    1. Spindel, S., Sapsford, K. E. Evaluation of optical detection platforms for multiplexed detection of proteins and the need for point-of-care biosensors for clinical use. Sensors (Basel). 14, (12), 22313-22341 (2014).
    2. Luppa, P. B., Bietenbeck, A., Beaudoin, C., Giannetti, A. Clinically relevant analytical techniques, organizational concepts for application and future perspectives of point-of-care testing. Biotechnol Adv. 34, (3), 139-160 (2016).
    3. Gauglitz, G. Point-of-Care Platforms. Annu Rev Anal Chem. 7, (1), 297-315 (2014).
    4. Jung, W., Han, J., Choi, J. W., Ahn, C. H. Point-of-care testing (POCT) diagnostic systems using microfluidic lab-on-a-chip technologies. Microelectron Eng. 132, 46-57 (2014).
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    7. Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Ann Rev Biomed Eng. 10, 107-144 (2008).
    8. Dincer, C., Bruch, R., Kling, A., Dittrich, P. S., Urban, G. A. Multiplexed point-of-care testing - xPOCT. Trends Biotechnol. 35, (2017).
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    19. Mattox, D. M. Handbook of Physical Vapor Deposition (PVD) Processing. Elsevier Inc. (2010).
    सूखी फिल्म Photoresist-विद्युत Microfluidic आधारित सेंसर मंच: उपकरण निर्माण, पर चिप परख तैयारी, और सिस्टम ऑपरेशन
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    Bruch, R., Kling, A., Urban, G. A., Dincer, C. Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation. J. Vis. Exp. (127), e56105, doi:10.3791/56105 (2017).More

    Bruch, R., Kling, A., Urban, G. A., Dincer, C. Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation. J. Vis. Exp. (127), e56105, doi:10.3791/56105 (2017).

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