Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Evaluatie van vasculaire controlemechanismen met behulp van videomicroscopie van geïsoleerde resistentie slagaders van ratten

Published: December 5, 2017 doi: 10.3791/56133
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 3, 3
1Department of Physical Therapy, Marquette University, 2Medical College of Wisconsin, 3Department of Physiology, Medical College of Wisconsin, 4Graduate Programs of Nurse Anesthesia, Texas Wesleyan University, 5Office of Research, Medical College of Wisconsin

Summary

Dit manuscript wordt beschreven in vitro videomicroscopie protocollen voor de beoordeling van de vasculaire functie in rat weerstand van de cerebrale bloedvaten. Het manuscript wordt ook beschreven technieken voor het evalueren van microvessel dichtheid met fluorescently geëtiketteerde lectine en weefsel perfusie met behulp van Laser Doppler flowmetrie.

Abstract

Dit protocol beschrijft het gebruik van in vitro televisie microscopie vasculaire functie in geïsoleerde cerebrale weerstand slagaders (en andere vaartuigen) moet worden geëvalueerd en technieken voor het evalueren van weefsel perfusie met behulp van Laser Doppler flowmetrie (LDF beschrijft ) en dichtheid van de microvessel met behulp van fluorescently label Griffonia simplicifolia (GS1) lectine. Huidige methoden voor het bestuderen van geïsoleerd weerstand slagaders in Transmurale druk ondervonden in vivo en bij gebrek aan parenchymal cel invloeden zorgen voor een kritische verbinding tussen in vivo studies en informatie die is opgedaan met moleculaire reductionistische benaderingen die beperkt inzicht geven in integratieve reacties op het niveau van het hele dier. LDF en technieken om selectief inleven arteriolen en haarvaten fluorescently-geëtiketteerden GS1 lectine bieden praktische oplossingen zodat onderzoekers uit te breiden de kennis die is opgedaan met studies van geïsoleerde resistentie slagaders. Deze paper beschrijft de toepassing van deze technieken te krijgen van de fundamentele kennis van vasculaire fysiologie en pathologie bij de rat als een algemeen experimentele model, en in een verscheidenheid van gespecialiseerde genetisch gemanipuleerde "ontwerper" rat stammen die kunnen bieden belangrijk inzicht verschaffen in de invloed van specifieke genen op belangrijke vasculaire fenotypen. Met behulp van deze waardevolle experimentele benaderingen in rat stammen ontwikkeld door selectief fokken strategieën en nieuwe technologieën voor de productie van gene knock-out modellen in de rat, zal het uitbreiden van de strengheid van wetenschappelijke lokalen in knock-out Muismodellen ontwikkeld en die kennis naar een meer relevante dierlijke model, met een goed begrepen fysiologische achtergrond en de geschiktheid voor fysiologische studies vanwege de grotere omvang uit te breiden.

Introduction

De vroegste studies van vasculaire functie in slagaders gebruikt conduit slagaders, en in veel gevallen de aorta. Strijdkrachtgeneratie in grote slagaders werd in het algemeen bestudeerd door een segment van de ring van de slagader te hechten aan een transducer kracht in een bad van weefsel; in het geval van de aorta, stroken door te snijden spiraalvormige van het schip zodat de gladde spiervezels waren georiënteerd in de lengterichting tussen het punt van de bijlage en de kracht transducer, zodat de beste schatting van de kracht gegenereerd door samentrekking van de gladde spieren langs de longitudinale as. De standaard techniek voor het snijden van de spiraalvormige stroken van aortas moest een roerstaaf in het lumen van het schip te plaatsen, breng een snee in de vaatwand onder de gewenste hoek en vasthouden aan het einde van de blootgestelde zijde van de vaatwand doordat de cut werd uitgebreid tot het produceren van een hele spiraalvormige strip van het schip. Op dat moment het endotheel zijde van het vaartuig in het algemeen om te verwijderen van puin vooraleer de strip van het vaartuig aan de transducer kracht te dompelen de voorbereiding in een zuurstofrijk werd uitgewist en temperatuur gecontroleerde weefsel bad. Uiteindelijk, dat aanpak tot één van de meest beroemde en belangrijke ontdekkingen in de geschiedenis van fysiologie door Furchgott en Zawadski1, namelijk de rol van endotheel leidde afgeleid ontspannen factor (EDRF), later geïdentificeerd als stikstofmonoxide, in reguleren van vasculaire functie. De cruciale voorval dat leidt tot die ontdekking was een situatie waarin de onderzoekers een intact endotheel gehandhaafd door het vermijden van contact van het endotheel kant van de slagader met buitenlandse oppervlakken, en merkte dat de aorta strip niet de verwachte deed vertonen Contractie aan acetylcholine (ACh), maar in plaats daarvan ontspannen in reactie op de ACh. Op basis van deze opmerking, de onderzoekers ontwikkelde een voorbereiding van de "sandwich" waarin ze gekoppeld een aorta segment met een intact endotheel (maar niet voor het genereren van contractiele kracht) naar een standaard helical strook van aorta en geconverteerd de ACh-geïnduceerde contractie in een ontspanning.

Twee grote vooruitgang op dit gebied, die vandaag op grote schaal worden gebruikt zijn de ontwikkeling van de voorbereidingen voor het meten van actieve contractiele kracht in kleine weerstand slagaders2,,3 (zoals die in de intestinale mesenterium3 ) en gecanuleerd weerstand slagader preparaten4,5,6. In een van de vroegste verslagen, Mulvany en Halpern3 beschreef het gebruik van het preparaat myograph draad te bestuderen van actieve contractiele kracht in geïsoleerde resistentie slagaders van de intestinale mesenterium van spontaan hypertensieve ratten (SHR) en normotensive WKY-besturingselementen. Na de ontwikkeling van de wire myograph systeem, werden gecanuleerde weerstand slagader voorbereidingen ontwikkeld om de studies van vaartuigen dichter naar in vivo voorwaarden4,5,6toestaan.  Hoewel beide benaderingen waardevolle resultaten opleveren, heeft de gecanuleerde slagader voorbereiding de toegevoegde voordelen van meer effectief behoud van intrinsieke actieve Toon in de slagaders; en waardoor de onderzoekers bestuderen van actieve myogenic reacties op veranderingen in Transmurale druk en vaartuig reacties op veranderingen in het debiet en endotheel schuifspanning (Zie Wapenschouwing tegen Halpern en Kelley6).

Een belangrijk doel van het huidige papier is om te beschrijven hoe de aloude techniek van videomicroscopie geïsoleerde, gecanuleerde weerstand slagaders gebruiken om nauwkeurige informatie over de mechanismen die actieve Toon in deze cruciale regelen schepen, onafhankelijk van invloeden van de neurale, humorale of parenchymal cel. Deze basisinformatie, met een standaard rat model en voorbeelden uit onze studies van nieuw genetisch gemanipuleerde rat stammen, krijgt de lezer een idee van de soorten de inzichten met betrekking tot de vasculaire functie die kan worden opgedaan met televisie microscopie benaderingen, en die kunnen worden ingezet in studies met een controle- en experimentele groep(en) van de onderzoeker te kiezen, inclusief krachtige nieuwe experimentele rat-modellen geproduceerd door selectieve inteelt en nieuw ontwikkelde genetische engineering-technieken.

Dankzij de precisie van televisie microscopie benaderingen, kan meting van diameterovergangen in gecanuleerde slagader preparaten bieden zeer waardevolle informatie betreffende endotheel-afhankelijke en endotheel-onafhankelijke mechanismen van vasculaire ontspanning, evenals belangrijke (en soms onverwachte) wijzigingen in vasculaire controlemechanismen die zich voordoen met hypertensie, hoog zout dieet en andere experimentele interventies. Daarnaast meten van druk-diameter relaties in geïsoleerde en gecanuleerd weerstand slagaders die maximaal worden versoepeld door behandeling met Ca2 +-gratis oplossing of een farmacologische vaatverwijdende drug, kan de onderzoeker te beoordelen structurele veranderingen in de slagaders als gevolg van vasculaire remodeling en passieve spanning-spanning relaties7 waarmee belangrijk inzicht verschaffen in de wijzigingen in de passieve mechanische eigenschappen van de slagaders die invloed kunnen hebben op de arteriële functie kunt berekenen onafhankelijk van (of naast) veranderingen in actieve controlemechanismen. Het is ook belangrijk op te merken dat uit studies van geïsoleerde resistentie slagaders verkregen informatie kan worden aangevuld met informatie verkregen met behulp van LDF, een praktische methode voor het uitrekenen van de perfusie van het weefsel in het hele dier niveau8,9 ,10, en door de informatie die is opgedaan bij de beoordeling van de dichtheid van de microvessel met behulp van fluorescently geëtiketteerde GS1 lectine, dat specifiek bindt aan glycoproteïne wordt in het membraan van de kelder van kleine arteriolen en haarvaten11 , 12. de laatste methode biedt een zeer nauwkeurige schatting van de dichtheid van de microvessel die is niet onderworpen aan de klassieke moeilijkheden bij het schatten van de dichtheid van de microvessel door het tellen van vaartuigen in vivo, bijvoorbeeld ontbrekende niet-geperfundeerd vaartuigen waar bloedtoevoer is gestopt als gevolg van actieve sluiting van arteriolen. Wanneer samen gebruikt, kunnen deze benaderingen belangrijk inzicht verschaffen om te correleren functionele wijzigingen in geïsoleerde resistentie slagaders aan veranderingen in de perfusie van het weefsel op het microcirculatory niveau; en enkele voorbeelden van het gebruik van deze waardevolle benaderingen in combinatie met de gecanuleerde slagader technieken zal ook worden verstrekt in het huidige manuscript.

