Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Torr Film fotoresist-baserade elektrokemiska mikroflödessystem Biosensor plattform: Enhet Fabrication, On-chip Assay förberedelse och systemdrift

doi: 10.3791/56105 Published: September 19, 2017
* These authors contributed equally

Summary

En mikroflödessystem biosensor plattform designades och dikta ihop användande låg kostnad torr film fotoresist teknik för snabb och känslig kvantifiering av olika analyter. Engångsbruk systemet möjliggör den elektrokemiska avläsningen av den-chip-orörlig enzymkopplad analyser med hjälp av den stop-flow tekniken.

Abstract

Under de senaste åren blev biomarkör diagnostik ett oumbärligt verktyg för diagnos av sjukdomar hos människan, särskilt för point-of-care diagnostiken. En lätt-till-använda och billig sensorplattform är mycket önskvärt att mäta olika typer av analyter (t.ex., biomarkörer, hormoner och droger) kvantitativt och specifikt. Av denna anledning var torr film fotoresist teknik - som möjliggör billiga, lättköpt och hög genomströmning fabrication - används för att tillverka den mikroflödessystem biosensor presenteras här. Beroende på bioassayen används efteråt, är en mångsidig plattform kan upptäcka olika typer av biomolekyler. För tillverkning av enheten, är platina elektroder strukturerade på ett flexibelt polyimid (PI) folie i endast renrum processteg. PI folien fungerar som substrat för elektroderna, som är isolerade med en epoxi-baserade fotoresist. Kanalen mikroflödessystem genereras därefter av utveckling och laminering av torr film fotoresist (DFR) folie på PI rånet. Genom att använda en hydrofoba stoppa barriär i kanal, kanalen är uppdelad i två specifika områden: en immobilisering avsnitt för enzymkopplad analysen och en elektrokemisk mätning cell för amperometrisk signal utläsningen.

På-chip bioassay immobilisering utförs av adsorption av biomolekyler till kanal ytan. Enzymet glukos oxidas används som en givare för elektrokemisk signal generation. I närvaro av substratet, glukos, produceras väteperoxid, som upptäcks vid platina arbetselektroden. Stop-flow tekniken används för att få signal förstärkning tillsammans med snabb upptäckt. Olika biomolekyler kan kvantitativt mätas genom introducerade mikroflödessystem systemet, ger en indikation av olika typer av sjukdomar, eller, när det gäller terapeutisk övervakning, underlätta en personlig terapi.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Under de senaste två decennierna blivit diagnostik program elementära för fördjupade studier på utvecklingen av globala folkhälsan. Traditionellt används laboratorium diagnostiska verktyg för upptäckt av sjukdomar. Även om de spelar fortfarande en viktig roll vid diagnos av sjukdomar, point-of-care testning (POCT) utförs nära patienten eller av patienten själv har blivit mer och mer vanligt på senare år. Särskilt i sådana fall som kräver omedelbar behandling, såsom akut hjärtinfarkt eller diabetes kontroll, är snabb bekräftelse av klinisk konstaterande viktigt. Därför finns det ett växande behov för PNA enheter som kan skötas av icke-experter och som samtidigt kan utföra exakt in vitro- diagnostiska tester i en kort tid1,2,3,4 .

Anmärkningsvärda förbättringar har redan uppnåtts i området POCT. Dock finns det fortfarande många utmaningar att övervinna5,6,7,8. För en POCT plattform lanseras framgångsrikt till marknaden och vara konkurrenskraftiga med laboratoriediagnostik, enheten måste strikt uppfylla följande krav: (i) ge exakt och kvantitativa testresultat som är förenliga med laboratorium resultat. (ii) har kort prov-till-resultat gånger, möjliggör omedelbar behandling av patienten. (iii) har okomplicerad och enkel hantering, även när drivs av otränade individer, och kräver minimerad användarinblandning; och (iv) består av en billig sensor som är konstruerad för engångsbruk applikationer. Utrustning-gratis diagnostik är dessutom gynnsam, främst i resursfattiga miljöer3,4,6.

På grund av dessa allvarliga krav, har endast två POCT system baserade på elektrokemisk detektion (t.ex. blod glukos teststickor) och lateral flow immunanalyser (t.ex. graviditetstester) framgångsrikt lanserats på marknaden så långt. Men båda systemen lider nackdelar såsom dålig prestanda (dvs blodglukoskontroll har felaktiga testresultat och lateral flow analyser ger bara kvalitativt (positivt eller negativt) mätresultat)4, 6. Dessa nackdelar konventionella POCT system har lett till en ökande efterfrågan på att utforska ny teknik som erbjuder snabb, billig och kvantitativa identifiering vid vård4,5.

