Summary
提出了一种有效的筛选方案, 以识别小分子, 促进形分化的胶质母细胞瘤干细胞 (GSCs)。该检测是基于一个干细胞分化的记者, 即增强 GFP (eGFP) 的表达是由人胶质细胞促进剂驱动。
Abstract
胶质母细胞瘤是成人最常见和最致命的原发性脑瘤, 仅在美国每年造成大约1.4万人死亡。术后存活中位数少于15月, 最大手术切除、放疗、莫化疗。发展更有效的大紫荆治疗所固有的挑战已变得越来越明显, 包括其不屈的侵袭性, 它对标准治疗的抵抗, 其遗传复杂性和分子适应性, 和亚大紫荆与正常干细胞有表型相似的细胞, 这里称为胶质母细胞瘤干细胞 (GSCs)。由于 GSCs 是肿瘤生长和进展所必需的, differentiation-based 治疗是这些不治之症的一种可行的治疗方式。
下面的协议描述了建立一个高通量筛选平台的程序集合, 旨在识别促进 GSC 形分化的小分子。在该系统的核心是一个胶质纤维酸性蛋白 (胶质细胞) 分化的记者-构造。本议定书载有下列一般程序: (1) 建立 GSC 分化的记者行;(2) 测试/验证记者对 GSC 自我更新/克隆能力的相关性;和 (3) 高容量流式细胞仪基础药物筛选。
筛选平台提供了一种简单而廉价的方法来识别促进 GSCs 分化的小分子。此外, 利用 FDA 批准的药物库, 有可能识别能更快地进行用途的制剂。此外, 促进癌症干细胞分化的疗法有望与目前的 "护理标准" 治疗方法协同工作, 这些疗法已被证明是针对和消除主要分化的癌细胞。
Introduction
最近的研究表明, 肿瘤中含有少量的细胞, 称为癌症干细胞 (协会) 或肿瘤启动细胞, 它们负责肿瘤的进展、转移以及对化疗和无线电治疗的抵抗力1,2. 肿瘤干细胞及其分化后代的存在被认为是促进瘤内异质性的重要因素, 因此是治疗癌症的主要障碍3。肿瘤细胞的层次, 由癌症干细胞理论提供, 启发了新的治疗癌症的策略的发展4。一种靶向肿瘤干细胞的方法是识别和抑制在胚胎发育过程中已知需要的信号通路。事实上, 我们和其他人以前发表过多篇论文, 描述了对神经干细胞相关信号通路的持续需求, 在胶质母细胞瘤中的声波刺猬和凹槽5,6,7。这项工作有助于巩固的理由, 几个肾小球临床试验。第二种靶向肿瘤干细胞的方法是促进其分化。这种方法得到了很多的支持, 由于良好的结果, 从前临床研究和治疗急性早幼粒细胞白血病的维甲酸 (ATRA, 维生素 a 模拟)。这里 ATRA 被发现去除成熟块和促进肿瘤细胞分化8。最近, Piccirillo 和同事已经优雅地表明, BMP-4 促进 GSC 分化为星形胶质细胞具有显著的抗大膜效应体外和体内9。
目前研究的基本原理是基于针对 GSCs 的 "逆向工程" 方法。鉴于大紫荆存在巨大的异质性, 且分化程度差是癌症的标志之一, 我们问是否可以促进一种更有利的表型分化成星形胶质细胞样的状态。在这里, 我们没有先验知识的信号通路, 维持 GSCs 在一个给定的肿瘤标本, 而是目标, 以达到预期的表型 (如胶质细胞阳性)。
本报告描述的程序, 建立 GSC 分化记者线从 GSC 丰富的文化转介到 GSC 克隆选择。使用的胶质母细胞瘤干细胞线是建立在实验室的安吉洛教授 Vescovi 从诊断原发性胶质瘤在医院圣拉斐尔-米兰, 意大利。这些线路已在多个出版物中广泛研究6、10、11、12、13、14。强烈建议那些有兴趣在实验室中实施这些技术的个人, 确定记者在他们计划研究的细胞中对癌症干细胞自我更新能力的相关性 (这对任何记者都是如此)。为完成此15、16提供了一个在该字段中接受的体外克隆分析的详细协议。最后, 给出了一个详细的协议, 描述了在流式细胞仪的药物屏幕上区分记者线的使用。值得注意的是, 类似于这里描述的形微分系统, 我们已经成功地建立并验证了 GSC 记者的 MAP2:GFP (神经元分化) 报告者的线。因此, 本文所描述的方法可以用于研究细胞分化为各种细胞谱系。
本报告中的一些数字可以在最近的出版物中找到: "阿曲库磺和其他神经肌肉阻滞剂促进形分化和消耗胶质母细胞瘤干细胞18。
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Protocol
注: 形和神经元慢报告系统被购买作为预先包装, 集中慢准备。具备流式细胞术的基本知识。此外, 为充分利用该协议, 用户将需要访问的流量式细胞仪与高通量的能力 (接受96井板作为样本来源)。
1. 慢转录报告系统
注: 在所有流细胞分析中, 使用父母、non-transduced、细胞或向量转 (荧光) 细胞来建立基线荧光。另外, 请注意, 在所有需要机械研磨的步骤中, 要温柔。苛刻的研磨可以杀死大量的脆弱的 GSCs 和影响流式细胞仪的结果。
- 板 1x106细胞在2毫升的完整神经干细胞生长培养基中的 6-井板。
- 传感器细胞通过添加慢记者在多重感染 (莫伊) 等于5。
- 添加2µL 的凝聚, 最终浓度为8µg/毫升。
- 孵育细胞在37° c 和 5% CO2过夜。
- 第二天, 替换生长培养基以去除未绑定病毒。将板放回孵化器中37° c 和 5% CO2 , 并孵育24小时。
- 收获0.5 毫升的总体积;在15毫升锥形管中, 在室温下旋转 360 x g 的5分钟的细胞, 并通过吸入去除上清液。在剩余的细胞中加入0.5 毫升的新鲜神经干细胞生长培养基, 并将板块返回到孵化器继续扩张。
- 加入200µL 离解试剂, 孵育5分钟, 在37° c。
- 通过轻轻移来分离细胞。
注意: 苛刻的研磨可能导致严重的 GSCs, 完全离解通常达到 20-30 倍。 - 为了最大限度地减少细胞的附着或聚集, 增加800µL 的平衡盐溶液 (HBSS) 的最终体积为1毫升。
- 将每个细胞悬浮液的200µL 转移到一个96井板的井中。
- 在这个过程中, 使用台式流式细胞仪与96井板能力配备了蓝色激光励磁和能力检测绿色荧光蛋白。对每次获得的至少1万活细胞进行流细胞分析。
- 用流式细胞仪测定 GFP 阳性细胞的百分率。
2. 克隆的选择、扩展和验证
- 平板细胞在100µL 的神经干细胞培养基的密度0.7 细胞每井 96-井板。
- 培养克隆在11天在37° c 和 5% CO2。此步骤高度依赖于单元格类型, 并且可能需要根据所使用的单元格行进行调整。作为一般规则, 球直径≥100µm 是一个很好的迹象表明存在的克隆 GSCs 在球。
- 使用装有 FITC 过滤器的荧光显微镜, 将含有单干细胞的水井标记为有1-5% 的细胞呈 GFP 阳性。
注: 在这一点上, 确定 GFP 阳性细胞的确切百分比并不太重要。每一个 subclones 将稍后通过流式细胞仪进行评估。这一步是为了减少要分析的克隆的总数量, 重点是由未分化的, 胶质-阴性, GSC 的球。 - 展开选定的记者克隆, 直到有足够数量的细胞进行流式细胞仪分析。一个 sub-confluent 的 6-井板含有≤ 1.5x105细胞/毫升应提供足够数量的细胞。
注意: GSCs 的隔离和扩展的详细过程可用17。
3. 胶质蛋白的测定: 流式细胞仪的 GFP 表达
- 从每个记者克隆和 non-transduced 控制中收获一个分细胞 (0.5 毫升), 以确定 GFP 阳性细胞的确切百分比。考虑到含有〜 1-5% GFP 阳性细胞的记者克隆。
- 在室温下旋转 360 x g 细胞5分钟, 用吸入去除上清。
- 对每个颗粒, 加入200µL 细胞离解试剂和孵化管在一个水浴设置为37° c。
- 研制细胞轻轻地达到一个单一的细胞悬浮 (通常在20到30倍)。
- 为了最小化细胞的连接或聚集, 添加800µL HBSS 到最后的体积1毫升。
- 每一个 96-井板从每个细胞悬浮转移200µL。
- 对于这个过程, 使用台式流式细胞仪与 96-井板能力。对每次获得的至少1万活细胞进行流细胞分析。
4. 埃尔达自我更新法评估克隆能力
注意: 对于对照, 父母、non-transduced 以及 GFP 表达的慢-转细胞, 都应用于确定 GSC 分化报告者的相对克隆潜能, 并将其与原来的 GSC 文化派生.
- 如上文所述, 游离分化--记者 subclones 成单细胞悬浮液。
- 96-井板细胞在100µL 完全神经干细胞生长培养基的细胞密度范围内, 每井5至500细胞。
- 孵育细胞9至11天在37° c 和 5% CO2。
- 在光显微镜下直接可视化球, 对正井进行评分。一个井应该被认为是 "积极的", 如果它包含至少一个单一的大干细胞。
- 插入数据: 总井分析和正面井的数量使用埃尔达在线接口可利用在 http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html。
5. 药物库稀释制剂
- 从-80 ° c 的存储器中取出库板, 用铝箔盖 (保护光敏化合物)。室温解冻约30分钟至一小时。
- 使用12声道多通道 pipettor 将库化合物稀释到完全神经干细胞介质中的0.2 毫米。在生长培养基中稀释亚甲基亚砜至10%
注: 当添加到细胞时, 亚砜的最终浓度应为0.1%。在培养中较高浓度的亚甲基亚砜可能会产生毒性。因此, 在治疗前, 建议在使用的细胞系中测试对亚砜的敏感性。 - 使用亚甲基亚砜作为车辆控制处理在每个板块的左、右栏中发现的细胞 (1 和12栏;井 A 到 H)。
- 用铝箔将稀释后的库板盖住, 并将原有的库板归还给-80 ° c 的冰箱进行长期贮存。
6. 药物筛
注意: 应使用亚砜处理的细胞来设置基线荧光和调整浇口。
- 板 5x103细胞在一个 96-井板99µL 完全神经干细胞生长培养基。
- 使用12声道多通道 pipettor, 在最终浓度为2µM (1 µL 0.2 毫米药物到99µL 的细胞悬浮) 或与亚砜 (控制) 的稀释库化合物处理细胞。在37° c 和 5% CO2中孵育72小时的板。
- 使用12声道多通道 pipettor 增加150µL 细胞离解试剂到每个井和孵化20分钟, 在37° c。
- 通过轻轻研制与12声道多通道 pipettor 分离细胞, 直到单细胞悬浮达到 (通常在20到30倍)。完全取消球所需的时间量将因 GSC 线而异。虽然推荐的细胞离解试剂 (见材料) 是安全和孵化45分钟没有影响的可行性在多个 GSC 线测试, 验证每 GSC 线将用于筛选。
注: 每井的最终体积应约250µL (100 µL 细胞悬浮液 + 150 µL 细胞离解试剂)。 - 用流式细胞仪测定表达胶质蛋白的细胞百分率: GFP 报告者。使用标准的浇口策略。首先, 剧情向前和侧面驱散得到细胞大小和生存能力的一般感觉。然后在可行的单细胞种群上放置一扇门。这是绿色荧光 (eGFP) 将被确定的人口。任何化合物, 导致在超过三标准偏差超过控制 (亚砜处理) GFP 阳性细胞的百分比增加被认为是一个积极的 "命中"。这个门槛应根据具体的应用和预期的严格度来调整。
注: 对于高吞吐量屏幕建议使用单个 GSC 记者克隆。在命中识别之后, 每个命中应该被验证反对另外的报告人 subclones 从同一 GSC 线。为了增加对真实命中的信心也建议测试化合物对记者 subclones 隔离从不同的 GSC 球线。
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Representative Results
三独立的患者衍生球线转与慢形记者编码的绿色荧光蛋白 (GFP) 融合在帧与 Zeocin 电阻卡带和驱动的人胶质细胞启动器元素 (图 1)。接下来的单个克隆是通过在96井板 (图 2) 中的每井电镀0.7 细胞而分离的, 随后是流细胞测定表达 GFP 的细胞百分比 (图 3)。干细胞克隆, 从单个细胞衍生, 含有 5% gfp 阳性细胞被称为 gl (胶质低), 而含有≥75% gfp 阳性细胞的克隆被称为 GH (胶质高), 与 gl 比较, 被认为是更有区别的。subclones (图 4)。
为了识别 GSCs 中可能控制形分化的药物和通路, 采用两个 NIH 临床收集库进行了小分子药物筛选。细胞被治疗72小时与727图书馆代理从 NIH 临床汇集 I 和 II, 设置在集中2µM 或相等的容量二甲基亚砜作为控制。在药物筛选之前, 这些药物的作用在我们所有患者衍生的肾小球干细胞线的细胞活力检测, 从0.2 µM 到20µM 的浓度不等。本议定书中所使用的浓度使我们能够识别出能够诱导形分化的化合物, 同时, 它能最大限度地减少由于药物浓度较高而可能不相干的毒性作用。
在孵化后, 我们通过流式细胞仪测定了胶质蛋白-GFP 报告细胞的表达率。在每个库板至少三口井中确定了 gfp 阳性细胞的生存率和百分率的基线, 并确定为三标准差的 gfp 阳性细胞在基线上的百分比增加而受到正面打击最小阈值为 25% GFP 阳性细胞。我们确定了12药物, 诱导 GFP 阳性人群的充分增加 (表 1)。
图 1: 形差异报告系统。
pGreenZeo 胶质蛋白的原理图: GFP 记者。GSCs 不表达必要的组合转录因子激活胶质纤维酸性蛋白 (胶质细胞) 启动子, 因此不会表达 GFP (顶部面板)。然而, 当适当的转录因子存在 (例如, 当细胞获得一个形的命运-区别) 时, 胶质蛋白的启动激活, 细胞将表达 GFP 报告 (底部面板)。(GSC 胶质瘤干细胞, T2A-protein 连接器, Zeo Zeocin 抗性基因, TF 转录因子)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 形分化-克隆选择。
HSR-GBM1 GSC subclones 表达低浓度 (GL) 或高浓度 (GH) 的代表性图片: GFP 报告使用荧光显微镜 (显示40X 放大倍数)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 用于测定绿色荧光的流式细胞仪。
HSR-GBM1 患者衍生的干细胞线是转与胶质蛋白: gfp 报告慢和多 subclones 是基于 gfp 表达的干细胞启动细胞, 并确认流式细胞仪。这些克隆被命名为 GL (胶质蛋白低) 或 GH (胶质高)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: HSR-GBM1 胶质蛋白的功能特性: GFP subclones。
GL subclones 是更多的克隆在体外, 表明由增加的 GSC 频率, 这是衡量的极端限制稀释分析 (埃尔达)。请单击此处查看此图的较大版本.
| 名称 | GFP + 细胞折叠增加 | 描述 | 血脑屏障 | 药物银行概率 |
| 长春 | 8.97 | 抗有丝分裂化疗 | - | 0.88 |
| 地 | 13.89 | 止泻 | + | 0.96 |
| 利 | 10.89 | 钙通道阻滞剂/脑血管扩张器 | 那 | 那 |
| 丙 | 10.73 | 焦虑/肌肉松弛剂, 集中作用 | 那 | 那 |
| 6-Azauridine | 15.07 | Antimetabolite/抗病毒 | 那 | 那 |
| 伊立 | 14.14 | Topisomerase I 抑制剂 | + | 0.63 |
| 阿曲库磺 | 8.16 | 去骨骼肌松弛剂 | + | 0.93 |
| 格列美 | 8.75 | 降 | + | 0.73 |
| 氯 | 9.83 | 防腐 | + | 0.92 |
| 辛 | 8.23 | 强苷 | - | 0.72 |
| 卡 | 10 | 抗心律失常剂 | + | 0.86 |
| 尼索地平 | 5.05 | 钙通道阻滞剂 | - | 0.95 |
表 1: HSR-GBM1 GL-1 中诱导胶质蛋白-GFP 报告的小分子
十二化合物被发现增加的百分比, gfp 表达细胞显着 (折叠增加显示), 并符合严格标准的3标准偏差的基线, 亚砜处理的细胞, 并与不少于 25% GFP 阳性细胞。一个特定的代理人的能力和概率, 以越过血脑屏障 (药物银行 (−)。缩写: NA (信息不可用)。
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Discussion
虽然以前的大多数 GSCs 研究主要集中在定义它们的标记上, 但在这项研究中, 我们决定采取逆向方法。我们主要关注 GSCs 产生的分化后代 (例如, 表达形和神经元标记的细胞)。在这里, 我们展示了一个基于细胞的高通量药物筛选系统的利用, 这是建立在人胶质蛋白的启动依赖的 GFP 表达。所有的实验都是利用患者衍生的干细胞胶质瘤细胞系进行的。加利et al17中描述了描述这些行的隔离和扩展的详细协议。
该系统不仅帮助我们识别出能够诱导 GSCs 细胞分化的小分子, 而且还有助于我们明确确定形分化标记蛋白的表达, 确定通过比较 GSC 频率, 克隆单个肾小球细胞的容量。埃尔达试验是由方湖和戈登 k 史密斯开发的。读者被鼓励阅读的手稿, 以 in-depth 理解的分析优势和限制15。菌落形成评分步骤是高度的细胞类型依赖, 并可能需要根据所使用的细胞线调整。此外, 作为一般规则, 我们使用球体直径小时µm 作为一个很好的迹象表明, 干细胞是由克隆 GSC。
此外, 我们在这里描述的药物筛选系统可以识别新的通路 (特别是乙酰胆碱和钙转运), 以维持 GSCs 在未分化状态下的需要 (见表 1)。起始药物浓度可能根据库和细胞线的使用而变化。此外, 细胞分化所需的时间可能需要调整。此外, 瘤验证药物命中需要一个体内肿瘤起始检测18。
这项技术的一个小限制是, 自发分化不可避免地发生在任何干细胞丰富的文化, 这种现象往往增加与文化中的通道数和不同的个体 subclones。事实上, 我们观察到 subclones 15 后的自发分化。因此, 我们限制我们的差异分析文化的通道数不超过五。
因此, 这一方法中最关键的一点也许是将这些 GSCs 的体外传代到最小, 并且在体外工作时, 保持 1.5x105细胞/毫升以下的培养基密度。此外, 强烈建议每种药物 "命中" 是对其他记者 subclones 从同一 GSC 线, 以及对记者 subclones 隔离从不同的病人派生 GSC 球线的验证。这将增加对真正 "命中" 的信心。