De huidige papier richt zich op het gebruik van video microscopie technieken voor het evalueren van vasculaire wijzigingen in slagaders van outbred Sprague-Dawley ratten. Het is echter belangrijk op te merken dat deze technieken hebben bewezen te zijn zeer waardevol in het ophelderen van fenotypische wijzigingen in gespecialiseerde genetisch gemanipuleerde rat stammen gemaakt door selectief fokken of gene bewerken met behulp van technieken. In dit manuscript bieden we voorbeelden van hoe video microscopie technieken hebben verstrekt belangrijke informatie met betrekking tot de vasculaire functie in een aantal waardevolle rat modellen, waaronder de Dahl zout-gevoelige (SS) rat-een ingeteelde rat stam, dat is de meest gebruikt experimenteel model voor het bestuderen van de mechanismen van zout gevoelige hypertenson18,19,20,21,22,23; en consomic ratten gemaakt via selectieve fokken van SS ratten met het zout-ongevoelig Brown Noorwegen (BN) rat stam. In de consomic rat panelen geweest elke chromosoom uit de rat Brown Noorwegen ingekruist individueel naar de Dahl SS24,25,26 genetische achtergrond. Gebruik van consomic rat panelen heeft verstrekt waardevolle aanwijzingen met betrekking tot specifieke chromosomen die aan zout gevoeligheid van bloeddruk en andere fenotypen bijdragen, met inbegrip van vasculaire reactiviteit24,25,26 2827, ,.

Selectieve fokken strategieën met behulp van SS ratten en consomic ratten uitvoering van individuele BN chromosomen hebben ook ingeschakeld voor de generatie van vernauwde congenisch stammen met kleine segmenten van individuele Brown Noorwegen chromosomen ingekruist in de genetische Dahl-SS achtergrond22,29. Deze kunnen bieden uiterst waardevolle input op specifieke genen of beperken van de regio's van de chromosomen die cruciale fysiologische variabelen, zoals bloeddruk, nierschade en vasculaire reactiviteit22,29kunnen beïnvloeden. Een andere sterke toevoeging aan genetische werkset rat is de ontwikkeling van rat gene knock-out modellen met behulp van geavanceerde gene bewerken technieken waaronder ZFNs, transcriptionele activator-achtige-effector nucleasen (TALENS), en meest recent CRISPR-Cas913 ,14,15,16,17. De komst van deze krachtige technieken waarmee genen te worden gevloerd in de rat is een enorm belangrijke ontwikkeling omdat gene knockout studies tot nu toe heb gebruikt (en blijven gebruiken) muizen bijna uitsluitend. Een andere experimentele component in het huidige document toont de waarde van de gecanuleerde slagader technieken en videomicroscopie om fysiologische controlemechanismen in knock-out ratten ontbreekt de meester antioxidant en cel beschermende transcriptie factor, nucleaire factor (erythroid afkomstige 2) - zoals - 2 (NRF2)30,31, die zijn ontwikkeld met behulp van technologie van de TALEN in de Sprague-Dawley genetische achtergrond17. In deze experimenten, werden in vitro videomicroscopie technieken gebruikt functionele verificatie van verlies van het NRF2-gen en het testen van een potentieel waardevolle therapeutische aanpak op basis van directe opregulatie van NRF2-gemedieerde antioxidant verdedigingen. NRF-2 is van aanzienlijk therapeutisch belang in de strijd tegen vasculaire oxidatieve stress bij de mens, in het licht van de teleurstellende resultaten van klinische proeven met betrekking tot directe toediening van anti-oxidanten zoals de vitamines C en E32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De medische universiteit van Wisconsin institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) goedgekeurd alle protocollen die zijn beschreven in dit document en alle procedures zijn in overeenstemming met de National Institutes of Health (NIH) Office van laboratorium Animal Welfare (OLAW) verordeningen.

1. bereiding van de oplossingen en vaartuig kamer

  1. Voorafgaand aan het uitvoeren van een reeks experimenten, bereiden 2 L 20 x geconcentreerd zout stockoplossing bestaande uit 278 g/L NaCl; KCl 14 g/L; 11.52 g/L MgSO4. 7H2O; en 9.4 g/L CaCl2. 2H2O. Ook het bereiden van 2 L 20 x geconcentreerd buffervoorraad, bestaande uit 80.8 g/L NaHCO3 en 0,4 g/L EDTA en 2 L 20 x geconcentreerd Ca2 +-gratis stockoplossing, bestaande uit 281.6 g/L NaCl; 14 g/L KCl en 11.52 g/L MgSO4. 7H2O.
    Opmerking: 20 X stamoplossingen kunnen worden opgeslagen in de koelkast tot gebruik.
  2. Op de dag van het experiment, bereiden 2 L van fysiologische zoutoplossing (PSS) van de 20 x geconcentreerde stamoplossingen als volgt: Voeg 100 mL 20 x zout voorraad tot 1800 mL gedeïoniseerd water in een erlenmeyer van 2 L of het bekerglas op een gemotoriseerde roeren plaat. Voeg 100 mL 20 x buffervoorraad terwijl het voortdurend zo de oplossing met een mengsel van koolwaterstofgassen, met 21% O2, 5% CO2, N-2, en onder het roeren met een magnetische roeren bar evenwicht. Voeg langzaam 0,28 g NaH2PO4 tijdens de controle van de pH-waarde; Pas zo nodig op een pH van 7,4 door toevoeging van druppels 6 N HCl of 6.5 N NaOH-oplossing van een pipet van Pasteur. Nadat de PSS is bereid en de pH is aangepast, voeg 1,98 g glucose naar de PSS.
    Opmerking: Het is belangrijk dat de Voeg langzaam de NaH2PO4 laatst observatie van de pH van de PSS omdat tijdens de toevoeging van NaH2PO4 tot en met een alkalische (pH > 7.4) kunnen vormen een neerslag van calciumfosfaat, zoals aangegeven door de verschijning van een bewolkt oplossing of een witte neerslag op de bodem van de container.
    Opmerking: De uiteindelijke samenstelling van de PSS is 119 mM/L NaCl; KCl 4,7 mM/L; 1,17 mM/L Mg2zo4; 1.6 mM/L CaCl2; 1,18 mM/L NaH2PO4; 24 mM/L NaHCO3; 0.03 mM/L EDTA; en 5.5 mM/L glucose. Hoewel de samenstelling van de PSS tussen laboratoria verschillen kan, is dit recept uitermate geschikt voor het behoud van de vasculaire Toon, endotheel functie en reacties op vasoactieve agenten in geïsoleerde resistentie slagaders.
  3. Bepalen van de maximale diameter en te beoordelen actief Toon in de slagader door overlegging van de maximale dilatatie van het vaartuig, bereiden 500 mL Ca2 +-PSS door toevoeging van 25 mL van de 20 X Ca2 +gratis-vrij van zout voorraad aan 450 mL gedeïoniseerd water , gevolgd door 25 mL 20 x buffervoorraad in een conische kolf of bekerglas soortgelijke stap 1.2 hierboven. 0,07 g van NaH2PO4 aan de oplossing toevoegen terwijl monitoring en aanpassing van de pH van de oplossing. De Ca2 +-gratis PSS wordt toegevoegd aan de PSS reservoir en vaartuig kamer aan het einde van het experiment om te voorkomen dat het afbreken van intracellulaire Ca2 + winkels die invloed kunnen hebben op de reacties van het schip in normale PSS. Omdat de Ca2 +-gratis oplossing is toegevoegd aan het einde van het experiment tot maximale ontspanning van de slagaders, er is geen noodzaak om toe te voegen van glucose naar de PSS.
    Opmerking: Wanneer voltooid, de uiteindelijke samenstelling van de Ca2 +-gratis PSS is 120.6 mM/L NaCl; KCl 4,7 mM/L; 1,17 mM/L Mg2zo4; 1,18 mM/L NaH2PO4; 24 mM/L NaHCO3; 0 mM/L CaCl2; en 0.03 mM/L EDTA.
    Opmerking: Bij veel studies waarbij maximale verwijding van de slagader, een calcium vermelding blocker zoals verapamil (1 µM) en/of een stikstofmonoxide-donor zoals natrium nitroprusside (10 µM) kan worden toegevoegd aan de oplossing, naast het verwijderen van Ca2 + van de PSS.
  4. Het handhaven van de PO2, PCO2en pH van de PSS door voortdurend zo de PSS stroomt in de zaal van het vaartuig in een bad van de standaard orgel gebruikt bij het bestuderen van geïsoleerde aorta ringen, intestinale vlotte spier of andere weefsels (Figuur 1). Gebruik synthetische fluorpolymeer van tetrafluorethyleen buis de gastank verbinden met de orgel-bad, omdat dit type buis gas ondoordringbare, in tegenstelling tot vele andere vormen van buizen, bijvoorbeeld, latex is.
  5. Plaats een kleine lucht-steen verbonden met het gasmengsel evenwichtsinstelling vaartuig aanwezig om te helpen handhaven van de PSS-gassamenstelling.
    Opmerking: Vaartuig reacties op veranderingen in PO2 kunnen worden getest door de PSS in het vaartuig zaal en luminal perfusaat zo met gasmengsels van verschillende percentages van O2 bijvoorbeeld, 21% O2, 10% O2, 5% O2 , en 0% O2, met 5% CO2 en evenwicht N233,34,35. Voor grotere aders met dikkere muren, waar diffusie van zuurstof in het midden van de vaatwand een beperking kunnen, kan een hoger percentage van zuurstof, bijvoorbeeld, 95% O2 worden gebruikt.
  6. Nauwlettend de temperatuur in de zaal van het vaartuig, als afzonderlijke ruimten in hun warmte overdracht kenmerken variëren kunnen.
    Opmerking: Vele commercieel voorbereid schip kamers voor studies voor gecanuleerde weerstand slagaders gebruikt gebruik een peristaltische pomp om te bezorgen zuurstofrijk PSS uit een reservoir van gas-geëquilibreerd en zeer nauwkeurige controle van Bad temperatuur en oxygenatie van de PSS.
  7. De PSS in een grote fles (2 L) Mariotte, met een stop en centrale glazen buis om te dienen als een reservoir te leveren voortdurend PSS in het orgel bad die verwarmt en de PSS stromend naar de vaartuig kamer (figuur 1A) gas-equilibrates plaatsen.
  8. Plaats de opening van de centrale glazen buis in de fles van Mariotte op hetzelfde niveau als de top van de PSS in de orgel-bad, aan het handhaven van een constante hydrostatische druk hoofd voor levering van PSS in de orgel-bad. Gebruik polyethyleen slang verbonden met een J-vormige glazen of plastic buis te leveren van de PSS uit de fles van Mariotte in het orgel-bad.
  9. Gebruik voor luminal perfusie (figuur 1A), polyethyleen slang de instroom pipet verbinden met een PSS-reservoir bestaat uit een 60 cc kunststof spuit verhoogde naar een positie die de gewenste instroom druk (meestal 80 mmHg voor studies van rat cerebrale onderhoudt slagaders), zoals gemeten met een druk transducer verbonden met het systeem via een afsluiter.
  10. Sluit de uitstroom pipet aan een polyethyleen buis om het PSS te stromen via het vaartuig in reactie op een drukverschil en sluit de lijn van de uitstroom naar een reservoir dat vergelijkbaar is met de instroom-reservoir. Gebruik een soortgelijk afsluiter en druk transducer verbinding om uitstroom druk te meten.
    Opmerking: Procedures voor het instellen van Transmurale druk en controle van de stroom door het schip worden beschreven in sectie 2, hieronder.
  11. Aan het einde van het experiment, spoel de kamer, bezorging lijnen en reservoir systemen met gedestilleerd water. Met regelmatige tussenpozen, vervangt u de buis en levering lijnen, schoon of vervang de kranen in het systeem en periodiek een glas PSS reservoirs te onderwerpen aan een acid wash om te voorkomen dat de groei van bacteriën en andere micro-organismen die verontreiniging veroorzaken en invloed op de reactiviteit van het vaartuig.

2. de gecanuleerde slagader voorbereiding

  1. Anesthetize van een rat Sprague-Dawley met 5% Isofluraan en onderhouden van de narcose met behulp van 1,5 tot 2,5% medische kwaliteit zuurstof36. U kunt ook het beheren van een intramusculaire injectie met ketamine (75,0 mg/kg), acepromazine (2,5 mg/kg) en xylazine (10.0 mg/kg); een intraperitoneale injectie van pentobarbital (50-60 mg/kg); of een andere goedgekeurde methode van de verdoving, afhankelijk van de protocollen en/of onderzoeker voorkeuren.
  2. De rat onder diepe verdoving onthoofden en verwijder de hersenen voor studies van cerebrale weerstand slagaders.
  3. Na verwijdering van de hersenen, zorgvuldig isoleren de middelste cerebrale slagader (MCA) (of andere slagaders van belang, bijvoorbeeld, arteria slagader of posterieure cerebrale slagader)37,,38. Om te isoleren van de MCAs, plaatst de hersenen liggende in een glazen petrischaaltje gevuld met ijskoude PSS (Figuur 2).
  4. Gebruik Vannas schaar en een Dumont #5 fijne punt pincet accijnzen van de MCA van de hersenen.  Reinig alle resterende hersenweefsel van de MCA met behulp van de verlostang en de slagader overbrengen in een temperatuur gecontroleerde vaartuig cupje met PSS zoals eerder is beschreven. 33 , 34  .
  5. Wilt overbrengen van de slagader naar de vaartuig-zaal, zachtjes Houd het verwijderde vaartuig door de ACA of de achterste communicerende slagader segment en plaats het zorgvuldig in de zaal.
    Opmerking: Naast de MCA, de gecanuleerde vaartuig systeem is geschikt voor een breed scala aan klein schip preparaten, met inbegrip van skeletspieren weerstand slagaders33,39,40, mesenterische weerstand slagaders 38 , 41 , 42en grote (eerste bestelling) arteriolen van de cremaster spier43, evenals menselijke coronaire arteriolen en menselijke arteriolen onderhuids vetweefsel verkregen tijdens gluteos biopsie44,45, 46,47.
  6. De slagader aan de instroom micropipet koppelen door te trekken naar de pipet base totdat de tip vooruitgang in het lumen van het MCA. Beveilig de slagader op de instroom pipet door koppelverkoop van een lus bereid uit een enkele streng vezel eerder geplaagd van 10-0 hechtingen rond de slagader (figuur 1B). Het andere uiteinde van de MCA aan de uitstroom pipet beveiligen door aanscherping van een tweede hechtdraad lus rond het schip (figuur 1B).
    Opmerking: Plaats de hechtdraad lussen op de micropipetten voorafgaand aan de montage van het vaartuig en positioneren dicht bij het laatste punt van de bijlage, waardoor ze gemakkelijk gleed over de slagader en snel beveiligd wanneer het vaartuig zich in positie, die minimaliseert het risico van de slagader glijdt de pipetten.
    Opmerking: Micropipetten bereid zijn van borosilicaatglas capillaire buis (inwendige diameter van 1 mm, 2 mm buitendiameter; 10 cm lang) met een trekker van de verticale micropipet. Voorafgaand aan het koppelen van de slagader, overeenkomen met de diameter van het uiteinde van de micropipetten zoveel mogelijk om te voorkomen dat de afstemming van de vaardigheden van de instroom en uitstroom weerstand in de perfusie-systeem.
  7. Nadat de slagader stevig aan de micropipetten gebonden is, gebruiken de micrometer verbonden aan de instroom Pipetteer houder te rekken van de slagader aan zijn lengte in situ .
  8. Tie uit alle takken van de kant met enkele strengen geplaagd van 10-0 hechtingen teneinde een constante druk in de slagader.
  9. Controleer of het ontbreken van lekken door ervoor te zorgen dat de intraluminale (Transmurale) druk constant blijft na het sluiten van tijdelijk de instroom pipet. Uit alle takken binden of Controleer of gaten in het schip als de druk valt. Herstellen perfusie nadat u hebt gecontroleerd dat de Transmurale druk constant blijft.
    Opmerking: Cannulation van geïsoleerde resistentie slagaders vereist handigheid en oefening. De belangrijkste voorzorgsmaatregelen in acht moeten worden genomen zijn om te voorkomen dat de pipetten te breken en om ervoor te zorgen dat de slagader niet de pipetten glijden. Het is belangrijk om te zacht met de geïsoleerde slagaders gedurende de gehele procedure, zoals trauma aan het vaartuig aan het endotheel schade kan en/of interfereren met de normale functie van de vasculaire gladde spieren.
  10. Het meten van de inwendige diameter van de slagader met behulp van een videomicroscopie setup (figuur 1A) bestaande uit een videocamera aangesloten op een ontleden Microscoop en aangesloten op een video micrometer en televisie monitor (cijfers 1B, 1 C). Hierdoor kan de waarnemer te meten vaartuig diameters handmatig door het plaatsen van de beweegbare referentielijnen op de binnenwand van de slagader en, indien gewenst, aan de buitenste wand van de slagader, om te meten van de wanddikte van vaartuig.
    Opmerking: Sommige video micrometers bieden automatisch bijhouden van de afmetingen van het schip.
    Opmerking: Het kalibreren van de video micrometer met een Microscoop fase micrometer en de instroom en uitstroom van druk omvormers met een kwik-manometer (0 mmHg, 50 mmHg 100 mmHg, 150 mmHg en 200 mmHg) tussen de experimenten teneinde te verzekeren van nauwkeurige metingen van vaartuig diameter en intraluminale druk.
    Opmerking: De druk van de Transmurale standaardbesturingselement voor rat MCA experimenten is 80 mmHg. Kalibratie voor hogere en lagere drukniveaus verzekert nauwkeurigheid voor studies van myogenic reacties op veranderingen in Transmurale druk en passieve druk-diameter curven in maximaal verwijde aders.
  11. Pas de hoogte van de instroom en uitstroom stuwmeren de gewenste Transmurale druk op een constant niveau te blijven. Het reservoir instroom met een kleine hoeveelheid (< 5 mmHg) te verhogen en verlagen van het reservoir van de uitstroom van hetzelfde bedrag handhaaft de gemiddelde Transmurale druk en creëert perfusie stroom in het vaartuig lumen6.
    Opmerking: Het verhogen van het reservoir van de instroom en het verlagen van het reservoir uitstroom met gelijke hoeveelheden onderhoudt de dezelfde gemiddelde Transmurale distending druk in de slagader, maar genereert een hydrostatische drukverschil dat stroom en shear stress in het schip veroorzaakt, waardoor de onderzoeker te evalueren endotheel-afhankelijke reacties op veranderingen in de intraluminale shear stress in verschillende experimentele groepen48.
  12. Beoordeling van myogenic reacties en vaartuig reacties op stimuli van vaatverwijdende, door ervoor te zorgen dat de slagader een passend niveau van actieve Toon (ongeveer 40%) voorafgaand aan het experiment vertoont. Gooi alle slagaders ontbreekt actieve Toon onbeweeglijk met uitzondering van schepen, bijvoorbeeld, kleine mesenterische slagaders die normaal gesproken geen actieve rust Toon vertonen.
    Opmerking: Voor vaartuigen die normaal gesproken geen spontane Toon vertonen, vooraf vernauwen de bloedvaten door een gelijkwaardig bedrag met behulp van een vasoconstrictor agonist zoals noradrenaline of phenylephrine. Een goede benadering voor het kiezen van de dosis van de agonist gewend pre samentrekken van de slagader is te gebruiken van een dosis50 EG van vasoconstrictor agent, bijvoorbeeldnoradrenaline41,42. Farmacologische vasoconstrictor agenten moeten echter niet worden toegepast op de slagaders die spontane actieve Toon onder voorwaarden rusten vertonen.
  13. Endotheel-afhankelijke reactiviteit van de gecanuleerde weerstand slagader testen door het meten van diameters van het schip tijdens de toevoeging van toenemende concentraties van ACh (10-10 M-10-5 M) aan de kamer van het vaartuig. Endotheel-onafhankelijke stikstofmonoxide gevoeligheid van de vasculaire gladde spieren testen door het meten van diameters van het schip tijdens de toevoeging van toenemende concentraties (10-10 M-10-5 M) van de stikstofmonoxide-donor natrium nitroprusside aan de vaartuig kamer.
    Opmerking: Gevoeligheid voor vasoconstrictor agenten en andere vaatverwijdende-agonisten kan worden getest in een soortgelijke manier door toenemende concentraties van de agonist toe te voegen aan de kamer van het vaartuig.
    Opmerking: Naast vasoactieve agenten, verschillende drugs, remmers en andere farmacologische stoffen kunnen worden toegevoegd aan het bad weefsel en/of de luminal perfusaat. Wijzigingen in PO2 (evenals PCO2 en pH) kunnen worden selectief toegediend aan het endotheel kant of de extra-luminal kant van de slagader door afzonderlijke evenwichtsinstelling van de luminal perfusaat met een steen van de lucht op een geijkte gasmengsel aangesloten anders dan het mengsel gewend equilibreer de PSS in het weefsel Bad33,34,49. Myogenic reacties op veranderingen in Transmurale druk kunnen worden bestudeerd door te sluiten de uitstroom pipet en verhoging (of verlaging) de hoogte van de PSS-reservoir verbonden met de instroom Pipetteer49,50,51 te vergroten of verkleinen van de intraluminale druk.
  14. Om te testen de rol van het endotheel in het bemiddelen van schip reacties op specifieke stimuli, verwijder het vasculaire endotheel en vergelijk vaartuig reacties op die prikkels in de aanwezigheid of afwezigheid van het endotheel. Als u wilt verwijderen van het endotheel, zorgvuldig ontkoppelen de slagader van de uitstroom pipet en langzaam perfuse het lumen van de slagader met een bolus van lucht (0,5-1,0 mL). Herstellen na lucht perfusie, perfusie van het PSS schakelt het cellulaire puin voordat opnieuw koppelverkoop het schip naar de uitstroom Pipetteer43.
    Opmerking: Na het endotheel denudatie procedure is het belangrijk om te controleren of dat het endotheel is verwijderd door het testen van vasculaire reacties op een agonist (meestal ACh) bekend voor de productie van endotheel-afhankelijke vasodilatatie in dat type schip. Echter in bepaalde pathologische voorwaarden, zijn endotheel-afhankelijke vasoconstrictors uitgebracht, in welk geval, het is belangrijk om te verifiëren dat de constrictor reactie is uitgeschakeld na endothelial verwijdering.
  15. Aan het einde van het experiment, bepalen van de maximale diameter van de slagader door toevoeging van Ca2 +-gratis PSS aan het perfusaat en superfusate. Actieve rust Toon (%) als ((Dmax-Drest) /Dmax) x 100, waar Dmax is het maximale diameter in aanwezigheid van Ca2 +berekenen-gratis oplossing en Drest is de diameter besturingselement rust.
    Opmerking: Diameter metingen van maximaal ontspannen slagaders in verschillende experimentele groepen zijn waardevol in het vergelijken van actieve rust Toon, structurele remodelleren (d.w.z., veranderingen in de muur dikte en lumen diameter) en passieve mechanische eigenschappen (stress-spanning relaties berekend op basis van passieve diameters op verschillende niveaus van Transmurale druk).

3. evaluatie van cerebrale bloed stroom reacties met LDF

  1. Anesthetize van het dier met 5% Isofluraan en veilig de rat in een stereotaxic apparaat9,10.
  2. Het handhaven van het dier onder constante verdoving terwijl ademhaling frequentie, einde getijde CO2en diepte van de verdoving met een teen snuifje36controleren.
  3. Zorgvuldig dun de schedel aan een lage snelheid tandheelkundige boor en minerale olie gebruikt om optische koppeling10doorschijnendheid. Wees voorzichtig om te voorkomen dat buitensporige warmte genereren en om te voorkomen dat het bot indringend.
    Opmerking: Dunner worden van de schedel maakt het mogelijk het laserlicht te bereiken van het onderliggende weefsel en worden teruggekaatst naar de sonde om te meten de Doppler shift, de omvang van die wordt bepaald door het aantal bewegende deeltjes (d.w.z., rode bloedcellen) en hun snelheid.
  4. Beveiligen van de LDF-sonde in een micromanipulator en plaats deze direct boven het verdunde gebied van de schedel. Tijdens het experiment is het zeer belangrijk om te voorkomen dat verkeer van de LDF-sonde of het preparaat zelf, zoals de LDF is bedoeld voor het meten van stroom in een beperkt gebied van het weefsel en zeer gevoelig voor beweging artefacten is.
    Opmerking: Elke beweging van de sonde uit de buurt van haar aanvankelijke standpunt zorgt voor een schatting van de bloedstroom in een ander gebied van het weefsel, uitschakeling van vergelijkingen. Terwijl LDF geen absolute flow waarden biedt en niet geschikt voor vergelijking tussen onderwerpen is, is het een uitstekende manier noninvasively om veranderingen in de perfusie van het weefsel in reactie op experimentele interventies in afzonderlijke houders; en relatieve veranderingen in LDF signaal van controlewaarden kunnen worden gemiddeld en ten opzichte van veranderingen in LDF signaal van het besturingselement in andere experimentele groepen.
    Opmerking: LDF is een handige aanpak inzicht te krijgen in de factoren bloedstroom op het niveau van het hele vasculaire bed in verschillende experimentele groepen8,9,10te reguleren. Evaluatie van weefsel perfusie met LDF biedt een praktische aanpak om te assimileren van kennis opgedaan uit geïsoleerde vaartuig studies een hele bed relativeren. Behoudens de regionale verschillen in vasculaire controlemechanismen weerstand slagaders en de microcirculatie geven metingen verkregen met LDF een goede indicatie van weefsel bloed datatransportbesturing die is over het algemeen overeen met resultaten verkregen met gecanuleerde slagader preparaten.

4. beoordeling van de skeletspieren Microvessel dichtheid met GS1 lectine

  1. De Musculus cremaster verwijderen door een mannelijke rat door het scrotum met standaard fijn chirurgische schaar open te snijden en vervolgens met behulp van een verlostang Dumont #5 te begrijpen van de spier.
    Opmerking: Dunne spieren (bijvoorbeeld, de Musculus cremaster, evenals de extensor digitorum longus en tibialis anterior spieren die zijn gevonden in zowel mannelijke als vrouwelijke ratten) zijn bij uitstek geschikt voor gebruik als geheel mounts voor lectine studies, hoewel histologische secties kunnen worden gebruikt voor dikker weefsels.
  2. Verwijder de Musculus cremaster van de teelbal met behulp van een enkele snede. Plaats het in ijskoude PSS en pin het uit in een petrischaal met een silicone-elastomeer voering op de bodem binnen oppervlak. Zachtjes tease weg bindweefsel met behulp van Dumont #5 pincet.
  3. Spoel de spier monsters met 2 mL gebufferd PSS en hen vervolgens onderdompelen in rhodamine-geëtiketteerden GS1 lectine (20 µg/mL PSS) voor 50 minuten in een 12-well cel cultuur plaat met 2 mL/goed dat is verpakt in aluminiumfolie uit te sluiten van licht.
  4. De weefsels van de lectine-oplossing verwijderen, spoel ze driemaal in de PSS met 5 min "wassen" incubations op een rocker, en bevestig ze op Microscoop dia's. Zorg ervoor dat de weefsels in het donker uit te broeden en de dia's opslaan in het donker om verlies van fluorescentie te voorkomen.
    Opmerking: Als de dia's kunnen niet onmiddellijk worden gebruikt, kunnen ze worden bewaard in de koelkast zonder verlies van fluorescentie. Voor langdurige opslag, kunnen de dia's worden gehouden in een vriezer ter voorkoming van verslechtering11.
  5. Microvessel dichtheid evalueren door het tellen van het aantal kruispunten van de gelabelde microvessels computer-gegenereerde rasterlijnen bovenop de afbeelding52, of met een duidelijk raster overlay bovenop de monitor die wordt gebruikt om de dia's weer te geven.
    Opmerking: GS1 lectine benaderingen zijn gebruikt om aan te tonen: zout-geïnduceerde microvasculaire rarefaction53, het beschermende effect van het voorkomen van zout geïnduceerde angiotensine II onderdrukking in het herstellen van de dichtheid van de microvessel in zout-dieren17 ,53,,,54; de rol van NRF2 in het bemiddelen van het beschermende effect van lage dosis angiotensine II infusie om te voorkomen dat microvessel rarefaction in zout-gevoed ratten17; en ook om te evalueren van de rol van angiotensine II in het handhaven van angiogenic reacties op chronische spierstimulatie in zout gevoed ratten54,55. Een voordeel van de GS1 lectine techniek is dat het kan worden gebruikt om te beoordelen van de dichtheid van de microvessel in de dezelfde dieren gebruikt voor studies van de gecanuleerde weerstand slagaders of LDF.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In vitro microscopie van gecanuleerde weerstand slagaders zorgt voor de studie van de factoren die beïnvloeden actieve Toon in de weerstand van de kleine slagaders (en grotere arteriolen) bij normale in vivo Transmurale druk en bij gebrek aan parenchymal cel invloeden. Naast de beoordeling van de reactiviteit van de vaartuigen op verschillende vaatverwijdende en vasoconstrictor stimuli en myogenic reacties op Transmurale druk hoogte in normale PSS, de Ca2 +-gratis PSS kunnen worden toegevoegd aan het perfusaat en superfusate aan het einde van het experiment om te bepalen van de maximale vaartuig diameter en muur dikte. De laatste metingen zijn zeer waardevol bij de beoordeling van de vasculaire remodeling, dat wil zeggen, veranderingen in de verhouding van de muur/lumen die in reactie op veranderingen in bloeddruk of beheer van farmacologische agenten kunnen optreden. Metingen van de diameter van maximaal verwijde schepen in Ca2 +-gratis PSS zijn nuttig voor de berekening van de intrinsieke tone ((Dmax-Drest) /Dmax) x 100, waarbij Dmax en Drest zijn de maximale (Ca2 +- gratis PSS) en diameter (PSS), respectievelijk rusten op het besturingselement evenwichtsinstelling druk (meestal 80 mmHg voor MCA). In onze ervaring, actieve Toon in de MCA gemiddeld ongeveer 40% bij een druk van Transmurale van 80 mmHg. Het meten van de diameter van maximaal verwijde aders is ook een praktische manier om te evalueren van de passieve mechanische eigenschappen van de schepen door het meten van de diameter van de bloedvaten op verschillende niveaus van Transmurale distending druk en het gebruik van de resultaten Bereken spanning-spanning relaties en andere mechanische eigenschappen van de vaartuigen7,-56.

Figuur 3 is een schematische weergave van drie vernauwde congenisch stammen afgeleid van de SS.13BN rat met behulp van extra selectief fokken benaderingen. In deze rat-stammen, de chromosomale segmenten bevatten ofwel het Brown Noorwegen renine allel (Ren1-BN) of zijn afgesneden net boven (Ren1-SSA) of gewoon hieronder (Ren1-SSB) de renine gene locus (dus behoud van de SS renine-allel). In die studie29, het chromosomale segment met het renine-allel voor bruine Noorwegen bevatte slechts 25 genen.

Figuur 4 illustreert de reactie op het endotheel-afhankelijke vaatverwijdende ACh (1 µM) in geïsoleerde MCAs van mannelijke Dahl SS ratten en de drie verkleinde congenisch stammen afgebeeld in Figuur 3. Gecombineerd gebruik van deze drie stammen van de congenisch die omvatten van (Ren1-BN) of zijn afgesneden net boven (Ren1-SSA) of onder (Ren1-SSB) het renine gene beperkt de regio van belang (d.w.z., het gebied rond de renine gene locus) tot ongeveer 25 genen. In deze experimenten, de dieren waren normotensive en gevoed een zoutarm (0,4% NaCl) dieet. In die studie29 endotheel-afhankelijke dilatatie aan ACh was afwezig in de ouderlijke stam van de SS en in zowel de congenisch stammen het behoud van de SS renine-allel, maar werd gerestaureerd in de stam van de congenisch met de BN renine-allel op de genetische achtergrond van de SS. De resultaten van die studie ondersteund de resultaten van eerdere onderzoeken met behulp van SS.13BN consomic ratten57,58 en sterk bewijs geleverd dat endotheel disfunctie is aanwezig in SS ratten, zelfs wanneer ze normotensive zijn en gevoed een low zout dieet. Genomen is samen, dat de resultaten van deze studies29,57,58 ondersteunen de hypothese dat endothelial dysfunctie bij SS ratten te wijten aan verminderde regulering van het renine-gen, wat resulteert in chronische blootstelling aan lage niveaus van angiotensine II in het bloed.

Een andere studie59, samengevat in Figuur 5, ten opzichte van de reactie op het endotheel-afhankelijke vaatverwijdende ACh in geïsoleerde MCAs (MCA) van mannelijke Dahl SS ratten en SS.5BN consomic ratten uitvoering van chromosoom 5 (met Brown Noorwegen genen voor verschillende isoforms van cytochroom P450-4A ω-hydroxylase). In deze studie werden dieren gevoed ofwel een zoutarm (0,4% NaCl) of hoog zout (4% NaCl) dieet. In tegenstelling tot de MCA van SS ratten, endotheel-afhankelijke dilatatie aan ACh bleef in MCA van de SS.5BN consomic rats gevoed low zout dieet. Daarnaast (en in tegenstelling tot de resultaten van SS.13BN consomic ratten57,58, Sprague-Dawley ratten33,39,40,60, en gouden hamsters 61), een hoog zout dieet niet elimineren van ACh-geïnduceerde dilatatie in de rats SS.5BN , die aangeeft dat CYP450-4A ω-hydroxylase en 20-hydroxyeicosatetraenoic zuur (20-HETE) zijn belangrijke contribuanten aan vasculaire oxidant stress en endotheel disfunctie bij SS ratten en tijdens de waterstand in de zout inname in andere stammen. Uit een experimentele perspectief, het falen van de hoog zout dieet te elimineren endotheel-afhankelijke dilatatie aan ACh biedt een voorbeeld van hoe de studies van de gecanuleerde weerstand slagaders onverwachte bevindingen die afwijken van de conventionele wijsheid kunnen produceren en kan leiden tot een nieuw inzicht in de complexe controlemechanismen, die de functie van deze cruciale schepen.

Figuur 6 toont de reactie van geïsoleerde MCA aan ACh (1 µM) in wild type en Nrf2(- / -) knockout ratten gevoed een low zout dieet (0,4% NaCl), hoge zout dieet (4% NaCl), of een hoog zout dieet met een bekende NRF2 activator30,62 . Bij het ontbreken van zout-geïnduceerde oxidatieve stress was ACh-geïnduceerde dilatatie qua MCA van wild type en Nrf2(- / -) knockout ratten. In overeenstemming met de resultaten van eerdere studies van Sprague-Dawley ratten, de hoog zout dieet geëlimineerd ACh-geïnduceerde dilatatie in wild type en Nrf2(- / -) knockout ratten. Toevoeging van de inductor van de NRF2 aan het hoge zout dieet hersteld endotheel-afhankelijke dilatatie ACh in het wild type ratten, maar niet in de Nrf2(- / -) rats, demonstreren van de succesvolle uitschakeling van de Nrf2 -gen in de knock-out rats, en ondersteuning van het gebruik van NRF2 up-regelgevers als een therapeutische aanpak ter verbetering van de vasculaire oxidatieve stress.

Figuur 7 vindt u een overzicht van LDF meetresultaten vergelijken van de antwoorden van de pial microcirculatie op progressieve vermindering van de arteriële bloeddruk geproduceerd door opeenvolgende bloed volume opnames bij Sprague-Dawley ratten gehandhaafd op een een normale zout (0,4% NaCl) dieet of een hoge zout (4% NaCl) dieet voor vier weken. In tegenstelling tot ratten gevoed een low zout dieet, ratten gevoed de hoog zout dieet vertonen een verminderde capaciteit om te handhaven van een constante doorbloeding tijdens verlagingen van de perfusie druk, waaruit blijkt dat de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor cerebrale bloed stroom autoregulatie door langdurige blootstelling aan een hoog zout dieet in het gedrang komen. De resultaten van die experimenten in overeenstemming zijn met de aanwezigheid van verminderde vasculaire ontspanning mechanismen in geïsoleerde cerebrale bloedvaten van zout-gevoed ratten60 en bieden een goed voorbeeld van hoe LDF metingen kunnen worden gebruikt om te ondersteunen en uitbreiden de resultaten van onderzoeken met geïsoleerde resistentie slagaders naar het niveau van het hele vasculaire bed.

Naast de evaluatie van de weerstand slagader functie met behulp van geïsoleerde slagaders en perfusie van weefsel met behulp van laser-Doppler flowmetrie, de dichtheid van de microvessel en de angiogenic reacties op verschillende stimuli zoals chronische spier stimulatie54, 55 kan worden geëvalueerd in de dezelfde dieren met behulp van fluorescently-geëtiketteerden GS1 lectine, dat selectief aan glycoproteïne wordt in het membraan van de kelder van de arteriolen en haarvaten bindt. Figuur 8 toont een typische lectine vlekken in de Musculus cremaster van Sprague-Dawley ratten gevoed een low zout dieet of hoog zout dieet voor 2 weken (Let op de lagere dichtheid van microvessels in de hoge zout gevoed ratten). Microvessel dichtheid wordt beoordeeld door het tellen van de snijpunten van lectine-label microvessels met een computer-gegenereerde referentie raster52, en biedt een uitstekende methode om te evalueren van de54,55 van de reacties van de angiogenic of detecteren en kwantificeren van het verlies van microvessels in omstandigheden zoals hoge bloeddruk en verhoogde zout inname12,17,53.

Figure 1
Figuur 1: In vitro videomicroscopie setup werkzaam te bestuderen van de geïsoleerde, gecanuleerde weerstand slagaders (A). Gecanuleerde weerstand slagader gebonden aan glas micropipetten (B) en video micrometer weergeven meting van de diameter van de lumen in gecanuleerde weerstand slagader (C). Balk van de schaal in deelvenster B de inwendige diameter van de gecanuleerde slagader (µm) en 125 µm in deelvenster C is de video display van de afstand tussen de beweegbare referentielijnen handmatig geplaatst op de binnenmuren van de slagader door de waarnemer uitvoeren van het experiment . Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Schematisch diagram van de procedure voor het isoleren van de middelste cerebrale slagader van de hersenen en het voorbereiden van cannulation met de micropipetten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Schematisch diagram van vernauwde congenisch rat stammen hebben kleine segmenten van Brown Noorwegen chromosoom 13 ingekruist in de Dahl zout gevoelige genetische achtergrond. Chromosomale segmenten bevatte het Brown Noorwegen renine allel (Ren1-BN) of net boven (Ren1-SSA) zijn afgesneden of net onder (Ren1-SSB) de locus van renine gen en dus behouden de SS renine-allel. Dit cijfer is gewijzigd en herdruk van Durand et al. 29 met toestemming van de American fysiologische Society. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Reactie van geïsoleerde, gecanuleerd MCAs van SS ratten en congenisch rat stammen (geïllustreerd in afbeelding 2) tot 1 µM acetylcholine. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde diameter verandering (Δ µm) ±SEM van de diameter van de controle voorafgaand aan acetylcholine rusten, en zijn replotted van een originele studie door Durand et al. 29 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: Reactie van geïsoleerde, gecanuleerde MCAs van SS ratten en SS.5BN consomic ratten op 1 µM acetylcholine in dieren gevoed zoutarm (0,4% NaCl) of hoog zout (4% NaCl) dieet. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde diameter verandering (Δ µm) ±SEM van de diameter van de controle voorafgaand aan acetylcholine rusten, en zijn replotted van een originele studie door Lukaszewicz et al. 64 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: Reactie op 1 µM acetylcholine in geïsoleerde, gecanuleerde MCAs van Nrf2(- / -) knockout ratten en wild type besturingselementen gevoed low zout dieet (0,4% NaCl), hoge zout dieet (4% NaCl), of hoog zout dieet met een bekende NRF2 activator30, 62. gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde diameter verandering (Δ µm) ±SEM van de diameter van de controle voorafgaand aan acetylcholine rusten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: Cerebrale doorbloeding beoordeeld door LDF in de pial van de microcirculatie. Sprague-Dawley ratten gehandhaafd op een hoog zout dieet gedurende vier weken tentoongesteld een aanzienlijke schade in hun vermogen om bloed stroom constante zoals arteriële bloeddruk in reactie op opeenvolgende bloed volume opnames daalde. Gegevens worden uitgezet als gemiddelde percentage van controle ±SEM * p < 0.05 vs. low zout dieet tegelijkertijd gemiddelde arteriële druk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 8
Figuur 8: Opname van rat cremaster spieren aangeduid met rhodamine-geëtiketteerden GS1 lectine te identificeren arteriolen en haarvaten voor beoordeling van de dichtheid van de microvessel. Cremaster spieren Sprague-Dawley ratten zoutarm gevoed werden verkregen (LS; 0,4% NaCl) of hoog zout (HS:4% NaCl) dieet voor 2 weken, en microvasculaire rarefaction in de HS-dieren vergeleken met LS besturingselementen aan te tonen. Schaal bar = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Zoals opgemerkt in de inleiding, deze paper beschrijft het gebruik van televisie microscopie en geïsoleerde resistentie slagader benaderingen om te evalueren van vasculaire functie niet alleen in de standaard rat modellen (zoals in dienst in de video), maar ook in sterk gespecialiseerd genetisch gemodificeerde rat stammen, waaruit de roman en krachtige inzichten die kunnen worden verkregen met behulp van deze benaderingen. Het gebruik van deze krachtige technieken te evalueren werkzame Toon en passieve mechanische eigenschappen van weerstand van de kleine slagaders kunnen leveren belangrijke informatie met betrekking tot een breed spectrum van vasculaire controleprocedures, met inbegrip van endotheel-afhankelijke verordening van actieve Toon in weerstand slagaders, vasculaire glad spierweefsel functie onder normale en pathofysiologische omstandigheden en passieve eigenschappen van de slagaders aan vasculaire remodeling gerelateerde en veranderingen in vasculaire muur mechanica. Endotheel disfunctie is aangetoond dat een krachtige voorspellende indicator zijn voor meerdere cardiovasculaire bijwerkingen bij de mens, met inbegrip van cardiovasculaire sterfgevallen63en gecanuleerde weerstand slagader preparaten zijn vooral waardevol Endotheel disfunctie opsporen en het vergroten van ons begrip van de mechanismen van het endotheel disfunctie.

Ter illustratie van de effectiviteit van in vitro videomicroscopie technieken met geïsoleerde resistentie slagaders, we voorbeelden gegeven van het gebruik van deze technieken in Dahl zout gevoelige (SS) ratten en roman consomic rat stammen die een verminderde vertonen zout gevoeligheid van bloeddruk ten opzichte van de SS ouderlijke stam24. Die studies onderzocht vasculaire controlemechanismen aan genen op de twee chromosomen die van bijzonder belang bij te dragen aan zout gevoeligheid van bloeddruk en vasculaire wijzigingen in de SS-rat gerelateerde. Deze chromosomen zijn chromosoom 13, het renine gene18,22,29,57,58, uitvoering en chromosoom 5, uitvoering van genen voor isoforms van CYP450-4A ω-hydroxylase64 ,65— het enzym dat synthetiseert 20-HETE, die grote gevolgen voor nierfunctie en vasculaire reactiviteit66,67,68 heeft. Een andere recente en krachtige toevoeging aan genetische werkset rat is de ontwikkeling van rat gene knock-out modellen met behulp van geavanceerde gene bewerkingstechnieken met inbegrip van: ZFNs; transcriptionele activator-achtige-effector nucleasen (TALENS), en meest recent CRISPR-Cas913,14,15,16,17. In vitro videomicroscopie met behulp van deze technieken om te studeren van geïsoleerde MCAs uit een Nrf2(- / -) knockout rat model dat de cruciale antioxidant en cel beschermende transcriptiefactor NRF2 mist, belangrijke heeft verstrekt en eerder onbekende inzicht in de mechanismen van zout-veroorzaakte endothelial dysfunctie bij gebrek aan een verhoogde bloed druk17. Specifieke resultaten van experimenten met behulp van deze gespecialiseerde rat modellen worden beschreven in een aantal eerdere verslagen17,29,57,58,59, 60 , 64 , 65 .

Hoewel het duidelijk is dat studies van geïsoleerde, gecanuleerde weerstand slagaders uiterst waardevol zijn in het begrip van de mechanismen tot regeling van de functie van deze kritisch belangrijke schepen onder een aantal voorwaarden, het is heel belangrijk om uit te oefenen een aantal voorzorgsmaatregelen om ervoor te zorgen dat er nauwkeurige en betrouwbare resultaten worden verkregen. Terwijl de cerebrale aderen en slagaderen van de weerstand van vele andere vasculaire bedden intrinsieke Toon vertonen, moeten sommige slagaders (met name mesenterische weerstand slagaders) vooraf gecontracteerde met vasoconstrictors zoals noradrenaline teneinde reacties op vaatverwijdende stimuli, en meer nauwkeurig simuleren in vivo voorwaarden, waar de schepen onder invloed van neurale en humorale vasoconstrictor stimuli, zoals noradrenaline uitgebracht vanaf adrenergic zenuw terminals zijn. Als zodanig is het belangrijk dat u vertrouwd met de basiseigenschappen van de slagaders worden bestudeerd, uit de literatuur of uit zorgvuldig voorbereidende experimenten uitgevoerd. Omdat het endotheel een belangrijke rol speelt bij het reguleren van grote arteriën, kleine slagaders en arteriolen in de microcirculatie, is het essentieel om voorzichtig om te voorkomen beschadiging van het endotheel tijdens isolatie en cannulation van de slagader. De klassieke test voor de integriteit van het endotheel is het bewijs dat ACh vaartuig dilatatie veroorzaakt. Een waarschuwing is dat onder omstandigheden van oxidatieve stress, het vaartuig endotheel mogelijk intact, maar vasodilatatie aan ACh afwezig is omdat buitensporige niveaus van superoxide opruimen de voorkomen van de reactie van vaatverwijdende stikstofmonoxide. In die gevallen kan endothelial integriteit worden geverifieerd door het herhalen van de ACh-toepassing in de aanwezigheid van een superoxide scavenger zoals tempol, die in reactie op ACh en andere stimuli vaatverwijdende endotheel-afhankelijke vasodilatatie moet herstellen. Ook in een aantal pathologische voorwaarden, kan het endotheel vrijgeven stoffen die leiden inkrimping van de vasculaire zachte spiercellen en vernauwing van de slagader tot; en in sommige gevallen is de endotheel-afhankelijke dilatatie (of vernauwing) gemedieerde via andere stoffen zoals cyclooxygenase metabolieten, H2O2, epoxygenase metabolieten, enz. De klassieke test voor een endotheel-afhankelijke vaatverwijdende of een vasoconstrictor stof is om aan te tonen dat de dilatatie of vernauwing van de slagader wordt uitgebannen door endothelial verwijdering. Tot slot, de identiteit van verschillende endotheel-afhankelijke vaatverwijdende en vasoconstrictor stoffen in het algemeen kan worden nagegaan door toediening van specifieke remmers of aaseters, zoals L-naam voor de remming van stikstofoxide synthase, indomethacin te remmen de vorming van cyclooxygenase metabolieten, katalase te scharrelen H2O2, Thromboxaan synthase remmers, epoxygenase-remmers, en/of antagonisten van de CYP450-4A/20-HETE pathway.

Het is ook belangrijk (en leerzaam) te kwantificeren de hoeveelheid actieve Toon aan het einde van het experiment door zoogdierlevercellen en superfusing de slagader met een Ca2 +-gratis PSS, of het beheren van een maximale dosis van een krachtige vaatverwijdende agent zoals papaverine. Een typische niveau van actieve rust Toon in het MCA, berekend als ((Dmax-Drest) /Dmax) x 100, is ongeveer 40%, waar Dmax en Drest zijn de maximale (Ca2 +-gratis PSS) en diameter (PSS), rust respectievelijk op de evenwichtsinstelling werkdruk (meestal 80 mmHg voor MCA). Vaartuigen met aanzienlijk minder actieve tone of slagaders tonen regiogebonden beperkingen of dilations zijn uitgesloten van de analyse, zoals de tekenen indicatief van trauma aan de vaartuigen zijn. Meting van de diameter van maximaal verwijde aders in Ca2 +-gratis oplossing maakt het ook mogelijk de onderzoeker te evalueren van de passieve mechanische eigenschappen van de schepen door meting arteriële diameter en berekening spanning-spanning-relaties tijdens opeenvolgende verhogingen in Transmurale druk in de7,maximaal verwijde schepen56. Deze passieve spanning-spanning relaties zijn gemakkelijk te verkrijgen, en geven een waardevolle indicatie van eventuele wijzigingen in de mechanische kenmerken van de vaartuigen.

Netheid van de pipetten, aansluitingen en leidingen leveren de reservoirs is cruciaal voor succesvolle experimenten. In dit verband is het belangrijk om alle oplossingen uit de buis spoelen nadat het experiment is afgerond, en te spoelen en reinigen van het weefsel bad, de levering buizen, en alle stuwmeren gebruikt voor het opslaan, warm, en gas-equilibreer de PSS vóór het bereiken van het vaartuig kamer. Kranen en kleppen in het uitvoeringssysteem moeten ook worden gereinigd en veranderd van tijd tot tijd als moet elke buis uitvoering PSS. Een klassieke teken van besmette leidingen is een grijze waas gegenereerd door schimmel en bacteriën; en deze wijzigingen worden begeleid door verlies van normale reactiviteit van de bloedvaten als gevolg van de stoffen die worden geproduceerd door de bacteriële besmetting. Besmetting door bacteriën en andere micro-organismen kan echter nog wel aanwezig in de afwezigheid van enig zichtbaar bewijs.

Wij zijn van mening dat de huidige Witboek biedt een nuttig voorbeeld voor het gebruik van de aloude technieken die uitzonderlijk goed geschikt voor studies van de slagaders van de allerbelangrijkste kleine weerstand van verschillende vasculaire bedden zijn. In combinatie met standaard benaderingen voor de evaluatie van weefsel perfusie, zoals LDF en de GS1 lectine methode voor het uitrekenen van microvessel de dichtheid, in vitro videomicroscopie voor gecanuleerde weerstand slagaders biedt uiterst waardevol inzicht in de factoren die bepalend zijn perfusie van het weefsel en hoe deze kunnen worden gewijzigd in ziekte staten. Naast het bieden van een krachtig instrument om te studeren fundamentele mechanismen van vasculaire glad spierweefsel en endotheel functie in standaard rat modellen, kan het gebruik van videomicroscopie te bestuderen van individuele weerstand slagaders worden toegepast voor andere diermodellen en menselijke weerstand slagaders. De toepassing van videomicroscopie van geïsoleerde resistentie slagaders van nieuwe genetisch gemodificeerde rat modellen opent nieuwe deuren voor het begrip van fenotypische veranderingen die zich naar aanleiding van gewijzigde functie van een menigte (en groeiende lijst) van genen voordoen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

De auteurs hun oprechte uitspreken Dank Katie Fink en Lynn Dondlinger voor hun onschatbare hulp bij de voorbereiding van dit manuscript.

Financiële steun: NIH #R21-OD018309; #R56-HL065289; en #R01-HL128242.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SS Rat Medical College of Wisconsin SS/JHsd/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
SS.5BN Consomic Rat Medical College of Wisconsin SS-Chr 5BN/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
SS.13BN Consomic Rat Medical College of Wisconsin SS-Chr 13BN/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-BN Congenic Rat Medical College of Wisconsin SS.BN-(D13hmgc41-D13)hmgc23/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-SSA Congenic Rat Medical College of Wisconsin SS.BN-(D13rat77-D13rat105/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-SSB Congenic Rat Medical College of Wisconsin SS.BN-(D13rat124-D13rat101/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Nrf2(-/-) Knockout Rat and Wild Type Littermates Medical College of Wisconsin SD-Nfe212em1Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Low Salt Rat Chow (0.4% NaCl)-AIN-76A Dyets, Inc. 113755
High Salt Rat Chow (4% NaCl)-AIN-76A Dyets, Inc. 113756
Colorado Video Caliper Colorado Video, Inc. Model 308
Video Camera Hitachi KPM1AN
Microscope Olympus Life Science CKX41
Television Monitor Panasonic WVBM1410
Pressure Transducers Stoelting 56360
Blood Pressure Display Unit Stoelting 50115
Cannulated Artery Chamber Living Systems Instrumentation CH-1 Single vessel chamber for general use
Temperature Controller for Single Chamber Living Systems Instrumentation TC-09S
Gas Dispersion Tube, Miniature,Straight Living Systems Instrumentation GD-MS Provides aeration in the vessel bath
Gas Exchange Oxygenator, Miniature Living Systems Instrumentation OX Allows gas exchange with perfusate
Laser-Doppler Flowmeter Perimed PeriFlux 5000 LDPM
GS1 Lectin Vector Labs RL-1102
Glass Capillary Tubes for Micropipettes Fredrich Haer Co. 27-33-1 2 mm ODX1 mm ID
Verticle Pipette Puller David Kopf Instruments Model 700C
Nylon suture material (10/0)-3 PLY Ashaway Line and Twine Manufacturing Co. 114-ANM-10 Single strands of 3 ply nylon suture teased out for use on vessels
Dumont #5 Forceps-Inox Fine Science Tools 11254-20
Vannas Scissors Fine Science Tools 15003-08
Protandim Protandim NRF2 Inducer: Contact Dr. Joe McCord (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU)
Sodium Chloride Fisher Bioreagents BP358-212
Sodium Bicarbonate Fisher Chemical S233-3
Dextrose (d-glucose) anhydrous Fisher Chemical D16-500
Magnesium Sulfate (MgSO4-7H2O) Sigma Aldrich M1880-500 G
Calcium Chloride (CaCl2-2 H2O) Sigma C5080-500G
Sodium Phosphate-Monobasic (NaH2PO4) Sigma S0751-500G
Potassium Chloride (KCl) Fisher Chemical P217-500G
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma ED255-500G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature. 288, 373-376 (1980).
  2. Bevan, J. A., Osher, J. V. A direct method for recording tension changes in the wall of small blood vessels in vitro. Agents Actions. 2, 257-260 (1972).
  3. Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile properties of small arterial resistance vessels in spontaneously hypertensive and normotensive rats. Circ. Res. 41, 19-26 (1977).
  4. Speden, R. N. The use of excised, pressurized blood vessels to study the physiology of vascular smooth muscle. Experientia. 41, 1026-1028 (1985).
  5. Osol, G., Halpern, W. Myogenic properties of cerebral blood vessels from normotensive and hypertensive rats. Am. J. Physiol. 249, H914-H921 (1985).
  6. Halpern, W., Kelley, M. In vitro methodology for resistance arteries. Blood Vessels. 28, 245-251 (1991).
  7. Feihl, F., Liaudet, L., Waeber, B. The macrocirculation and microcirculation of hypertension. Curr Hypertens Rep. 11, 182-189 (2009).
  8. Smits, G. J., Roman, R. J., Lombard, J. H. Evaluation of laser-Doppler flowmetry as a measure of tissue blood flow. J Appl Physiol. 61, 666-672 (1985).
  9. Hudetz, A. G., Roman, R. J., Harder, D. R. Spontaneous flow oscillations in the cerebral cortex during acute changes in mean arterial pressure. J Cereb Blood Flow Metab. 12, 491-499 (1992).
  10. Hudetz, A. G., Smith, J. J., Lee, J. G., Bosnjak, Z. J., Kampine, J. P. Modification of cerebral laser-Doppler flow oscillations by halothane, PCO2, and nitric oxide synthase blockade. Am J Physiol. 269, H114-H120 (1995).
  11. Hansen-Smith, F. M., Watson, L., Lu, D. Y., Goldstein, I. Griffonia simplicifolia I: fluorescent tracer for microcirculatory vessels in nonperfused thin muscles and sectioned muscle. Microvasc Res. 36, 199-215 (1988).
  12. Greene, A. S., Lombard, J. H., Cowley, A. W., Hansen-Smith, F. M. Microvessel changes in hypertension measured by Griffonia simplicifolia I lectin. Hypertension. 15, 779-783 (1990).
  13. Aitman, T., Dhillon, P., Geurts, A. M. A RATional choice for translational research? Dis Model Mech. 9, 1069-1072 (2016).
  14. Geurts, A. M., et al. Knockout rats via embryo microinjection of zinc-finger nucleases. Science. 325, 433 (2009).
  15. Geurts, A. M., et al. Generation of gene-specific mutated rats using zinc-finger nucleases. Methods Mol Biol. 597, 211-225 (2010).
  16. Geurts, A. M., Moreno, C. Zinc-finger nucleases: new strategies to target the rat genome. Clin Sci (Lond). 119, 303-311 (2010).
  17. Priestley, J. R., Kautenburg, K. E., Casati, M. C., Endres, B. T., Geurts, A. M., Lombard, J. H. The NRF2 knockout rat: a new animal model to study endothelial dysfunction, oxidant stress, and microvascular rarefaction. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310, H478-H487 (2016).
  18. Cowley, A. W., et al. Brown Norway chromosome 13 confers protection from high salt to consomic Dahl S rat. Hypertension. 37, 456-461 (2001).
  19. Rapp, J. P. Dahl salt-susceptible and salt-resistant rats. A review. Hypertension. 4, 753-763 (1982).
  20. Rapp, J. P., Wang, S. M., Dene, H. A genetic polymorphism in the renin gene of Dahl rats cosegregates with blood pressure. Science. 243, 542-544 (1989).
  21. Manning, R. D. Jr, Meng, S., Tian, N. Renal and vascular oxidative stress and salt-sensitivity of arterial pressure. Acta Physiol Scand. 179, 243-250 (2003).
  22. Moreno, C., et al. Multiple blood pressure loci on rat chromosome 13 attenuate development of hypertension in the Dahl S hypertensive rat. Physiol Genomics. 31, 228-235 (2007).
  23. Tobian, L., Lange, J., Iwai, J., Hiller, K., Johnson, M. A., Goossens, P. Prevention with thiazide of NaCl-induced hypertension in Dahl "S" rats. Evidence for a Na-retaining humoral agent in "S" rats. Hypertension. 1, 316-323 (1979).
  24. Mattson, D. L., et al. Chromosome substitution reveals the genetic basis of Dahl salt-sensitive hypertension and renal disease. Am J Physiol Renal Physiol. 295, F837-F842 (2008).
  25. Kunert, M. P., et al. Consomic strategies to localize genomic regions related to vascular reactivity in the Dahl salt-sensitive rat. Physiol Genomics. 26, 218-225 (2006).
  26. Cowley, A. W., Liang, M., Roman, R. J., Greene, A. S., Jacob, H. J. Consomic rat model systems for physiological genomics. Acta Physiol Scand. 181, 585-592 (2004).
  27. Kunert, M. P., Dwinell, M. R., Lombard, J. H. Vascular responses in aortic rings of a consomic rat panel derived from the Fawn Hooded Hypertensive strain. Physiol Genomics. 42A, 244-258 (2010).
  28. Liang, M., et al. Renal medullary genes in salt-sensitive hypertension: a chromosomal substitution and cDNA microarray study. Physiol Genomics. 8, 139-149 (2002).
  29. Durand, M. J., Moreno, C., Greene, A. S., Lombard, J. H. Impaired relaxation of cerebral arteries in the absence of elevated salt intake in normotensive congenic rats carrying the Dahl salt-sensitive renin gene. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 299, H1865-H1874 (2010).
  30. Hybertson, B. M., Gao, B., Bose, S. K., McCord, J. M. Oxidative stress in health and disease: the therapeutic potential of Nrf2 activation. Mol Aspects Med. 32, 234-246 (2011).
  31. Itoh, K., et al. An Nrf2/small Maf heterodimer mediates the induction of phase II detoxifying enzyme genes through antioxidant response elements. Biochem Biophys Res Commun. 236, 313-322 (1997).
  32. Myung, S. K., et al. Efficacy of vitamin and antioxidant supplements in prevention of cardiovascular disease: systematic review and meta-analysis of randomised controlled trials. BMJ. 346, f10 (2013).
  33. Fredricks, K. T., Liu, Y., Lombard, J. H. Response of extraparenchymal resistance arteries of rat skeletal muscle to reduced PO2. Am J Physiol. 267, H706-H715 (1994).
  34. Fredricks, K. T., Liu, Y., Rusch, N. J., Lombard, J. H. Role of endothelium and arterial K+ channels in mediating hypoxic dilation of middle cerebral arteries. Am J Physiol. 267, H580-H586 (1994).
  35. Frisbee, J. C., Maier, K. G., Falck, J. R., Roman, R. J., Lombard, J. H. Integration of hypoxic dilation signaling pathways for skeletal muscle resistance arteries. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 283, R309-R319 (2002).
  36. Pavlov, T. S., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A. Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium. J Vis Exp. (103), (2015).
  37. Nelson, M. T., Conway, M. A., Knot, H. J., Brayden, J. E. Chloride channel blockers inhibit myogenic tone in rat cerebral arteries. J Physiol. 502 (Pt 2), 259-264 (1997).
  38. Brayden, J. E., Halpern, W., Brann, L. R. Biochemical and mechanical properties of resistance arteries from normotensive and hypertensive rats. Hypertension. 5, 17-25 (1983).
  39. Weber, D. S., Lombard, J. H. Elevated salt intake impairs dilation of rat skeletal muscle resistance arteries via ANG II suppression. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278, H500-H506 (2000).
  40. Weber, D. S., Lombard, J. H. Angiotensin II AT1 receptors preserve vasodilator reactivity in skeletal muscle resistance arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 280, H2196-H2202 (2001).
  41. Wang, J., Roman, R. J., Falck, J. R., de la Cruz, L., Lombard, J. H. Effects of high-salt diet on CYP450-4A omega-hydroxylase expression and active tone in mesenteric resistance arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288, H1557-H1565 (2005).
  42. Raffai, G., et al. Modulation by cytochrome P450-4A omega-hydroxylase enzymes of adrenergic vasoconstriction and response to reduced PO2 in mesenteric resistance arteries of Dahl salt-sensitive rats. Microcirculation. 17, 525-535 (2010).
  43. Mishra, R. C., Wulff, H., Hill, M. A., Braun, A. P. Inhibition of Myogenic Tone in Rat Cremaster and Cerebral Arteries by SKA-31, an Activator of Endothelial KCa2.3 and KCa3.1 Channels. J Cardiovasc Pharmacol. 66, 118-127 (2015).
  44. Freed, J. K., Beyer, A. M., LoGiudice, J. A., Hockenberry, J. C., Gutterman, D. D. Ceramide changes the mediator of flow-induced vasodilation from nitric oxide to hydrogen peroxide in the human microcirculation. Circ Res. 115, 525-532 (2014).
  45. Beyer, A. M., Durand, M. J., Hockenberry, J., Gamblin, T. C., Phillips, S. A., Gutterman, D. D. An acute rise in intraluminal pressure shifts the mediator of flow-mediated dilation from nitric oxide to hydrogen peroxide in human arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 307, H1587-H1593 (2014).
  46. Durand, M. J., et al. Vascular actions of angiotensin 1-7 in the human microcirculation: novel role for telomerase. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36, 1254-1262 (2016).
  47. Beyer, A. M., et al. Transition in the mechanism of flow-mediated dilation with aging and development of coronary artery disease. Basic Res Cardiol. 112, 5 (2017).
  48. Muller, J. M., Chilian, W. M., Davis, M. J. Integrin signaling transduces shear stress--dependent vasodilation of coronary arterioles. Circ Res. 80, 320-326 (1997).
  49. Liu, Y., Harder, D. R., Lombard, J. H. Interaction of myogenic mechanisms and hypoxic dilation in rat middle cerebral arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H2276-H2281 (2002).
  50. Potocnik, S. J., et al. Endothelium-dependent vasodilation in myogenically active mouse skeletal muscle arterioles: role of EDH and K+ channels. Microcirculation. 16, 377-390 (2009).
  51. Harder, D. R. Pressure-dependent membrane depolarization in cat middle cerebral artery. Circ Res. 55, 197-202 (1984).
  52. Greene, A. S., Rieder, M. J. Measurement of vascular density. Methods Mol. Med. 51, 489-496 (2001).
  53. Hernandez, I., Cowley, A. W., Lombard, J. H., Greene, A. S. Salt intake and angiotensin II alter microvessel density in the cremaster muscle of normal rats. Am J Physiol. 263, H664-H667 (1992).
  54. Resende, M. M., Amaral, S. L., Moreno, C., Greene, A. S. Congenic strains reveal the effect of the renin gene on skeletal muscle angiogenesis induced by electrical stimulation. Physiol Genomics. 33, 33-40 (2008).
  55. Petersen, M. C., Munzenmaier, D. H., Greene, A. S. Angiotensin II infusion restores stimulated angiogenesis in the skeletal muscle of rats on a high-salt diet. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 291, H114-H120 (2006).
  56. Frisbee, J. C., Weber, D. S., Liu, Y., DeBruin, J. A., Lombard, J. H. Altered structure and mechanics of skeletal muscle arteries with high-salt diet and reduced renal mass hypertension. Microvasc Res. 59, 323-328 (2000).
  57. Drenjancevic-Peric, I., Lombard, J. H. Introgression of chromosome 13 in Dahl salt-sensitive genetic background restores cerebral vascular relaxation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287, H957-H962 (2004).
  58. Drenjancevic-Peric, I., Phillips, S. A., Falck, J. R., Lombard, J. H. Restoration of normal vascular relaxation mechanisms in cerebral arteries by chromosomal substitution in consomic SS.13BN rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 289, H188-H195 (2005).
  59. Lukaszewicz, K. M., Paudyal, M. P., Falck, J. R., Lombard, J. H. Role of vascular reactive oxygen species in regulating cytochrome P450-4A enzyme expression in Dahl salt-sensitive rats. Microcirculation. 23, 540-548 (2016).
  60. Lombard, J. H., Sylvester, F. A., Phillips, S. A., Frisbee, J. C. High-salt diet impairs vascular relaxation mechanisms in rat middle cerebral arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 284, H1124-H1133 (2003).
  61. Priestley, J. R., et al. Reduced angiotensin II levels cause generalized vascular dysfunction via oxidant stress in hamster cheek pouch arterioles. Microvasc Res. 89, 134-145 (2013).
  62. Velmurugan, K., Alam, J., McCord, J. M., Pugazhenthi, S. Synergistic induction of heme oxygenase-1 by the components of the antioxidant supplement Protandim. Free Radic Biol Med. 46, 430-440 (2009).
  63. Widlansky, M. E., Gokce, N., Keaney, J. F., Vita, J. A. The clinical implications of endothelial dysfunction. J Am Coll Cardiol. 42, 1149-1160 (2003).
  64. Lukaszewicz, K. M., Falck, J. R., Manthati, V. L., Lombard, J. H. Introgression of Brown Norway CYP4A genes on to the Dahl salt-sensitive background restores vascular function in SS-5BN consomic rats. Clin Sci (Lond). 124, 333-342 (2013).
  65. Lukaszewicz, K. M., Lombard, J. H. Role of the CYP4A/20-HETE pathway in vascular dysfunction of the Dahl salt-sensitive rat. Clin Sci (Lond). 124, 695-700 (2013).
  66. Roman, R. J. P-450 metabolites of arachidonic acid in the control of cardiovascular function. Physiol Rev. 82, 131-185 (2002).
  67. Roman, R. J., Maier, K. G., Sun, C. W., Harder, D. R., Alonso-Galicia, M. Renal and cardiovascular actions of 20-hydroxyeicosatetraenoic acid and epoxyeicosatrienoic acids. Clin Exp Pharmacol. 27, 855-865 (2000).
  68. Roman, R. J., Alonso-Galicia, M. P-450 eicosanoids: A novel signaling pathway regulating renal function. News Physiol Sci. 14, 238-242 (1999).

Tags

Geneeskunde kwestie 130 weerstand slagaders endotheel microcirculatie zout hypertensie cerebrale circulatie
Evaluatie van vasculaire controlemechanismen met behulp van videomicroscopie van geïsoleerde resistentie slagaders van ratten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lukaszewicz, K. M., Durand, M. J.,… More

Lukaszewicz, K. M., Durand, M. J., Priestley, J. R. C., Schmidt, J. R., Allen, L. A., Geurts, A. M., Lombard, J. H. Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats. J. Vis. Exp. (130), e56133, doi:10.3791/56133 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter