Summary
פרוטוקול זה מתאר intratracheal ההזרקות של פישר 344 חולדות עם Francisella tularensis. הליך זה מחקה ריאתי החשיפה של בני אדם סוכן biothreat פוטנציאל זה יכול לשמש כדי לבדוק את החיסון והיעילות הטיפולית נגד tularemia ריאתי.
Abstract
זיהום ריאתי עם החיידק Francisella tularensis יכול לגרום למחלה רצינית וקטלניים, tularemia, אצל בני אדם. עקב המחסור הנוכחי חיסון tularemia שאושרו עבור בני אדם, המחקר מתמקדת פיתוח החיסון ניצול מודלים בעלי חיים המתאימים. העכברוש פישר 344 התפתחה מודל זה משקף את הרגישות האנושית tularensis פ זיהום, ובכך הוא מודל אטרקטיבי עבור פיתוח החיסון tularemia. חיסון Intratracheal של העכברוש 344 פישר עם פ tularensis מחקה חשיפה ריאתי אצל בני אדם. שילוח מוצלח לתוך קנה הנשימה עכברוש הוא קריטי עבור משלוח ריאתי. Laryngoscope עם תאורה משמש לצנרר כראוי את tracheae של מרדימים חולדות; המיקום הנכון בתוך קנה הנשימה נקבעת על ידי מכשיר פשוט לזהות את הנשימה. בעקבות צנרור, התרבות tularensis פ מועבר ב מנה נמדד באמצעות מזרק. טכניקה זו המשקלל ריאתי מסירת tularensis פ בתוך קנה הנשימה העכברושים להעריך את יעילות החיסון.
Introduction
פ tularensis (Ft) גורם המחלה האנושית, tularemia. כאשר החיידק נרכשים דרך המסלול ריאתי, זה מוביל tularemia pneumonic, אשר יש תחלואה גבוהה התמותה1. פ tularensis נחשב סוכן biothreat בשל הסכנה הקשורים לטפסים שידורה, ויש כיום אין חיסון שאושרו לשימוש בני אדם בארה ב מאמץ אינטנסיבי נמצא בעיצומו בימים אלה לפתח חיסונים, צעדים טיפוליים נגד tularemia pneumonic, כדי להגן על האוכלוסייה האנושית נגד השימוש הפסול הזה biothreat חיידקי
רוב המחקר tularemia התמקדה המודל העכבר, בשל הרגישות של עכברים לזיהום פ tularensis , השכיחות של נוגדנים. עם זאת, עכברים הוכיחו להיות דוגמנית קשה לפיתוח חיסון, בשל הקושי של הוכחת יעילות החיסון זה מודל2. לאחרונה, העכברוש פישר 344 פותחה כמודל עבור פיתוח חיסון tularemia3. הרגישות של החולדה פישר 344 תת השונים פ tularensis מחקה רגישות אנושית4, חולדות יכול להיות מוגן נגד אתגר ריאתי פ tularensis על ידי חיסון באמצעות זן תרכיב חי ידוע של הגנה בני5,6,7. כי החולדה פישר 344 מודלים תכונות מסוימות של זיהום פ tularensis של בני אדם, זה יכול להיות מודל מאוד שימושי עבור הפיתוח של חיסון המגן מפני ריאתי tularensis פ חשיפה.
