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Cancer Research

교류 Cytometry 기반 약물 세포종 줄기 세포의 세포 분화를 촉진 하는 작은 분자의 식별에 대 한 시스템 검사

doi: 10.3791/56176 Published: January 10, 2018

Summary

효율적인 심사 프로토콜 astroglial 분화 세포종 줄기 세포 (GSCs)에 홍보 하는 작은 분자의 식별을 위해 제공 됩니다. 분석 결과 줄기 세포 감 별 법 기자에 의하여 향상 된 GFP (eGFP)의 식을 인간의 GFAP 발기인에 의해 구동 됩니다 기반으로 합니다.

Abstract

세포종 (GBM)은 미국 에서만 매년 약 14000 죽음을 일으키는 원인이 되는 성인에서 가장 일반적이 고 가장 치명적인 기본 뇌 종양. 메디아 생존 진단 다음 최대한 외과 절제술, 방사선 및 temozolomide 요법으로 15 개월 미만 이다. 더 효과적인 GBM 치료법 개발에 도전 점점 더 분명 되 고 등의 탄력성이 침입, 표준 치료에 그것의 저항, 그것의 복잡 한 유전 및 분자 적응성, GBM의 모집단 정상 줄기 세포, phenotypic 유사성과 셀 본 세포종 줄기 세포 (GSCs) 라고. GSCs 종양 성장 및 진행을 위해 필요 하기 때문에 차별화에 기초를 둔 치료가 불 치의 신생에 대 한 가능한 치료 양식 적임을 나타냅니다.

다음 프로토콜 플랫폼 GSC astroglial 차별화를 홍보 하는 작은 분자의 식별 목적으로 상영 높은 처리량을 설정 하는 절차의 컬렉션을 설명 합니다. 시스템의 핵심에는 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP) 차별화 기자-구문입니다. 다음과 같은 일반적인 절차를 포함 하는 프로토콜: (1) 설립 GSC 차별화 기자 라인; (2) 테스트/유효성 검사 GSC 자체-갱신/clonogenic 용량; 기자의 관련성 그리고 (3) 높은-용량 cytometry 마약 검사를 기반으로.

심사 플랫폼 GSCs 차별화를 홍보 하는 작은 분자를 식별 하는 간단 하 고 저렴 한 접근을 제공 합니다. 또한, FDA 승인 약품의 라이브러리의 활용 더 급속 하 게 내리거나 수 에이전트의 식별에 대 한 가능성을 보유 하고있다. 또한, 암 줄기 세포 분화를 촉진 하는 치료 대상 및 주로 더 차별화 된 암 세포를 제거 하기 위해 표시 되었습니다 현재 "표준 치료" 치료 공동 성으로 작동 하도록 예상 된다.

Introduction

최근 연구는 작은 인구를 포함 하는 종양 세포, 암 줄기 세포 (CSCs) 또는 시작 하는 종양 세포 나의 종양 진행, 전이, 그리고 항 암 치료 및 라디오 치료 1, 저항에 대 한 책임은 2. 암 줄기 세포 및 종양 내의 그들의 분화 progenies intratumoral이 추진 하는 중요 한 요소를 간주 하 고 따라서 암3치료에 주요 장애물을 나타냅니다. 종양 세포 계층, 암 줄기 세포 이론에 의해 제공 된 치료 암 4새로운 전략의 개발 영감 하고있다. 암 줄기 세포를 대상으로 하는 한 가지 방법은 식별 하 고 영향을 받는 장기의 배아 발달 동안에 필요한 것으로 알려져 있습니다 신호 경로 억제 하는 것입니다. 사실, 우리와 다른 사람 신경 줄기 세포 관련 신호 경로 소닉 고슴도치와 노치 세포종5,,67에 대 한 지속적인 요구를 설명 하는 여러 논문을 출판 이전 했습니다. 이 작품은 여러 GBM 임상 시험에 대 한 근거를 응고에 도움이 되었습니다. 암 줄기 세포를 대상으로 두 번째 방법은 그들의 차별화 홍보 하는 것입니다. 이 방법은 retinoic 산 (ATRA, 비타민 A 아날로그)와 급성 promyelocytic 백혈병 치료에 전 임상 및 임상 연구에서 유리한 결과로 인해 지원 많이 받았습니다. 여기 ATRA 성숙 블록을 제거 하 고 암 세포 감 별 법8촉진 발견 됐다. 더 최근에, Piccirillo와 동료 우아하게 나타났습니다 BMP-4 중요 한 안티-GBM 효과 생체 외에서 그리고 vivo에서9이다에 GSC 차별화를 촉진.

현재 연구에 대 한 근거 GSCs를 대상으로 "역된 공학" 접근을 기반으로 합니다. GBM와 암의 특징 중 하나 되 고 불 쌍 한 차별화와 광대 한이 감안할 때, 우리는 경우 우리는 호의 베푸는 표현 형-사이토와 같은 상태로 차별화 홍보 수 물었다. 여기, 우리가 특정된 종양 견본에서 GSCs를 유지 하지만 오히려 원하는 표현 형 (예: GFAP 양성) 달성을 목표로 하는 신호 통로의 사전 지식이 필요가 없습니다.

이 보고서는 GSC 차별화 기자-라인 GSC 농축 문화 변환에서 GSC 클론 선택 영역을 설정 하는 데 사용 하는 절차를 설명 합니다. 세포종 neurosphere 라인 사용 병원 산 라파엘 레-밀라노, 이탈리아에서 기본 세포종의 진단 가진 환자에서 교수 안젤로 Vescovi의 실험실에서 설립 되었다. 이 라인은 여러 간행물 6,10,,1112,13,14에서 광범위 하 게 연구 되었습니다. 그들의 실험실에서 이러한 기술을 구현에 관심이 있는 개인 공부를 계획 하는 세포에서 암 줄기 세포 자체 갱신 용량 기자의 관련성 확인 것이 좋습니다 (이 어떤 기자). 생체 외에서 clonogenic 분석 실험은 분야에서 허용 중 하나에 대 한 자세한 프로토콜이15,16을 달성 하기 위해 제공 됩니다. 마지막으로, cytometry 기반 약 스크린에 차별화 기자-라인의 활용을 설명 하는 상세한 프로토콜 끝에 제공 됩니다. 노트, 마찬가지로 astroglial 차별화 시스템 설명, 우리 성공적으로 설립 하 고 GSC 기자 라인 MAP2:GFP (신경 분화) 기자를 통합 검증. 따라서,이 방법론 설명 종이 다양 한 세포 계보에 세포 분화 연구에 적용할 수 있습니다.

이 보고서에 있는 숫자 중 일부는 최근 간행물에서 찾을 수 있습니다: "Atracurium Besylate 다른 신경 근육 차단 에이전트 astroglial 차별화 홍보 및 세포종 줄기 세포18고갈.

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Protocol

참고: Astroglial 및 신경 lentivirus 기자 시스템 사전 패키지, 집중 lentiviral 준비로 구매 되었다. 교류 cytometry 기술의 기본 지식이 필요 합니다. 또한,이 프로토콜을 사용 하는 전체에 대 한 사용자 흐름 cytometer 높은 처리량 용량 (샘플 소스로 96 잘 접시를 허용)에 대 한 액세스를 해야 합니다.

1. lentiviral Transcriptional 기자 시스템

참고: 모든 흐름 cytometric 분석에 사용 하 여 부모, 비 불리고, 셀 또는 벡터 불리고 (비 형광) 셀 설정 기준 형광. 또한, 유의 하십시오, 기계적 분쇄 이라고 어디 모든 단계에서 부드러운. 가혹한 분쇄 연약한 GSCs의 상당한 수를 죽 일 고 흐름 cytometry 결과 영향을 미칠 수 있습니다.

  1. 플레이트 1 x 106 셀 6 multiwell 격판덮개에 완전 한 신경 줄기 세포 성장 매체의 2 ml.
  2. Lentivirus 기자 5 크거나 감염 (moi)의 다양성에 추가 하 여 셀 transduce.
  3. 8 µ g/mL의 최종 농도 대 한 polybrene의 2 µ L를 추가 합니다.
  4. 37 ° C, 5% CO2 에서 셀을 밤새 품 어.
  5. 다음 날, 성장 매체 언바운드 바이러스 제거를 교체 합니다. 37 ° C, 5% CO2 배양 기에 다시 접시를 놓고 24 h에 대 한 품 어.
  6. 수확 0.5 mL 전체 볼륨; 360 x g 15 mL 원뿔 튜브에 실 온에서 5 분에 셀 아래로 회전 하 고 열망 하 여 상쾌한을 제거 합니다. 나머지 셀에 신선한 신경 줄기 세포 성장 매체의 0.5 mL을 추가 하 고 지속적인된 확장을 위한 인큐베이터에 접시를 반환 합니다.
  7. 분리 시 약의 200 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 5 분 동안 품 어
  8. 부드럽게 위아래로 pipetting으로 세포 분열.
    참고: 가혹한 분쇄 GSCs의 중대 한 살해 귀 착될 지도 모른다, 완전 한 분리는 일반적으로 20-30 시간 후 이루어집니다.
  9. 셀 첨부 파일 또는 집계를 최소화 하기 위해 800 µ L의 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 1 mL의 최종 볼륨을 추가 합니다.
  10. 각 세포 현 탁 액의 200 µ L 96 multiwell 격판덮개의 우물에 전송.
  11. 이 절차에 대 한 96 잘 접시 기능이 여기 블루 레이저와 녹색 형광 단백질을 검출 하는 능력을 갖추고 있는 벤치탑 교류 cytometer를 사용 합니다. 각 인수에 대 한 적어도 10000 가능한 셀 흐름 cytometric 분석을 수행 합니다.
  12. Cytometry 여 GFP-긍정적인 세포의 백분율을 결정 합니다.

2. subclone 선택, 확장, 및 유효성 검사

  1. 96-multiwell 격판덮개의 우물 당 0.7 세포의 밀도에서 신경 줄기 세포 매체의 100 µ L에 플레이트 세포.
  2. 문화를 37 ° C, 5% CO2에 11 일에 대 한 복제. 이 단계 높은 종속 셀 종류 이며, 셀 라인 사용에 따라 조정 필요 합니다. 일반적으로 구체 직경 ≥ 100 µ m는 neurospheres에서 clonogenic GSCs의 존재의 좋은 표시 이다.
  3. FITC 필터 장착 형광 현미경을 사용 하 우물 단일 neurosphere 포함 하는 셀의 1 ~ 5% 되 GFP-긍정적인 표시 합니다.
    참고: 결정 GFP-긍정적인 세포의 정확한 백분율은이 시점에서 너무 중요 하지 않다. subclones의 각 나중 cytometry에 의해 평가 됩니다. 총을 줄이기 위해이 단계를 수행 하는 수에 의해 시작 되는 neurospheres에 중점을 두고 분석 하는 클론의 undifferentiated, GFAP-부정, GSC.
  4. Cytometry 분석에 대 한 셀의 충분 한 수 있습니다 때까지 선택 된 기자 클론을 확장 합니다. ≤ 1.5x105 셀/mL를 포함 하는 6-multiwell 격판덮개의 하위 confluent 잘 셀의 충분 한 번호를 제공 해야 합니다.
    참고: 격리와 GSCs의 확장에 대 한 자세한 절차는 사용할 수 17.

3. Cytometry GFAP:GFP 식의 결정

  1. 각 기자 복제 및 GFP-긍정적인 세포의 정확한 비율을 결정 하기 위해 비 불리고 컨트롤 셀 (0.5 mL)의 약 수를 수확. 고려 기자 클론 1 ~ 5 %GFP-긍정적인 세포를 포함 하는.
  2. 실 온에서 5 분 동안 360 x g에서 셀 회전 고 열망 하 여 상쾌한을 제거 합니다.
  3. 각 펠 릿 세포 분리 시 약의 200 µ L을 추가 하 고 37 ° c 설정 물 욕조에 튜브를 품 어
  4. (보통 20 ~ 30 배) 사이의 단일 세포 현 탁 액을 달성 하기 위해 부드럽게 셀 triturate
  5. 셀 첨부 파일 또는 집계를 최소화 하기 위해 800 µ L HBSS 1 mL의 최종 볼륨을 추가 합니다.
  6. 각 세포 현 탁 액에서 96 multiwell 격판덮개의 우물 당 200 µ L를 전송 합니다.
  7. 이 절차에 대 한 96 잘 접시 기능이 있는 벤치탑 교류 cytometer를 사용 합니다. 각 인수에 대 한 적어도 10000 가능한 셀 흐름 cytometric 분석을 수행 합니다.

