Summary
Dit protocol biedt een aanpak voor de hele transcriptome analyse van zebravis embryo's, larven, of cellen gesorteerd. Wij omvatten isolatie van RNA, pad analyse van RNASeq gegevens en qRT-PCR-gebaseerde validatie van gen expressie veranderingen.
Abstract
De analyse van de wereldwijde gen expressie veranderingen is een waardevol instrument voor de identificatie van nieuwe trajecten die ten grondslag liggen aan de waargenomen fenotypen. De zebravis is een uitstekend model voor snelle beoordeling van hele transcriptome van hele dieren of individuele cel populaties te wijten aan het gemak van isolatie van RNA van grote aantallen dieren. Hier wordt een protocol voor globale gen expressie analyse in zebrafish embryo's met behulp van RNA sequencing (RNASeq) gepresenteerd. We beschrijven de voorbereiding van RNA van hele embryo's of van cel populaties verkregen met behulp van de cel sorteren in transgene dieren. Ook beschrijven we een aanpak voor de analyse van de RNASeq gegevens om verrijkt trajecten en Ontology van het gen (ga) bedingen in global gen expressie datasets te identificeren. Tot slot bieden we een protocol voor validatie van gen expressie veranderingen met behulp van kwantitatieve reverse-transcriptase PCR (qRT-PCR). Deze protocollen voor vergelijkende analyse van controle en experimentele sets van zebrafish kunnen worden gebruikt om nieuwe gen expressie veranderingen te identificeren, en moleculaire inzicht geven in de fenotypen van belang.
Introduction
Vergelijkende analyse van de wereldwijde genexpressie is een waardevol instrument om nieuwe genen die bijdragen tot het waargenomen fenotypen te identificeren. Dergelijke analyses meestal rekenen op kwantitatieve beoordeling van transcript overvloed vergeleken tussen experimentele en controle van monsters. Gerichte aanpak, zoals qRT-PCR zijn relatief snel en nauwkeurig onderzoek van enkel gen expressie veranderingen. RNA sequencing (RNASeq) biedt een brede, hypothese-vrije benadering ter identificatie van belangrijke wijzigingen in genexpressie tussen monsters, waardoor het nu de standaard voor dergelijke onderzoeken over experimentele systemen.
Zebravis opgedoken als een prominente model op vele terreinen van de ziekte. Oorspronkelijk ontwikkeld voor hun nut in Ontwikkelingsbiologie studies, vanwege hun hoge vruchtbaarheid en relatief lage kosten van onderhoud, experimenteel gebruik van zebravis uitgegroeid tot een breed scala aan fenotypes van embryonale volwassen stadia zo goed als een breed scala van moleculaire testen1,2,3. Inderdaad, deze voordelen maken het moleculaire mechanistisch onderzoek snelle en kosteneffectieve omwille van het gemak van het verwerven van grote hoeveelheden materiaal gecombineerd met het gemak van zowel milieu als genetische manipulatie in alle stadia van het leven. Bovendien, het transparante karakter van de zebravis embryo's en larven maken het ideaal voor het genereren van cel - en weefsel-specifieke transgene verslaggever lijnen waardoor in vivo visualisatie van discrete cel populaties4. Exploitatie van dergelijke lijnen vergunningen global gen expressie analyse in specifieke geïsoleerde celtypes gebaseerd op verslaggever genexpressie.
Hier presenteren we een uitgebreide protocol voor globale gen expressie analyse met behulp van RNASeq na cultuur van zebravis embryo's. Genetische experimentele manipulaties, met inbegrip van morfolino (MO)-gebaseerde voorbijgaande gene knockdown of CRISPR-gemedieerde genoom bewerken, hebben ingediend elders5,6,7. We daarom concentreren op een gedetailleerd protocol voor isolatie van RNA uit hele embryo's of gesorteerd op transgene verslaggever-uiten cellen gevolgd door eenvoudige rekenkundige analyse van de resultaten van de RNASeq met traject gereedschappen en gene ontologie (GO) voorwaarden. Tot slot hebben wij een strategie voor de validatie van gen expressie wijzigingen opgenomen door kwantitatieve reverse-transcriptase PCR (qRT-PCR). Deze protocollen zijn van toepassing op de zebravis embryo's onderworpen aan een breed scala van experimentele omstandigheden, met inbegrip van de vergelijking van genetische mutanten of milieuomstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle dierlijke protocollen hieronder zijn in overeenstemming met en goedgekeurd door de Universiteit van Maryland institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC).
1. embryo voorbereiding
- genereren embryo's via natuurlijke paring
- cultuur embryo's tot 3 maanden van leeftijd, reproductieve volwassenheid 5 , 8 .
- Scheiden van de volwassen mannelijke en vrouwelijke vissen van de gewenste stam in verdeelde paring tanks aan de vooravond van de embryo's worden verzameld, en 2 mannetjes en 3 vrouwtjes toevoegen aan elke tank.
Opmerking: Gebruik van de transgene insulin2a:mCherry fluorescerende verslaggever stam toegestaan de analyse van de alvleesklier β-cellen. - Overdracht vis voor de paring met verse systeem water tank en de scheidingslijn te verwijderen zodra de lampjes op de volgende ochtend komen.
- Laat de vis om te paren natuurlijk tot embryo's worden waargenomen in de bodem tank. Verzamelen embryo's in intervallen van 30 min tot de gewenste hoeveelheid wordt opgehaald. Elke winkel verzameld tijdstip in aparte petrischalen in embryo media op 28,5 ° C.
- Het uitvoeren van microinjection van genetisch materiaal of plaatsing in experimentele voedingsbodems 6, indien gewenst, en cultuur van de embryo's verse Hank ' s embryo middellange 8 in 10-cm petrischalen bij 28,5 ° C.
Opmerking: P.a. gen expressie in morfolino (MO) geïnjecteerd of mutant dieren, er rekening mee dat elke manipulatie incidentele effecten op de genexpressie hebben kan. Mutanten kunnen vertonen genetische compensatie op het niveau van de transcriptie die niet wordt nageleefd door MO gebaseerde gen gericht op 9.
- Fase embryo's
- cultuur van de embryo's in groepen van 50 – 75 embryo's per 10-cm petrischaal ter bevordering van de consistente developmental timing van alle embryo's.
- Volgen de ontwikkelingstoxiciteit morfologie met behulp van ontleden Microscoop kerntransfer, epiboly en Somiet stadium om ontwikkelings progressie 10.
Opmerking: Verwijderen van een stervende of misvormde embryo's om te voorkomen dat de vertraging in de ontwikkeling in de schotel. - Scheiden de embryo's op basis van de ontwikkelingstoxiciteit leeftijd. Meten van de leeftijd van de embryo met Somiet nummer na segmentatie (na gastrulatie, 10.33 h post bevruchting (hpf)) tot ongeveer 24 hpf. Fase van de embryo's en larven met behulp van totale lichaamslengte na 24 hpf.
Opmerking: De somieten zijn de chevron-vormige mesodermal weefsels die aanwezig zijn op het dorsale deel van het embryo. - Plaats van de gesorteerde embryo's in een incubator 28,5 ° C en laat ontwikkeling aan de vooruitgang van de gewenste leeftijd.
2. Eencellige Dissociatie: Hele Embryo en gesorteerd op cel populaties
- heel embryo dissociatie
- euthanaseren de zebravis embryo's in de gewenste stadium door het plaatsen van de petrischaal op ijs gedurende 5-15 minuten totdat er geen beweging wordt waargenomen .
- Een pool van 20 embryo's overbrengen in een tube van gelabelde 1,5 mL microcentrifuge. Verwijder alle overtollige embryo media uit de buis microcentrifuge.
- Voeg toe 200 µL lysis reagens (Zie Tabel van materialen) aan de buis met embryo's. Meng de embryo's in cellysis reagens mechanisch met behulp van een stamper. Voeg 800 µL lysis reagens om zodat het totale volume 1 mL toe. Winkel bij-80 ° C tot RNA extractie.
- Flow-gesorteerd op cel isolatie 11
- Transfer van de embryo's van de petrischaal in een 1,5 mL microcentrifuge buis en verwijder zoveel embryo medium mogelijk.
Opmerking: Afhankelijk van de leeftijd van de embryo's, mechanische dissociatie kan ook worden geëist bij deze stap. Met embryo's > 48 hpf, raden we het gebruik van een stamper te verstoren embryo integriteit alvorens. - Broeden de embryo's met 1 mL dissociatie buffer 1 (Zie Tabel van materialen) in 1,5 mL microcentrifuge buis. Incubeer gedurende 15 à 30 minuten bij kamertemperatuur. Triturate de oplossing door zachtjes op en neer met behulp van een P1000 tip te mengen elke 3-4 min tijdens de incubatie stap pipetteren. DOEN niet VORTEX.
- Verzamelen van de embryo's door centrifugeren gedurende 3 minuten op 300 x g en verwijder de bovendrijvende substantie. Resuspendeer de embryo's in 1 mL dissociatie buffer 2 (Zie Tabel van materialen). Incubeer gedurende 15 à 30 minuten bij kamertemperatuur met regelmatige Pipetteer verpulvering.
- Beoordelen de spijsvertering door verdunning van 1-2 µL van suspensie in fluorescentie-activated cell sorting (FACS) buffer onder Microscoop.
Opmerking: Volledige spijsvertering heeft plaatsgevonden wanneer het onderzochte monster enkele cellen met minimale cel clusters en stukken van embryonaal weefsel toont. - Verzamelen de cellen door centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 min. verwijderen supernatant. Resuspendeer de cellen door een zeef cel 40 µm onverteerd weefsel te verwijderen uit het monster in 1 mL FACS buffer en zwaartekracht filter.
- Met behulp van een hemocytometer cellen tellen en Verdun met FACS buffer om ongeveer 1 x 10 6 cellen/mL in een buis FACS.
Opmerking: Voor celtypes met een relatief klein aantal per embryo (minder dan 5% van het totaal), zoals alvleesklier β-cellen, gebruikt u een minimum van 1.000 fase-matched embryo's. - Bieden de FACS sorteren faciliteit met de FACS buizen met 1 mL van schorsing celsteekproeven evenals FACS buis met alleen lysis reagens of FACS Buffer. Poort van de FACS stroom-sorter voor het verzamelen van slechts enkele cellen die uitdrukking geven aan de fluorescerende verslaggever.
- Voeren de FACS stroom-sortering totdat de gewenste cel nummers zijn verzameld.
Opmerking: Voor het uitvoeren van RNASeq, is er een minimale totale RNA vereiste. We hebben ontdekt dat 3000-5000 cellen voldoende te isoleren van hoge kwaliteit, hoge-concentratie RNA. - Slaan de verzamelde cellen op ijs en ga onmiddellijk naar RNA voorbereiding.
- Transfer van de embryo's van de petrischaal in een 1,5 mL microcentrifuge buis en verwijder zoveel embryo medium mogelijk.
3. RNA voorbereiding
- Uittreksel RNA
- de verzamelde monster (uit stap 2) met lysis reagens gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
- Toevoegen 0,2 mL chloroform voor elke 1,0 mL lysis reagens gebruikt en omkeren van de buizen met de hand voor 15 s. Incubate gedurende 2-3 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer de monsters bij 12.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C.
- De gescheiden, waterige fase overbrengen in een verse buis en Voeg 0,5 mL van isopropanol voor elke 1,0 mL lysis reagens gebruikt. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer de monsters bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
- Wassen met 75% ethanol en centrifugeer de monsters bij 7.500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. het supernatant volledig verwijderen en laat lucht droog, bij kamertemperatuur. Resuspendeer de RNA in 15-30 µL diethyl pyrocarbonate (DEPC)-behandeld water.
- Zuiveren kwalitatief hoogwaardige RNA
- de RNA-schorsing combineren met 1/10 volume 3 M Natriumacetaat (pH 5.5) en 1 hoeveelheid isopropanol. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer de monsters bij 12.500 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
- Wassen van de pellet met ijskoude 70% ethanol in DEPC-behandeld water samen en centrifugeer de monsters bij 10.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Herhaal de wassen stap eenmaal.
- Verwijder het supernatant en laten drogen bij kamertemperatuur. Resuspendeer in DEPC-behandeld water.
- Assay het uitgepakte RNA voor de concentratie (ng/µL) en zuiverheid (260/230 ratio) met behulp van een spectrometer absorptie. Zorg ervoor dat de waarde van 260/230 ~ 2.0 voordat u verdergaat met RNASeq. Bewaren bij-80 ° C tot onse (maximaal 6 maanden).
- De monsters van RNA Stuur naar een leverancier of core RNASeq en genexpressie wijzigen analyse gebaseerd op kwantificering van sequencing leest. De resultaten van de leverancier worden meestal geleverd als een lijst van genen vertonen een significante vouw-verandering in afschrift leest tussen monsters.
Opmerking: Een kolom kan worden gebruikt als de bovenstaande methode resulteert in slechte kwaliteit RNA. De hoeveelheid, concentratie en RNA Integrity nummer (RIN) voor RNA monsters moeten worden bevestigd met de leverancier of de kern. De leverancier of de kern zal meestal ook RIN.
4. Traject en GO Term analyse
Opmerking: Zie afbeelding 1 voor representatieve output van de analyse van gen expressie na RNASeq door de kern of de leverancier verstrekte.
- Sorteren differentially uitgedrukte genen
- vergelijking van een enkele experimentele voorwaarde versus controle
- Open gegevens (resultaten) in een werkblad managementsoftware (Zie tabel van materialen ).
- Selecteer de drop-down pijl naast de ' soort ' en selecteer " aangepast sorteren " binnen het werkblad met de differentially uitgedrukte genen in de experimentele versus controle voorwaarde.
- Schakelt het onder ' kolom ' omhoog in het venster dat verschijnt en kies om te sorteren op de ' LFC ' kolom. Zorgen ' waarden ' is geselecteerd in de ' sorteren op ' kolom. Selecteer sorteren van ' groot naar klein ' in de ' volgorde ' kolom en klik op " OK ".
Opmerking: Dit zal sorteren de differentially uitgedrukte genen zodat mensen met een verhoogde expressie (positieve LFC) verschijnt boven aan de lijst, terwijl die met verminderde expressie (negatieve LFC) aan de onderkant van de lijst verschijnen zal.
- Vergelijken de meerdere experimentele omstandigheden op één besturingselement als volgt.
- Selecteer de eerste cel in een lege kolom op de experimentele 1 versus controle werkblad bepalen differentieel uitgedrukt genen gevonden in twee experimentele omstandigheden. Typ de volgende formule in de cel:
Opmerking: deze vergelijking is een combinatie van het als, ISFOUT en MATCH functies. (i) de functie vergelijken, MATCH (A1, Experimental2_vs_Control! A:, 0), zoekt de waarde in A1 (de ENSEMBL-ID) in het een kolom (a:) van het werkblad met de naam Experimental2_vs_Control (Experimental2_vs_Control!). De " 0 " aangeeft om te zoeken naar een exacte overeenkomst, en als er geen exacte overeenkomst wordt gevonden, de functie als resultaat een waarde van " 1 ", terwijl als geen overeenkomende waarde wordt gevonden, de functie een fout retourneert " N/A ". (ii) het resultaat van de functie vergelijken wordt vervolgens ingevoerd in de functie IsError, ISERROR (MATCH (A1, Experimental2_vs_Control! A:, 0)), waar, als de input is " 1 " die aangeeft een match werd gevonden, het zal terugkeren " valse ", en als de ingang " N/A " met vermelding van een match werd niet gevonden, het zal terugkeren " ware ". (iii) de " ware " of " valse " resultaat is dan inbreng in de functie als als (ISERROR (MATCH (A1, Experimental2_vs_Control! A:, 0)), " ", " dubbele "), waar, als de ingang " ware " die aangeeft een match werd niet gevonden, wordt de waarde tussen de eerste set aanhalingstekens geretourneerd (" ") die leeg is, en dus de cel leeg. Als de ingang " valse " die aangeeft een match werd gevonden, wordt de waarde tussen de tweede set aanhalingstekens geretourneerd (" dubbele "), en de cel zal zeggen " dupliceren ". - Pers " Enter " of " terug " uit te voeren van de vergelijking. Selecteer de cel met de vergelijking en klik op het vak in de rechterbenedenhoek van de cel. Houd de muis geklikt en slepen het geselecteerde gebied helemaal naar beneden van de kolom tot de laatste ' functie-ID ', de vergelijking naar elke cel in de kolom kopiëren.
- Selecteer " aangepast sorteren " opnieuw, het toevoegen van een tweede niveau van het sorteren door te klikken op de " + " pictogram in de lagere linkerhoek. In het eerste niveau, " sorteren ", onder kolom selecteren " dubbele ", onder sorteren op Selecteer ' waarden ', en onder Order selecteren ' Z tot A '. In het tweede niveau, " vervolgens op ", onder kolom selecteren ' LFC ', onder sorteren op Selecteer ' waarden ', en onder Order selecteren ' groot naar klein ' en selecteer " OK ".
Opmerking: Dit zal de lijst van genen sorteren in 4 groepen op basis van de directionaliteit van expressie wijzigen. Het is belangrijk om te controleren de genen gevonden in beide experimentele omstandigheden om ervoor te zorgen dat de verandering in de expressie in de zelfde richting beide of in tegengestelde richtingen is. - Verwijder alle haakjes uit de gene symbolen kolom voordat u verdergaat of de resultaten niet worden in de databases gevonden zullen. Selecteer de hele kolom met gen symbolen. Selecteer " bewerken " dan " vervangen door " in de drop-down ' bestand ' menu. Type " (*) " in de " zoeken: " balk van het venster vervangen, en laat de " vervangen: " bar leeg. Selecteer ' Alles vervangen ' verwijderen van alle exemplaren van haakjes.
Opmerking: Het * vertegenwoordigt een willekeurig aantal tekens, door het plaatsen van dit teken tussen twee haakjes, het programma wordt gevraagd om te vinden van elke instantie in de gemarkeerde cellen en elk exemplaar van haakjes wordt vervangen door niets, waardoor ze te verwijderen.
- Selecteer de eerste cel in een lege kolom op de experimentele 1 versus controle werkblad bepalen differentieel uitgedrukt genen gevonden in twee experimentele omstandigheden. Typ de volgende formule in de cel:
- vergelijking van een enkele experimentele voorwaarde versus controle
- Vaststellen verrijkt trajecten
- de gene symbolen van de set waarvoor wil bepalen de verrijkte trajecten naar het Klembord kopiëren. Ga naar de ConsensusPathDB 12. Selecteer " Gene instellen analyse " op de zijbalk links in de webpagina, gevolgd door " oververtegenwoordiging analyse ".
- Plakken de lijst van genen in de " een lijst van gene/proteïne-id plakken " vak. Selecteer gene symbool in de " gen/proteïne ID type " vogelhuisje en tikken " doorgaan ". Naast het selectievakje " trajecten zoals gedefinieerd door traject databases " ingesteld onder het traject gebaseerde sectie.
Opmerking: Een aantal opties voor de analyse verschijnt en de lijst met beschikbare databases te zoeken. Het is raadzaam de selecteren alle databases behalve de keggen en Reactome databases zoals ze de meest gevestigde en uitgebreide zijn. De minimale overlapping met de input lijst en p-waarde cutoff-instellingen kan ook worden aangepast op basis van behoeften. Is het raadzaam het verlaten van deze instellingen op de standaard 2 gen minimale overlap en een 0,01 p-waarde cutoff. - Selecteer " vind verrijkt sets " verkrijgen van de lijst van trajecten die genen in de input lijst bevatten.
Opmerking: De uitvoer worden in tabelindeling, met inbegrip van de naam van elk traject gevolgd door " grootte instellen " (met vermelding van het aantal totale genen in het traject), " kandidaten bevatte " (met vermelding van het aantal genen in de input lijst die in dat traject ), evenals de p-waarde en q-waarde (FDR) en de database waarmee de weg werd geïdentificeerd.
- Generatie traject netwerken
- bepalen verrijkt trajecten zoals hierboven beschreven.
- Selecteer alle van de verrijkte trajecten te visualiseren in een traject netwerk door ofwel het selecteren van elke doos naast de namen van de traject moeten worden gevisualiseerd of door te klikken op " alle " onder " Selecteer " in de kolomkop boven de selectie vakken, selecteer vervolgens " Visualiseren van geselecteerde verzamelingen ".
Opmerking: We raden alle trajecten visualiseren als er minder dan 30; Als er groter dan 30 trajecten zijn is het aan te raden de top 30 meest verrijkt trajecten te selecteren (die met het grootste aantal genen uit de input lijst). - Aanpassen de " relatieve overlapping " en " kandidaten gedeeld " filters, door het selecteren van een van deze vakken in het midden boven aan de pagina en invoeren van desirEd procent relatieve overlappen of aantal gedeelde kandidaten worden strengere zodat de meer relevante overlapt binnen het traject netwerken duidelijker en selecteer " van toepassing ".
Opmerking: Wij raden een minimale relatieve overlapping van 0.2, met vermelding van een 20% gene overlapping tussen 2 trajecten om deze te verbinden, en ten minste 2 gedeelde kandidaten. De legenda van de grafiek kan worden gezien door te klikken op de legenda van de grafiek in de linkerbovenhoek van de pagina.
- Bepaling van verrijkte GO voorwaarden
- de gene symbolen van de groep waarvoor men wenst te bepalen van de verrijkte gene ontologieën naar het Klembord kopiëren. Ga naar de ' ga verrijking analyse tool ' in de Gene Ontology Consortium 13. De lijst met gene symbolen plakken in het vak aan de linkerkant van de pagina onder " uw gene IDs hier … "
- Selecteer welke set van GO termen te gebruiken, vermeld onder het vak gen-id's: biologische processen, moleculaire functie of cellulaire component. Kiezen (aanbevolen) ' biologisch proces '. Selecteer ' Danio rerio ' onder de GO voorwaarden vogelhuisje en tikken " indienen ".
Opmerking: Wij raden de cutoff standaard p-waarde van 0.05.
5. Keuring door qRT-PCR
Opmerking: afzonderlijke genen geïdentificeerd met aanzienlijke gen expressie veranderingen in RNASeq dient te worden geverifieerd door gerichte qRT-PCR in repliceren experimenten.
- cDNA synthese
- pak het RNA uit embryo's met behulp van de methode beschreven in punt 3.1. RNA extractie.
- Converteren 1 µg van RNA aan cDNA met behulp van cDNA conversie kit (Zie Tabel van materialen). Combineer dNTPs, RNA en reverse transcriptase enzym. Uitvoeren van de reactie van de thermocycler volgens de fabrikant ' s specificaties.
- Verdund cDNA 1:3 in DEPC-behandeld water. Bewaren bij 4 ° C voor maximaal 1-2 maanden.
- qRT-PCR verificatie
- genen verifiëren door qRT-PCR van RNA sequencing resultaten te selecteren. Het identificeren van genen met hoge vouw wijzigingen in expressie. Bepalen welke van deze genen bevatten ook hoge lees telt, zoals dit blijkt uit overvloedige expressie.
- 10-12 doelen kiezen uit de hoge vouw wijziging, hoge lees tellen lijst van genen. Inleidingen aan het versterken van de doelgenen die zich uitstrekken over ten minste 1 intron-exon grens ontwerpen.
- Het gene of invoeren gerichte regio van het gen qPCR primer ontwerp site 14. Selecteer het " 2 qPCR inleidingen ontwerpen " en prompt de site primer set maakt.
Opmerking: Moet omvatten interne controle primers, zoals β-actine, om te normaliseren vergelijkingen tussen de monsters. De β-actine inleidingen zijn F: 5 ' - TCGAGCTGTCTTCCCATCCA - 3 ' en R: 5 ' - TCACCAACGTAGCTGTCTTTCTG - 3 '. - Combineren de cDNA, voorwaartse primer, omgekeerde primer en polymerase. Uitvoeren van qRT-PCR versterking om te bepalen van de relatieve expressie van genen 15.
- Analyseren van de relatieve mRNA uitdrukking van de genen van belang door relatieve kwantificering bepaling 15.
- Vergelijken de qRT-PCR RNASeq resultaten om ervoor te zorgen dat de directionaliteit van differentiële expressie strookt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sorteren van Differentially uitgedrukte genen:
Om te identificeren differentially uitgedrukte genen in het larvale stadium van zebravis modellen van Alström-syndroom en syndroom van Bardet-Biedl (BBS), we gericht ofwel alms1 of afschriften van de bbs1 door het injecteren van eerder gevalideerd splice-blokkerende Mnd in wild-type zebrafish embryo's16,17. 5 dagen na bevruchting (dpf), twee replicatieonderzoeken van RNA werden gehaald uit elke voorwaarde, evenals de embryo's geïnjecteerd met controle MO, zoals beschreven in punt 3 hierboven. RNA van elk monster werd sequenced tot een diepte van ~ 120 miljoen leest met ~ 107 miljoen leest uitgelijnd aan de zebravis genoom. Tussen 85-90% van het uitgelijnde luidt als volgt toegewezen aan exonic regio's van het genoom.
1.348 totale genen werden aanzienlijk veranderd in het Alström-model en 471 totale genen werden aanzienlijk veranderd in de BBS-model. Gedeelde wijzigingen in genexpressie tussen de modellen of de wijzigingen die uniek zijn voor een van de modellen werden geïdentificeerd als beschreven in punt 4.2. 1084 totale genen werden uniek veranderd in het Alström-model, 612 omhoog-geregeld en 472 down-gereguleerde en 207 genen waren uniek veranderd in het model van de BBS, 176 omhoog-geregeld en 31 down-gereglementeerde (Figuur 2, Tabel S1en S2 tabel). 264 genen bleken te worden aanzienlijk gewijzigd in beide modellen, 73 werden omhoog-geregeld 182 werden naar beneden-geregeld en 9 toonde tegenovergestelde veranderingen in expressie tussen de twee modellen (Figuur 2, Tabel S1en S2 tabel (Zie Aanvullende Tables.xlsx)). De discrepantie cijfers van differentially uitgedrukte genen tussen de twee modellen suggereren dat verschillende stadia in de ontwikkeling mogelijk van invloed op bbs1 en alms1 .
Interessant is dat suggereren het grote aantal differentially uitgedrukte genen in het Alström-model dat alms1 speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling in de fase 5 dpf terwijl het kleinere aantal gene wijzigingen in het objectmodel van BBS dat suggereren de rol van bbs1 misschien niet zo prominent op dit tijdstip. Eerdere analyses van de transcriptomic op 2 dpf voorgesteld daarentegen de omgekeerde18.
Bepaling van verrijkte trajecten en Gene Ontologies in Zebrafish Model van Alström syndroom:
Om het duidelijker het ophelderen van de moleculaire Profiel van het model van de Alström, werden de trajecten en gene ontologieën verrijkt in de differentially uitgedrukte genen geïdentificeerd. Verrijkte trajecten werden bepaald door het opvragen van de ConsensusPathDB en verrijkte Gene Ontologies werden bepaald door de Gene Ontology Consortium opvragen, zoals beschreven in secties 4.3-4.5. De meest hoogverrijkt onder de genen omhoog-geregeld in de Alström model, door aantal genen of vouw de verrijking, werden geanalyseerd. 31 totale trajecten werden omhoog-geregeld in het Alström-model. Afgezien van de globale groep "metabolisme", werden de sterkst getroffen trajecten de aangeboren en adaptieve immuunsysteem met 32 en 20 genen, respectievelijk (figuur 3A). Stroomafwaarts β-cel receptor signalering gebeurtenissen waren ook verrijkt suggereren immuunsysteem up-verordening in dit model. Verschillende signaalroutes waren ook verrijkt onder de omhoog-geregeld genen in het Alström model, consistent met de vereniging van Alström syndroom met primaire cilium dysfunctie, een signalering belangrijk centrum van de cel (figuur 3A). Daarnaast waren de drie trajecten geassocieerd met insuline secretie omhoog-geregeld: vetzuren gebonden aan GPR40, vrije vetzuren en acetylcholine (figuur 3A). Dit is in overeenstemming met de zeer penetrant insuline resistentie en type 2 diabetes fenotypes bij Alström patiënten. Zes GO voorwaarden werden verrijkt onder de omhoog-geregeld genen in het Alström-model, met inbegrip van de erytrocyt differentiatie, erytrocyt homeostase, myeloïde cel homeostase en homeostatische processen (figuur 3B). Om te beoordelen van de onderlinge verbondenheid van de trajecten omhoog-geregeld, een traject-netwerk van het Alström model omhoog-geregeld trajecten werd gegenereerd (Figuur 3 c). Het belangrijkste knooppunt van onderling verbonden trajecten bleek een hoge mate van connectiviteit tussen de trajecten die zijn gekoppeld aan het immuunsysteem en signalering, terwijl een van de kleine knooppunten geopenbaard connectiviteit tussen de drie insuline regelgevende trajecten. Tot slot, wij gecontroleerd de gen expressie veranderingen geïdentificeerd door RNASeq door beoordeling van 5 gene streefcijfers, die beide up - of down-geregeld in het Alström-model waren. De directionaliteit van gen expressie veranderingen door qRT-PCR in aste gck, bmb, btr26, en ifi35, ten opzichte van controle, gerecapituleerd die nageleefd door RNASeq (figuur 4A-B).
Figuur 1. Representatieve output van gen expressie analyse na RNASeq door de kern of de leverancier verstrekte. Functie-ID geeft de id-nummer van de ENSEMBL-gen. Lees graven geeft het aantal leest in control of experimentele monsters die aan dat gen in het genoom zijn uitgelijnd. Verandering van de vouw en het logboek van de verandering van de vouw geven de mate van verandering in de expressie van het gen tussen de experimentele en controle monster in hetzij de positieve (toename) in expressie in de richting van de experimentele monster, of negatieve (afname) in expressie in de richting van de experimentele monster. De p-waarde en de FDR zijn statistische tests om te bepalen van de betekenis van de resultaten; voor RNASeq-experimenten, is een strengere FDR waarde van 0.05 gebruikt om te bepalen van betekenis. Gene_symbol geeft de NCBI gen-ID en gene_name vindt u de volledige naam van het gen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Differentially uitgedrukte genen in de BBS en Alström modellen. Aantal genen omhoog-geregeld (rood) of naar beneden-geregeld (geel) in alms1 MO (groen) geïnjecteerd embryo's, bbs1 MO (oranje) geïnjecteerd embryo's of beide in vergelijking met standaardbesturingselement MO geïnjecteerd embryo's. * Geeft aantal genen in beide veranderd maar hebben tegenover de wijzigingen in de expressie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figure 3. Upregulated trajecten en verrijkte GO termen in het Alström-model. (A) Upregulated trajecten door aantal genen. (B) Upregulated gaan termen door vouwen verrijking. (C) traject connectiviteit van upregulated trajecten in het Alström-model. Traject-verbindingen bepaald door een minimum van 20% gedeeld genen tussen trajecten en ten minste 2 genen elkaar overlappen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. qRT-PCR validatie van gen expressie veranderingen. Wijzigingen in genexpressie geïdentificeerd door RNASeq werden bevestigd in leeftijd - en behandeling-matched 5 dpf embryo's, geïnjecteerd met besturingselement, alms1 of bbs1 MO. (A) deelverzameling van genen tonen van mRNA uitdrukking van genen met qRT-PCR. (B) gelijkwaardige gegevens tonen lezen telt uit de RNASeq dataset. Alle gegevens zijn ten opzichte van controle en qRT-PCR werden genormaliseerd naar actine. Aste, asteroïde homolog 1; gck, glucokinase; BMB, brambleberry; btr26, bloeddorstige-gerelateerde gen familie, lid 26; ifi35, interferon-geïnduceerde proteïne 35. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De in dit protocol beschreven aanpak biedt een relatief snelle en kostenefficiënte strategie voor de analyse van de transcriptome-niveau van de hele dieren of bepaalde gesorteerde cel populaties. De zebravis biedt een voordelige model voor dit soort studie vanwege het gemak en de snelheid bij het genereren van grote hoeveelheden van het starten van materiaal, het gemak van uitvoering van genetische of milieu experimentele omstandigheden, en de beschikbaarheid van een groot spectrum van transgene verslaggever lijnen waardoor voor isolatie van celtype specifieke en weefsel-specifieke populaties.
Terwijl hier niet gedetailleerd, kan deze methode gemakkelijk weefselsecties verzameld van jonge of volwassen vis als alternatief voor FACs en collectie. Wij ook ontwikkeld een basisanalyse follow-up strategie die alleen op het gebruik van elementaire werkblad opdrachten en reeds bestaande traject en GO databases berust. Het grote voordeel van deze aanpak is het gemak van toegankelijkheid zonder op hoog niveau expertise in Computerbeheer programmering of database. Als zodanig is deze strategie geldt voor onderzoekers van alle achtergronden voor informatieve analyse van grote gen expressie datasets.
Onze aanpak combineert basic zebrafish de embryo en de larvale cultuur met RNA extractie standaardtechnieken gevolgd door RNASeq. RNASeq vereist een grote hoeveelheid hoogwaardige grondstof; Sommige verkopers vereisen 2 µg totaal RNA. Dientengevolge, is zeldzame/zeldzaam celtypes of individuele embryo analyse buiten bereik. Echter, de afgelopen vijf jaar hebben aangetoond dat dramatische verbeteringen in lage-rendement analyses, datasets gegenereerd op basis van kleinere monsters, en lagere hoeveelheden van RNA, en we verwachten dat deze toepassingen in de nabije toekomst mogelijk zal zijn. Om ervoor te zorgen nauwkeurige resultaten, de toevoeging van zowel technische replicaten, dat wil zeggen, het genereren van twee RNA bibliotheken uit één sample, en biologische replicaten, dat wil zeggen, verzamelen embryo's uit meerdere verparingen, is ideaal. Deze stappen kunt de onderzoekers aan besturingselement voor variatie in monsters en sequenties geïdentificeerd in alle monsters zijn meer kans om echte resultaten, met de verminderde kans op mist een lager resultaat lezen-graaf.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.) en T32DK098107 (T.L.H. en J.E.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial Reagents | |||
| TriZol | Thermo Scientific | 15596026 | lysis reagent |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | dissociation buffer 1 |
| FACSMax | Genlantis | T200100 | dissociation buffer 2 |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| FirstStrand cDNA conversion | Thermo Scientific | K1621 | cDNA conversion kit |
| 2X SYBR Green Master Mix | Roche | 4707516001 | qRT-PCR Master Mix |
| FACS buffer | Fisher Scientific | 50-105-9042 | |
| chloroform | Sigma Aldrich | 288306 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Strains | |||
| Tuebingen | ZIRC | ZL57 | |
| ins2a:mCherry | ZIRC | ZL1483 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 40 micron cell strainer | Sigma | CLS431750 | |
| FACS tube | BD Falcon | 352063 | |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Inverted Microscope | Zeiss | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Illumina HiSeq | Illumina | ||
| LightCycler 480 | Roche | ||
| Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set | Aquaneering | ZHCT100 | |
| FACS tube 5 mL polypropylene tube | BD Falcon | 352063 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | ||
| Consensus Path DB | http://cpdb.molgen.mpg.de/ | ||
| GO Enrichment Analysis | http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis |
References
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
- Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , 4th ed, Academic Press. (2017).
- Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. The Zebrafish: Genetics, Genomics, and Transcriptomics. , 4th ed, Academic Press. (2016).
- Detrich, H. W. The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , 3rd ed, Academic Press. (2011).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J Vis Exp. (109), (2016).
- MPIMG. ConsenusPathDB. , Available from: http://cpdb.molgen.mpg.de/ (2017).
- Consortium, G. O. Enrichment analysis Tool. , Available from: http://www.geneontology.org/ (2017).
- IDT. IDT Primerquest Tool. , Available from: https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index (2017).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M.
- Leitch, C. C., Lodh, S., Prieto-Echague, V., Badano, J. L., Zaghloul, N. A. Basal body proteins regulate Notch signaling through endosomal trafficking. J Cell Sci. 127 (Pt 11), 2407-2419 (2014).
- Lodh, S., Hostelley, T. L., Leitch, C. C., O'Hare, E. A., Zaghloul, N. A. Differential effects on beta-cell mass by disruption of Bardet-Biedl syndrome or Alstrom syndrome genes. Hum Mol Genet. 25 (1), 57-68 (2016).
- Hostelley, T. L., Lodh, S., Zaghloul, N. A. Whole organism transcriptome analysis of zebrafish models of Bardet-Biedl Syndrome and Alstrom Syndrome provides mechanistic insight into shared and divergent phenotypes. BMC Genomics. 17, 318 (2016).