För att möta dessa utmaningar PNA enheter, har DFR teknik nyligen använts för tillverkning av engångs- och låg kostnad biosensorer9,10,11,12, 13 , 14. DFRs jämfört med mjuk och flytande litografiska material, såsom PDMS eller SU-8, och presentera många fördelar: de (i) finns i en mängd kompositioner och tjocklekar (från ett par µm till flera millimeter); (ii) har en mycket grov yta, vilket underlättar vidhäftning till olika material; (iii) funktionen utmärkt tjocklek enhetlighet; (iv) erbjuda billiga lättköpt och hög genomströmning fabrication för massproduktion. (v) är lätt att skära med olika billiga verktyg, som en enkel sax; och (vi) möjliggöra skapandet av tredimensionella strukturer, såsom mikroflödessystem kanaler, genom att stapla flera DFR lager ovanpå varandra.

Å andra har DFRs i allmänhet en relativt dålig upplösning jämfört med flytande fotoresister, som främst orsakas av filmtjocklek och ökade avståndet mellan masken och DFR på grund av skyddsfolien, vilket dessutom gör ljus spridning. Fortfarande, för tillverkning av integrerade mikroflödessystem biosensorer, DFRs är mycket lämplig för billig massproduktion.

Därför arbetar vi närvarande i detta vid tillverkning och tillämpning av en DFR-baserade elektrokemiska mikroflödessystem biosensor. Det detaljerade protokollet beskriver varje produktion steg i biosensor plattformen, på-chip immobilisering av en DNA-baserad modell analysen och dess elektrokemiska avläsning med stop-flow teknik. Denna universella plattform möjliggör upptäckt av talrika sorter av biomolekyler, använder olika analys teknik (t.ex. genomik, cellomics och proteomik) eller assay format (t.ex. konkurrenskraftiga, smörgås eller direkt). Baserat på en sådan DFR plattform, visat vår grupp tidigare framgångsrikt snabba och känsliga kvantifiering av olika analyter, inklusive antibiotika13,15,16 (tetracyklin, pristinamycin, och ß-laktamantibiotika), troponin jag17och substans P18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. tillverkning av mikrofabricerade Biosensor använder DFR teknik

