Summary
Этот протокол представляет собой подход для анализа всей транскриптом от zebrafish эмбриона, личинки, или сортировка клеток. Мы включать изоляции РНК, путь анализа данных RNASeq и на основе ПЦР qRT Проверка изменения выражения гена.
Abstract
Анализ изменения выражения гена глобальных является ценным инструментом для выявления роман пути, лежащие в основе наблюдаемых фенотипов. Данио рерио является прекрасным примером для быстрой оценки всего транскриптом из всего животного или отдельных клеточных популяций из-за легкости изоляции RNA от большого количества животных. Здесь представлен протокол для анализа глобальных ген выражение в данио рерио эмбрионов, с помощью РНК последовательности (RNASeq). Мы описываем подготовка РНК из всей эмбрионов или клеточных популяций, полученные с помощью ячейку Сортировка в трансгенных животных. Мы также описать подход для анализа данных RNASeq для выявления обогащенного пути и онтология гена (GO) термины в наборах данных глобальной ген выражение. Наконец мы предоставляем протокол для проверки изменения выражения гена, с использованием количественных обратной транскриптазы ПЦР (qRT ПЦР). Эти протоколы может использоваться для сравнительного анализа, контроля и экспериментальных наборов данио рерио для определения изменения выражения гена Роман и обеспечить молекулярной понимание фенотипов интерес.
Introduction
Сравнительный анализ экспрессии генов глобальных является ценным инструментом для выявления роман гены способствуя наблюдаемых фенотипов. Такой анализ обычно полагаются на количественную оценку транскрипта изобилия по сравнению между экспериментальной и контроль образцов. Целевые подходы, такие как qRT ПЦР относительно быстрой и точной для исследования изменения выражения одного гена. РНК последовательности (RNASeq) предлагает широкий, гипотеза свободный подход к выявить значительные изменения в экспрессии генов между образцами, что делает его теперь стандарт для таких расследований экспериментальных систем.
Данио рерио стали известные модели во многих областях болезни. Первоначально разработанный для их полезности в биологии развития исследований, благодаря их высокой плодовитости и относительно низкая стоимость обслуживания, экспериментальное использование данио рерио развивалась включать широкий спектр фенотипов от эмбриональных взрослой стадии также как широкий спектр молекулярных assays1,2,3. Действительно эти преимущества делают механистический показывают быстрый и экономически эффективным из-за легкости приобретения большого количества материалов в сочетании с легкостью генетических и экологических манипуляций на всех этапах жизни. Кроме того прозрачный характер zebrafish эмбриона и личинки делают его идеальным для создания трансгенных репортер линии конкретных клеток и тканей, позволяя в vivo визуализации отдельных клеток населения4. Эксплуатация таких линий позволяет анализ выражения глобальной гена в типах конкретных изолированных клеток, основанные на выражении гена репортера.
Здесь мы представляем всеобъемлющий протокол для глобальных ген выражение анализа с использованием RNASeq после культуры zebrafish эмбриона. Генетические манипуляции экспериментальной, включая Морфолино (MO)-на основе переходных генов нокдаун или изменения генома ТРИФОСФАТЫ опосредованной, были представлены в другом месте5,6,7. Поэтому мы сосредоточиться на подробный протокол для изоляции RNA от всей эмбрионов или сортировка трансгенных репортер выражая клетки, следуют простой Вычислительный анализ RNASeq результаты, используя путь инструменты и генная Онтология (GO) термины. Наконец мы включили стратегию для проверки изменения выражения гена, количественная обратная транскриптаза ПЦР (qRT ПЦР). Эти протоколы применяются к данио рерио эмбрионов, подвергается широкий спектр экспериментальных условиях, включая сравнение генетических мутантов или экологических условий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
всех животных протоколы, изложенные ниже, в соответствии с и утверждена Университета Мэриленд институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC).
1. Подготовка эмбрионов
- Создание эмбрионов через природных спаривания
- культуры эмбрионов до 3 месяцев, репродуктивного зрелости 5 , 8 .
- Отделить взрослых мужчин и женщин рыб от нужного напряжения в разделенном спаривания танки вечером перед эмбриона коллекции и добавить 2 кобеля и 3 суки в каждой цистерне.
