Summary
Een efficiënte screening-protocol wordt gepresenteerd voor de identificatie van kleine moleculen ter bevordering van astroglial differentiatie in glioblastoma stamcellen (GSCs). De bepaling is gebaseerd op een stamcel differentiatie verslaggever waarbij de expressie van de verbeterde GFP (eGFP) wordt gedreven door de menselijke promotor van het algemeen kaderakkoord voor vrede.
Abstract
Glioblastoma (GBM) is de meest voorkomende en meest dodelijke primaire hersentumor bij volwassenen, waardoor ongeveer 14.000 doden elk jaar in de VS alleen. Mediane overleving na diagnose is minder dan 15 maanden met maximale chirurgische resectie, straling en temozolomide chemotherapie. De uitdagingen die inherent zijn aan de ontwikkeling van effectievere behandelingen GBM steeds duidelijk geworden, en omvatten de onverzettelijke invasiviteit, haar weerstand tegen standaard behandelingen zijn genetische complexiteit en moleculaire aanpassingsvermogen en subpopulaties van GBM cellen met fenotypische overeenkomsten met normale cellen van de stam, hierna te noemen glioblastoma stamcellen (GSCs). Omdat GSCs vereist voor tumorgroei en progressie zijn, vertegenwoordigt differentiatie gebaseerde therapie een levensvatbare behandeling modaliteit voor deze ongeneeslijke gezwellen.
Het volgende protocol beschrijft een verzameling van procedures om een hoge throughput screening platform gericht op de identificatie van kleine moleculen ter bevordering van de GSC astroglial differentiatie. De kern van het systeem is een gliale fibrillary zuur eiwit (GFAP) differentiatie verslaggever-construct. Het protocol bevat de volgende algemene procedures: (1) tot oprichting van de GSC differentiatie verslaggever lijnen; (2) testen/valideren de relevantie van de verslaggever voor GSC zelf-vernieuwing/clonogenic capaciteit; en (3) hoge capaciteit stroom-cytometry gebaseerd drug screening.
De screening-platform biedt een eenvoudige en goedkope aanpak ter identificatie van de kleine moleculen ter bevordering van de differentiatie van de GSCs. Gebruik van bibliotheken van FDA-goedgekeurde geneesmiddelen houdt bovendien de mogelijkheden voor de identificatie van agenten die sneller andere doelen kan worden gebruikt. Ook worden therapieën die bevordering van Kanker stamcel differentiatie geacht te werken synergetisch met huidige "standaard van zorg" therapieën die te richten en te elimineren vooral meer gedifferentieerde kankercellen is gebleken.
Introduction
Recente studies hebben aangetoond dat tumoren een kleine populatie bevatten van cellen, cellen van de stam van kanker (CSCs) of inleiding van de tumor cellen, genoemd die belast zijn met progressie van de tumor, uitzaaiingen en weerstand tegen chemo - en radio-therapieën 1, 2. de aanwezigheid van cellen van de stam van kanker en hun meer gedifferentieerde nakomelingschap binnen tumoren wordt beschouwd als een belangrijke factor die bevordering van intratumoral heterogeniteit en vormt aldus een grote hindernis in het behandelen van kankers3. Tumor cel hiërarchie, geboden door de theorie van de stamcel kanker, heeft de ontwikkeling van nieuwe strategieën voor de behandeling van kankers 4geïnspireerd. Een aanpak voor het richten van de cellen van de stam van kanker is het identificeren en remmen signaalroutes waarvan bekend is dat tijdens de embryonale ontwikkeling van het betrokken orgaan verplicht worden. Inderdaad, wij en anderen eerder hebben gepubliceerd meerdere documenten beschrijven de voortdurende eis van de neurale stamcellen-relevante signaalroutes Sonic Hedgehog en Notch in glioblastoma5,6,7. Dit werk heeft geholpen bij het stollen van de motivering van de verschillende GBM klinische proeven. Een tweede aanpak voor het richten van de cellen van de stam van kanker is het bevorderen van hun differentiatie. Deze aanpak heeft ontvangen veel steun als gevolg van de gunstige resultaten van preklinische en klinische studies in het behandelen van acute promyelocytic leukemie met retinoic zuren (ATRA, een vitamine-A-analoog). Hier bleek ATRA te verwijderen van het blok van rijping en kanker cel differentiatie8te bevorderen. Meer recent, Piccirillo en collega's elegant is gebleken dat BMP-4 GSC differentiatie in astrocyten met belangrijke anti-GBM effecten in vitro en in vivo9 bevordert.
De reden voor de huidige studie is gebaseerd op een "omgekeerde engineering" aanpak voor het richten van de GSCs. Gezien de grote heterogeniteit aanwezig in GBM en met arme differentiatie wordt een van de kenmerken van de kanker, vroegen we als we een meer gunstige fenotype - differentiatie in een Astrocyt-achtige toestand kunnen bevorderen. Wij hebben hier geen voorkennis van de signaalroutes die handhaven GSCs een gegeven tumor specimen maar veeleer streven naar een gewenste fenotype (bijvoorbeeld GFAP positiviteit).
Dit verslag beschrijft de procedures die zijn gebruikt om de GSC differentiatie verslaggever-lijnen van de transductie van GSC-verrijkt culturen aan GSC kloonselectie. Het glioblastoma neurosphere lijnen gebruikt werden opgericht aan het laboratorium van Professor Angelo Vescovi van patiënten met een diagnose van primaire glioblastoma bij ziekenhuis San Raffaele - Milano, Italië. Deze lijnen zijn uitvoerig bestudeerd in verschillende publicaties 6,10,11,12,13,14. Het is sterk aanbevolen dat personen die geïnteresseerd zijn in het implementeren van deze technieken in hun laboratorium bepalen de relevantie van de verslaggever voor Kanker stamcel zelf-vernieuwing capaciteit in de cellen die zij van plan om te studeren (dit geldt voor elke verslaggever). Een gedetailleerd protocol voor één van de in vitro clonogenic tests geaccepteerd in het veld wordt geleverd aan het bereiken van deze15,16. Ten slotte, een gedetailleerd protocol met een beschrijving van het gebruik van de differentiatie verslaggever-lijnen in een flow-cytometry gebaseerd drug scherm wordt geleverd aan het eind. Van de nota, hebben ook aan het astroglial differentiatie systeem hier beschreven, we met succes vastgesteld en gevalideerd GSC verslaggever lijnen integratie van een MAP2:GFP (neuronale differentiatie) verslaggever. Daarom de methoden beschrijven in dit papier kan worden toegepast om te bestuderen van celdifferentiatie in verschillende geslachten van de cel.
Enkele van de cijfers in dit verslag kan worden gevonden in een recente publicatie: "Atracurium Besylate en andere neuromusculaire blokkering agenten bevorderen astroglial differentiatie en afbreken van glioblastoma stamcellen18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Astroglial en neuronale lentivirus verslaggever systemen werden aangekocht als voorverpakte, geconcentreerde lentivirale preparaten. Basiskennis van stroom cytometry techniek is vereist. Voor een optimaal gebruik van dit protocol moet de gebruiker ook toegang tot een cytometer van de stroom met hoge doorvoersnelheid capaciteit (accepteert 96-wells-platen als monsterbron).
1. lentivirale transcriptionele verslaggever systeem
Opmerking: In alle stroom cytometrische analyses, gebruik ouderlijke, niet-getransduceerde, cellen of cellen met vector-getransduceerde (niet-tl) voor de vaststelling van basislijn fluorescentie. Ook, merk op dat in alle maatregelen waar mechanische verpulvering wordt aangedrongen, te zacht. Harde verpulvering kan doden van een groot aantal van de kwetsbare GSCs en stroom cytometry resultaten beïnvloeden.
- 1 x 106 cellen in 2 mL zuiver volledige neurale stamcellen groeimedium in een 6-multiwell plaat plaat.
- Transduce cellen door toevoeging van lentivirus verslaggever aan een veelheid van infectie (moi) gelijk is aan 5.
- Voeg 2 µL van polybrene voor een eindconcentratie van 8 µg/mL.
- Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 's nachts.
- De volgende dag, vervang groeimedium om niet-afhankelijke virus te verwijderen. Plaats de plaat terug in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2 en incubeer gedurende 24 uur.
- Oogst 0,5 mL van het totale volume; spin down cellen bij 360 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in een conische buis 15 mL en de bovendrijvende vloeistof verwijderen door aspiratie. Voeg 0,5 mL verse neurale stamcellen groeimedium aan de resterende cellen en de plaat terug naar de incubator voor verdere uitbreiding.
- Voeg 200 µL van dissociatie reagens en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
- Distantiëren cellen door pipetteren zachtjes op en neer.
Opmerking: Harde verpulvering kan resulteren in aanzienlijke doden van GSCs, volledige dissociatie wordt gewoonlijk bereikt na 20 - 30 keer. - Toevoegen om te minimaliseren cel bijlage of aggregatie, 800 µL van Henks evenwichtig zout oplossing (HBSS) voor een eindvolume van 1 mL.
- Breng 200 µL van elke celsuspensie aan een putje van een 96-multiwell plaat.
- Gebruik voor deze procedure een benchtop stroom cytometer met het vermogen van de 96-wells-plaat voorzien van een blauwe laser voor excitatie en het vermogen van het opsporen van groen fluorescent proteïne. Stroom cytometrische analyses uitvoeren met het ten minste 10.000 levensvatbare cellen voor elke aankoop.
- Het bepalen van het percentage GFP-positieve cellen door stroom cytometry.
2. subclone selectie, uitbreiding en validatie
- De cellen van de plaat in 100 µL van neurale stamcellen medium bij een dichtheid van 0,7 cellen per putje van een 96-multiwell plaat.
- Cultuur klonen voor 11 dagen bij 37 ° C en 5% CO2. Deze stap is zeer celtype afhankelijk en zal waarschijnlijk vereisen een aanpassing gebaseerd op de cellijn gebruikt. Als algemene regel is een bol diameter ≥ 100 µm een goede indicatie van de aanwezigheid van clonogenic GSCs in de neurospheres.
- Met behulp van een fluorescente microscoop voorzien van een FITC-filter, markeren de putjes waarin een enkele neurosphere waar ~ 1-5% van de cellen GFP-positief zijn.
Opmerking: Het bepalen van dat het exacte percentage van GFP-positieve cellen is niet te kritisch op dit punt. Elk van de subklonen zal later behandeld worden door stroom cytometry. Deze stap wordt uitgevoerd ter vermindering van het totaal aantal klonen te analyseren met nadruk op neurospheres die afkomstig van zijn gedifferentieerdeproductie, GFAP-negatief, GSC. - Vouw de geselecteerde verslaggever klonen totdat er een voldoende aantal cellen voor analyse door stroom cytometry. Een sub confluente goed van een 6-multiwell plaat met ≤ 1.5x105 cellen/mL dient een voldoende aantal cellen.
Opmerking: Een gedetailleerde procedure voor de isolatie en de uitbreiding van de GSCs is beschikbaar 17.
3. bepaling van GFAP:GFP expressie door Stroom Cytometry
- Oogst een hoeveelheid cellen (0,5 mL) van elke verslaggever kloon en niet-getransduceerde besturingselementen om te bepalen van het exacte percentage van GFP-positieve cellen. Overwegen verslaggever klonen met ~ 1-5% GFP-positieve cellen.
- Spin cellen bij 360 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en bovendrijvende vloeistof verwijderen door aspiratie.
- Elke pellet, voeg 200 µL van cel dissociatie reagens en Incubeer de buizen in een waterbad ingesteld op 37 ° C.
- Triturate cellen zachtjes om de schorsing van een eencellige (meestal tussen de 20 tot 30 keer).
- Toevoegen om te minimaliseren cel bijlage of aggregatie, 800 µL HBSS tot een eindvolume van 1 mL.
- 200 µL per putje van een 96-multiwell plaat van elke celsuspensie overbrengen.
- Gebruik voor deze procedure een benchtop stroom cytometer met het vermogen van de 96-wells-plaat. Stroom cytometrische analyses uitvoeren met het ten minste 10.000 levensvatbare cellen voor elke aankoop.
4. ELDA zelf-vernieuwing Assay te beoordelen van Clonogenic capaciteit
Opmerking: Voor besturingselementen, zowel ouders, niet-getransduceerde, evenals GFP-uiten lentivirus-getransduceerde cellen, moet worden gebruikt om te bepalen van het potentieel van de relatieve clonogenic van de GSC differentiatie verslaggever lijnen naar de oorspronkelijke GSC culturen waaruit ze waren afgeleid.
- Distantiëren differentiatie-reporter subklonen in eencellige schorsingen zoals hierboven beschreven.
- De cellen van de plaat in 96-multiwell platen in 100 µL van volledige neurale stamcellen groei media op cel dichtheden variërend tussen 5 en 500 cellen per putje.
- Incubeer de cellen gedurende 9 tot 11 dagen bij 37 ° C en 5% CO2.
- Scoren positief putten door rechtstreekse visualisatie van neurospheres onder een lichte Microscoop. Een goed moet worden overwogen "positief" als het bevat minimaal één grote neurosphere.
- Sluit de gegevens: totale wells geanalyseerd en het aantal positieve putjes met behulp van de ELDA online interface beschikbaar op http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html.
5. drug bibliotheek verdunning voorbereiding
- Bibliotheek platen verwijderen uit opslag bij-80 ° C, dek af met aluminiumfolie (Bescherm lichtgevoelige stoffen). Voor ongeveer 30 min tot een uur op kamertemperatuur ontdooien.
- Gebruik een 12-kanaals meerkanaals pipet om te verdunnen van de verbindingen van de bibliotheek tot 0.2 mM in volledige neurale stamcellen medium. DMSO verdunnen tot 10% in groeimedium
Opmerking: De uiteindelijke concentratie van DMSO moet 0,1% wanneer toegevoegd aan de cellen. Toxiciteit kan leiden tot een hogere concentratie van DMSO in de cultuur. Om deze reden is het aanbevolen om de gevoeligheid voor DMSO testen in de cellijn gebruikt, vóór de behandeling. - DMSO als voertuig controle gebruiken voor de behandeling van de cellen in de kolommen van het linker- en rechterkant van elke plaat (de kolommen 1 en 12; Wells A tot en met H).
- Dekking van de verdunde bibliotheek platen met aluminiumfolie en de originele platen van de bibliotheek terug te keren naar de vriezer-80 ° C voor langdurige opslag.
6. drugs scherm
Opmerking: Cellen DMSO-behandeld moeten worden gebruikt om de fluorescentie basislijn instellen en aanpassen gating.
- Plaat 5 x 103 cellen in een 96-multiwell plaat in 99 µL van het groeimedium volledig neurale stamcellen.
- Cellen met verdunde bibliotheek verbindingen op een eindconcentratie van 2 µM (1 µL van 0,2 mM drug in 99 µL celsuspensie) of DMSO (control) met behulp van een 12-kanaals meerkanaals Pipet, behandelen. Incubeer de platen gedurende 72 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
- Met behulp van een 12-kanaals meerkanaals pipet 150 µL van cel dissociatie reagens toevoegen aan elk putje en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C.
- Distantiëren cellen door voorzichtig triturating met een 12-kanaals meerkanaals pipet totdat één celsuspensie is bereikt (meestal tussen de 20 tot 30 keer). De hoeveelheid tijd die vereist is om zich te distantiëren van de neurospheres volledig zal variëren tussen de GSC lijnen. Terwijl het aanbevolen cel dissociatie reagens (Zie materiaal) veilig is en incubatie gedurende 45 minuten had geen effect op leefbaarheid in meerdere regels van de GSC getest, Controleer of voor elke GSC lijn moet worden opgenomen in de screening.
Let op: Het eindvolume in elk Nou moet ongeveer 250 µL (100 µL celsuspensie + 150 µL van cel dissociatie reagens). - Het bepalen van het percentage van de cellen, uiting geven aan de verslaggever van de GFAP:GFP door stroom cytometry. Gebruik standaard gating strategie. Eerst, plot voorwaartse en zijdelingse verstrooit om een algemeen gevoel van Celgrootte en levensvatbaarheid. Plaats dan een poort op de levensvatbare eencellige bevolking. Dit is de bevolking waarvoor groene fluorescentie (eGFP) zal worden bepaald. Ieder samengestelde dat resulteert in een toename van het percentage van GFP-positieve cellen door meer dan drie standaarddeviaties controle (DMSO-behandeld) wordt beschouwd als een positieve "hit". Deze drempel moet worden aangepast volgens de specifieke toepassing en de gewenste striktheid.
Opmerking: Voor de hoge doorvoer scherm wordt aanbevolen met behulp van een enkele GSC verslaggever subclone. Na hit identificatie, elke hit moet worden gevalideerd tegen extra verslaggever subklonen uit de dezelfde GSC-lijn. Om te vergroten van het vertrouwen voor echte hits is raden ook aan het testen van verbindingen tegen verslaggever subklonen geïsoleerd uit verschillende GSC neurospheres lijnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Drie onafhankelijke patiënt afkomstige neurospheres lijnen werden getransduceerde met de lentivirus astroglial verslaggever codering voor een groen fluorescent proteïne (GFP) gesmolten in-frame met een Zeocin weerstand cassette en gedreven door het menselijke element van GFAP promotor ( Figuur 1). Volgende individuele klonen werden geïsoleerd door plating 0.7 cellen per putje in een 96 goed bord (Figuur 2), dit werd gevolgd door flow cytometrische bepaling van het percentage cellen uiten GFP (Figuur 3). Neurosphere klonen, afgeleid van afzonderlijke cellen, met ≤5% GFP-positieve cellen worden aangeduid als GL (GFAP laag) terwijl klonen met ≥75% GFP positieve cellen worden aangeduid als GH (GFAP hoog) en worden beschouwd als meer worden gedifferentieerd ten opzichte van de GL subklonen (Figuur 4).
Ter identificatie van de agenten en trajecten die astroglial differentiatie in GSCs controleren kunnen, werd een kleine-molecuul drug-scherm met behulp van twee NIH klinische collectie bibliotheken uitgevoerd. Cellen werden behandeld voor 72 uur met 727 bibliotheek agenten uit de NIH klinische collectie I en II, ingesteld op een concentratie van 2 µM of een gelijk volume van DMSO als een besturingselement. Het effect van deze agenten werd getest op de levensvatbaarheid van de cellen in alle onze patiënt afkomstige GBM neurosphere lijnen in concentraties variërend van 0,2 µM tot 20 µM, voordat de drug screening. De concentratie die wordt gebruikt in dit protocol konden we identificeren van verbindingen die konden ertoe astroglial differentiatie en op hetzelfde moment, het geminimaliseerd potentieel uit-doel toxische effecten als gevolg van de hogere concentraties van de drug.
Na incubatie vastbesloten wij het percentage cellen uiten van het algemeen kaderakkoord voor vrede-GFP-verslaggever door stroom cytometry. Referentieniveaus voor de levensvatbaarheid en het percentage van GFP-positieve cellen werden vastgesteld in ten minste drie putten voor elke bibliotheek plaat, en een positieve hit werd bepaald als een toename van het percentage van GFP-positieve cellen van drie standaarddeviaties liggen boven de basislijn (DMSO) en een minimale drempel van 25% GFP positieve cellen. We geïdentificeerd 12 drugs voldoende verhoging van het GFP-positieve bevolking (tabel 1 geïnduceerde).
Figuur 1: Astroglial differentiatie verslaggever systeem.
Schematisch diagram van pGreenZeo GFAP:GFP verslaggever. GSCs doen niet express de juiste combinatie van transcriptiefactoren nodig om te activeren van de promotor gliale fibrillary zuur eiwit (GFAP) en dus zal niet express GFP (bovenste paneel). Echter, wanneer de juiste transcriptiefactoren aanwezig zijn (bijvoorbeeld wanneer cellen verwerven het lot van een astroglial - onderscheiden) de promotor GFAP actief wordt, en de cellen de GFP verslaggever (onderste paneel) zal uitspreken. (GSC - Glioma cel van de stam, T2A-eiwit linker, Zeo-R - Zeocin resistentie gen, TF - transcriptiefactor). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Astroglial differentiatie - Subclone selectie.
Representatieve foto's van HSR-GBM1 SGR subklonen uiten van lage niveaus (GL) of hoge niveaus (GH) van de verslaggever van de GFAP:GFP met behulp van fluorescentie microscopie (40 X vergroting wordt weergegeven). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Stroom Cytometry voor de bepaling van groene fluorescentie.
HSR-GBM1 patiënt afkomstige neurosphere lijn was getransduceerde met GFAP:GFP verslaggever lentivirus en meerdere subklonen werden geselecteerd op basis van GFP expressie in de neurosphere Inleiding-cel en bevestigd door stroom cytometry. Deze klonen werden genoemd GL (GFAP laag) of GH (GFAP hoog). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Functionele karakterisering van HSR-GBM1 GFAP:GFP subclones.
GL subklonen zijn meer clonogenic in vitro zoals aangegeven door de toegenomen GSC frequenties die worden gemeten door de Extreme beperken verdunning analyse (ELDA). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Naam | -Voudige toename in GFP + cellen | Beschrijving | Bloed-hersenbarrière | Drug Bank waarschijnlijkheid |
| Vinorelbine | 8.97 | Anti-mitotische chemotherapie | - | 0.88 |
| Diphenoxylate | 13.89 | Antidiarrheal | + | 0.96 |
| Lomerizine | 10.89 | Calciumantagonist / cerebrale vaatverwijdende | NB | NB |
| Phenprobamate | 10,73 | Anxiolyse / spier relaxant, centraal handelen | NB | NB |
| 6-Azauridine | 15.07 | Antimetabolite / antivirale | NB | NB |
| Irinotecan | 14.14 | Topisomerase ik remmer | + | 0.63 |
| Atracurium besylaat | 8.16 | Nondepolarizing skelet spierverslapper | + | 0.93 |
| Glimepiride | 8,75 | Antidiabetic | + | 0,73 |
| Hexachlorofeen | 9,83 | Antiseptische | + | 0.92 |
| Digoxine | 8.23 | Cardiotonic glycoside | - | 0.72 |
| Antiaritmica | 10 | Anti-aritmie agent | + | 0.86 |
| Nisoldipine | 5.05 | Calciumantagonist | - | 0.95 |
Tabel 1: Kleine moleculen inducerende GFAP-GFP verslaggever expressie in HSR-GBM1 GL-1
Twaalf verbindingen bleken aanzienlijk te verhogen het percentage cellen GFP-uitdrukken (-voudige toename wordt weergegeven) en voldoet aan de strenge criteria van ≥3 standaarddeviaties over de basislijn, DMSO-behandelde cellen, en met maar liefst 25% GFP-positieve cellen. Het vermogen en de waarschijnlijkheid van een bepaalde agent te steken van de bloed-hersenbarrière (Drug Bank (−). Afkorting: Nb (informatie niet beschikbaar).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Terwijl de meeste van de eerdere studies van GSCs was vooral gericht op de markeringen die ze bepalen, in dit onderzoek besloten hebben we om de omgekeerde aanpak. We concentreren ons vooral op de gedifferentieerde nakomelingschap gegenereerd door GSCs (bijvoorbeeld cellen uiten van astroglial en neuronale stiften). Hier tonen we het gebruik van een hoge-doorvoer-cel-gebaseerde drug screening systeem, dat gebaseerd is op menselijke GFAP promotor-afhankelijke expressie van GFP. Alle experimenten werden uitgevoerd met behulp van patiënt-afgeleide neurosphere glioblastoma cellijnen. Een gedetailleerd protocol met een beschrijving van de isolatie en de uitbreiding van deze lijnen is beschreven in Galli et al.17.
Het systeem ons niet alleen geholpen bij de identificatie van kleine moleculen die staat inducerende celdifferentiatie van GSCs zijn maar ook hielp ons om ondubbelzinnig dat de expressie van de astroglial differentiatie markering GFAP bepaalt de clonogenic capaciteit van afzonderlijke GBM cellen door het vergelijken van de GSC frequenties. De bepaling van ELDA werd ontwikkeld door Yifang Hu en Gordon K. Smyth. Lezers worden aangemoedigd om te lezen van het manuscript voor een diepgaand inzicht in de assay sterke punten en beperkingen15. De vorming van de kolonie scoren stap is zeer celtype afhankelijk en zal waarschijnlijk vereisen een aanpassing gebaseerd op de cellijn gebruikt. Bovendien, als een algemene regel, gebruiken we bol diameter ≥100 µm als een goede indicatie dat de neurosphere is ontstaan door een clonogenic GSC.
Bovendien, de drug screening systeem we hier beschrijven maakt het mogelijk voor de identificatie van nieuwe trajecten (specifiek acetylcholine en calcium vervoer) die nodig zijn voor het handhaven van GSCs in de ongedifferentieerde staat (zie tabel 1). De beginconcentratie van de drug kan variëren afhankelijk van de bibliotheek en cel lijn gebruikt. Ook wellicht de tijd die nodig is voor celdifferentiatie aanpassing. Bovendien vereist tumorigene validatie van drug hits een tumor in vivo initiatie assay 18.
Mogelijk is een kleine beperking van deze techniek dat spontane differentiatie onvermijdelijk in de cultuur van elke stam-cel verrijkt optreedt, en dit verschijnsel dreigt toe te nemen met het aantal passages in cultuur verschilt tussen individuele subklonen. Inderdaad, we waargenomen spontane differentiatie in onze subklonen in het algemeen na passage 15. Daarom beperkt wij onze analyses van de differentiatie aan culturen passage nummers niet meer dan vijf.
Misschien het meest kritieke punt in deze methode daarom houden in vitro passaging van deze GSCs tot een minimum, en bij het werken in vitro, te handhaven van de dichtheid van de cultuur onder 1.5x105 cellen/mL. Bovendien is het sterk aanbevolen dat elk medicijn "hit" wordt gevalideerd tegen extra verslaggever subklonen van dezelfde GSC lijn, alsmede tegen verslaggever subklonen geïsoleerd uit verschillende patiënt afkomstige GSC neurospheres lijnen. Dit zal het verhogen van het vertrouwen dat een echte "hit" bij de hand is.
De veelzijdigheid van de methodologie beschreven in deze robuuste protocol versterkt de therapeutische waarde van een drug-geïnduceerde Kanker stamcel differentiatie en moet helpen bij het identificeren van nieuwe drugs als potentiële nieuwe therapeutische strategieën voor GBM en andere tumoren. Tot slot kan de bepaling worden geoptimaliseerd om te worden gebruikt met niet-neoplastische neurale stamcellen, andere soorten kanker, en met verschillende differentiatie verslaggevers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de NIH R01CA187780.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ESGRO Complete Accutase | EMD Millipore | SF006 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus) | SBI (System Biosciences) | SR10015VA-1 | |
| 50 ml sterile disposable reagent reservoirs | Corning | 4870 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 96 well plate | Falcon | 353072 | |
| Biolite T25 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130189 | |
| Biolite T75 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130190 | |
| 15 ml Centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 1.5ml Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 0.5 - 20uL | VistaLab Technologies | 1060-0020 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 5-250uL | VistaLab Technologies | 1060-0250 | |
| Multi 12-channel pipette tips 25 μl | VistaLab Technologies | 4060-1002 | |
| Multi 12-channel pipette tips 250 μl | VistaLab Technologies | 4060-9025 | |
| Guava easyCyte 5HT Benchtop Flow Cytometer | EMD Millipore | 0500-4005 | |
| NIH Clinical Collections 1 and 2 small molecule libraries | Evotec | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For the preparation of neural stem cell media (500 mL) | Final concentration | ||
| BSA | GoldBio.com | A-421-250 | 0.20% |
| DMEM/F12 10X | Corning | 90-091-PB | 1X |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3149 | 0.0002% |
| HEPES 1M | Sigma Aldrich | H4036 | 5.4 mM |
| Insulin-Transferrin- Selenium (ITS -G) (100X) | Life Technologies | 41400-045 | 1X |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | 14.5 mM |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) 100X | Gibco | 15140-122 | 1X |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | 16 nM |
| Putrescine | Sigma Aldrich | P5780 | 4.8 µM |
| Basic FGF (FGF2), Human | GoldBio | 1140-02-50 | 10 ng/ml |
| EGF, Human | GoldBio | 1150-04-100 | 20 ng/ml |
| Bottle-Top Filter, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind | Corning | 431160 | Use to filter sterlize media |
References
- Maher, E. A., et al. Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter. Genes Dev. 15 (11), 1311-1333 (2001).
- Bonavia, R., Inda, M. M., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. Heterogeneity maintenance in glioblastoma: a social network. Cancer Res. 71 (12), 4055-4060 (2011).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Sul, J., Fine, H. A. Malignant gliomas: new translational therapies. Mt Sinai J Med. 77 (6), 655-666 (2010).
- Bar, E. E., Chaudhry, A., Farah, M. H., Eberhart, C. G. Hedgehog signaling promotes medulloblastoma survival via Bc/II. Am J Pathol. 170 (1), 347-355 (2007).
- Chu, Q., Orr, B. A., Semenkow, S., Bar, E. E., Eberhart, C. G. Prolonged inhibition of glioblastoma xenograft initiation and clonogenic growth following in vivo Notch blockade. Clin Cancer Res. 19 (12), 3224-3233 (2013).
- Schreck, K. C., et al. The Notch target Hes1 directly modulates Gli1 expression and Hedgehog signaling: a potential mechanism of therapeutic resistance. Clin Cancer Res. 16 (24), 6060-6070 (2010).
- Warrell, R. P. Jr, et al. Differentiation therapy of acute promyelocytic leukemia with tretinoin (all-trans-retinoic acid). N Engl J Med. 324 (20), 1385-1393 (1991).
- Piccirillo, S. G., et al. Bone morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells. Nature. 444 (7120), 761-765 (2006).
- Bar, E. E., et al. Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma. Stem Cells. 25 (10), 2524-2533 (2007).
- Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres. Am J Pathol. 177 (3), 1491-1502 (2010).
- Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathol. 50 (4), 357-368 (2012).
- Lim, K. S., et al. Inhibition of monocarboxylate transporter-4 depletes stem-like glioblastoma cells and inhibits HIF transcriptional response in a lactate-independent manner. Oncogene. 33 (35), 4433-4441 (2014).
- Kahlert, U. D., et al. ZEB1 Promotes Invasion in Human Fetal Neural Stem Cells and Hypoxic Glioma Neurospheres. Brain Pathol. 25 (6), 724-732 (2014).
- Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. J Immunol Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).
- Meyer, M., et al. Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 851-856 (2015).
- Galli, R., et al. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64 (19), 7011-7021 (2004).
- Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. Atracurium Besylate and other neuromuscular blocking agents promote astroglial differentiation and deplete glioblastoma stem cells. Oncotarget. 7 (1), 459-472 (2016).