  1. beredning av PI wafers.
    1. Cut en PI substrat i 6 - in runda plattor (wafers). Sätta PI rånet i en ugn vid 120 ° C i ungefär 1 h för en uttorkning baka.
  2. Första photolithography steg för lyft processen.
    1. Programmera den spin-bestrykare till en 30-s spinning tid vid 3000 rpm, med en acceleration av 2.000 rpm/s. plats PI rånet på den spin-bestrykare och fixa det, tillämpa ett vakuum. Fördela 2 mL av en motstår, möjliggör lyft processen, och starta programmet spin-bestrykare. Ta bort rånet från den spin-bestrykare och soft-baka PI rånet på en värmeplatta under 2 minuter vid 100 ° C.
    2. Justera önskad masken för mönstring elektroderna på PI rånet med blotta ögat och Utsätt det för 400 mJ/cm 2 UV ljus (365 nm). Rånet i en skål fylld med resist-matchande utvecklare i orbitalskak och låt den skaka något för 1 min.
    3. Efter den överskjutande resist avlägsnas, använda dusch och skölj PI rånet med avjoniserat vatten (DI-) på en våt bänk som du kan torka efteråt med hjälp av tryckluft.
  3. Nedfall av platina för bildandet av elektroderna.
    1. Använda en standard fysiska vapor deposition process att insättning 200 nm platina på wafer 19.
    2. Placera rånet i en skål. Lägg den matchande remover i bunken och ta bort den lyft resist medan något skakar rånet i orbitalskak tills alla överskott platinum tas bort. Skölj och torka PI rånet som beskrivs i steg 1.2.3.
  4. Andra photolithography steg: bilda isoleringsskiktet.
    1. Sätta PI rånet i ugn förvärmd till 120 ° C i 5 min att torka den.
    2. Program det första steget i en spin-bestrykare till 5 s spinning tid på 500 rpm. Programmera det andra steget för 30 s vid 4.000 rpm, med en acceleration av 700 rpm/s.
    3. Placera PI rånet på den spin-bestrykare och fixa det, tillämpa ett vakuum. Fördela 4 mL av en lämplig epoxy-baserat fotoresist innan du startar programmet spin-bestrykare.
    4. Mjuk-baka belagda rånet för 3 min vid 95 ° C på en värmeplatta.
    5. Justera masken för isoleringsskiktet på rånet med hjälp av markeringarna respektive justering och en okularlinsen. Exponera rånet till 100 mJ/cm 2 UV ljus (365 nm).
    6. För en efter exponering baka, placera rånet på en förvärmd värmeplatta för 2 min vid 95 ° C.
    7. Placera rånet i en skål och utveckla resist med en lämplig utvecklare (t.ex. 1-metoxi-2-propyl-bensyl i 2 min, när det gäller SU-8) i orbitalskak.
    8. Skölj PI rånet först med isopropanol och skölj och torka den som beskrivs i steg 1.2.3.
    9. Hard-baka fotoresist i ugn för 3 h på 150 ° C.
  5. Plasma-assisted rengöring av elektroderna.
    1. Att ta bort fotoresist restprodukter, använda syre plasma med en standard plasma enhet. Starta rengöringsprogrammet, med 200-W låg frekvens makt med 100% O 2 flöde, en hastighet av 250 sccm och en sammanlagd tid av 3 min.
    2. Placera PI rånet i plasma kammaren, fixa rånet på grundad tallriken med glaslock och starta processen plasma.
  6. Silver och silverklorid nedfall: skapa på-chip referenselektroden.
    1. Passivate platina kontakten kuddar av rånet med en UV-känslig tejp. Klipp folien till 5 mm bred och 11 cm långa ränder och bifoga dem till rånet, skydda delar inte att deponeras hos silver.
    2. För silver nedfall, sätta ett ultraljudsbad (35 kHz) i ett dragskåp och sätt in en behållare av silver elektrolytlösning (100 g/L Ag, pH 12,5) i badet. Inställd rumstemperatur och kraft till 10% i ultraljudsbad.
      Försiktighet: Silver elektrolyt lösningar är mycket giftiga och bör hanteras med yttersta försiktighet. Röken ska aldrig inhaleras.
    3. Ansluta bulk kontakt referens elektroderna till en konstant strömkälla. Anslut räknaren elektroden, en silvertråd som är nedsänkt i silver elektrolytlösningen, till den aktuella källan använder standard anslutningskablar.
    4. Anger den aktuella källan till DC och en strömtäthet av -4,5 mA/cm 2, vilket resulterar i en silver beläggningshastighet på cirka 0,3 µm/min. börja sonic badet och låt den aktuella källan kör för 10 min. Skölj rånet med DI-vatten
    5. För klorering av referenselektroden, infoga ett fartyg av 0,1 M kaliumklorid (KCl) lösning in i sonic badet. Anslut bulk kontakt rånet och en platina elektrod som är nedsänkt i KCl lösningen med den konstanta strömkällan.
    6. Anger den aktuella källan till DC och en strömtäthet av + 0,6 mA/cm 2, vilket resulterar i en beläggningshastighet på cirka 0,075 µm/min. börja sonic badet och låt den aktuella källan kör för 7,5 min.
    7. Skölj och torka PI wafer, som beskrivs i steg 1.2.3.
    8. Ta bort UV-känsliga tejpen efter en UV (365 nm) exponering av 300 mJ/cm 2 och skölj och torka PI rånet, igen som beskrivs i steg 1.2.3.
  7. Tredje photolithography steg: med hjälp av DFRs att skapa mikroflödessystem kanalerna.
    1. Skär behövs DFR lager till en storlek liknar rånet (20 x 20 cm 2). Fixa önskad masken på enhetens exponering och justera de DFR lagret på masken med blotta ögat. Belysa resist med 250 mJ/cm 2 UV ljus (365 nm).
    2. Ta bort skyddsfolien av fotoresist och utveckla resist för ungefär 2 min (beroende på strukturerna) i en 1% natriumkarbonat (Na 2 CO 3) lösning med en standard ultraljudsbad (35 kHz) som förvärmts till 42 ° C och en sonic makt 100%. För att stoppa reaktionen omedelbart, skaka resist för 1 min i en 1% HCl bad i orbitalskak. Skölj och torka varje DFR lager, som beskrivs i steg 1.2.3.
      Obs: Totalt fyra DFR lager måste behandlas som nämns i steg 1,7: en kanal lager och en pärm lager och två baksidan lager (förhindra biosensor böjning i slutet).
  8. Laminering av DFR lager på PI substraten.
    1. Placera PI rånet på en öppenhet overhead folie och fixa det med vanlig tejp. Justera kanal DFR lagret på PI rånet i Mikroskop, använda de respektiva justering strukturerna.
    2. För laminering, Använd en standard heta rulle Lamineringsmaskiner och värm övervalsen till 100 ° C och den nedersta rullen till 60 ° C. Ställ in trycket till 3 bar, med en hastighet av 0,3 m/min. plats framåt rånet med fasta DFR lagret i mitten av Lamineringsmaskiner och starta det; DFR pressas genom lamineringsmaskinen. Upprepa steg efter roterande rånet av 180°.
    3. För att förhindra böjning av biosensor, laminat två utvecklade baksidan lagren på rånet efter steg 1.8.1-1.8.2.
  9. Sysselsätter en hydrofoba stoppa barriär och tätning chip.
    1. Ta bort det skyddande lagret från framsidan av kanalen DFR låger genom att placera standard tejp i ena änden av DFR och dra det uppåt. Använda en hand dispenser med 0,004-i-rör för att fördela små droppar av upplöst polytetrafluoreten i brunnarna av isoleringsskiktet. För att försegla mikroflödessystem chip, laminat täcka DFR lagret den på kanallagret, som beskrivs i steg 1,8.
  10. Hard-baka de mikroflödessystem biosensor.
    1. Ta bort alla skyddande folier på omslaget och baksidan DFR lager. Strimlat av biosensorer med en vanlig sax. Bota markerna i en ugn vid 160 ° C för 3 h.