חיסון יעיל צריך להגן. על בני האדם מפני חשיפה ריאתי tularensis פ. החשיפה ריאתי סביר של שהוסבה לכלי נשק tularensis פ יהיה aerosolized חיידקים בשאיפה לתוך הריאות8. עם זאת, תרסיס מהדור tularensis פ הוא מסוכן ובלתי מסורבלת, דורש ציוד מיוחד הבלימה. מסלול חלופי של חשיפה ריאתי בחולדה שהוא אולי יותר להתאמה עבור מספר מעבדות חסר ציוד מיוחד היא דרך חיסון intratracheal6. טכניקה זו מנצל laryngoscope את המיקום הנכון של צנתר בתוך קנה הנשימה של עכברוש anesthetized. מיקומה בתוך קנה הנשימה, יותר מאשר את הוושט, מאומת על ידי מכשיר פשוט מדמיין זרימת האוויר מהריאות. פ tularensis מועברת לאחר מכן לריאות דרך הצנתר על ידי המינהל עם מזרק, ואחריו החדרת אוויר לתוך הצנתר על מנת להבטיח משלוח ריאתי של החיידקים. לעומת זאת, Jemski5 דיווח בעבר כי tularensis פ מחוסן לתוך פישר 344 חולדות דרך המסלול תוך-אפי יכול לא להיות תרבותי מן הריאות עד 3 ימים לאחר חיסון, המציין את חיסון תוך-אפי בחולדות אינה לא תוצאה ישירה של חיידקים לתוך הריאות.
הסוכן בחר צורות של tularensis פ (פ tularensis subsp. tularensis, subsp. tularensis פ holarctica) מחייבים הליכים הבלימה אבטחה ברמה 3 (BSL3), אשר תמנע צילום וידאו. עם זאת, פ novicida (Fn) פטור הסוכן בחר מצב עקב שלה avirulence בבני אדם בריאים, יכול להיות מנוצל בבטחה תחת אבטחה ברמה 2 (BSL2) תנאים9,10. יתר על כן, Fn משמש כבסיס עבור חיסונים הקלוש בשידור חי יכול להגן מפני חשיפה ריאתי tularensis פ כאשר מתבצעת דרך חיסון intratracheal11,12,13. הטכניקה המובאת כאן מאפשר הלימוד של זיהומים המתרחשים דרך המסלול ריאתי ניצול חולדות כמודל לבני. טכניקה זו יכולה להתבצע ללא צורך ציוד מניבות תרסיס מיוחד. Fn שימש את הטכניקות הבוליוודי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
עבודה זו בוצעה בהתאמה קפדנית עם ההמלצות במדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה של מכוני הבריאות הלאומיים. פרוטוקולים בעלי חיים המערבים מכרסמים אושרו על ידי אוניברסיטת טקסס סן אנטוניו מוסדיים חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה (IACUC) תחת פרוטוקול MU009(RA).
1. להכין קטטר לקנה מחוון, פ tularensis Inoculum
- להכין קטטר (20 G x 2 ב)
- לחתוך את 20 G x 2 ב המחט ולטחון קצה המחט של בלאנט, חלקה לסיים עם כלי רוטרי.
הערה: אורך המחט קהות צריך לאפשר את הטיפ מתכת לבטל כ 3 מ מ לתוך שרוול קטטר כשהוא מתיישב על המחט קהות. המחט קהות נותן את הקטטר קשיחות מבנית כדי לאפשר מיקום של הקטטר לקנה, העדר של קצה המחט קהות המגיחה מתוך שרוול קטטר מונע פגיעה לקנה הנשימה. - לנקות את המחטים קהות, קטטרים באמצעות אתנול 70% ולחטא תחת אור UV במשך 15 דקות
- לחתוך את 20 G x 2 ב המחט ולטחון קצה המחט של בלאנט, חלקה לסיים עם כלי רוטרי.
- להכין את קנה הנשימה מחוון
- לקצץ טיפ פיפטה 1,000 µL כדי לאפשר את הטיפ לשבת לתוך חור קטטר, טופס של החותם לאוויר.
- להסיר מסנן µL תרסיס מכשול פיפטה טיפ 200, המקום בפנים הטיפ פיפטה החתוך בעבר µL 1,000-
- להבטיח המסנן יכול לנוע בחופשיות בתוך קצה פיפטה 1,000 µL כאשר הטיפ הוא הצביע טיפ למטה.
- Inoculum tularensis פ
- לגדול tularensis פ עומס בן לילה על צלחת אגר המתאימה ב- 37 ° שריטה ג כ 100 µL של הדשא חיידקים מהצלחת אגר עם סטרילי מזריקים לולאה ולהשתמש לחסן 500 מ"ל Erlenmeyer בקבוק המכיל 250 מ של מדיום הגידול נוזלי המתאים (עבור Fn: ציר סויה tryptic (TSB) בתוספת 0.1% L-ציסטאין הידרוכלוריד מונוהידראט) דגירה רועד בין לילה ב- 37 מעלות צלזיוס.
הערה: novicida פ משמש הוידאו גדל על צלחת אגר (TSA) tryptic סויה בתוספת 0.1% L-ציסטאין הידרוכלוריד מונוהידראט. - Centrifuge התרבות לילה נוזלי מבוגר ב g 4,221 x בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע מבלי לשבש את פעולת בגדר חיידקים.
התראה: פעל המוסד ' המלצות אבטחה s כדי למחוק את תגובת שיקוע. - בעדינות מחדש להשעות בגדר חיידקי 25 מ של מדיום נוזלי המתאים (Fn: TSB בתוספת 0.1% L-ציסטאין הידרוכלוריד מונוהידראט) המכיל 10% גליצרול, באמצעות פיפטה 25 מ ל.
- באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, aliquot התרבות חיידקי resuspended לתוך 500 aliquots µL, בקבוקים, להקפיא באמבט קרח יבש/אתנול, ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס
- כדי לקבוע את כייל של הבקבוקונים תרבות קפוא, להסיר שתי מבחנות קפוא המאוחסנים ב- 80 ° C, להפשיר על קרח, ולבצע דילולים טורי, באגירה פוספט מלוחים (PBS) ואחריו ציפוי על מדיום הגידול המתאים (Fn: TSA המכיל 0.1% L-ציסטאין הידרוכלוריד). צלחות הן מודגרות h 24-48-37 מעלות צלזיוס, יחידות ויוצרים מושבה (CFU) ממוספרים כדי לחשב את מספר תאים חיידקיים בתוך הבקבוקונים תרבות קפואים (ממוצע של שתי מבחנות).
- להכין את inoculum חיידקים על ידי מפשיר בקבוקון קפוא בקרח ולאחר מכן לדלל את התרבות עם PBS הריכוז הסופי של 10 7 CFU/100 µL. Inoculum צריך להיות בריכוז שיניבו את CFU הרצוי ב- 100 µL (הריכוז הסופי של גליצרול בתוך inoculum לא יכול להיות יותר מ- % 3, כדי למנוע חנק של העכברוש). תרבות קפוא הבקבוקונים מאוחסנים ב- 80 ° C יכול לשמש עד שישה חודשים לאחר הכנה-
- לגדול tularensis פ עומס בן לילה על צלחת אגר המתאימה ב- 37 ° שריטה ג כ 100 µL של הדשא חיידקים מהצלחת אגר עם סטרילי מזריקים לולאה ולהשתמש לחסן 500 מ"ל Erlenmeyer בקבוק המכיל 250 מ של מדיום הגידול נוזלי המתאים (עבור Fn: ציר סויה tryptic (TSB) בתוספת 0.1% L-ציסטאין הידרוכלוריד מונוהידראט) דגירה רועד בין לילה ב- 37 מעלות צלזיוס.
2. עכברוש הרדמה
- להתחבר לחדר הרדמה מכשיר אידוי הפעלה כראוי איזופלוריין של מכונת הרדמה.
- חיבור הגז ניקוי צינור על תא הרדמה לגז ניקוי המערכת.
- פתח את זרימת החמצן על מכונת הרדמה כדי 4 ליטרים לדקה
- להגדיר את מאדה איזופלוריין 5%-
- למקם את החולדה בבית הבליעה הרדמה.
הערה: אנו בדרך כלל מנצלים חולדות בין 8-10 שבועות (130-180 גרם); עכברים צעירים שקשה לחסן באמצעות טכניקה זו בשל גודלו הקטן של חלל הפה. - כאשר תנאי הגיוס של הרדמה התרחש, לשמר את החולדה-איזופלוריין 5%, 2 ל'/min חמצן אפקט. זה לוקח בערך 3-10 דקות
- לקבוע את העומק של הרדמה על ידי האיכות ואת קצב הנשימה פעימות הלב, ואת תגובת רפלקס גירוי כמו במבחן קמצוץ הבוהן. אידיאלי עומק ההרדמה שציין רוזן s 1-1.5 בין כל נשימה.
3. חיסון Intratracheal
- להסיר את החולדה מן החדר הרדמה ולמקם את העכברוש dorsally על הדוכן צנרור מכרסמים. לצרף את השיניים הקדמיות של עכברוש המחזיק כדי לשמור עכברוש במקום.
הערה: אם החולדה מתחיל להתעורר במהלך ההליך, ניתן להסיר את הקטטר, החולדה חזר לחדר הרדמה כדי להגיע למטוס עמוק יותר של הרדמה. - להשתמש ביד הדומיננטית לעבור באותו צד של תמיכה יד הלשון עם נקודה רחבה ההלבשה האגודל מלקחיים.
- שימוש תומכת יד ובטוח הלשון laryngoscope נגד העכברוש, ' s להוריד את הלסת, ולהמחיש את קנה הנשימה והושט של החיה. קנה הנשימה לפתוח ולסגור כמו החולדה נושם.
- הוסף הצנתר המכיל 20 גאייג-קהה-מחט, מוכן בשלב 1.1, לתוך קנה הנשימה. אולי יש התנגדות קלה, וייתכן הכניסה לתוך קנה הנשימה " באמפי " עקב הקטטר לשפשף את הסחוסים בקנה הנשימה. בשל לחות או נשימה רדודה, קנה הנשימה יכול להיות מכוסה האפיגלוטיס המונע ויזואליזציה של קנה הנשימה. בעדינות לגעת בקצה של הסחוס האפיגלוטיס יגרום הכנף סחוס לפתוח ולחשוף את קנה הנשימה.
- הסר קהה-המחט של הקטטר תוך הקפדה על הקטטר נשאר לקנה.
- לאפשר כמה שניות לעבור העכברוש להיות מסוגל לנשום סביב קטטר מוכנס לתוך קנה הנשימה.
- מושב בחוזקה מחוון קנה הנשימה אל הקטטר פתיחה. תנועה של המכשול תרסיס יציין הצנתר הוכנס כהלכה לתוך קנה הנשימה.
- להבטיח כי החולדה שוכבת על הדוכן צנרור כך בחזה של החיה פונה בניצב למישור של העמדה צנרור.
- להסיר את מחוון קנה הנשימה ולספק 100 µL (10 7 CFU) של inoculum המכיל tularensis פ באמצעות טיפ פיפטה 200 µL, בחוזקה ישיבה הטיפ כנגד הפתח קטטר.
- לצרף 1 מ"ל slip עצה טוברקולין מזרק מלא אוויר ולספק 300 µL של אוויר כדי לוודא inoculum יגיע לריאות של העכברוש.
- להסיר את הצנתר קנה הנשימה ולהסיר את החולדה פלטפורמת כירורגי.
- לאפשר את החולדה לעורר ולהחזיר לכלוב. ודא כי הנשימה חזר לשגרה.
- לקבוע את CFU ב tularensis פ inoculum כפי שמתואר בשלב 1.3.5 כדי לאשר את CFU יועבר. בתוך קנה הנשימה.
- חזור על השלבים 3.1-3.9 על חוסנו (תמים) חיות PBS µL 100 במקום inoculum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תגובת חיסון intratracheal של tularensis פ בחולדה ההורמונאלית יכול להיקבע על ידי מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה) נגד חיידקים UV-לא פעיל, כפי שתואר לעיל11. סה כ אימונוגלובולין G (IgG) בתגובה של פישר 344 חולדות לא מופעל כל התא חיידקים היה חיסון המוערך פוסט-intratracheal עם זן הקלוש של Fn (107 CFU inoculum)-ביום 14 וביום 28 (איור 1). חולדות מוק-חיסון קיבל PBS intratracheally. עלייה titers בסרום נוגדן נגד חיסון שלאחר Fn ביחס תמים מוק-חיסון חיות מציין את יעילות החיסון intratracheal. תגובתיות בסרום נמוך עשוי להצביע על מיקום intratracheal שגוי.
איור 1: סה כ אג תגובות לחיות הקלוש Fn Intratracheal חיסון בחולדות F344. סרה של חולדות F344 (n = 5) intratracheally חוסנו עם חי הקלוש זן Fn (107 CFU) נותחו עבור רמות IgG סה כ תגובתי עם התא כולו Fn יום 14, חיסון לאחר 28 יום. חולדות חוסנו-מוק (תמים) (n = 5) היו intratracheally חוסנו עם PBS. האזור אדום מציין תגובתיות של sera תמימה (חולדות F344 שחוסנו ואימץ PBS). קווי השגיאה מייצגים ב- SEM אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
העכברוש פישר 344 הופך להיות מודל חשוב עבור פיתוח חיסון tularemia3. חשיפה tularensis פ דרך המסלול ריאתי הוא קריטי עבור הוכחת יעילות כנגד צורות שהוסבה לכלי נשק של tularensis פ, כי אלה יימסרו אירוסולים. חיסון Intratracheal של העכברוש מקלה על חשיפה של הריאות עכברוש tularensis פ ללא צורך גדול, יקר ומסובך תרסיס יצירת ציוד. כל הניסויים ניצול הסוכן בחר צורות של פ tularensis בנוסף דורשים בלימה BSL3, אשר בדרך כלל מתרחשת בחלל הוגבלה בצורה קשה. לפיכך, טכניקה זו מקטינה את כמות ציוד נוסף שצריך להיות שוכן בתוך סביבת העבודה הזה.
בגלל Fn היה המתח tularensis פ מנוצל עבור צילום וידאו, כל הטכניקות בוצעו תחת בלימה BSL2. עיבוד של טכניקה זו לסביבה BSL3 כולל כל ההליכים מבוצעים על אבטחה הקבינט על ידי אנשי ללבוש ציוד אבטחה (מלא הוד, מכונת ההנשמה מטהר אוויר מופעל (PAPR), לכיסוי כל עם המנוע, כפול כפפות, מגפונים), ולהפחית עיבודים אלה ניידות, מיומנות, ואת ניראות. מחוון קנה הנשימה הוא מרכיב חשוב המאפשר את האישור כי הקטטר בוצעה כהלכה בתוך קנה הנשימה, בהתחשב שלעיתים קרובות קשה לעשות אחרת קביעה זו בעת עבודה בתנאים BSL3.
ישנם עכברים אנטומית "סימולטורים" של קנה הנשימה ואת הושט, ואלה שימושי לשפר את הטכניקה עובדים עם בעלי חיים. עם זאת, עבודה עם הסימולטור אינה זהה לעבודה עם עכברוש חי. אחד האמצעים כדי לקבוע אם טכניקה זו מבוצעת כהלכה החי היא לנצל Trypan blue לצבוע גם inoculum על עכברוש anesthetized, לאחר ההליך מיד להרדימו. דיסקציה של רקמת הריאה, הבטן תחשוף אם לצבוע נמסרה לתוך הריאות לא הוושט. עכברוש זה יש חוסן עם Fn (מטר) באמצעות הטכניקה הזו יכולה להרדימם גם זמן קצר לאחר חיסון, רקמת הריאה מצופה כדי לקבוע התצהיר בפועל בתוך הריאות.
חיסון intratracheal הנכון יהיה חשוב להערכת יעילות החיסון tularemia העכברוש פישר 344, אבל זה יכול להיות גם שימושי עבור חיסון אחרות ו/או יישומים טיפוליים בחולדות, כולל biodefense. לפיכך, טכניקה זו ייתכן להתאמה למגוון רחב של יישומים ריאתי ניצול המודל עכברוש. בעוד משלוח באמצעות תרסיס יוצר המכשיר עשוי להיות דומה יותר תרחיש biothreat, חיסון intratracheal של tularensis פ מייצג חלופה פשוטה יחסית, חסכונית לפיתוח חיסון tularemia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי את ההגנה איום הפחתת סוכנות (DTRA) תחת חוזה HDTRA1-14-C-0116, ואת המרכז למצוינות גנומיקה זיהום (משרד ההגנה #W911NF-11-1-0136 מקלדת).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GreenLine fiber optic blade size 0 | Carefusion | 5-5231-00 | Macintosh American profile |
| GreenLight system laryngoscope handle | Carefusion | 4559GSP | |
| Exel International Safelet I.V. Catheter | EXEL INTERNATIONAL | 26743 | |
| Slip Tip Sterile Syringes 1mL | BD | 309659 | |
| Broad Point Dressing Thumb Forceps | Thermo Scientific | 76-302 | |
| 200 μL barrier tip | GeneseeScientific | 24-142 | |
| 1,000 μL pipette tip | Olympus Plastics | 24-173 | |
| Dremel 3000-2/28 Rotary tool kit | Dremel | 3000228 | |
| Rodent Intubation Stand | Braintree Scientific | RIS 200 | |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Rodent anesthesia machine | Surgivet | VTC302 Classic T3 | |
| Rodent Anesthesia chamber | Braintree Scientific | AB 1 |
References
- Ellis, J., Oyston, P. C. F., Green, M., Titball, R. Tularemia. Clin Microbiol Rev. 15 (4), 631-646 (2002).
- Lyons, C. R., Wu, T. H. Animal models of Francisella tularensis infection. Ann N Y Acad Sci. 1105, (2007).
- Hutt, J. A., Lovchik, J. A., Dekonenko, A., Hahn, A. C., Wu, T. H. The Natural History of Pneumonic Tularemia in Female Fischer 344 Rats after Inhalational Exposure to Aerosolized Francisella tularensis subspecies tularensis Strain Schu S4. Am J Pathol. 187 (2), 252-267 (2017).
- Ray, H. J., et al. The Fischer 344 rat reflects human susceptibility to Francisella pulmonary challenge and provides a new platform for virulence and protection studies. PloS one. 5, e9952 (2010).
- Jemski, J. V. Respiratory tularemia: comparison of selected routes of vaccination in Fischer 344 rats. Infect Immun. 34 (3), 766-772 (1981).
- Wu, T. H., et al. Vaccination of Fischer 344 rats against pulmonary infections by Francisella tularensis type A strains. Vaccine. 27 (34), 4684-4693 (2009).
- Mara-Koosham, G., Hutt, J. A., Lyons, C. R., Wu, T. H. Antibodies contribute to effective vaccination against respiratory infection by type A Francisella tularensis strains. Infect Immun. 79 (4), 1770-1778 (2011).
- Oyston, P. C., Sjostedt, A., Titball, R. W. Tularaemia: bioterrorism defence renews interest in Francisella tularensis. Nat Rev Microbiol. 2 (12), 967-978 (2004).
- Kingry, L. C., Petersen, J. M. Comparative review of Francisella tularensis and Francisella novicida. Front Cell Infect Microbiol. 4, 35 (2014).
- Rohmer, L., et al. Comparison of Francisella tularensis genomes reveals evolutionary events associated with the emergence of human pathogenic strains. Genome Biol. 8 (6), R102 (2007).
- Chu, P., et al. Live attenuated Francisella novicida vaccine protects against Francisella tularensis pulmonary challenge in rats and non-human primates. PLoS Pathog. 10 (10), e1004439 (2014).
- Signarovitz, A. L., et al. Mucosal Immunization with Live Attenuated Francisella novicida U112ΔiglB Protects against Pulmonary F. tularensis SCHU S4 in the Fischer 344 Rat Model. PloS one. 7 (10), e47639 (2012).
- Cunningham, A. L., et al. Enhancement of vaccine efficacy by expression of a TLR5 ligand in the defined live attenuated Francisella tularensis subsp. novicida strain U112DiglB::fljB. Vaccine. 32 (40), 5234-5240 (2014).