这个健壮的协议中所描述的方法的多功能性增强了药物诱导的肿瘤干细胞分化的治疗价值, 并有助于识别新的药物作为肾小球和其他肿瘤的潜在的新型治疗策略。最后, 该方法可用于非神经干细胞、其他肿瘤类型以及不同的分化程度的报道。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了 NIH R01CA187780 的部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ESGRO Complete Accutase | EMD Millipore | SF006 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus) | SBI (System Biosciences) | SR10015VA-1 | |
| 50 ml sterile disposable reagent reservoirs | Corning | 4870 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 96 well plate | Falcon | 353072 | |
| Biolite T25 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130189 | |
| Biolite T75 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130190 | |
| 15 ml Centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 1.5ml Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 0.5 - 20uL | VistaLab Technologies | 1060-0020 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 5-250uL | VistaLab Technologies | 1060-0250 | |
| Multi 12-channel pipette tips 25 μl | VistaLab Technologies | 4060-1002 | |
| Multi 12-channel pipette tips 250 μl | VistaLab Technologies | 4060-9025 | |
| Guava easyCyte 5HT Benchtop Flow Cytometer | EMD Millipore | 0500-4005 | |
| NIH Clinical Collections 1 and 2 small molecule libraries | Evotec | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For the preparation of neural stem cell media (500 mL) | Final concentration | ||
| BSA | GoldBio.com | A-421-250 | 0.20% |
| DMEM/F12 10X | Corning | 90-091-PB | 1X |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3149 | 0.0002% |
| HEPES 1M | Sigma Aldrich | H4036 | 5.4 mM |
| Insulin-Transferrin- Selenium (ITS -G) (100X) | Life Technologies | 41400-045 | 1X |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | 14.5 mM |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) 100X | Gibco | 15140-122 | 1X |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | 16 nM |
| Putrescine | Sigma Aldrich | P5780 | 4.8 µM |
| Basic FGF (FGF2), Human | GoldBio | 1140-02-50 | 10 ng/ml |
| EGF, Human | GoldBio | 1150-04-100 | 20 ng/ml |
| Bottle-Top Filter, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind | Corning | 431160 | Use to filter sterlize media |
References
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