Summary
Denne protokol præsenterer en tilgang til hele transkriptom analyse fra zebrafisk embryoner, larver, eller sorteret celler. Vi omfatter isolering af RNA, sti analyse af RNASeq data og qRT-PCR-baserede validering af gen expression ændringer.
Abstract
Analyse af globale gen expression ændringer er et værdifuldt redskab til at identificere nye veje underliggende observerede fænotyper. For zebrafisk er en fremragende model for hurtig vurdering af hele transkriptom fra hele dyr eller individuelle cellepopulationer på grund af lethed af isolering af RNA fra et stort antal dyr. Her præsenteres en protokol for globale gen expression analyse i zebrafisk embryoner ved hjælp af RNA sekventering (RNASeq). Vi beskriver forberedelse af RNA fra hele embryoner eller cellepopulationer fremstillet ved hjælp af cellen sortering i transgene dyr. Vi beskriver også en tilgang til analyse af RNASeq data til at identificere beriget veje og gen ontologi (gå) vilkår i globale gen expression datasæt. Endelig, vi leverer en protokol for validering af gen expression ændringer ved hjælp af kvantitative reverse transkriptase PCR (qRT-PCR). Disse protokoller kan bruges til komparative analyser af kontrol og eksperimentelle sæt af zebrafisk for at identificere nye gen expression ændringer og give molekylære indsigt fænotyper af interesse.
Introduction
Sammenlignende analyse af globale genekspression er et værdifuldt redskab til at identificere nye gener bidrager til observerede fænotyper. Sådanne analyser typisk stole på kvantitativ vurdering af udskrift overflod i forhold mellem eksperimentelle og kontrolprøver. Målrettede tiltag, såsom qRT-PCR er forholdsvis hurtig og nøjagtig undersøgelse af enkelt gen expression ændringer. RNA sekventering (RNASeq) tilbyder en bred, hypotese-fri tilgang for at identificere væsentlige ændringer i genekspression mellem prøver, gør det nu standard for sådanne undersøgelser på tværs af eksperimentelle systemer.
Zebrafisk er dukket op som en fremtrædende model på tværs af mange sygdomsområder. Oprindeligt udviklet til deres nytte i undersøgelser, udviklingsmæssige biologi, på grund af deres høje frugtbarhed og relativt lave udgifter til vedligeholdelse, eksperimenterende brug af zebrafisk har udviklet sig til også for at omfatte en bred vifte af fænotyper fra embryonale voksen faser såvel som en bred vifte af molekylære undersøgelser,1,2,3. Ja, disse fordele gør molekylære Mekanistiske undersøgelser hurtige og omkostningseffektive på grund af lethed, hvormed erhverve store mængder af materiale kombineret med lethed af både genetiske og miljømæssige manipulation på alle stadier af livet. Desuden zebrafisk embryoner og larver gennemsigtige karakter gør den ideel til generering af celle - og tissue-specifikke transgene reporter linjer giver i vivo visualisering af diskrete celle populationer4. Udnyttelse af sådanne linjer tillader global gen expression analyse i særlige isolerede celletyper baseret på reporter gen expression.
Her præsenterer vi en omfattende protokol for globale gen expression analyse ved hjælp af RNASeq efter kultur af zebrafisk embryoner. Genetiske eksperimentelle manipulationer, herunder morpholino (MO)-baseret forbigående gen knockdown eller CRISPR-medieret genom-redigering, er blevet præsenteret andetsteds5,6,7. Vi har derfor fokusere på en detaljeret protokol til isolering af RNA fra hele embryoner eller sorteret transgene reporter-udtrykker celler efterfulgt af simple beregningsmæssige analyse af RNASeq resultater ved hjælp af pathway værktøjer og gen ontologi (GO) vilkår. Endelig har vi medtaget en strategi for validering af gen expression ændringer af kvantitative reverse transkriptase PCR (qRT-PCR). Disse protokoller er gældende for zebrafisk embryoner udsat for en lang række eksperimentelle betingelser, herunder sammenligning af genetiske mutanter eller miljømæssige forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle animalske protokoller skitseret nedenfor er i overensstemmelse med og godkendt af University of Maryland institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC).
1. embryo forberedelse
- generering embryoner gennem naturlig parring
- kultur embryoner til 3 måneder i alder, reproduktive modenhed 5 , 8 .
- Adskille voksne mandlige og kvindelige fisk fra den ønskede stamme til delt parring tanke om aftenen før embryo samling, og Tilføj 2 hanner og 3 tæver til hver tank.
Bemærk: Brug af transgene insulin2a:mCherry fluorescerende reporter stamme tilladt analyse af pancreas β-celler. - Overførsel fisk til parring tank med frisk system vand og fjerne rabatten når lysene tændes den følgende morgen.
- Tillader fisk at parre naturligt indtil embryoner er observeret i bunden tank. Indsamle embryoner i 30 min. mellemrum, indtil den ønskede mængde er indsamlet. Butikken hver indsamlet tidspunkt i separate petriskåle i embryo medier på 28,5 ° C.
- Udføre mikroinjektion af genetisk materiale eller placering i eksperimentel dyrkningsmedier 6, hvis det ønskes, og kultur embryoner i frisk Hank ' s embryo medium 8 i 10 cm petriskåle ved 28,5 ° C.
Bemærk: gen expression analyse i morpholino (MO) injiceres eller mutant dyr, opmærksom på, at hver manipulation kan have utilsigtede virkninger på genekspression. Mutanter kan udstille genetiske kompensation for transskription, der ikke er observeret af MO-baserede gen målretning 9.
- Fase embryoner
- kultur embryoner i grupper af 50 – 75 embryoner pr. 10 cm petriskål at fremme konsekvent udviklingsmæssige timing af alle embryoner.
- Overvåge udviklingsmæssige morfologi ved hjælp af dissekere mikroskop på blastomer, epiboly og somite faser for at sikre udviklingsmæssige progression 10.
Bemærk: Fjern eventuelle døende eller misdannede fostre for at forhindre udviklingsmæssige forsinkelse i fadet. - Adskille de embryoner, der er baseret på den udviklingsmæssige alder. Måle embryo alder ved hjælp af somite nummer efter segmentering (efter gastrulation 10,33 h post befrugtning (hpf)) indtil ca 24 hpf. Stadium embryoner og larver bruger kroppens samlede længde efter 24 hpf.
Bemærk: Somites er den chevron-formet mesodermale væv til stede på den dorsale del af embryoet. - Læg de sorterede embryoner i en 28,5 ° C inkubator og tillade udviklingen at gå videre til den ønskede alder.
2. Encellede Dissociation: Hele fosteret og sorteret cellepopulationer
- hele embryo dissociation
- Euthanize zebrafisk embryoner på det ønskede tidspunkt ved at placere petriskålen i isbad i 5-15 min, indtil ingen bevægelse er observeret .
- Overføre en pulje af 20 embryoner til et mærket 1,5 mL microcentrifuge rør. Fjern eventuelle overskydende embryoner medier fra microcentrifuge tube.
- Tilføje 200 µL lysis reagens (Se Tabel af materialer) til rør indeholdende embryoner. Homogeniseres embryoner i lysis reagens mekanisk ved hjælp af en pistil. Tilføje 800 µL lysis reagens for at bringe den samlede mængde til 1 mL. Opbevares ved-80 ° C indtil RNA udvinding.
- Flow-sorteret celle isolation 11
- overførsel af embryoner fra petriskålen ind i en 1,5 mL microcentrifuge rør og fjerne så meget embryo medium som muligt.
Bemærk: Afhængigt af embryo alder, mekanisk dissociation kan også være påkrævet på dette trin. Med embryoner > 48 hpf, anbefaler vi brug af en pistil at forstyrre embryo integritet, før du fortsætter. - Ruger embryoner med 1 mL af dissociation buffer 1 (Se Tabel af materialer) i 1,5 mL microcentrifuge tube. Inkuber i 15-30 min. ved stuetemperatur. Hakkede løsningen af forsigtigt pipettering op og ned ved hjælp af en P1000 tip for at blande hver 3-4 min. under trinnet inkubation. GØR ikke VORTEX.
- Indsamle embryoner ved centrifugering i 3 min. ved 300 x g og Fjern supernatanten. Genopslæmmes embryoner i 1 mL dissociation buffer 2 (Se Tabel af materialer). Inkuber i 15-30 min. ved stuetemperatur med regelmæssige afpipetteres ændring.
- Vurdere fordøjelsen ved at fortynde 1-2 µL af suspension i fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) buffer under mikroskop.
Bemærk: Komplet fordøjelsen opstod, når de undersøgte alikvot viser enkelt celler med minimal celle klynger og stykker af forskning i embryonale væv. - Indsamle cellerne ved centrifugering ved 300 x g i 5 min. Fjern supernatanten. Cellerne genopslæmmes i 1 mL FACS buffer og tyngdekraften filter gennem en 40 µm celle si at fjerne ufordøjet væv fra prøven.
- Tælle celler ved hjælp af en hemocytometer og fortyndes med FACS buffer til ca 1 x 10 6 celler/mL i en FACS tube.
Bemærk: For celletyper med et relativt lille antal pr. embryo (mindre end 5% af total), såsom pancreas β-celler, bruge et minimum af 1.000 fase-matchede embryoner. - Give FACS sortering facilitet med FACS rør indeholdende 1 mL af celle suspension prøver samt FACS tube indeholder kun lysis reagens eller FACS Buffer. Gate FACS flow-sorteringsanlæg for at indsamle kun enkelt celler, der udtrykker den fluorescerende reporter.
- Udføre FACS flow-sortering indtil den ønskede celle numre er blevet indsamlet.
Bemærk: For at udføre RNASeq, der er en total RNA krævede minimum. Vi har konstateret, at 3.000-5.000 celler er tilstrækkelig til at isolere høj kvalitet, høj koncentration RNA. - Gemme de indsamlede celler på is og gå straks til RNA forberedelse.
- overførsel af embryoner fra petriskålen ind i en 1,5 mL microcentrifuge rør og fjerne så meget embryo medium som muligt.
3. RNA forberedelse
- Uddrag RNA
- inkuberes indsamlede prøven (fra trin 2) med lysis reagens i 5 min ved stuetemperatur.
- Tilføj 0,2 mL chloroform til hver 1,0 mL lysis reagens anvendes og invertere rørene i hånden for 15 s. Incubate for 2-3 min. ved stuetemperatur. Centrifugeres prøver på 12.000 x g i 15 min. ved 4 ° C.
- Overføre den adskilte, vandig fase til en frisk tube og der tilsættes 0,5 mL isopropanol for hver 1,0 mL af lysis reagens, der anvendes. Der inkuberes i 10 min. ved stuetemperatur. Centrifugeres prøver på 12.000 x g i 10 min. ved 4 ° C.
- Vask med 75% ethanol og centrifugeres prøver på 7.500 x g i 5 min. ved 4 ° C. Fjern supernatanten helt og lad lufttørre ved stuetemperatur. Genopslæmmes RNA i 15-30 µL diethyletheren pyrocarbonate (DEPC)-behandlet vand.
- Rense høj kvalitet RNA
- kombinere RNA suspension med 1/10 bind 3 M natriumacetat (pH 5,5) og 1 rumfang af isopropanol. Inkuber i 20 min. ved stuetemperatur og centrifugeres prøver på 12.500 x g i 10 minutter ved 4 ° C.
- Vaske pellet med iskold 70% ethanol i DEPC-behandlet vand og centrifugeres prøver på 10.000 x g i 5 min. ved 4 ° C. Gentag trinnet vask engang.
- Fjern supernatanten og lad tørre ved stuetemperatur. Genopslæmmes i DEPC-behandlet vand.
- Assay ekstraheret RNA for koncentration (ng/µL) og renhed (260/230 ratio) ved hjælp af en absorption spektrometer. Sikre, at værdien 260/230 er ~ 2.0, før du fortsætter med RNASeq. Opbevares ved-80 ° C indtil ose (op til 6 måneder).
- Send RNA prøver til en kreditor eller kerne til RNASeq og genekspression ændre analyse baseret på kvantificering af sekventering læser. De resultater, der returneres fra kreditoren leveres typisk som en liste over gener udstiller en betydelig fold-ændring i afskriften læser mellem prøver.
Bemærk: En kolonne kan bruges, hvis ovenstående metode giver dårlig kvalitet RNA. Mængde, koncentration og RNA integritet nummer (RIN) RNA prøver bør bekræftes med kreditor eller kerne. Kreditor eller kerne vil også typisk vurdere RIN.
4. Pathway og GO sigt analyse
NOTE: Se figur 1 for repræsentative output af gen expression analyse efter RNASeq fastsat af den kerne eller kreditor.
- Sortering varierende udtrykte gener
- sammenligne en enkelt eksperimentelle betingelse versus kontrol
- Open data (resultater) i et regneark management software (Se tabel af materialer ).
- Vælg den rullepilen ud for den ' form ' knappen og vælg " brugerdefineret sorteringog " inden for det regneark, der indeholder de varierende udtrykte gener i den eksperimentelle versus kontrol tilstand.
- Vælg boksen under ' kolonne ' i det vindue, der popper op og vælger at sortere efter den ' LFC ' kolonne. Sikre ' værdier ' vælges i den ' form på ' kolonne. Vælg sortere fra ' største til mindste ' i den ' orden ' kolonne, og klik " OK ".
Bemærk: Dette vil sortere de varierende udtrykte gener så dem med øget udtryk (positiv LFC) vises øverst på listen, mens dem med nedsat udtryk (negative LFC) vises i bunden af listen.
- Sammenligne de flere eksperimentelle betingelser til en enkelt kontrol som følger.
- Vælg den første celle i en tom kolonne på den eksperimentelle 1 versus kontrol regneark til at bestemme varierende udtrykte gener fundet i to forsøgsbetingelser. Skriv følgende formel i cellen:
NOTE: denne ligning er en kombination af FUNKTIONERNE hvis, og MATCH funktioner. (i) funktionen MATCH, MATCH (A1, Experimental2_vs_Control! Kolonnebogstavet, 0), søges der efter værdien i A1 (ENSEMBL-ID) i kolonnen A (kolonnebogstavet) i regnearket ved navn Experimental2_vs_Control (Experimental2_vs_Control!). Den " 0 " angiver for at lede efter en eksakt match, og hvis der findes en præcis værdi, funktionen returnerer en værdi af " 1 ", mens hvis arkivet ikke bliver fundet, funktionen returnerer en fejl " N/A ". (ii) et resultat af funktionen Sammenlign er derefter input til funktionen IsError, ISERROR (MATCH (A1, Experimental2_vs_Control! Kolonnebogstavet, 0)), hvor, hvis input er " 1 " med angivelse af en kamp blev fundet, det vil vende tilbage " falske ", og hvis input er " N/A " med angivelse af en kamp ikke blev fundet, det vil vende tilbage " sande ". (iii) den " sande " eller " falske " resultatet er derefter input til funktionen hvis hvis (ISERROR (MATCH (A1, Experimental2_vs_Control! Kolonnebogstavet, 0)), " ", " duplikere "), hvor, hvis input er " sande " med angivelse af en kamp blev ikke fundet, det vil returnere værdien i mellem det første sæt anførselstegn (" ") som er tomme, og derfor cellen vil være tom. Hvis input er " falsk " der angiver en kamp blev fundet, det vil returnere værdien i mellem det andet sæt anførselstegn (" dubletter "), og cellen vil sige " duplikere ". - Tryk " Enter " eller " returnere " at køre ligningen. Marker den celle, der indeholder ligningen og klik på boksen i nederste højre hjørne af cellen. Hold musen klikkede og træk det valgte område hele vejen ned i kolonnen indtil sidst ' funktions-ID ', kopiere ligningen i hver celle i kolonnen.
- Vælg " brugerdefineret sorteringog " igen, tilføje et andet niveau af sortering ved at klikke på den " + "-ikonet i nederste venstre hjørne. I det første niveau, " sortere efter ", under kolonnen Vælg " duplikere ", under form på Vælg ' værdier ', og under rækkefølge Vælg ' Z til A '. I det andet niveau, " derefter af ", under kolonnen Vælg ' LFC ', under Sorter på Vælg ' værdier ', og under rækkefølge Vælg ' største til mindste ' og marker " OK ".
Bemærk: Dette vil sortere listen over gener i 4 grupper baseret på tekstretning udtryk ændring. Det er vigtigt at kontrollere de gener, der findes i både eksperimentelle betingelser til at sikre, at ændringen i udtrykket er i den samme retning i både eller i modsatte retninger. - Fjerne alle parenteser fra kolonnen gen symboler før proceduren eller resultaterne ikke vil findes i databaserne. Vælge hele kolonnen, der indeholder genet symboler. Vælg " redigere " derefter " erstatte " i drop-down ' fil ' menuen. Type " (*) " i den " finde hvad: " bar af Erstat-vindue, og lad den " erstattes af: " bar tom. Vælg ' erstatte alle ' til at fjerne alle forekomster af parenteser.
Bemærk: Den * repræsenterer et vilkårligt antal tegn, ved at placere denne karakter mellem to parenteser programmet bedt om at finde eventuelle forekomst i de markerede celler og enhver forekomst af parentes vil blive erstattet med intet og dermed fjerne dem.
- Vælg den første celle i en tom kolonne på den eksperimentelle 1 versus kontrol regneark til at bestemme varierende udtrykte gener fundet i to forsøgsbetingelser. Skriv følgende formel i cellen:
- sammenligne en enkelt eksperimentelle betingelse versus kontrol
- Bestemmer beriget veje
- kopi gen symboler sæt til som man ønsker at bestemme den berigede veje til Udklipsholder. Gå til ConsensusPathDB 12. Vælg " gen sæt analyse " på venstre sidebjælke af websiden, efterfulgt af " overrepræsentation analyse ".
- Indsæt liste over gener i den " indsætte en liste over gen/protein id'er " boks. Vælg gen symbol i den " gen/protein id type " boksen og klik " Fortsæt ". Marker feltet ud for " veje som defineret af pathway databaser " under vej-baserede indstiller afsnit.
Bemærk: En række muligheder for analyse vises herunder listen over tilgængelige databaser til at søge. Vi anbefaler at vælge alle databaser undtagen Kegg og Reactome databaser som de er den mest etablerede og omfattende. Den mindste overlapper input liste og p-værdi cutoff indstillinger kan også justeres baseret på behov. Vi anbefaler forlader disse indstillinger på standard 2 gen minimum overlapning og en 0,01 p-værdi cutoff. - Vælg " finde beriget sæt " at få listen over veje indeholdende gener på listen input.
Bemærk: Output vil være i tabelformat, herunder navnet på hver pathway, efterfulgt af " indstille størrelsen af " (der angiver antallet af samlede gener i pathway), " kandidater indeholdt " (med angivelse af antallet af gener på listen input, der er i denne vej ), p-værdi og q-værdien (FDR) samt den database, hvorfra vejen blev identificeret.
- Generation af pathway netværk
- bestemme beriget veje som beskrevet ovenfor.
- Vælg alle de berigede veje til at visualisere i et pathway netværk ved enten at vælge hver boks ud for vej navnene til visualiseres eller ved at klikke på " alle " under " skal du vælge " i kolonneoverskriften ovenfor markeringsbokse, vælg derefter " Visualisere markerede sæt ".
Bemærk: Vi anbefaler at visualisere alle veje, hvis der er mindre end 30; Hvis der er større end 30 veje anbefaler vi at vælge de top 30 mest beriget veje (dem, der indeholder det største antal gener fra listen input). - Juster den " relative overlapning " og " delte kandidater " filtre, ved at vælge enten boks i midten øverst på siden og indtaste desirEd procent relative overlapper eller antal delte kandidater til at være mere stringent for at gøre det mere relevant overlapninger inden for de pathway netværk klarere, og vælg " anvender ".
Bemærk: Vi anbefaler et minimum relative overlapning af 0,2, der angiver en 20% gen overlapning mellem 2 veje til at forbinde dem, og et minimum af 2 delt kandidater. Graf legenden kan ses ved at klikke på grafen legende i det øverste venstre hjørne af siden.
- Bestemmelse af beriget GO vilkår
- Kopier genet symboler af den gruppe, som man ønsker at bestemme beriget gen ontologier til Udklipsholder. Gå til den ' GO berigelse analyse værktøj ' i gen ontologi konsortium 13. Indsæt liste over gen symboler i boksen i venstre side af siden under " din gen id'er her … "
- Vælg hvilke sæt af GO udtryk at bruge, vises nedenunder boksen gen-id'er: biologisk proces, molekylære funktion eller cellulære komponent. Vælg (anbefalede) ' biologiske proces '. Vælg ' Danio rerio ' nedenunder farten vilkår boksen og klikke på " Send ".
Bemærk: Vi anbefaler at bruge standard p-værdi cutoff på 0,05.
5. Verifikation af qRT-PCR
NOTE: enkelte gener identificeret med betydelig gene expression ændringer i RNASeq bør kontrolleres ved målrettet qRT-PCR i Repliker eksperimenter.
- cDNA syntese
- uddrag af RNA fra embryoner ved hjælp af metoden beskrevet i afsnit 3.1. RNA udvinding.
- Konvertere 1 µg af RNA til cDNA ved hjælp af cDNA konvertering kit (Se Tabel af materialer). Kombinere RNA, dNTP'er og reverse transkriptase enzym. Udføre thermocycler reaktion ifølge producenten ' s specifikationer.
- Fortyndes cDNA 1:3 i DEPC-behandlet vand. Opbevares ved 4 ° C i op til 1-2 måneder.
- qRT-PCR kontrol
- Vælg gener at kontrollere af qRT-PCR fra RNA sekventering resultater. Identificere gener med høj fold ændringer i udtryk. Afgøre, hvilke af disse gener også indeholde høje Læs tæller, som angiver rigelige udtryk.
- Vælg 10-12 mål fra den høje fold ændring, høje Læs tæller liste over gener. Design primere til at forstærke de mål gener, der strækker sig over mindst 1 intron-exon grænse.
- Indtast gen eller målrettede region af genet i qPCR primer design site 14. Vælg den " design 2 qPCR primere " og bede den arbejdsplads hen til oprette primer sæt.
Bemærk: Sørg for at medtage intern kontrol primere, som β-actin, for at normalisere sammenligninger mellem prøver. Β-actin primere er F: 5 ' - TCGAGCTGTCTTCCCATCCA - 3 ' og R: 5 ' - TCACCAACGTAGCTGTCTTTCTG - 3 '. - Kombinerer cDNA, fremad primer, reverse primer og polymerase. Udføre qRT-PCR-amplifikation for at bestemme de relative udtryk af gener 15.
- Analysere relative mRNA udtrykket af gener af interesse ved relative kvantificering bestemmelse 15.
- Sammenligne qRT-PCR RNASeq resultater at sikre, at retningen af differential udtryk er konsekvent.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sortering af varierende udtrykte gener:
For at identificere varierende udtrykte gener i zebrafisk modeller af Alström syndrom og Bardet-Biedl syndrom (BBS) larve fase, målrettet vi enten alms1 eller bbs1 udskrifter ved at indsprøjte tidligere valideret splice-blokerende MOs i Wild-type zebrafisk embryoner16,17. På 5 dage post befrugtning (dpf), to replikater af RNA blev udvundet fra hver tilstand samt embryoner injiceres med kontrol MO, som beskrevet i afsnit 3 ovenfor. RNA fra hver prøve blev sekventeret til en dybde af ~ 120 millioner læser med ~ 107 millioner læser justeret til zebrafisk genom. Mellem 85-90% af den justerede læser tilknyttet exonic regioner i genomet.
1.348 samlede gener var betydeligt ændret i modellens Alström og 471 samlede gener var betydeligt ændret i BBS model. Fælles ændringer i genekspression mellem modeller eller ændringer, der er unikke for en af modellerne blev identificeret som beskrevet i afsnit 4.2. 1.084 samlede gener var entydigt ændret i modellens Alström, 612 op-regulerede og 472 nedreguleret, og 207 gener var entydigt ændret i BBS model, 176 op-regulerede og 31 nedreguleret (figur 2, Tabel S1og Tabel S2). 264 gener fandtes at være væsentligt ændret i begge modeller, 73 blev op-regulerede og 182 var nedreguleret, og 9 viste overfor ændringer i udtryk mellem de to modeller (figur 2, Tabel S1og Tabel S2 (Se Supplerende Tables.xlsx)). De afvigende numre af varierende udtrykte gener mellem de to modeller tyder på, at bbs1 og alms1 kan påvirke forskellige stadier i udviklingen.
Interessant, tyder det store antal af varierende udtrykte gener i modellens Alström på, at alms1 spiller en vigtig rolle i udviklingen på stadiet 5 dpf mens det mindre antal gen ændringer i BBS-modellen tyder på, at rollen som bbs1 kan ikke være så fremtrædende på dette tidspunkt. Derimod foreslog tidligere transkriptom analyser på 2 dpf den omvendte18.
Bestemmelse af beriget veje og gen ontologier i zebrafisk Model af Alström syndrom:
For at belyse mere klart den molekylære profil af Alström modellen, blev veje og gen ontologier beriget med de varierende udtrykte gener identificeret. Beriget veje blev bestemt ved at forespørge ConsensusPathDB og beriget gen ontologier blev bestemt ved at forespørge gen ontologi konsortium, som beskrevet i afsnit 4.3-4,5. Den mest højtberiget blandt de gener op-reguleret i Alström model, af antallet af gener eller fold berigelse, blev analyseret. 31 samlede veje blev reguleret op i modellens Alström. Bortset fra den brede gruppe af "stofskifte", den mest berørte veje var den medfødte og adaptive immunsystem med 32-20 gener, henholdsvis (figur 3A). Downstream β-celle receptoren signalering begivenheder blev også beriget tyder på immunsystemet op-forordningen i denne model. Flere signaling veje blev også beriget blandt de op-regulerede gener i modellens Alström overensstemmelse med sammenslutningen af Alström syndrom med primære cilium dysfunktion, en større signaling midten af cellen (figur 3A). Derudover tre veje tilknyttet insulinsekretion blev op-regulerede: fedtsyrer bundet til GPR40, frie fedtsyrer og acetylcholin (figur 3A). Dette er i overensstemmelse med stærkt penetrant insulin resistens og type 2 diabetes fænotyper i Alström patienter. Seks GO vilkår blev beriget blandt de op-regulerede gener i den Alström model, herunder erytrocyt differentiering, erytrocyt homøostase, myeloide celler homøostase og homeostatiske processer (figur 3B). For at vurdere samspillet mellem den op-regulerede veje, genereret et pathway netværk af Alström model op-regulerede veje blev (figur 3 c). Den store knude af sammenkoblede veje viste en høj grad af tilslutning blandt veje forbundet med immunsystemet og signalering, mens en af de mindre noder afsløret forbindelsen mellem de tre insulin regulerende veje. Endelig har vi bekræftet gen udtryk ændringerne identificeret af RNASeq ved vurdering af 5 gen mål, som var enten op - eller nedreguleret i Alström modellen. Retning for indtastning af gen expression ændringer af qRT-PCR i aste, gck, bmb, btr26, og ifi35, i forhold til kontrol, sammenfattet der observeret af RNASeq (figur 4A-B).
Figur 1. Repræsentative output af gen expression analyse efter RNASeq fastsat af den kerne eller kreditor. Funktions-ID'ET angiver ENSEMBL gen id-nummer. Læs tæller angiver antallet læsninger i enten kontrol eller eksperimentelle prøver, der højrejusteres, at genet i genomet. Fold ændring og log forandringens fold angiver graden af skift i udtryk af genet mellem den eksperimentelle og styre prøve i enten positiv (stigning) i udtryk i retningen eksperimentel prøve, eller negativ (fald) i udtryk i eksperimentel prøve retning. P-værdi og FDR er statistiske tests for at bestemme betydningen af resultater; for RNASeq eksperimenter bruges en strengere FDR værdi på 0,05 til at bestemme betydning. Gene_symbol angiver NCBI gen ID, og gene_name viser det fulde navn af genet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Varierende udtrykte gener i BBS og Alström modellerne. Antallet af gener op-regulerede (rød) eller nedreguleret (gul) i alms1 MO (grøn) injiceres embryoner, bbs1 MO (orange) injiceres embryoner, eller begge dele i forhold til standard kontrol MO injiceres embryoner. * Betegner antallet af gener ændret i både men har overfor ændringer i udtryk. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figure 3. Upregulated veje og beriget GO vilkår i Alström modellen. (A) Upregulated veje af antallet af gener. (B) Upregulated gå vilkår af fold berigelse. (C) sti connectivity i upregulated veje i Alström modellen. Pathway forbindelser bestemmes af mindst 20% fælles gener mellem veje og mindst 2 gener overlapper. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Fig. 4. qRT-PCR validering af gen expression ændringer. Ændringer i genekspression identificeret ved RNASeq blev bekræftet i alder - og behandling-matchede 5 dpf embryoner, injiceret med kontrol, alms1 eller bbs1 MO. (A) undersæt af gener viser mRNA udtryk af gener ved hjælp af qRT-PCR. (B) tilsvarende data viser Læs tæller fra RNASeq dataset. Alle data er i forhold til kontrol, og qRT-PCR var normaliseret til aktin. aste, asteroide homolog 1; GCK, glucokinase; BMB, brambleberry; btr26, blodtørstige-relaterede gen familie medlem 26; ifi35, interferon-induceret protein 35. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fremgangsmåden i denne protokol tilbyder en relativt hurtige og omkostningseffektive strategi for transkriptom-niveau analyse af hele dyr eller bestemte sorterede cellepopulationer. For zebrafisk giver en fordelagtig model for denne type af undersøgelse på grund af den lethed og hurtighed i at generere store mængder materiale, lethed i gennemførelsen af genetiske eller miljømæssige forsøgsbetingelser og tilgængeligheden af en stor spektrum af transgene reporter linjer giver mulighed for dyrkning af celletype specifikke og væv-specifikke befolkningsgrupper.
Mens ikke detaljeret her, kunne denne metode let rumme væv sektioner indsamlet fra unge eller voksne fisk som et alternativ til FACs og samling. Vi har også udviklet en grundlæggende opfølgning analyse strategi, som kun bygger på anvendelsen af grundlæggende regneark kommandoer og allerede eksisterende vejen og gå databaser. Den største fordel ved denne tilgang er let tilgængelighed uden at det kræver ekspertise på højt niveau i computer programmering eller database management. Som sådan, gælder denne strategi for efterforskerne i alle baggrunde for informativ analyse af store gen expression datasæt.
Vores tilgang kombinerer grundlæggende zebrafisk embryoner og larver kultur med standard RNA udvinding teknikker efterfulgt af RNASeq. RNASeq kræver en stor mængde af høj kvalitet råvare; nogle forhandlere kræver 2 µg af total RNA. Som et resultat, er sjældne/sjældne celletyper eller individuelle embryo analyse uden for rækkevidde. Men de sidste fem år har påvist dramatiske forbedringer i lav-udbytte analyser, datasæt genereret fra mindre prøver og lavere mængder, RNA, og vi forventer, at disse programmer vil være muligt i den nærmeste fremtid. For at sikre nøjagtige resultater, tilsætning af både tekniske replikater, dvs, er generere to RNA biblioteker fra en enkelt prøve, og biologiske replikater, dvs, indsamle embryoner fra flere parringer, ideel. Disse trin giver forskere til kontrol for variation i prøver, og sekvenser identificeret i alle prøver er mere tilbøjelige til at være sandt resultater, med reducerede sandsynligheden for mangler en lavere Læs-count resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.) og T32DK098107 (T.L.H. og J.E.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial Reagents | |||
| TriZol | Thermo Scientific | 15596026 | lysis reagent |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | dissociation buffer 1 |
| FACSMax | Genlantis | T200100 | dissociation buffer 2 |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| FirstStrand cDNA conversion | Thermo Scientific | K1621 | cDNA conversion kit |
| 2X SYBR Green Master Mix | Roche | 4707516001 | qRT-PCR Master Mix |
| FACS buffer | Fisher Scientific | 50-105-9042 | |
| chloroform | Sigma Aldrich | 288306 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Strains | |||
| Tuebingen | ZIRC | ZL57 | |
| ins2a:mCherry | ZIRC | ZL1483 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 40 micron cell strainer | Sigma | CLS431750 | |
| FACS tube | BD Falcon | 352063 | |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Inverted Microscope | Zeiss | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Illumina HiSeq | Illumina | ||
| LightCycler 480 | Roche | ||
| Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set | Aquaneering | ZHCT100 | |
| FACS tube 5 mL polypropylene tube | BD Falcon | 352063 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | ||
| Consensus Path DB | http://cpdb.molgen.mpg.de/ | ||
| GO Enrichment Analysis | http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis |
References
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
- Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , 4th ed, Academic Press. (2017).
- Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. The Zebrafish: Genetics, Genomics, and Transcriptomics. , 4th ed, Academic Press. (2016).
- Detrich, H. W. The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , 3rd ed, Academic Press. (2011).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J Vis Exp. (109), (2016).
- MPIMG. ConsenusPathDB. , Available from: http://cpdb.molgen.mpg.de/ (2017).
- Consortium, G. O. Enrichment analysis Tool. , Available from: http://www.geneontology.org/ (2017).
- IDT. IDT Primerquest Tool. , Available from: https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index (2017).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M.
- Leitch, C. C., Lodh, S., Prieto-Echague, V., Badano, J. L., Zaghloul, N. A. Basal body proteins regulate Notch signaling through endosomal trafficking. J Cell Sci. 127 (Pt 11), 2407-2419 (2014).
- Lodh, S., Hostelley, T. L., Leitch, C. C., O'Hare, E. A., Zaghloul, N. A. Differential effects on beta-cell mass by disruption of Bardet-Biedl syndrome or Alstrom syndrome genes. Hum Mol Genet. 25 (1), 57-68 (2016).
- Hostelley, T. L., Lodh, S., Zaghloul, N. A. Whole organism transcriptome analysis of zebrafish models of Bardet-Biedl Syndrome and Alstrom Syndrome provides mechanistic insight into shared and divergent phenotypes. BMC Genomics. 17, 318 (2016).