4. 엘 다 자기 갱신 분석 결과 Clonogenic 용량을 평가 하

참고: 컨트롤에 대 한 모두 부모의 비 불리고, 뿐 아니라, GFP 표현 lentivirus 불리고 셀 사용 해야 원래 GSC 문화는 그들이에 GSC 차별화 기자 라인의 상대 clonogenic 잠재력을 결정 하 파생.

  1. 위에서 설명한 대로 차별화 기자 subclones 단일 셀 정지로 해리.
  2. 플레이트 셀 셀 밀도 잘 당 5, 500 세포 사이에서 완전 한 신경 줄기 세포 성장 매체의 100 µ L에서 96 multiwell 격판덮개에.
  3. 37 ° C, 5% CO2에서 9 ~ 11 일에 대 한 셀을 품 어.
  4. Neurospheres는 가벼운 현미경의 직접 시각화 하 여 긍정적인 웰 스 점수. 잘 "긍정적인" 적어도 하나의 큰 neurosphere 포함 하는 경우 고려 되어야 한다.
  5. 데이터 연결: 웰 스 분석 및 http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html에서 사용할 수 있는 엘 다 온라인 인터페이스를 사용 하 여 양수 우물의 수.

5. 약물 라이브러리 희석 준비

  1. -80 ° C에 저장에서 라이브러리 번호판을 제거, 알루미늄 호 일 커버 (빛에 민감한 화합물 보호). 실 온에서 1 시간 30 분 약 thaw.
  2. 12 채널 멀티 채널 pipettor를 사용 하 여 완전 한 신경 줄기 세포 매체에 0.2 m m를 라이브러리 화합물을 희석. 성장 매체에서 10 %DMSO 희석
    참고: DMSO의 최종 농도 0.1% 셀에 추가 해야 합니다. 문화에 있는 DMSO의 높은 농도 독성에 발생할 수 있습니다. 이러한 이유로, 치료 전에 사용 세포 선에서 DMSO에 감도 테스트 하는 것이 좋습니다.
  3. 차량 제어로 DMSO를 사용 하 여 셀 (열 1, 12; 각 판의 왼쪽 및 오른쪽 열에서 발견 치료 웰 스 A H 통해)입니다.
  4. 커버 알루미늄 호 일로 희석된 라이브러리 접시 하 고 장기 저장을 위한-80 ° C 냉장고를 원래 라이브러리 접시를 반환 합니다.

6. 약 스크린

참고: DMSO 치료 셀 설정 기준 형광 게이팅 조정 하는 사용 되어야 한다.

  1. 5 x 103 셀 완전 한 신경 줄기 세포 성장 매체의 99 µ L에서 96 multiwell 격판덮개에 격판덮개.
  2. 12 채널 멀티 채널 pipettor를 사용 하 여 셀 2 µ M (세포 현 탁 액의 99 µ L에 0.2 m m 약 1 µ L)의 최종 농도에 희석된 라이브러리 화합물 또는 DMSO (제어) 취급 합니다. 37 ° C, 5% CO2에서 72 h에 대 한 번호판을 품 어.
  3. 12 채널 멀티 채널 pipettor를 사용 하 여 각 잘 하 셀 분리 시 약의 150 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 20 분 동안 품 어
  4. 단일 셀 서 스 펜 션 (20 ~ 30 번) 사이 보통 달성 될 때까지 부드럽게 12 채널 멀티 채널 pipettor 함께 분쇄 하 여 세포를 분리. Neurospheres를 완전히 분리 하는 데 필요한 시간의 양을 GSC 라인 사이 달라질 수 있습니다. 권장된 셀 분리 시 안전은 (자료 참조) 최대 45 분간 인큐베이션 했다 생존 능력에 영향을 주지 않습니다 여러 GSC 라인 테스트 하는 동안 심사에 사용 될 각 GSC 라인에 대 한 확인 합니다.
    참고: 각 최종 볼륨 잘 이어야 한다 대략 250 µ L (세포 현 탁 액의 100 µ L +의 세포 분리 시 약 150 µ L).
  5. GFAP:GFP 기자 cytometry로 표현 하는 세포의 백분율을 결정 합니다. 표준 제어 전략을 사용 합니다. 먼저, 셀 크기와 생존의 일반적인 감각을 얻을 하 고 측면 없앤다 플롯. 다음 가능한 단일 세포 인구에 게이트를 놓습니다. 이것은 인구 녹색 형광 (eGFP) 결정 됩니다. "히트" 긍정적으로 간주 됩니다 (DMSO 처리) 어떤 화합물 GFP-긍정적인의 비율에 있는 증가 세포 3 표준 편차에 의해 제어 이 임계값에 따라 특정 응용 프로그램 및 원하는 엄중 조정 되어야 한다.
    참고: 높은 처리량에 대 한 스크린은 권장 단일 GSC 기자 subclone를 사용 하 여. 히트 식별 다음 각 히트 같은 GSC 선에서 추가 기자 subclones에 대 한 확인 되어야 합니다. 사실 조회에 대 한 신뢰도 증가 하는 또한 것이 좋습니다 라인 다른 GSC neurospheres에서 격리 화합물 기자 subclones에 대 한 테스트.

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Representative Results

3 개의 독립적인 환자 파생 neurospheres 라인 Zeocin 저항 카세트 녹색 형광 단백질 (GFP) 융합에 프레임에 대 한 인코딩 lentivirus astroglial 기자와 불리고 되었고 인간의 GFAP 발기인 요소 ( 에 의해 구동 그림 1). 다음 개별 클론 96 잘 접시 (그림 2)에 잘 당 0.7 셀을 도금 하 여 고립 되었다,이 GFP (그림 3)를 표현 하는 세포의 백분율의 흐름 cytometric 결정에 의해 그 뒤를 이었다. Neurosphere 클론, ≤ 5 %GFP-긍정적인 세포를 포함 하는 단일 셀에서 파생 이라고 GL (GFAP 낮은) ≥75 %GFP 긍정적인 세포를 포함 하는 클론 GH (GFAP 높은) 라고 하 고는 GL에 비해 더 분화 될 것으로 간주 됩니다. subclones (그림 4)입니다.

에이전트와 GSCs에 astroglial 차별화를 제어할 수 있는 경로 식별 하기 위해 작은 분자 약물 화면 두 NIH 임상 컬렉션 라이브러리를 사용 하 여 수행 되었다. NIH 임상 컬렉션에서 727 라이브러리 에이전트와 72 시간 I 및 II, 2 µ M의 농도 또는 컨트롤로 DMSO의 동일한 볼륨에 설정에 대 한 세포 치료. 이러한 에이전트의 효과 모든 환자에서 파생 된 GBM neurosphere 라인 0.2 µ M에서 마약 검사 전에 20 µ M에 배열 하는 농도 세포 생존 능력에 시험 되었다. 농도 astroglial 차별화를 유도 할 수 있던 화합물을 식별 하는이 프로토콜에서 사용 하는 동시에, 그것은 더 높은 약물 농도로 인해 대상에서 잠재적으로 독성 효과 최소화.

부 화, 다음 우리는 cytometry에 의해 GFAP GFP 기자를 표현 하는 세포의 비율 결정. 생존 및 GFP-긍정적인 세포의 비율에 대 한 기준을 각 라이브러리 플레이트에 대 한 적어도 3 개의 우물에 결정 했다 고 긍정적인 히트 기준선 (DMSO)를 통해 3 개의 표준 편차의 GFP-긍정적인 세포의 비율의 증가로 결정 했다 그리고 25 %GFP 긍정적인 세포의 최소 임계값. GFP-긍정적인 인구 (표 1)에 충분 한 증가 유발 하는 12 약물 파악.

Figure 1
그림 1: Astroglial 차별화 기자 시스템입니다.
PGreenZeo GFAP:GFP 기자의 회로도입니다. GSCs 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP) 발기인을 활성화 하는 데 필요한 녹음 방송 요인의 적절 한 결합을 표현 하지 않습니다 하 고 따라서 GFP (상단 패널)을 표현 하지 않습니다. 그러나, 적절 한 전사 인자는 존재 (셀 astroglial 운명-을 취득 하는 경우 예: 차별화) GFAP 발기인 활성화 되 고 셀 GFP 기자 (하단 패널)를 표현 합니다. (GSC-Glioma 줄기 세포, T2A 단백질 링커, Zeo-R-Zeocin 저항 유전자, TF-녹음 방송 요인). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: Astroglial 차별화-Subclone 선택입니다.
낮은 수준 (GL) 또는 높은 수준의 (GH) 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 GFAP:GFP 기자를 표현 하는 HSR GBM1 GSC subclones의 대표 사진 (40 X 확대 표시 됩니다). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: Cytometry 녹색 형광의 결정에 대 한.
HSR GBM1 환자 파생 neurosphere 라인 GFAP:GFP 기자 lentivirus로 불리고는 그리고 여러 subclones GFP neurosphere 시작 셀에 식에 따라 고 cytometry에 의해 확인 된 선정 됐다. 이러한 GL (GFAP 낮은) 또는 GH (GFAP 높은) 선정 됐다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: HSR GBM1 GFAP:GFP의 기능 특성 subclones.
GL subclones는 더 clonogenic에서 시험관에 의해는 극단적인 제한 희석 분석 (ELDA) 측정는 GSC 주파수 증가에 표시 된 대로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

이름 GFP + 셀 배 증가 설명 혈액 뇌 장벽 마약 은행 확률
Vinorelbine 8.97 반대로 mitotic 화학 요법 - 0.88
Diphenoxylate 13.89 Antidiarrheal + 0.96
Lomerizine 10.89 칼슘 채널 차단제 / 대뇌 vasodilator NA NA
Phenprobamate 10.73 완화 / 근육 이완, 중앙 행동 NA NA
6-Azauridine 15.07 Antimetabolite / 항 바이러스 NA NA
Irinotecan 14.14 Topisomerase 나 억제제 + 0.63
Atracurium Besylate 8.16 Nondepolarizing 골격 근육 완화 제 + 0.93
Glimepiride 8.75 당뇨 + 0.73
Hexachlorophene 9.83 살 균 + 0.92
Digoxin 8.23 Cardiotonic glycoside - 0.72
Flecainide 10 항 부정맥 제 + 0.86
Nisoldipine 5.05 칼슘 채널 차단제 - 0.95

표 1: 작은 분자 GFAP GFP 기자 식 HSR GBM1 GL-1 유도
12 화합물 GFP 표현 세포의 비율을 크게 증가 하는 것을 발견 했다 (배 증가 표시) 및 기준선, DMSO 치료 세포 이상과 미만 25 %GFP-긍정적인 세포 ≥3 표준 편차의 엄격한 기준을 충족. 능력과 주어진된 대리인의 확률 교차 하는 혈액 두뇌 방 벽 (마약 은행 (−). 약어: 없음 (사용할 수 없는 정보)

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Discussion

그들을 정의 하는 표식에 주로 집중 하는 GSCs의 이전 연구의 대부분,이 연구에서 우리가 결정 역 접근 하는 것. 우리는 GSCs (예를 들어, 셀 astroglial와 신경 마커)에 의해 생성 된 차별화 된 progenies에 주로 집중 한다. 여기 우리 인간의 GFAP 발기인 종속 식을 GFP의 기반 시스템 심사 높은 처리량 셀 기반 약물의 사용을 보여 줍니다. 모든 실험 환자 파생 neurosphere 세포종 세포 라인을 활용 하 여 수행 했다. 분리와이 라인의 확장을 설명 하는 상세한 프로토콜 Galli 17에 설명 되어 있습니다.

시스템 뿐만 아니라 GSCs의 세포 분화를 유도 할 수 있다 그러나 또한 도움이 우리가 astroglial 분화 마커 GFAP 표현 결정 명백 하 게 결정 하는 작은 분자의 식별에 우리를 원조는 GSC 주파수를 비교 하 여 개별 GBM 셀의 clonogenic 용량. ELDA 분석 결과 Yifang Hu와 고 든 K. 스미스에 의해 개발 되었다. 독자는 분석 결과 장점과 한계15의 충분히 이해에 대 한 원고를 읽을 것을 권장. 단계 점수 식민지 형성은 매우 셀 종속 및 사용 셀 라인에 따라 조정 필요 합니다. 또한, 일반적으로 우리는 neurosphere GSC clonogenic에 의해 유래 했다 좋은 표시로 구체 직경 ≥100 µ m를 사용 합니다.

또한, 우리가 여기에 대해 설명 하는 시스템을 심사 하는 약물 GSCs 미 분화 상태에서를 유지 하는 데 필요한 새로운 경로 (특히 아 세 틸 콜린과 칼슘 전송)의 식별에 대 한 수 있습니다 (표 1 참조). 시작 약물 농도 사용 라이브러리 및 셀 라인에 따라 달라질 수 있습니다. 또한, 세포 분화에 필요한 시간은 조정을 할 수 있습니다. 또한, 마약 안타의 tumorigenic 유효성 검사 vivo에서 종양 개시 시험 18필요 합니다.

잠재적으로이 기술의 마이너 한계가 이다 자발적인 차별화 필연적으로 어떤 줄기 세포 농축 문화에서 발생 하 고이 현상을 문화에서 통로의 수와 함께 증가 하는 경향 및 개별 subclones 사이 다릅니다. 사실, 우리 자연 차별화 우리의 subclones에서 일반적으로 후 관찰 통로 15. 따라서, 우리는 우리의 차별화 분석 통로 숫자 5를 초과 하지 않는 문화에 제한.

따라서, 아마도이 방법론에서 가장 중요 한 포인트에서 일 생체 외에서를 최소 하 고 이러한 GSCs의 생체 외에서 뿌리고 유지 하는 1.5x105 셀/mL 아래 문화 밀도 유지. 또한, 각 약물 같은 GSC 선에서 추가 기자 subclones에 대 한 뿐만 아니라, 기자 subclones에 대 한 유효성 검사는 "히트" 다른 환자 파생 GSC neurospheres에서 라인 격리 하는 것이 좋습니다. 이것은 진정한 "히트"가 자신감 증가.

이 강력한 프로토콜에서 설명 하는 방법론의 다양성 약물 유발 암 줄기 세포 분화의 치료 가치를 강화 하 고 GBM 및 다른 종양에 대 한 잠재적인 새로운 치료 전략으로 신약을 식별에 도움이 될. 마지막으로, 분석 결과 비 종양 약 신경 줄기 세포, 다른 암 종류와 다른 차별화 기자 데 최적화 될 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 작품은 NIH R01CA187780에 의해 부분적으로 지원 되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ESGRO Complete Accutase EMD Millipore SF006
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650
HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Sigma Aldrich H6648
Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus) SBI (System Biosciences) SR10015VA-1
50 ml sterile disposable reagent reservoirs Corning 4870
6 well plate Thermo Fisher Scientific 130184
96 well plate Falcon 353072
Biolite T25 cm² Flask Vented Thermo Fisher Scientific 130189
Biolite T75 cm² Flask Vented Thermo Fisher Scientific 130190
15 ml Centrifuge tubes Celltreat 229411
1.5ml Microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-129
Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 0.5 - 20uL VistaLab Technologies 1060-0020
Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 5-250uL VistaLab Technologies 1060-0250
Multi 12-channel pipette tips 25 μl VistaLab Technologies 4060-1002
Multi 12-channel pipette tips 250 μl VistaLab Technologies 4060-9025
Guava easyCyte 5HT Benchtop Flow Cytometer EMD Millipore 0500-4005
NIH Clinical Collections 1 and 2 small molecule libraries Evotec
Name Company Catalog Number Comments
For the preparation of neural stem cell media (500 mL) Final concentration
BSA GoldBio.com A-421-250 0.20%
DMEM/F12 10X Corning 90-091-PB 1X
Heparin sodium salt Sigma Aldrich H3149 0.0002%
HEPES 1M Sigma Aldrich H4036 5.4 mM
Insulin-Transferrin- Selenium (ITS -G) (100X) Life Technologies 41400-045 1X
NaHCO3 Sigma Aldrich S-5761 14.5 mM
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) 100X Gibco 15140-122 1X
Progesterone Sigma Aldrich P8783 16 nM
Putrescine Sigma Aldrich P5780 4.8 µM
Basic FGF (FGF2), Human GoldBio 1140-02-50 10 ng/ml
EGF, Human GoldBio 1150-04-100 20 ng/ml
Bottle-Top Filter, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind Corning 431160 Use to filter sterlize media

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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교류 Cytometry 기반 약물 세포종 줄기 세포의 세포 분화를 촉진 하는 작은 분자의 식별에 대 한 시스템 검사
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Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells. J. Vis. Exp. (131), e56176, doi:10.3791/56176 (2018).More

Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells. J. Vis. Exp. (131), e56176, doi:10.3791/56176 (2018).

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