2. På-chip immobilisering analysförfarande

  1. Adsorption av metoden i området immobilisering av kanal.
    1. Bered en 100 µg/mL avidinen i 10 mM fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid pH 7,4.
    2. Dosera 2 µL av avidinen lösningen på öppningen av biosensor.
      Obs: Kanalen är fylld av kapillärkrafter tills vätskan når den hydrofoba stoppa barriären.
    3. Att säkerställa att den fluidic håller stannar vid barriären under hela inkubationstiden, dispensera 2 µL DI-vatten på utloppet av chip. Inkubera chip vid 25 ° C för 1 h i en stängd behållare.
    4. Ta bort överflödig reagenser genom inloppet av chip genom att tillämpa vakuum. Tvätta kanalen med 50 μl tvättbuffert (PBS med 0,05% Tween-20), portioneras ut på utlopp när vakuumet tillämpas. Torka kanalen för 30 s när vakuumet tillämpas.
  2. Blockerar kanalen ytan för att hämma ospecifik bindning.
    1. Bered en 1% bovint serumalbumin (BSA) i 10 mM PBS vid pH 7,4.
    2. Pipett 2 µL av 1% BSA lösningen på inloppet och 2 µL DI-vatten på kanalen utlopp. Inkubera chip vid 25 ° C för 1 h i sluten behållare. Ta bort överflödigt reagenser och torka kanalen som beskrivs i steg 2.1.4.
  3. Inkubation av DNA oligos märkt med biotin och 6-FAM.
    1. Förbereda olika koncentrationer (0,001-5 µM) av DNA lösningen i 10 mM PBS vid pH 7,4.
    2. Dosera 2 µL av en koncentration av DNA lösningen på inloppet och 2 µL DI-vatten på utlopp. Inkubera chip vid 25 ° C i 15 min i en stängd behållare.
    3. Upprepa steg 2.3.2 för de andra DNA-koncentrationer med ytterligare biosensor chips.
    4. Ta bort överflödig reagenser och torka kanalen som beskrivs i steg 2.1.4.
  4. Immobilisering av GOx-märkt 6-FAM antikroppar.
    1. Formulera en koncentration om 6-FAM antikroppar i 10 mM PBS vid pH 7,4 5 µg/mL.
    2. Införa 2 µL av antikropp lösningen till inloppet och 2 µL DI-vatten till uttaget av kanalen. Inkubera märkt antikropparna vid 25 ° C i 15 min i en sluten behållare. Ta bort överflödigt reagenser, enligt beskrivningen i steg 2.1.4.