Примечание: Использование штамма флуоресцентные репортер трансгенных insulin2a:mCherry позволил анализ β-клеток поджелудочной железы. - Передачи рыбы для спаривания танк система пресной водой и удалить разделитель, сразу же после того, как свет пришел на следующее утро.
- Позволяют рыбы к спариванию, естественно, пока эмбрионов наблюдаются в нижнем баке. Соберите эмбрионов в интервалах 30 минут до желаемой суммы. Хранить каждый сбор момент времени в отдельных Петри в СМИ эмбриона на 28,5 ° C.
- Микроинъекции генетического материала или размещение в 6 экспериментальных культуры средств массовой информации, при желании и культура эмбрионов в свежих Хэнк ' s эмбриона средних 8-10см Петри на 28,5 ° C.
Примечание: для анализа выражения гена в Морфолино (MO) вводят или мутанта животных, обратите внимание, что каждая манипуляция может иметь непредвиденные последствия на экспрессию генов. Мутанты могут exhibit генетических компенсацию на уровне транскрипции, что не наблюдается MO-основанные геном ориентации 9.
- Стадии эмбрионов
- культура эмбрионов в группах 50 – 75 эмбрионов за 10-см Петри блюдо для поощрения последовательного развития сроки всех эмбрионов.
- Мониторинг развития морфологии, с использованием рассечения Микроскоп на этапах бластомера, epiboly и Сомит для обеспечения развития прогрессии 10.
Примечание: Удалить любые умирающего или неправильно эмбрионов для предотвращения задержки развития в блюдо. - Отдельных эмбрионов, основанный на эпоху развития. Измеряют возраст эмбриона, используя номер Сомит после сегментации (после гаструляция 10,33 h пост оплодотворение (hpf)) до примерно 24 hpf. Этап эмбрионов и личинки, используя длины всего тела после 24 hpf.
Примечание: Сегменты являются Шеврон образный mesodermal ткани, на спинной частью эмбриона. - Поместить отсортированные эмбрионов в инкубатор 28,5 ° C и позволяют развитие прогресса до нужного возраста.
2. Сингл клеточная диссоциация: Весь эмбриона и сортировка клеточных популяций
- весь эмбриона диссоциации
- усыпить данио рерио эмбрионы на стадии желаемого, поместив чашку Петри на льду для 5-15 мин до тех пор, пока не движение наблюдается .
- Пул 20 эмбрионов перенести пробки microcentrifuge меткой 1,5 мл. Удалите любые средства массовой информации избыточного эмбриона из пробки microcentrifuge.
- Лизис добавить 200 мкл реагента (см. Таблицу материалы) в пробирку, содержащую эмбрионов. Однородный эмбрионов в лизис реагента, механически с помощью пестика. Добавьте 800 мкл Реагента лизис довести объем до 1 мл. Хранить при температуре-80 ° C до извлечение RNA.
- Потока сортировка клеток изоляции 11
- переноса эмбрионов с Петри в пробки microcentrifuge 1,5 мл и удалить столько зародыша среды как можно скорее.
Примечание: В зависимости от возраста эмбриона, механические диссоциации могут потребоваться на этом шаге. С эмбрионами > 48 hpf, мы рекомендуем использовать пестика нарушить целостность эмбриона перед продолжением. - Инкубировать эмбрионов с 1 мл раствора диссоциации буфера 1 (см. Таблицу материалы) в пробки microcentrifuge 1,5 мл. Инкубируйте 15-30 мин при комнатной температуре. Нарезанных решение, мягко закупорить вверх и вниз с помощью P1000 наконечник для смешивания каждые 3-4 мин на этапе инкубации. ДЕЛАТЬ не VORTEX.
- Собирать эмбрионы центрифугированием на 3 мин на 300 x g и удалить супернатант. Вновь приостановите эмбрионы в 1 мл диссоциации буфера 2 (см. Таблицу материалы). Инкубируйте 15-30 мин при комнатной температуре с регулярной накапайте Тритурация.
- Оценить пищеварение путем разбавления 1-2 мкл суспензии активированного флуоресценции клеток, сортировка (FACS) буфера под микроскопом.
Примечание: Полное переваривание произошла, когда рассмотрены Алиготе показывает отдельные ячейки с минимальным клеток кластеры и кусочки эмбриональных тканей. - Собирать клетки центрифугированием при 300 x g для 5 минут удалить супернатант. Вновь приостановить клеток в 1 мл СУИМ буфер и гравитации фильтр через сито клеток 40 мкм, чтобы удалить непереваренных ткани из образца.
- Подсчитать ячейки, используя Горяева и разбавляют СУИМ буфер для примерно 1 х 10 6 клеток/мл в трубке СУИМ.
Примечание: Для типов клеток с относительно небольшим числом за эмбриона (менее 5% от общего числа), таких как β-клеток поджелудочной железы, используйте минимум 1000 этап соответствует эмбрионов. - Обеспечивают СУИМ, объекта с СУИМ пробирки, содержащие 1 мл образцов клеток подвески, а также СУИМ трубка, содержащая только лизис реагента или СУИМ буфер сортировки. Ворота СУИМ потока сортировщик собирать только одной клетки, которые выражают флуоресцентные репортер.
- Выполнять СУИМ потока сортировка до тех пор, пока число желаемых клеток были собраны.
Примечание: Для выполнения RNASeq, существует как минимум требуется всего РНК. Мы обнаружили, что клетки 3000-5000 достаточно изолировать высокого качества, высокой концентрации РНК. - Хранить собранные клетки на льду и немедленно приступить к подготовке РНК.
- переноса эмбрионов с Петри в пробки microcentrifuge 1,5 мл и удалить столько зародыша среды как можно скорее.
3. Подготовка РНК
- Извлечь РНК
- инкубировать собранных образца (из шага 2) с лизис реагент для 5 мин при комнатной температуре.
- Добавить 0,2 мл хлороформа для каждого 1,0 мл реагента лизиса используется и инвертировать трубы вручную для 15 s. инкубировать в течение 2-3 минут при комнатной температуре. Центрифугуйте образцы на 12000 g x 15 мин на 4 ° C.
- Раздельный, водная фаза передать свежие трубки и добавить 0,5 мл изопропанола для каждого 1,0 мл реагента лизиса используется. Проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре. Центрифугуйте образцы на 12000 g x 10 мин на 4 ° C.
- Мыть с 75% этанола и Центрифугуйте образцы на 7500 g x 5 мин при 4 ° C. полностью удалить супернатант и дать высохнуть при комнатной температуре. Вновь приостановить РНК в 15-30 мкл диэтиловым pyrocarbonate (DEPC)-очищенной воды.
- Очистить высокого качества РНК
- объединить РНК подвеска с 1/10 объема 3 M ацетат натрия (рН 5,5) и 1 объем изопропанола. Проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре и Центрифугуйте образцы на 12 500 x g за 10 минут на 4 ° C.
- Помыть лепешка с ледяной 70% этанола в DEPC-лечение водой и Центрифугуйте образцы на 10000 x g 5 мин при 4 ° C. Повторите шаг мыть раз.
- Удалить супернатант и дайте высохнуть при комнатной температуре. Вновь приостановить в DEPC-лечение водой.
- Assay извлеченные РНК для концентрации (нг/мкл) и чистоты (260/230 соотношение) с использованием абсорбционный спектрометр. Убедитесь, что значение 260/230 ~ 2.0 прежде чем с RNASeq. Хранить при температуре-80 ° C до насe (до 6 месяцев).
- Отправить образцы РНК поставщика или ядро для RNASeq и экспрессии генов изменить анализ на основе количественной оценки виртуализации читает. Результаты, возвращенные из поставщика обычно предоставляются как список генов, экспонируется значительные фолд изменения в текст читает между выборками.
Примечание: Столбец может использоваться, если приведенный выше метод дает низкое качество РНК. Сумма, концентрации и РНК целостности номер (Рин) для образцов РНК должен быть подтвержден с продавцом или ядра. Поставщика или ядро обычно также оценит Рин.
4. Пути и идти термин анализ
Примечание: Смотри Рисунок 1 представитель вывода анализа выражения гена после RNASeq, представленной на ядро или производителем.
- , Сортировка дифференциально выразил генов
- , сравнивая одно экспериментальное условие против управления
- открытые данные (результаты) в программное обеспечение для управления электронной таблицы (см. таблица материалов ).
- Выберите стрелку раскрывающегося списка рядом с ' рода ' и выберите " Настраиваемая сортировка " в пределах таблицы, содержащие дифференциально выраженной генов в экспериментальных по сравнению с контролем состояния.
- Выберите поле ' столбец ' в окне, которое хлопает вверх и выбрать сортировку по ' LFC ' столбец. Обеспечение ' значения ' выбран в ' Сортировка по ' столбец. Выберите, чтобы отсортировать от ' по убыванию ' в ' заказ ' столбец и нажмите кнопку " ОК ".
Примечание: Это будет сортировать дифференциально выраженной гены, так что те, с повышенной выражением (положительный LFC) появится в верхней части списка, в то время как те, с уменьшение выражением (отрицательные LFC) появится в нижней части списка.
- Сравнить несколько экспериментальных условий для одного элемента управления следующим образом.
- Выберите первую ячейку в пустом столбце на экспериментальной 1 против управления таблицы для определения дифференциально выразил генов в двух экспериментальных условиях. В ячейке введите следующее уравнение:
Примечание: Эта формула представляет собой сочетание если, ЕОШИБКА и матч функции. (i функция матч, матч (А1, Experimental2_vs_Control! : A, 0), будет искать значение в ячейке A1 (ENSEMBL ID) в столбце A (: a) из таблицы с именем Experimental2_vs_Control (Experimental2_vs_Control!). " 0 " указывает искать точное совпадение, и, если найдено точное соответствие, функция возвращает значение " 1 ", а если совпадение не найдено, функция будет возвращать ошибку " н/д ". (ii) результат матча функции затем вход в функцию ЕОШИБКА, ЕОШИБКА (матч (А1, Experimental2_vs_Control! : A, 0)), где, если входные данные " 1 " указанием матч был найден, он будет возвращать " ложных ", и если вход " н/д " указанием матч не был найден, он будет возвращать " TRUE ". (iii " TRUE " или " ложные " результат, затем вход в функцию если если (ЕОШИБКА (матч (А1, Experimental2_vs_Control! : A, 0)), " ", " дублировать "), где, если входные данные " TRUE " указанием матч не был найден, он будет возвращать значение между первый набор кавычек (" ") который пуст, и поэтому ячейка будет пустым. Если входные данные " ложные " указанием матч был найден, он будет возвращать значение между второй набор кавычек (" дублировать "), и ячейка будет говорить " дублировать ". - Пресс " введите " или " возвращение " для запуска этого уравнения. Выберите ячейку, содержащую формулу и щелкните поле в правом нижнем углу ячейки. Сохранить нажал мышью и перетащите выделенную область весь путь вниз по колонне до последнего ' идентификатор функции ', чтобы скопировать формулу в каждую ячейку в столбце.
- Выберите " Настраиваемая сортировка " снова, добавить второй уровень сортировки, щелкнув " + " значок в левом нижнем углу. На первом уровне " Сортировка по ", под заголовком столбца выберите " дублировать ", в разделе Сортировка выберите ' значения ' и в разделе Порядок выберите ' от Z до A '. На втором уровне " затем в ", под заголовком столбца выберите ' LFC ', в разделе Сортировка выберите ' значения ' и в разделе Порядок выберите ' по убыванию ' и выберите " ОК ".
Примечание: Это будет сортировать список генов на 4 группы, основанные на направленность изменения выражения. Важно проверить гены в обеих экспериментальных условиях, чтобы убедиться, что изменения в выражении в том же направлении в обоих или в противоположных направлениях. - Удалите круглые скобки из символов столбца гена, прежде чем приступить или результаты не удалось найти в базах данных. Выберите весь столбец, содержащий символы, ген. Выберите " редактировать " затем " заменить " в раскрывающемся списке ' файл ' меню. Тип " (*) " в " найти: " бар заменить окна, и оставить " заменить: " бар пустой. Выберите ' заменить все ' для удаления всех экземпляров скобок.
Примечание: * представляет любое количество символов, поместив этот символ между двумя скобки, программа будет предложено найти любой экземпляр в заштрихованных клетках и любой экземпляр скобки будут заменены ничего, тем самым удаляя их.
- Выберите первую ячейку в пустом столбце на экспериментальной 1 против управления таблицы для определения дифференциально выразил генов в двух экспериментальных условиях. В ячейке введите следующее уравнение:
- , сравнивая одно экспериментальное условие против управления
- Определение обогащенный пути
- копии гена символов набора для какой желает определить обогащенного пути в буфер обмена. Перейти к ConsensusPathDB 12. Выберите " гена набор анализ " на левой боковой панели веб-страницы, а затем " анализ перепредставленности ".
- Вставить список генов в " вставить список идентификаторов гена/белок " поле. Символ выберите гена в " гена/белков идентификатор типа " поле и нажмите " продолжить ". Выберите поле рядом с " пути, как это определяется путь базы данных " под на основе пути задает раздел.
Примечание: Ряд вариантов для анализа появится список доступных баз данных для поиска. Мы рекомендуем, де выбор всех баз данных, кроме базы данных Kegg и Reactome, поскольку они являются наиболее авторитетных и всеобъемлющей. Нахлестом с параметрами ввода списка и p значение обрезания можно регулировать также основаны на потребностях. Мы рекомендуем оставить эти параметры по умолчанию 2 Джин нахлестом и 0,01 p-значение отсечки. - Выберите " найти обогащенного наборы " для получения списка путей, содержащих гены в списке ввода.
Примечание: Вывод будет в формате таблицы, включая имя каждого пути следуют " задать размер " (с указанием числа общей генов в пути), " кандидатов содержится " (с указанием числа генов в списке ввода, которые находятся в этом пути ), а также значение p и q значение (ФДР) и база данных, из которого был определен путь.
- Поколение сетей путь
- определить обогащенного пути, как описано выше.
- Выбрать все обогащенного путей для визуализации в сетевой путь, выбрав каждый флажок имена пути для отображения или нажав " все " под " выберите " в заголовке столбца выше полях выбор, затем выберите " Визуализировать выбранных наборов ".
Примечание: Мы рекомендуем визуализации все пути, если есть меньше, чем 30; Если есть больше чем 30 пути мы рекомендуем выбор топ 30 самых обогащенного пути (те, которые содержат наибольшее количество генов из входного списка). - Настройка " относительные совпадения " и " общих кандидатов " фильтры, выбрав либо поле в центре верхней части страницы и ввод desirЭд % относительной перекрываются или количество общих кандидатов, чтобы быть более жесткими, с тем чтобы сделать более актуальными перекрывает путь сети яснее и выберите " применяются ".
Примечание: Мы рекомендуем относительной нахлестом 0.2, указывающее 20% генов дублирования между 2 пути, чтобы соединить их и минимум 2 общих кандидатов. Легенда диаграммы можно увидеть, нажав на легенде графика в верхнем левом углу страницы.
- Определение терминов обогащенного GO
- скопировать символы гена группы, для которой один хочет, чтобы определить обогащенного гена онтологии в буфер обмена. Перейти к ' инструмент GO обогащения анализа ' в Консорциум Ontology гена 13. Вставьте список гена символов в поле в левой части страницы под " гена идентификаторы здесь … "
- выбрать какой набор терминов го для использования, перечисленные под поле идентификаторы гена: биологический процесс, молекулярные функции или клеточных компонентов. Выберите (рекомендуется) ' биологический процесс '. Выберите ' данио рерио ' под собой условия поле и нажмите " отправить ".
Примечание: Мы рекомендуем использовать отсечки p значение по умолчанию равное 0,05.
5. Проверка qRT-ПЦР
Примечание: отдельные гены, отождествляется с изменения выражения значительные гена в RNASeq должны быть проверены путем целенаправленных qRT ПЦР в реплицировать экспериментов.
- синтеза cDNA извлечь РНК из эмбрионов, с помощью метода, описанного в разделе 3.1. Извлечение RNA.
- Преобразование 1 мкг РНК в cDNA, с помощью преобразования cDNA комплекта (см. Таблицу материалы). Объедините РНК, дНТФ и фермента обратной транскриптазы. Выполните Термоциклер реакции согласно данным производителя ' s спецификации.
- Развести cDNA 1:3 в DEPC-лечение водой. Хранить при 4 ° C до 1-2 месяцев.
- проверки qRT ПЦР
- выберите генов для проверки qRT-ПЦР РНК последовательности результатов. Идентифицировать гены с высоким раз изменения в выражении. Определить, какие из этих генов также содержат высокий чтения графов, как это указывает обильные выражения.
- Выбрать цели 10-12 от изменения высокой раза, количество высокое чтения список генов. Дизайн праймеров для того чтобы усилить генов-мишеней, которые охватывают по крайней мере 1 Интрон экзона границы.
- Заключать ПЦР грунтовка дизайн сайта 14 ген или целевого региона гена. Выберите " дизайн 2 ПЦР праймеры " и запрос на сайт, чтобы создать набор грунтовка.
Примечание: Не забудьте включить праймеров внутреннего контроля, таких как β-актина, нормализовать сравнений между выборками. Β-актина грунтовки являются F: 5 ' - TCGAGCTGTCTTCCCATCCA - 3 ' и R: 5 ' - TCACCAACGTAGCTGTCTTTCTG - 3 '. - Сочетают cDNA, вперед грунт, обратный грунт и полимеразы. Выполнять qRT ПЦР-амплификации определить относительное выражение генов 15.
- Анализ относительное выражение мРНК генов интерес определение относительной количественная оценка 15.
- Сравнить qRT ПЦР для RNASeq результаты, чтобы гарантировать согласованность направленность дифференциальной выражение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сортировка дифференциально выразил генов:
Для выявления дифференциально выраженной генов в личиночной стадии данио рерио моделей Alström синдром и Синдром Барде-Бидля (BBS), мы ориентированы либо alms1 или bbs1 стенограммы путем инъекций ранее проверены сплайс блокирование MOs в одичал тип zebrafish эмбриона16,17. На 5 дней после оплодотворения (dpf), два репликация РНК были извлечены из каждого состояния, а также эмбрионы вводят с управления МО, как описано в разделе 3 выше. RNA от каждого образца был секвенирован на глубине ~ 120 миллионов читает с ~ 107 миллионов читает унифицированных данио рерио генома. 85-90% соответствие гласит сопоставляется exonic регионов генома.
1,348 всего гены были значительно изменены в Alström модели и 471 всего гены были значительно изменены в модели BBS. Общие изменения в экспрессии генов между модели или изменения, уникальные для одной из моделей были определены как описано в разделе 4.2. 1 084 всего гены были однозначно изменилось в модели Alström, 612 регулируется вверх и 472 регулируются вниз и 207 гены были однозначно изменилось в модели BBS, 176 регулируется вверх и вниз регулируется 31 (Рисунок 2, Таблица S1и S2 таблицы). 264 гены были найдены значительно изменен в обеих моделях, 73 были регулируется до 182 были в вниз регулируется и 9 показан противоположные изменения в выражении между двумя моделями (Рисунок 2, Таблица S1и S2 таблицы (см. Дополнительные Tables.xlsx)). Противоречивые цифры различной степени выраженной генов между двумя моделями предположить, что bbs1 и alms1 могут влиять на различных этапах развития.
Интересно, что большое количество различной степени выраженной генов в Alström модели показывают, что alms1 играет важную роль в области развития на этапе 5 dpf, тогда как меньшее количество изменения гена в BBS модели показывают, что роль bbs1 не может быть видно, в этот момент времени. В отличие от предыдущих анализов транскриптомики на 2 dpf предложил обратный18.
Определение обогащенного пути и онтология гена в Zebrafish модель Alström синдрома:
Чтобы более четко разъяснить молекулярного профиля в Alström модели, были определены пути и Джин онтологии, обогащенный в различной степени выраженной генов. Обогащенный пути были определены путем запроса ConsensusPathDB и обогащенного онтология гена были определены путем запроса Консорциум Ontology гена, как описано в разделах 4.3-4.5. Наиболее высоко обогащенного среди генов, регулируется вверх в Alström модель, количество генов или сложить обогащения, были проанализированы. 31 всего пути были вверх регулируется в Alström модели. Помимо широкого группировки «обмен веществ», наиболее сильно затронутых путей были врожденного и адаптивного иммунной системы с 32 до 20 генов, соответственно (рис. 3A). Вниз по течению β-клеток рецепторов сигналов, что события были также обогатили, предлагая иммунной системы вверх регулирование в этой модели. Также несколько сигнальных путей обогатились среди вверх регулируется генов в Alström модели, в соответствии с Ассоциацией Alström синдром с первичной ресничку дисфункции, крупный центр сигнализации ячейки (Рисунок 3А). Кроме того, три пути, связанные с секреции инсулина были вверх регулируется: жирные кислоты привязан к GPR40, свободных жирных кислот и ацетилхолина (рис. 3A). Это согласуется с высокой проникающей инсулин сопротивление и тип 2 диабета фенотипы в Alström больных. Шести терминов го обогатились среди вверх регулируется генов в Alström модели, включая дифференциацию эритроцитов, эритроцитов гомеостаза, миелоидных клеток гомеостаза и гомеостаза процессов (рис. 3B). Оценить взаимосвязь вверх регулируется пути, пути сеть Alström, модель регулируемой вверх пути был создан (рис. 3 c). Основной узел взаимосвязанных путей показали высокую степень связи между пути, связанные с иммунной системой и сигнализации, в то время как один из узлов, незначительные показали связь между пути регулирования трех инсулина. Наконец мы проверили изменения выражения гена, выявленные оценки 5 гена целей, которые были либо вверх или вниз регулируется в модели Alström, RNASeq. Направление изменения выражения гена qRT-ПЦР в aste, ГЦК, bmb, btr26 и ifi35, относительно управления, изъятый наблюдается RNASeq (рис. 4A–B).
Рисунок 1. Представитель вывода анализа выражения гена после RNASeq, представленной на ядро или производителем. Функция ID указывает ENSEMBL гена идентификационный номер. Счетчики чтения указывает число операций чтения в элемент управления или экспериментальных образцов, которые выровнены для этого гена в геном. Раз изменение и журнал изменения раз указывают степень изменения в экспрессии гена между экспериментальной и контролировать образца либо положительные (увеличение) в выражение в направлении экспериментальный образец или отрицательные (уменьшение) в выражение в направлении экспериментальный образец. P значение и ФДР являются статистические тесты, чтобы определить значимость результатов; для RNASeq экспериментов чтобы определить значение используется более строгие ФДР значение 0,05. Gene_symbol указывает идентификатор гена NCBI, а gene_name содержит полное имя гена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Дифференциально выразил генов в моделях BBS и Alström. Количество вверх регулируется генов (красный) или вниз регулируется (желтый) в alms1 MO (зеленый) вводят эмбрионов, bbs1 MO (оранжевый) вводят эмбрионов или оба по сравнению с стандартный элемент управления МО вводят эмбрионов. * Обозначает количество генов, изменения в обоих, но имеющие напротив изменения в выражении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Figure 3. Upregulated пути и обогащенного GO термины в Alström модели. (A) Upregulated пути количество генов. (B) Upregulated GO условия путем обогащения фолд. (C) путь подключения upregulated путей в Alström модели. Путь соединения определяется как минимум 20% общих генов между пути и по крайней мере 2 гены перекрываются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. qRT-PCR подтверждения изменения выражения гена. Изменения в экспрессии генов, выявленных RNASeq были подтверждены в возраст - и лечение соответствует 5 dpf эмбрионов, вводится с контроля, alms1 или bbs1 МО (A) подмножество генов, показаны выражение mRNA генов с помощью qRT ПЦР. (B) эквивалентных данных показаны чтения графов из набора RNASeq данных. Все данные относительно элемента управления, и qRT-PCR были нормализованы в актина. Aste, астероид гомолога 1; ГЦК, Глюкокиназа; BMB, brambleberry; btr26, семейство кровожадных связанных генов, член 26; ifi35, интерферон индуцированного белка 35. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Подход, описанный в настоящем Протоколе предлагает сравнительно быстрое и экономически эффективные стратегии транскриптом уровень анализа всего животных или конкретных отсортированных клеточных популяций. Данио рерио обеспечивает модель выгодно для этот тип исследования из-за легкость и быстрота в генерации большого количества начиная материала, простота реализации генетических или экспериментальных условий окружающей среды и наличия большой спектр трансгенных репортер линий, позволяя для изоляции типа клеток конкретные и ткани конкретных групп населения.
Хотя не подробно здесь, этот метод можно легко разместить разделов ткани, собранных от несовершеннолетних или взрослых рыб как альтернатива СУИМ и коллекции. Мы также разработали основные последующий анализ стратегии, которая только опирается на использование базовой таблицы команды и уже существующие пути и идти баз данных. Основным преимуществом такого подхода является простота доступа не требует высокого уровня знаний в компьютерной программы или базы данных управления. Таким образом эта стратегия применяется для следователей из всех слоев общества для информативных анализа наборов данных выражение больших гена.
Наш подход сочетает в себе основные zebrafish эмбриона и личинок культуры с стандартных методов извлечения РНК, следуют RNASeq. RNASeq требуется большое количество исходного материала высокого качества; Некоторые продавцы требуют 2 мкг всего РНК. В результате типы редкие/редко клеток или анализ отдельных эмбрион находится вне досягаемости. Однако за последние пять лет продемонстрировали значительное улучшение в маломощных анализов, наборы данных, созданные из небольших выборок и Нижняя РНК количествах, и мы ожидаем, что эти приложения можно будет в ближайшем будущем. Для обеспечения точных результатов, добавление обоих технических реплицирует, т.е., создавая две библиотеки РНК от одного образца и биологические реплицирует, т.е., собирая эмбрионов от нескольких вязки, является идеальным. Эти шаги позволяют исследователям управления вариации в образцах, и последовательности, определенные во всех образцах с большей вероятностью быть реальные результаты, с сокращением вероятность пропуска ниже результат чтения граф.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.) и T32DK098107 (T.L.H. и J.E.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial Reagents | |||
| TriZol | Thermo Scientific | 15596026 | lysis reagent |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | dissociation buffer 1 |
| FACSMax | Genlantis | T200100 | dissociation buffer 2 |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| FirstStrand cDNA conversion | Thermo Scientific | K1621 | cDNA conversion kit |
| 2X SYBR Green Master Mix | Roche | 4707516001 | qRT-PCR Master Mix |
| FACS buffer | Fisher Scientific | 50-105-9042 | |
| chloroform | Sigma Aldrich | 288306 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Strains | |||
| Tuebingen | ZIRC | ZL57 | |
| ins2a:mCherry | ZIRC | ZL1483 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 40 micron cell strainer | Sigma | CLS431750 | |
| FACS tube | BD Falcon | 352063 | |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Inverted Microscope | Zeiss | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Illumina HiSeq | Illumina | ||
| LightCycler 480 | Roche | ||
| Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set | Aquaneering | ZHCT100 | |
| FACS tube 5 mL polypropylene tube | BD Falcon | 352063 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | ||
| Consensus Path DB | http://cpdb.molgen.mpg.de/ | ||
| GO Enrichment Analysis | http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis |
References
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
- Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , 4th ed, Academic Press. (2017).
- Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. The Zebrafish: Genetics, Genomics, and Transcriptomics. , 4th ed, Academic Press. (2016).
- Detrich, H. W. The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , 3rd ed, Academic Press. (2011).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J Vis Exp. (109), (2016).
- MPIMG. ConsenusPathDB. , Available from: http://cpdb.molgen.mpg.de/ (2017).
- Consortium, G. O. Enrichment analysis Tool. , Available from: http://www.geneontology.org/ (2017).
- IDT. IDT Primerquest Tool. , Available from: https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index (2017).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M.
- Leitch, C. C., Lodh, S., Prieto-Echague, V., Badano, J. L., Zaghloul, N. A. Basal body proteins regulate Notch signaling through endosomal trafficking. J Cell Sci. 127 (Pt 11), 2407-2419 (2014).
- Lodh, S., Hostelley, T. L., Leitch, C. C., O'Hare, E. A., Zaghloul, N. A. Differential effects on beta-cell mass by disruption of Bardet-Biedl syndrome or Alstrom syndrome genes. Hum Mol Genet. 25 (1), 57-68 (2016).
- Hostelley, T. L., Lodh, S., Zaghloul, N. A. Whole organism transcriptome analysis of zebrafish models of Bardet-Biedl Syndrome and Alstrom Syndrome provides mechanistic insight into shared and divergent phenotypes. BMC Genomics. 17, 318 (2016).
