ويصف هذه المخطوطة في المختبر بروتوكولات الفحص المجهري الفيديو لتقييم وظيفة الأوعية الدموية في الشرايين الدماغية مقاومة الفئران. ويصف المخطوط أيضا تقنيات لتقييم كثافة ميكروفيسيل مع فلوريسسينتلي المسمى نضح يكتين والأنسجة باستخدام الليزر دوبلر Flowmetry.
هذا البروتوكول وصف الاستخدام في المختبر مجهرية التلفزيون لتقييم وظيفة الأوعية الدموية في الشرايين المقاومة الدماغية المعزولة (وغيرها من السفن)، ويصف تقنيات لتقييم نضح الأنسجة باستخدام الليزر دوبلر Flowmetry (LDF ) والمسمى ميكروفيسيل كثافة استخدام فلوريسسينتلي يكتين سيمبليسيفوليا جريفونيا (GS1). الأساليب الحالية لدراسة معزولة الشرايين المقاومة في ترانسمورال الضغوط التي تواجه في فيفو وفي غياب التأثيرات خلية متني بتوفير ارتباط حرجة بين في فيفو الدراسات والمعلومات المكتسبة من جزيئية النهج الاختزالية التي توفر البصيرة محدودة إلى استجابات متكاملة على مستوى الحيوان كله. LDF وتقنيات تحديد الشرايين والشعيرات الدموية بشكل انتقائي مع المسمى فلوريسسينتلي يكتين GS1 تقديم حلول عملية لتمكين المحققين لتوسيع المعرفة المكتسبة من الدراسات للشرايين المقاومة المعزولة. هذا الكتاب يصف تطبيق هذه التقنيات على اكتساب المعرفة الأساسية بالأوعية الدموية علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض في الفئران كنموذج تجريبي عام، وفي مجموعة متنوعة من متخصصة وراثيا سلالات الفئران “مصمم” التي يمكن أن توفر المهم ثاقبة تأثير جينات معينة على هامة تعمل الأوعية الدموية. استخدام هذه النهج التجريبي قيماً في سلالات الفئران وضعتها الوراثي استراتيجيات وتكنولوجيات جديدة لإنتاج نماذج خروج المغلوب الجينات في الفئران، ستوسع صرامة أماكن العلمية المتقدمة في نماذج الماوس خروج المغلوب و توسيع نطاق تلك المعرفة إلى نموذج حيوان أكثر أهمية، مع خلفية الفسيولوجية مفهومة جيدا ومدى ملاءمتها للدراسات الفسيولوجية بسبب حجمه أكبر.
الدراسات أقرب وظيفة الأوعية الدموية في الشرايين تستخدم قناة الشرايين، وفي كثير من الحالات الشريان الاورطي. عموما درس توليد القوة في الشرايين الكبيرة عن طريق إرفاق مقطع الدائري الشريان محول قوة في حمام أنسجة؛ وفي حالة الشريان الاورطي، بالقطع الحلزونية شرائط السفينة حيث أن ألياف العضلات الملساء كانت موجهة في اتجاه طولي بين نقطة المرفق ومحول القوة، لتوفير أفضل تقدير للقوة الناتجة عن انكماش العضلات الملساء على طول محورها الطولي. وكان تقنية قياسية لقطع شرائط حلزونية من أورتاس وضع قضيب زجاج في التجويف للسفينة، وجعل قطع في جدار السفينة في زاوية المطلوب، وعلى عقد لنهاية حافة يتعرض الجدار السفينة كما تم تمديد الخفض إنتاج بأكمله قطاع حلزونية من السفينة. عند هذه النقطة، عموما تم مسح الجانب غشائي السفينة لإزالة الحطام قبل إرفاق محول قوة قطاع السفن وغمر التحضير في اﻷوكسيجين، والتحكم في درجة الحرارة حمام الأنسجة. في نهاية المطاف، أن نهج أدى إلى واحدة من الاكتشافات الأكثر شهرة وأهمية في تاريخ علم وظائف الأعضاء فورتشجوت وزاوادسكي1، إلا وهي دور البطانة المستمدة عامل الاسترخاء (EDRF)، حددت بعد ذلك كأكسيد النيتريك، في تنظيم وظيفة الأوعية الدموية. وكان هذا الحدث الحاسمة المؤدية إلى أن اكتشاف حالة التي تحتفظ بطانة سليمة عن طريق تجنب الاتصال الجانب غشائي الشريان مع الأسطح الخارجية المحققين، ولاحظت أن قطاع الابهري لا يحمل المتوقعة تقلص إلى أستيل (ACh)، لكن بدلاً من ذلك استرخاء في الاستجابة لمنظمة العمل ضد الجوع. وبناء على هذه الملاحظة، المحققون البلدان المتقدمة النمو إعداد “ساندويتش” التي يعلقونها جزء الابهر مع بطانة سليمة (ولكن غير قادر على توليد قوة الهوس) إلى شريط حلزوني قياسي من الشريان الاورطي وتحويلها المستحثة منظمة العمل ضد الجوع انكماش في استرخاء.
اثنين تقدما كبيرا في هذا المجال التي تستخدم على نطاق واسع اليوم هي تنمية الاستعدادات لقياس قوة الهوس النشطة في مقاومة صغيرة الشرايين2،3 (مثل تلك الموجودة في مساريق الأمعاء3 ) ومقني المقاومة شريان الأعمال التحضيرية4،،من56. في أحد التقارير الأولى، وصف مولفاني وهالبيرن3 استخدام إعداد أسلاك ميوجراف لدراسة قوة الهوس النشطة في الشرايين المقاومة المعزولة من مساريق الأمعاء عفويا ضغط الدم الفئران (باستفاض) و ضوابط وكي نورموتينسيفي. بعد تطوير نظام ميوجراف الأسلاك، وضعت المقاومة مقني الشريان الاستعدادات للسماح بالدراسات المتعلقة بالسفن أقرب إلى في فيفو الظروف4،،من56. في حين توفر كلا النهجين نتائج قيمة، إعداد الشريان مقني قد أضيفت مزايا أكثر فعالية الحفاظ على لهجة نشطة مضمنة في الشرايين؛ والسماح للمحققين بدراسة الردود شذوذ النشطة للتغييرات في الردود transmural الضغط والسفينة على التغيرات في معدل التدفق وإجهاد القص غشائي (انظر استعراض هالبيرن وكيلي6).
أحد الأهداف رئيسية لهذه الورقة هو وصف كيفية توظيف تقنية العريقة للفحص المجهري الفيديو استخدام الشرايين المقاومة المعزولة، مقني من أجل الحصول على معلومات دقيقة بشأن الآليات التي تنظم لهجة النشطة في هذه الأهمية السفن، مستقلة عن الخلايا العصبية أو خلطيه أو متني التأثيرات. هذه المعلومات الأساسية، تستخدم نموذج الفئران قياسية وأمثلة من دراساتنا من جديد وراثيا هندسيا سلالات الفئران، وسيتم تزويد القارئ بفكرة عن أنواع الأفكار المتعلقة بوظيفة الأوعية الدموية التي يمكن أن تكتسب بالتلفزيون النهج الفحص المجهري، والتي يمكن استخدامها في الدراسات المتعلقة بأي عنصر تحكم والتجريبية مجموعة (مجموعات) لاختيار المحقق، بما في ذلك نماذج الفئران التجريبية الجديدة القوية التي تنتجها الاستيلاد الانتقائي والمطورة حديثا الوراثية التقنيات الهندسية.
بفضل دقة النهج مجهرية التلفزيون، قياس التغيرات القطر في الشريان مقني التحضيرية يمكن أن توفر معلومات قيمة للغاية فيما يتعلق بالآليات المعتمدة على البطانة والبطانة مستقلة من الأوعية الدموية الاسترخاء، فضلا عن تعديلات هامة (وغير متوقعة في بعض الأحيان) في آليات مراقبة الأوعية الدموية التي تحدث مع ارتفاع ضغط الدم والنظام الغذائي الملح عالية، والتدخلات التجريبية الأخرى. وبالإضافة إلى ذلك، قياس الضغط-قطر علاقات في عزل ومقني الشرايين المقاومة التي أقصى استرخاء بالمعاملة مع Ca2 +-الحرة حل أو دواء وعائي الدوائي، يسمح للمحقق لتقييم التغيرات الهيكلية في الشرايين بسبب إعادة عرض الأوعية الدموية، وحساب العلاقات السلبية الإجهاد-الانفعال7 التي يمكن توفير نظرة ثاقبة التغيرات في الخواص الميكانيكية السلبي للشرايين التي يمكن أن تؤثر على وظيفة الشرايين الهامة مستقلة من (أو بالإضافة إلى) إجراء تغييرات في آليات مراقبة فعالة. من المهم أيضا أن نلاحظ أن المعلومات المكتسبة من الدراسات للشرايين المقاومة معزولة يمكن أن تستكمل بالمعلومات التي تم الحصول عليها من خلال استخدام LDF، طريقة عملية لتقييم نضح الأنسجة في الحيوان كله مستوى8،9 ،10، ومن المعلومات المكتسبة من تقييم ميكروفيسيل كثافة استخدام المسمى فلوريسسينتلي GS1 يكتين، التي تلزم على وجه التحديد إلى بروتين سكري مويتيس في الغشاء الطابق السفلي ل الشرايين والشعيرات الدموية الصغيرة11 , 12-يوفر طريقة الأخيرة وضع تقديرات دقيقة للغاية للكثافة ميكروفيسيل التي لا تخضع لصعوبات الكلاسيكية في تقدير الكثافة ميكروفيسيل عن طريق العد السفن في فيفو، على سبيل المثال في عداد المفقودين غير perfused السفن حيث يتم إيقاف تدفق الدم بسبب الإغلاق النشط للشرايين. عندما تستخدم معا، هذه النهج يمكن أن توفر فكرة هامة للربط بين التعديلات الفنية في الشرايين المقاومة المعزولة للتغييرات في نضح الأنسجة على المستوى ميكروسيركولاتوري؛ وستقدم أيضا بعض الأمثلة على استخدام هذه النهج قيماً بالاقتران مع تقنيات الشريان مقني في المخطوطة الحالية.
تركز هذه الورقة على استخدام تقنيات الفحص المجهري الفيديو لتقييم التغيرات الأوعية الدموية في شرايين فئران سبراغ داولي أووتبريد. ومع ذلك، من المهم ملاحظة أن هذه التقنيات قد أثبتت أن تكون قيمة للغاية في توضيح التعديلات المظهرية في سلالات الفئران المهندسة وراثيا متخصصة للغاية تم إنشاؤها بواسطة الوراثي أو الجيني تحرير باستخدام تقنيات. في هذه المخطوطة، نحن نقدم أمثلة على تقنيات الفحص المجهري الفيديو كيف قدمت معلومات هامة فيما يتعلق بوظيفة الأوعية الدموية في عدد من الفئران قيمة النماذج، بما في ذلك داهل المراعية للملح (SS) سلالة الجرذان، الفئران الفطرية التي الأكثر انتشارا استخدام نموذج تجريبي لدراسة آليات هايبرتينسون الحساسة الملح18،19،20،21،،من2223؛ والجرذان كونسوميك التي تم إنشاؤها عن طريق الانتقاء الوراثي للفئران SS مع سلالة الجرذ البنى النرويج (BN) الملح غير متحسسة. في لوحات فأر كونسوميك، كان كل كروموسوم من الفئران “النرويج براون” إينتروجريسيد على حدة إلى SS داهل24،،من2526 الوراثية الخلفية. استخدام لوحات الفئران كونسوميك قدمت أدلة قيمة فيما يتعلق بالكروموسومات المحددة التي تسهم في حساسية الملح ضغط الدم وغيرها تعمل، بما في ذلك الأوعية الدموية مفاعليه24،25،26 ،،من2728.
استراتيجيات الوراثي باستخدام SS الجرذان والفئران كونسوميك تحمل الفردية BN الكروموسومات مكنت أيضا توليد سلالات كونجينيك ضاقت مع شرائح صغيرة من إينتروجريسيد الكروموسومات “النرويج براون” الفردية إلى SS داهل الوراثية خلفية22،29. وهذه توفر قيمة للغاية الإدخال على جينات محددة أو تضييق المناطق الكروموسومات التي يمكن أن تؤثر على المتغيرات الفسيولوجية حاسمة، مثل ضغط الدم والتلف الكلوي والأوعية الدموية مفاعليه22،29. آخر قوية بالإضافة إلى الأدوات الوراثية الجرذ هو تطوير جينات الفئران خروج المغلوب نماذج استخدام الجينات متقدمة تحرير تقنيات بما في ذلك زفنس، نوكليسيس المنشط–مثل-المستجيب النسخي (تالينس)، وفي الآونة الأخيرة كريسبر Cas913 ،،من1415،،من1617. ظهور هذه التقنيات القوية التي تمكن من الجينات أن خرج في الفئران تطور بالغة أهمية نظراً لدراسات الجينات خروج المغلوب حتى الآن استخدمت (والاستمرار في استخدام) الفئران حصرا تقريبا. عنصر آخر من عناصر تجريبية في هذه الورقة يوضح قيمة تقنيات الشريان مقني والفيديو المجهري لتقييم آليات المراقبة الفسيولوجية في الجرذان خروج المغلوب يفتقر إلى النسخ الحماية المضادة للأكسدة والخلية الرئيسية العوامل، العامل النووي (المستمدة من محمر 2)-مثل-2 (NRF2)30،31، التي تم تطويرها باستخدام التكنولوجيا TALEN في الخلفية الوراثية سبراغ داولي17. في تلك التجارب، واستخدمت في المختبر تقنيات الفحص المجهري الفيديو لتوفير التحقق الوظيفية لفقدان الجينات NRF2 واختبار نهج علاجية يحتمل أن تكون قيمة استناداً إلى أوبريجولاتيون مباشرة من مضادات الأكسدة بوساطة NRF2 الدفاعات. جبهة الخلاص الوطني-2 لها أهمية علاجية كبيرة في مكافحة الأكسدة والأوعية الدموية في البشر، وفي ضوء النتائج المخيبة للآمال للتجارب السريرية التي تشمل الإدارة المباشرة للمواد المضادة للأكسدة مثل فيتامينات ج وه32.
وكما ذكر في المقدمة، وتصف هذه الورقة استخدام مجهر التلفزيون والشريان المقاومة المعزولة نهج لتقييم وظيفة الأوعية الدموية ليس فقط في نماذج الفئران القياسية (كالمستخدمة في الفيديو)، ولكن أيضا بدرجة عالية من التخصص وراثيا سلالات الفئران المهندسة، التي تظهر في الرواية والأفكار القوية التي ي…
The authors have nothing to disclose.
الكتاب الإعراب عن شكرهم الخالص فينك كاتي ولين دوندلينجير لما قدموه من المساعدة في إعداد هذه المخطوطة.
منحة الدعم: R21 # المعاهد الوطنية للصحة-OD018309؛ #R56-HL065289؛ #R01-HL128242.
SS Rat | Medical College of Wisconsin | SS/JHsd/Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
SS.5BN Consomic Rat | Medical College of Wisconsin | SS-Chr 5BN/Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
SS.13BN Consomic Rat | Medical College of Wisconsin | SS-Chr 13BN/Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
Ren1-BN Congenic Rat | Medical College of Wisconsin | SS.BN-(D13hmgc41-D13)hmgc23/Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
Ren1-SSA Congenic Rat | Medical College of Wisconsin | SS.BN-(D13rat77-D13rat105/Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
Ren1-SSB Congenic Rat | Medical College of Wisconsin | SS.BN-(D13rat124-D13rat101/Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
Nrf2(-/-) Knockout Rat and Wild Type Littermates | Medical College of Wisconsin | SD-Nfe212em1Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
Low Salt Rat Chow (0.4% NaCl)-AIN-76A | Dyets, Inc. | 113755 | |
High Salt Rat Chow (4% NaCl)-AIN-76A | Dyets, Inc. | 113756 | |
Colorado Video Caliper | Colorado Video, Inc. | Model 308 | |
Video Camera | Hitachi | KPM1AN | |
Microscope | Olympus Life Science | CKX41 | |
Television Monitor | Panasonic | WVBM1410 | |
Pressure Transducers | Stoelting | 56360 | |
Blood Pressure Display Unit | Stoelting | 50115 | |
Cannulated Artery Chamber | Living Systems Instrumentation | CH-1 | Single vessel chamber for general use |
Temperature Controller for Single Chamber | Living Systems Instrumentation | TC-09S | |
Gas Dispersion Tube, Miniature,Straight | Living Systems Instrumentation | GD-MS | Provides aeration in the vessel bath |
Gas Exchange Oxygenator, Miniature | Living Systems Instrumentation | OX | Allows gas exchange with perfusate |
Laser-Doppler Flowmeter | Perimed | PeriFlux 5000 LDPM | |
GS1 Lectin | Vector Labs | RL-1102 | |
Glass Capillary Tubes for Micropipettes | Fredrich Haer Co. | 27-33-1 | 2 mm ODX1 mm ID |
Verticle Pipette Puller | David Kopf Instruments | Model 700C | |
Nylon suture material (10/0)-3 PLY | Ashaway Line and Twine Manufacturing Co. | 114-ANM-10 | Single strands of 3 ply nylon suture teased out for use on vessels |
Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | |
Vannas Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
Protandim | Protandim | NRF2 Inducer: Contact Dr. Joe McCord (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU) | |
Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
Sodium Bicarbonate | Fisher Chemical | S233-3 | |
Dextrose (d-glucose) anhydrous | Fisher Chemical | D16-500 | |
Magnesium Sulfate (MgSO4-7H2O) | Sigma Aldrich | M1880-500 G | |
Calcium Chloride (CaCl2-2 H2O) | Sigma | C5080-500G | |
Sodium Phosphate-Monobasic (NaH2PO4) | Sigma | S0751-500G | |
Potassium Chloride (KCl) | Fisher Chemical | P217-500G | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | ED255-500G |