3. Amperometrisk Signal upptäckt med Stop-flow teknik

  1. beredning av substrat för elektrokemisk detektion.
    1. Formulera en 40 mM glukoslösning i 0,1 M fosfatbuffrad Koksaltlösning vid pH 7,4 i ultrarent vatten.
    2. För inledande behandling, Bered en 0,1 M PBS vid pH 7,4 i ultrarent vatten.
  2. Förberedande behandling av arbetselektroder.
    1. Använda skräddarsydda chip innehavaren för lätt placering av chip och en fluidic och elektrisk anslutning.
    2. Elektriskt ansluta biosensor till potentiostaten. Säkerställa fluidic kontakten av mikrofabricerade kanalen till en sprutpumpen och reagens behållaren med hjälp av skräddarsydda adapter och rör. Starta den bärbara datorn som är ansluten till potentiostaten och spruta pumpstyrningen, styra fluidic flödet genom chipet.
    3. Starta sprutpumpen manuellt, med 0,1 M fosfatbuffrad Koksaltlösning med en flödeshastighet av 20 µL/min. På arbetselektroden kontra på chip referenselektroden, tillämpa en Växla spänning av 0,8 och -0,05 V för 5 s varje för 30 cykler. Efter detta oxidera arbetselektroden genom att tillämpa en spänning på 0,8 V för 60 s.
  3. Assay avläsning med stop-flow teknik.
    1. Att starta assay signal utläsningen, vänta tills den uppmätta aktuella signalen stabiliserar. Stoppa sprutpumpen och växla reagensen från 0,1 M fosfatbuffrad Koksaltlösning till 40 mM glukoslösning och starta programvaran på sprutan pumpstyrningen; Det kommer att automatiskt stoppa flödet för 1, 2 eller 5 min och kommer starta flödet igen. Observera den resulterande nuvarande toppen.
      Obs: För analys av data, antingen den nuvarande toppen eller laddningen av toppen kan anses, som beskrivs i modellen av en elektrokemisk signal avläsning ( figur 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Konstruktion och tillverkning av mikrofabricerade Biosensor plattformen:

Tillverkning av mikrofabricerade biosensor marker realiseras på wafer-nivå med photolithographic standardmetoder som sysselsätter flera DFR lager. Denna tillverkning strategi bygger på laminering av utvecklade lager av DFRs på ett platinum-mönstrad PI substrat, bildar de mikroflödessystem kanalerna. En kort sammanfattning som skildrar olika fabrication stegen ges i figur 1. En enda 6 - in-wafer består av 130 mikroflödessystem biosensorer, vardera med en dimension på 8 × 10 mm2.

Figure 1
Figur 1. Grafisk illustration av de olika fabrication stegen i ultrakalla biosensor plattformen. (a) skär PI substrat i 6 - in runda plattor (wafers). (b) exponeringen av ett möjligt spin-belagd lyft motstå med respektive masken för platina mallning. (c) substrat efter exponering, efter exponering tillbaka och utveckla fotoresist. (d) fysisk förångningsdeposition Platinum på substratet. (e) lyft process för att ta bort den överskjutande fotoresist. (f) spin-beläggning av SU-8, bildar ett isoleringslager. (g) O2 plasma processen att ta bort SU-8 rester på Pt elektroderna. (h) galvanisk nedfall av Ag/Granulatfyllda referenselektroden. i) UV-exponering och utveckling av olika DFR lager. (j) laminering DFR lager på PI rånet. k) dispense löst polytetrafluoreten, bildar en hydrofoba stoppa barriär mellan immobilisering kapillären och den elektrokemiska cellen. l) slutliga elektrokemiska mikroflödessystem biosensor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Varje biosensor består av en mikroflödessystem kanal, separerade i två distinkta områden med en hydrofob stoppa barriär: en immobilisering sektion och en elektrokemisk cell, markerade i rött och blått, respektive i figur 2. Den immobilisering delen av microchannel har en yta volym av 10,34 mm2 och en volym av 580 nL, vilket resulterar i en hög yta-att volymförhållandet 155 cm-1. Den elektrokemiska cellen innehåller ett på-chip silver/silverkloridreferenselektrod, en räknare och platina arbetselektroden. Denna separation av området immobilisering och elektrokemiska utläsningen av analysens förhindrar kontaminering av elektroderna med biomolekyler och därför hämmar elektrod påväxt. Det gör dessutom exakt mätning av immobilisering reagenser av kapillär fyllning.

Figure 2
Figur 2. Illustration av de operativa principen av elektrokemiska mikroflödessystem plattformen. (a) scheman över en modell analys baserat på metoden. (b) fotografi av den mikroflödessystem biosensor visar dess viktigaste beståndsdelar, inbegripet counter elektroden (CE), referenselektroden (RE), arbetselektroden (WE) och stoppa barriären (SB). Området immobilisering är markerade i rött och den elektrokemiska cellen markeras i blått. (c) Schematisk reaktion av oxidation av producerad väteperoxid på Pt arbetselektroden för amperometrisk detektering i elektrokemiska cellen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Genom att använda DFRs för tillverkning av sensorn, tillåter tillverkningsprocessen hög genomströmning på wafer-nivå. Därför kan kostnaderna hållas nere till ett minimum. Utvecklingen av alla DFR lager är gjort med hjälp av enkla och billiga folie masker och en vakuum exponering unit, snarare än kostsamma krom masker och en mask-aligner. Minskningen av de nödvändiga renrum processteg till ett minimum skär dessutom kostnaderna för tillverkning ännu mer. Totalt tar fabrication proceduren en arbetsinsats om ungefär 10 h, exklusive de bakning gånger och den fysisk förångningsdeposition av platina.

On-chip Assay inkubation:

På-chip assay inkubering sker endast genom kapillärkrafter. Droppvis pipettering av olika reagenser på öppningen av kanalen mikroflödessystem drivs vätskorna genom kanalen av kapillaritet åtgärd tills de når den hydrofoba stoppa barriären. Under steady-state-förhållanden inkuberas därefter reagenser för en distinkt tid. Detta passiva system möjliggör kapillär fyllning av kanalen, utan behov av eventuella externa instrumentering som en sprutpump, och möjliggör exakt mätning av reagenser, som vätskan automatiskt stannar vid stopp barriären. Dessutom arbetsflödet är konsistent med en konventionell ELISA och det fungerar med hög viskositet vätskor som serum eller blod.

I syfte att detta experiment demonstreras chip operationen av ett enkelt test assay anställa avidinen-biotin interaktionen, som visas i figur 2. På-chip assay inkubation börjar med adsorption av metoden till kapillär ytan för 1 h, följt av ett blockerande steg med BSA för en annan 1 h. Därefter inkuberas 6-FAM/biotin-märkt DNA i immobilisering kapillär för 15 min, där det binder till avidinen molekyler. Mellan varje INKUBERINGSSTEGET, tas någon obundna biomolekyler bort av en tvätt steg. Tvättbufferten tillämpas via kanalen utlopp med en skräddarsydd vakuum adapter. I det sista steget introduceras glukos oxidas-märkt antifluorescein antikroppar till kanalen för 15 min. Efter det är biosensor redo för den elektrokemiska avläsning, använda en 40 mM glukoslösning som substrat.

Amperometrisk Signal avläsning med Stop-flow teknik:

För den signal avläsningen av immobiliserade analysen, kan enzymer produkten (här, H2O2), producerades i närvaro av dess substrat, glukos, upptäckas elektrokemiskt på arbetselektroden i den elektrokemiska cellen. För att uppnå snabb detektering tillsammans med signal förstärkning, är den så kallade stopp-flow tekniken används13. I denna metod stoppas flödet av substratet, vilket leder till en ansamling av produkten inuti kapillären. Mängden producerad H2O2 därför beror på mängden bundna glukosoxidas och är beroende av mängden bundna biotinylerade DNA. Genom att starta om flödet, spolas förbättrad H2O2 koncentrationen därefter igenom cellen elektrokemiska mätningar, vilket resulterar i en nuvarande topp-signal, som illustreras i figur 3.

För analys av data, stop-flow tekniken erbjuder två olika parametrar: den maximala höjden och avgift (dvs integralen) av peak signalen. Båda parametrarna är direkt proportionell till stopptidenoch kan därför användas för att analysera data. Med tanke på data utvärderingen, när du använder topphöjden, signal höjden beror på den högsta H2O2 koncentrationen och därmed på dess diffusion koefficient och tillämpad stopptiden. Ju längre stopptiden, ju högre uppmätta signalen svar. Av denna anledning konstant mätas topphöjden, ner till en minsta längd av immobilisering kapillär. Denna speciella funktionen av stopp-flow teknik möjliggör en drastisk minskning av chip dimensioner, särskilt i kapillär längd, samtidigt som känsligheten för sensorn.

Figure 3
Figur 3. Modell av en typiskt erhållna elektrokemiska signal avläsning av en enzymkopplad analys med hjälp av stopp-flow teknik. (a) ett flöde av 40 mM glukoslösning med en hastighet av 20 µL/min tillämpades. Under stoppfasen (1, 2 eller 5 min), enzym produktionen av H2O2 fortsätter. Genom att starta om flödet, spolas den ackumulerade H2O2 igenom den elektrokemiska cellen, där väteperoxid detekteras elektrokemiskt. Genom att upprepa mätningen flera gånger (felstaplar; SEM), en på-chip kalibrering kurva b) erhålls. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Det protokoll som presenteras här för tillverkning av en mikroflödessystem elektrokemisk biosensor möjliggör utvecklingen av en billig, kompakt och lätt-till-använda plattform för detektion av biomolekyler. Beroende på analysen används efteråt på biosensor, kan flera olika biomarkörer upptäckas. Detta gör plattformen mycket mångsidig och ger bred tillgång till olika områden av applikationer, från standard diagnostiska tester (t.ex. att fastställa förekomsten av specifika sjukdomar på läkarmottagningen) till point-of-care program (t.ex. terapeutisk övervakning av en patient för individualiserad läkemedelsbehandling). Särskilt i point-of-care diagnostics, miniatyriserade biosensorer har många fördelar jämfört med konventionella metoder, som vanligtvis kräver omfattande laboratorieutrustning, specialiserade anställda, och stora reagens och provvolymer och har lång handläggningstid gånger.

Tillverkning av detta biosensor kräver strikt efter protokollet. Annars kan tillverkning problem uppstå. En av frågorna som oftast observerade är feljusteringen av olika lager. Detta kan enkelt lösas genom att använda en mer avancerad apparatur för tillverkningsprocessen, vilket möjliggör enklare och mer precisa anpassningen av de olika lagrarna.

DFR tekniken erbjuder möjligheten till snabb och billig tillverkning. Däremot, är tekniken begränsad när det gäller upplösning. Till exempel kan inte mikroflödessystem kanaler mycket små strukturer (mindre än 100 µm) realiseras med hjälp av protokollet som presenteras här. I sådant fall måste photolithographyen utföras av en hög precision mask aligner med glas fotomasker. Dessutom kan en alltför-wide kanal också vara problematiskt, eftersom kanalen kunde böja sig ner, att minska höjden på kanalen och påverka beteendet mikroflödessystem chip.

Vi anser att DFR teknik kommer att vara mer närvarande i framtida tillämpningar eftersom det enkelt kan skalas upp för kommersiellt bruk. Massproduktion av DFR-baserade mikroflödessystem sensorer kommer att inga hinder när det träffar marknaden eftersom tekniken är väletablerad inom andra tillämpningsområden (t.ex. flexibel elektronik).

När det gäller att minska komplexiteten i hela systemet, kommer att vårt framtida arbete fokusera på utformningen och genomförandet av en disponibel mikroflödessystem patron som innehåller biosensor chip; en avfall reservoar; och pre-lastat reagens, såsom tvättbuffert och andra assay komponenter. Amperometrisk mätning, kan leverans av provet och de övriga reagenserna sedan ges av pneumatiskt styrda. Detta kommer att utföras av handhållna läsaren och kommer att gå igenom mikroflödessystem biosensor chip till en avfall reservoar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill tacka de tyska Research Foundation (DFG) för att delvis finansiera detta arbete under Grant nummer UR 70/10-01 och UR 70/12-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Pyralux DuPont AP8525R Used as polyimide substrate
MA-N 1420 Micro Resist Technology MA-N1420 Lift-off resit to define the platinum depostion
Ma-D 533s Micro Resist Technology MaD533S Developer for MA-N1420
Platinum - - Electrode and contact pad material
Ma-R 404s Micro Resist Technology MaR404S Remover for MA-N1420
SU-8 3005 MicroChem Corp. SU-8-3005 Photoresist to define the electrode area and as insulation
1-methoxy-2-propanol acetate Sigma-Aldrich 108-65-6 Developer for SU-8 3005
2-Propanol VWR 8.18766.2500 Removing of the SU-8 developer
1020R Ultron Systems Inc. 1020R UV sensitive adhesive tape for protection of contact pads
Arguna S Degussa 1935 For Silver depostion on reference electrode
KCl Methrom 62308.020 For chloridation of the silver reference electrode
Pyralux DuPont PC1025 Dry film photoresist
Sodium carbonat Fluka 71352 Developer for Pyralux PC1025
Hydrogen chloride Sigma-Aldrich 30720 To top the development of the DFR
Teflon AF 1600 DuPont AF1600 For employing the stopping barrier
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
PA104 Mega Electronics - Bubble etch tank
FED 53 Binder 9010-0018 Oven
SPIN150 APT - Spin coater
Präzitherm Harry Gestigkeit GmbH PZ 28-2 Hot plate
Hellas Bungard Elektronik 40000 Exposure unit
Tetra30-LF-PC Diener - Plasma unit
Univex 500 Leybold - Physical vapor deposition unit
Shaker S4 ELMI - Orbital shaker
Sonorex Super 10 P Bandelin 783 Sonic bath
6221 DC and AC Keithley - Current source
HRL 350 Ozatec - Laminator unit
Vaccum pen EFD - Vacuum pen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spindel, S., Sapsford, K. E. Evaluation of optical detection platforms for multiplexed detection of proteins and the need for point-of-care biosensors for clinical use. Sensors (Basel). 14, (12), 22313-22341 (2014).
  2. Luppa, P. B., Bietenbeck, A., Beaudoin, C., Giannetti, A. Clinically relevant analytical techniques, organizational concepts for application and future perspectives of point-of-care testing. Biotechnol Adv. 34, (3), 139-160 (2016).
  3. Gauglitz, G. Point-of-Care Platforms. Annu Rev Anal Chem. 7, (1), 297-315 (2014).
  4. Jung, W., Han, J., Choi, J. W., Ahn, C. H. Point-of-care testing (POCT) diagnostic systems using microfluidic lab-on-a-chip technologies. Microelectron Eng. 132, 46-57 (2014).
  5. Yager, P., et al. Microfluidic diagnostic technologies for global public health. Nature. 442, (7101), 412-418 (2006).
  6. Fu, E., Yager, P., Floriano, P. N., Christodoulides, N., McDevitt, J. T. Perspective on diagnostics for global health. IEEE Pulse. 2, (6), 40-50 (2011).
  7. Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Ann Rev Biomed Eng. 10, 107-144 (2008).
  8. Dincer, C., Bruch, R., Kling, A., Dittrich, P. S., Urban, G. A. Multiplexed point-of-care testing - xPOCT. Trends Biotechnol. 35, (2017).
  9. Horak, J., Dincer, C., Bakirci, H., Urban, G. A disposable dry film photoresist-based microcapillary immunosensor chip for rapid detection of Epstein-Barr virus infection. Sens Actuators B Chem. 191, 813-820 (2014).
  10. Method for the fabrication of a "lab on chip" from photoresist material for medical diagnostic applications. US patent. Jobst, G., Gamp, T. 7,691,623 (2010).
  11. Kling, A., Dincer, C., Armbrecht, L., Horak, J., Kieninger, J., Urban, G. Electrochemical microfluidic platform for simultaneous multi-analyte detection. Procedia Eng. 120, 916-919 (2015).
  12. Armbrecht, L., Dincer, C., Kling, A., Horak, J., Kieninger, J., Urban, G. Self-assembled magnetic bead chains for sensitivity enhancement of microfluidic electrochemical biosensor platforms. Lab Chip. 15, 4314-4321 (2015).
  13. Dincer, C., et al. Designed miniaturization of microfluidic biosensor platforms using the stop-flow technique. Analyst. 141, 6073-6079 (2016).
  14. Weltin, A., Kieninger, J., Enderle, B., Gellner, A. K., Fritsch, B., Urban, G. A. Polymer-based, flexible glutamate and lactate microsensors for in vivo applications. Biosens Bioelectron. 61, 192-199 (2014).
  15. Kling, A., et al. Multianalyte Antibiotic Detection on an Electrochemical Microfluidic Platform. Anal Chem. 88, (20), 10036-10043 (2016).
  16. Bruch, R., et al. Clinical on-site monitoring of ß-lactam antibiotics for a personalized antibiotherapy. Sci Rep. (2017).
  17. Horak, J., Dincer, C., Qelibari, E., Bakirci, H., Urban, G. Polymer-modified microfluidic immunochip for enhanced electrochemical detection of troponin i. Sens Actuators B Chem. 209, 478-485 (2015).
  18. Horak, J., Dincer, C., Bakirci, H., Urban, G. Sensitive, rapid and quantitative detection of substance P in serum samples using an integrated microfluidic immunochip. Biosens Bioelectron. 58, 186-192 (2014).
  19. Mattox, D. M. Handbook of Physical Vapor Deposition (PVD) Processing. Elsevier Inc. (2010).
Torr Film fotoresist-baserade elektrokemiska mikroflödessystem Biosensor plattform: Enhet Fabrication, On-chip Assay förberedelse och systemdrift
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bruch, R., Kling, A., Urban, G. A., Dincer, C. Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation. J. Vis. Exp. (127), e56105, doi:10.3791/56105 (2017).More

Bruch, R., Kling, A., Urban, G. A., Dincer, C. Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation. J. Vis. Exp. (127), e56105, doi:10.3791/56105 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter