Summary
Bu iletişim kuralı Zebra balığı embriyolar, larva, Bütün transcriptome analiz için bir yaklaşım sunar veya hücre sıralanır. RNA izolasyonu, RNASeq veri yolu çözümlemesi ve qRT PCR dayalı doğrulama gen ifade değişiklikleri içerir.
Abstract
Küresel gen ifade değişiklikleri yeni yollar gözlenen fenotipleri temel tanımlamak için değerli bir araç analizidir. Zebra balığı yalıtım hayvanlar çok sayıda gelen RNA'ın bütün hayvan veya tek tek hücre popülasyonlarının kolaylığı nedeniyle gelen tüm transcriptome hızlı değerlendirilmesi için mükemmel bir modeldir. Burada küresel gen ifade analiz Zebra balığı embriyo RNA sıralama (RNASeq) kullanarak bir protokol sunulmuştur. Biz hazırlık RNA'ın bütün embriyo veya hücre içinde Transjenik hayvanlar sıralama kullanarak elde edilen hücre popülasyonlarının tanımlamak. Biz de zenginleştirilmiş yolları ve gen Ontoloji (GO) koşulları küresel gen ifade veri kümesi tanımlamak için RNASeq veri çözümlemesi için bir yaklaşımı açıklamak. Son olarak, nicel transkriptaz PCR (qRT-PCR) kullanarak gen ifade değişiklikleri doğrulamak için bir protokol sağlar. Bu protokollerin denetim karşılaştırmalı analizi ve deneysel Zebra balığı kümesi için roman gen ifade değişiklikleri tanımlamak için kullanılabilir ve moleküler fenotipleri ilgi içgörü sağlamak.
Introduction
Küresel gen ekspresyonu karşılaştırmalı analizi için gözlenen fenotipleri katkıda roman genlerin tanımlamak için değerli bir araçtır. Bu tür analizler genellikle nicel değerlendirmesi arasında deneysel karşılaştırıldığında transkript bereket itimat ve kontrol örnekleri. Hedeflenen yaklaşımlar, qRT-PCR gibi nispeten hızlı ve doğru tek gen ifade değişikliklerin incelenmesi için. RNA sıralama (RNASeq) gen ifade örnekleri, yapım o şimdi böyle araştırmalar için standart deneysel sistemleri arasında arasındaki önemli değişiklikleri tanımlamak için geniş, hipotez-Alerjik bir yaklaşım sunmaktadır.
Zebra balığı birçok hastalığı alanda genelinde önemli bir model olarak ortaya çıkmıştır. Başlangıçta gelişim biyolojisi çalışmaları, yüksek verimlilik ve bakım, nispeten düşük maliyeti nedeniyle onların yardımcı programı için geliştirilmiş Zebra balığı deneysel kullanımı fenotipleri gelen embriyonik olarak yetişkin aşamaları de için geniş bir eklemek gelmifltir bir 1,2,3dizi moleküler deneyleri. Nitekim, bu avantajları moleküler mekanik çalışmalar hızlı yapmak ve büyük miktarda malzeme edinme kolaylığı nedeniyle düşük maliyetli yaşam tüm aşamaları, genetik ve çevresel işleme kolaylığı ile kombine. Ayrıca, Zebra balığı embriyo ve larva şeffaf doğası vivo içinde görselleştirme ayrı hücre nüfus4sağlayan hücre ve doku özel transgenik muhabir satırları oluşturmak için ideal hale. Bu satırları sömürü küresel gen ifade analizi muhabir gen ifade üzerinde temel alan belirli izole hücre türlerine izin verir.
Burada RNASeq sonra Zebra balığı embriyo kültürü kullanarak küresel gen ifade analizi için kapsamlı bir iletişim kuralı mevcut. Morpholino (MO) dahil olmak üzere genetik deneysel manipülasyonlar-tabanlı geçici gen nakavt veya CRISPR-aracılı genom düzenleme, sunulmuş başka bir yerde5,6,7. Biz bu nedenle veya RNA izolasyonu bütün embriyolar için detaylı bir protokol odaklanmak transgenik muhabir ifade hücreleri RNASeq sonuçları yol araçları ve gen Ontoloji (GO) terimleri kullanarak basit hesaplamalı analiz tarafından takip sıralanmış. Son olarak, nicel ters transkriptaz PCR (qRT-PCR) tarafından gen ifade değişiklikleri doğrulama için bir strateji dahil ettik. Bu protokoller deneysel koşullar, genetik mutantlar veya çevre koşullarının karşılaştırılması dahil olmak üzere geniş bir tabi Zebra balığı embriyolar için geçerlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ana hatlar aşağı tüm hayvan iletişim kuralları'e göre vardır ve University of Maryland kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylı.
1. embriyo hazırlık
- doğal çiftleşme aracılığıyla oluşturma embriyo
- kültür embriyolar için 3 ay-in yaş, üreme vade 5 , 8 .
- Ayırmak istediğiniz zorlanma yetişkin erkek ve dişi balık bölünmüş çiftleşme tankları embriyo koleksiyonu önce akşam ve 2 ve 3 erkek her tanka ekleyin.
Not: Transgenik insulin2a:mCherry floresan muhabir zorlanma kullanımına izin pankreas β-hücreleri analizini. - Çiftleşme için transfer balık tank taze sistemi su ile ve hemen ertesi sabah ışıkları boşaldıktan sonra ayırıcıyı kaldırmak.
- Embriyo alt tankında gözlenir kadar doğal olarak çiftleşmeye balık izin. İstediğiniz miktarda toplanan kadar embriyo 30 dk aralıklarla toplamak. Mağaza her zaman noktası ayrı Petri yemeklerinde embriyo medya 28.5, toplanan ° C.
- Mikroenjeksiyon genetik malzeme veya yerleşim deneysel kültür medya 6 ' da, istenirse gerçekleştirmek ve taze Hank embriyo kültür ' s embriyo orta 8 10 cm Petri yemeklerinde 28.5 ° C'de
Not: enjekte morpholino (PT) veya mutant hayvanlar gen ifade analizi için her manipülasyon gen ekspresyonu olası etkileri olabilir unutmayın. Mutantlar 9 hedefleme PT tabanlı gen tarafından gözlenen değil transkripsiyon düzeyinde genetik tazminat sergilemek.
- Sahne embriyo
- gruplar halinde embriyo kültür 50 – 75 embriyo tüm embriyoların tutarlı gelişim zamanlaması tanıtmak için 10 cm Petri kabına başına.
- İzlemek gelişimsel ilerleme 10 emin olmak için blastomere, epiboly ve somite aşamalarında diseksiyon mikroskop kullanarak gelişimsel morfolojisi.
Not: çanak gelişimsel gecikme önlemek için herhangi bir ölen veya hatalı biçimlendirilmiş embriyo çıkarın. - Gelişimsel geçerlilik süresi temel embriyo ayırın. Somite numarasını kullanarak bölümleme (sonrası gastrulasyon 10.33 h sonrası döllenme (hpf)) sonra embriyo yaş yaklaşık 24 kadar ölçmek hpf. Sahne embriyo ve toplam vücut uzunluğu 24 sonra kullanarak larva hpf.
Not: Somites chevron şeklindeki Mezodermal doku embriyonun dorsal kısmındaki mevcut bulunur. - Sıralanmış embriyo 28.5 ° C kuluçka makinesi yerleştirin ve geliştirme ilerlemeniz için istenilen yaş sağlar.
2. Tek hücreli ayrılma: Bütün embriyo ve hücre popülasyonlarının sıralanmış
- bütün embriyo ayrılma
- ötenazi Zebra balığı embriyoların istenen aşamada hiçbir hareketi gözlenen kadar 5-15 dakika buzda Petri kabına koyarak .
- Etiketli 1.5 mL microcentrifuge tüp bir havuzu 20 embriyo transfer. Herhangi bir fazla embriyo medya microcentrifuge tüpü çıkarması.
- Eklemek 200 µL lizis reaktif (Tablo malzemeleri görmek) embriyo içeren tüp. Mekanik bir havaneli ile kullanarak lysis reaktif embriyo lunaparkçı. Toplam hacim için 1 mL getirmek için 800 µL lizis reaktif ekleyin. -80 ° c RNA ayıklama kadar mağaza.
- Akışı sıralanmış hücre izolasyon 11
- embriyo Petri kabına 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarmak ve mümkün olduğunca fazla embriyo orta kaldırmak.
Not: embriyo yaş bağlı olarak mekanik ayrışma da bu adımda gerekli olabilir. Embriyo ile > 48 hpf, devam etmeden önce embriyo bütünlüğünü bozmaya bir havaneli kullanımı tavsiye ediyoruz. - Kuluçkaya embriyo ile ayrılma arabelleği 1 1 mL (Tablo malzemeleri görmek) 1.5 mL microcentrifuge tüp. 15-30 dakika oda sıcaklığında için kuluçkaya. Çözüm yavaşça her 3-4 dk kuluçka adımı sırasında karıştırmak için P1000 ucu kullanarak yukarı ve aşağı pipetting tarafından triturate. DEĞİL girdap mı.
- 300 x g de 3 dk aralıklarla tarafından embriyo toplamak ve süpernatant kaldırın. Embriyolardan 1 mL ayrılma arabellek (Tablo malzemeleri görmek) 2 yeniden askıya alma. 15-30 dakika düzenli damlalıklı toz ile oda sıcaklığında için kuluçkaya.
- 1-2 µL süspansiyon (FACS) arabellek mikroskop altında sıralama Floresans aktif hücredeki sulandrarak sindirim değerlendirmek.
Not: muayene aliquot tek hücreleri en az hücre kümeleri ve embriyonik doku parçaları gösterdiğinde tam sindirim oluştu. - Hücreleri tarafından Santrifüjü 300 x g 5 dk. Kaldır süpernatant için de toplamak. Hücreleri 1 mL FACS tampon ve yerçekimi filtre sindirilmemiş doku örneğinden kaldırmak için bir 40 µm hücre süzgeç aracılığıyla yeniden askıya alma.
- Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve yaklaşık 1 x 10 6 hücre/ml bir FACS tüp bir FACS arabellek ile sulandırmak.
Not: nispeten az sayıda embriyo (daha az toplamı %5) pankreas β-hücreleri gibi başı ile hücre tipleri için en az 1.000 sahne eşlemeli embriyo kullanın. - Özelliği hücre süspansiyon örnekleri 1 mL içeren FACS tüpler gibi sadece lizis reaktif veya FACS arabellek içeren FACS tüp sayesinde sıralama FACS sağlar. FACS akışı floresan muhabir hızlı yalnızca tek hücreleri toplamak için sıralayıcı kapısı.
- Gerçekleştirmek FACS akışı sıralama istediğiniz hücre sayıları toplayana kadar.
Not: RNASeq gerçekleştirmek için işte toplam RNA gerekli en az. Biz 3.000-5.000 hücreleri yüksek kaliteli, yüksek konsantrasyon RNA yalıtmak için yeterli olduğunu bulduk. - Kendine hakim hücre buza depolamak ve hemen RNA hazırlık için devam.
- embriyo Petri kabına 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarmak ve mümkün olduğunca fazla embriyo orta kaldırmak.
3. RNA hazırlık
- Ayıklamak RNA
- lizis reaktif oda sıcaklığında 5 min için toplanan örnekle (--dan adım 2) kuluçkaya.
- Ekle 0.2 mL kloroform her 1.0 mL lizis reaktif için kullanılan ve tüpler el ile oda sıcaklığında 2-3 dk 15 s. Incubate için tersine çevirin. 12.000 x g 15dk için de örnek 4'te santrifüj kapasitesi ° C.
- Ayrılmış, sulu faz için taze bir tüp aktarmak ve isopropanol için kullanılan lizis reaktif her 1.0 mL 0.5 mL ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya. 12.000 x g 10 dk de örnekleri 4'te santrifüj kapasitesi ° C.
- Yıkama ile % 75 etanol ve 7.500 x g 5 min için de örnek 4'te santrifüj kapasitesi ° C. süpernatant tamamen kaldırmak ve hava için oda sıcaklığında kuru sağlar. RNA 15-30 µL Dietil pyrocarbonate (DEPC) yeniden askıya alma-tedavi su.
- Arındırmak yüksek kaliteli RNA
- RNA süspansiyon 1/10 Cilt 3 M sodyum asetat (pH 5.5) ile birleştirmek ve 1 isopropanol hacmi. Oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya ve 12.500 x g 10 dakika için de örnek 4'te santrifüj kapasitesi ° C.
- Pelet buz gibi % 70 etanol DEPC tedavi su ile yıkama ve 10.000 x g 5 min için de örnek 4'te santrifüj kapasitesi ° C. tekrar bir kez yıkama adım.
- Süpernatant kaldırmak ve oda sıcaklığında kurumasını bekleyin. DEPC tedavi suda yeniden askıya alma.
- Konsantrasyonu (ng/µL) ve Absorpsiyon spektrometresi kullanılarak saflık (260/230 oranı) ayıklanan RNA tahlil. 260/230 değeri olduğundan emin olun ~ 2.0 RNASeq işlemine devam etmeden önce. -80 ° C'de bize kadar saklamake (6 ay).
- RNA örnekleri göndermek bir satıcı ya da çekirdek için RNASeq ve gen ifade okuma sıralama, miktar dayalı analiz. Satıcıdan döndürülen sonuçlar genellikle transkript okuma örnekleri arasında önemli bir kat-değişiklik sergilenmesi genler listesi olarak sağlanan.
Not: belgili tanımlık yukarıda yöntem kalitesiz RNA belirtiyorsa bir sütun kullanılabilir. Tutarı, konsantrasyon ve RNA örnekleri için RNA bütünlük numarası (RIN) satıcı veya çekirdek ile onaylanması. Satıcı veya çekirdek RIN de genellikle değerlendirecek.
4. Yol ve gitmek dönem analizi
Not: bkz: şekil 1 gen ifade analizi temsilcisi çıktısı için çekirdek veya satıcı tarafından sağlanan RNASeq sonra.
- Açık tek bir deneysel koşula karşı denetim karşılaştırma Sıralama differentially genlerin ifade verileri bir elektronik tablo yönetim yazılımı (sonuçlar) (bkz: malzemeler tablo ).
- Yanındaki aşağı açılan oku seçin ' sıralama ' düğmesini tıklatın ve seçin " özel sıralama " deneysel kontrol koşulu karşı differentially ifade genler içeren elektronik tablo içinde.
- Altında kutusunu işaretleyin ' sütun ' açılır penceresinde ve göre sıralamak seçin ' LFC ' sütun. Emin olmak ' değerler ' içinde seçilen ' sıralama koşulu ' sütun. Gelen sıralamak için seçin ' büyükten küçüğe ' içinde ' sipariş ' sütun ve tıkırtı " Tamam ".
Not: Bu azalma ifade (negatif LFC) ile listenin alt kısmında görünür iken bu artan ifade (pozitif LFC) ile listesinin en üstünde görünmesi Bu differentially ifade genler sıralanır.
- Tek bir denetim için birden çok deneysel koşullar aşağıdaki gibi karşılaştırın.
- Seçin deneysel differentially belirlemek için 1 kontrol elektronik tablo karşı boş bir sütunda ilk hücreye iki deneysel koşullarda bulunan genler dile getirdi. Aşağıdaki eşitliği hücre içine yazın:
Not: Bu denklem IF, EHATALIYSA, bir kombinasyonudur ve maç işlevleri. (i) KAÇINCI işlevi, kaçıncı (A1, Experimental2_vs_Control! Tümüne, 0), A1 değerini arar (ENSEMBL ID) Experimental2_vs_Control adlı elektronik tablo bir sütun (tümüne) içinde (Experimental2_vs_Control!). " 0 " için tam bir eşleşme, bakmak için gösterir ve tam bir eşleşme bulunursa, işlev değerini döndürür " 1 ", eşleşme bulunursa, bu işlev bir hata döndürür iken " N/A ". (ii) maç işlevinin sonucu sonra IsError işlevi, EHATALIYSA (maç (A1, Experimental2_vs_Control! giriş Tümüne, 0)), nerede, giriş ise " 1 " gösteren bir eşleşme bulundu, o-ecek dönmek " yanlış ", ve giriş ise " N/A " gösteren bir eşleşme bulunamazsa, o-ecek dönmek " gerçek ". (III) " doğru " ya da " yanlış " sonuç ise o zaman Eğer işlevi içine girişi (EHATALIYSA (maç (A1, Experimental2_vs_Control! Tümüne, 0)), " ", " yinelenen "), nerede, giriş ise " gerçek " gösteren bir eşleşme bulunamazsa, bu tırnak işareti ilk kümesi arasında değer döndürür (" ") boş olduğu ve bu nedenle hücre boş olacaktır. Giriş ise " yanlış " gösteren bir eşleşme bulundu, bu tırnak işaretleri ikinci kümesi arasında değer döndürür (" yinelenen "), ve hücre diyecekler " yinelenen ". - Basın " Enter " ya da " geri " denklemi çalıştırmak için. Denklemi içeren hücreyi seçin ve hücrenin sağ alt köşesinde kutusunda tıklatın. Tıklayan fare tutun ve seçili alanı sütun aşağı tüm yol kadar son sürükleyebilir ' özellik kimliği ', sütundaki her hücreyi denklemi için.
- Select " özel sıralama " yeniden tıklatarak sıralama ikinci bir düzeyde ekleyin " + " simge sol alt köşedeki. İlk kademede " göre sıralama ", sütun Seç altında " yinelenen ", sıralama koşulu Seç altındaki ' değerleri ' ve sipariş Seç altındaki ' Z-A '. İkinci kademede " sonra tarafından ", sütun Seç altında ' LFC ', sıralama koşulu Seç altındaki ' değerleri ' ve sipariş Seç altındaki ' büyükten küçüğe ' ve seçin " Tamam ".
Not: Bu ifade değişimin yönünü göre 4 gruplara genler listesi sıralanır. Ifade değişikliği hem de veya ters yönde aynı yönde olduğundan emin olmak için her iki deneysel koşullarda bulunan genler kontrol etmek önemlidir.
Önce veritabanlarında devam etmeden veya sonuçları bulundu değil - herhangi bir parantez gen sembolleri sütundan kaldırın. Gen sembolleri içeren sütunun tamamını seçin. Seçin " düzenleme " sonra " yerine ", açılan ' dosya ' menü. Türü " (*) " içinde " Aranan: " bar Değiştir penceresinin ve terk " eski yerine koymak ile: " boş bar. Seçin ' Tümünü Değiştir ' çıkarmak tüm örnek-in parantez için.
Not: * temsil herhangi bir sayıda karakter iki parantez program herhangi bir örnek vurgulanan hücrelerdeki bulmak için istenir ve parantez içinde herhangi bir örneğini arasındaki bu karakterin yerleştirerek, hiçbir şey, böylece bunları kaldırmayı ile değiştirilecek.
- Seçin deneysel differentially belirlemek için 1 kontrol elektronik tablo karşı boş bir sütunda ilk hücreye iki deneysel koşullarda bulunan genler dile getirdi. Aşağıdaki eşitliği hücre içine yazın:
- Belirleme yolları zenginleştirilmiş
- kopya kümesi için hangi bir gen sembollerin dilek panoya zenginleştirilmiş yolları belirlemek için. ConsensusPathDB 12 ' ye gidin. Seçin " gen analizi ayarla " Web sayfasının sol kenar, ardından " aşırı temsil analiz ".
- Yapıştırın genlerinde listesi " gen/protein tanımlayıcıları yapıştırın " kutusu. Seçme gen simge " gen/protein tanımlayıcısı türü " kutu ve tıkırtı " devam et ". Yanındaki kutuyu seçin " yolu veritabanlarının tarafından tanımlandığı gibi yollar " yolu tabanlı altında Ayarlar bölümünde.
Not: Arama için kullanılabilir veritabanları listesine dahil olmak üzere bir dizi seçenek analizi için görünür. Onlar en kurulan ve kapsamlı olarak Kegg ve Reactome veritabanları dışındaki tüm veritabanları de-seçmenizi öneririz. Giriş listesi ve p-değeri kesme ayarları ile en az çakışma da ihtiyaçlarına göre ayarlanabilir. Bu ayarları varsayılan 2 gen en az örtüşme ve 0,01 p-değeri kesme bırakarak öneririz. - Select " zenginleştirilmiş kümeleri bulmak " giriş listesinde genleri içeren yollar listesini elde etmek için.
Not: Ardından her yolu adını da dahil olmak üzere tablo formatında çıkış olacaktır " küme boyutu " (Toplam yol genlerinde sayısını gösteren), " yer alan adaylar " (o yolu olan genler giriş listesinde sayısını gösteren ), yanı sıra p-değeri ve q-değeri (FDR) ve hangi yol tespit veritabanı.
- Yolu ağları nesil
- belirlemek zenginleştirilmiş yolları yukarıda açıklandığı gibi.
- Tüm yol ağında her kutusunu görüntülenmeyecektir için yol adlarının yanındaki seçerek veya tıklatarak görselleştirmek için zenginleştirilmiş yolları seçin " tüm " altında " seçin " sonra seçim kutuları yukarıda sütun başlığını seçin " Seçili ayarlar görselleştirmek ".
Not: Eğer az 30 tüm yolları görüntülenmesi önerilir; yoksa 30 yollar büyük top 30 en zenginleştirilmiş yolları (Bu genler giriş listesinden en fazla içeren) seçmenizi öneririz. - Ayarla " göreli örtüşme " ve " adaylar paylaşılan " filtreler, sayfanın üst ortasına ya kutusunu işaretleyip giren desirEd yüzde göreli veya bu daha uygun hale getirmek için daha sıkı olmak paylaşılan aday sayısı ile çakışıyor daha net ve seçme yolu ağları içinde " uygulamak ".
Not: En az bir göreli örtüşme 0.2, onları bağlamak için 2 yolları ve en az 2 paylaşılan adaylar arasında % 20 gen örtüşme belirten önerilir. Grafik göstergeyi Grafik göstergede sayfanın üst sol tıklayarak görülebilir.
- Zenginleştirilmiş GO şartlar belirlenmesi
- kopyalamak için bir dilek zenginleştirilmiş gen kaynakta panoya belirlemek grup gen sembolleri. Git ' git zenginleştirme çözümleme aracı ' Gene Ontoloji Konsorsiyumu 13 ' te. Gen simgelerin listesi altında sayfanın sol tarafındaki kutusuna yapıştırın ", gen kimlikleri … "
- Gen kimlikleri kutusunun altında listelenen kullanmak için git şartları grubunu seçmek: biyolojik süreci, moleküler işlevi veya hücresel bileşeni. (Önerilen) seçin ' biyolojik süreci '. Seçin ' Danio rerio ' gitmek altında şartlar kutusunda ve'ı tıklatın " gönder ".
Not: Varsayılan p-değeri kesme 0,05 kullanarak önerilir.
5. Doğrulama qRT-PCR tarafından
Not: bireysel genler önemli gen ifade RNASeq değişimler ile tanımlanan hedeflenen qRT-PCR Çoğalt deneylerde tarafından doğrulanmadı.
- cDNA sentez
- Bölüm 3.1'açıklanan yöntemi kullanarak embriyo gelen RNA ayıklayın. RNA çıkarma.
- RNA'ın dönüştürmek 1 µg cDNA dönüştürme kullanarak cDNA için (bkz. Tablo reçetesi) kit. RNA, dNTPs ve transkriptaz enzimi birleştirir. Üreticiye göre thermocycler reaksiyonu gerçekleştirmek ' s belirtimleri.
- CDNA 1:3 DEPC tedavi su oranında seyreltin. 1-2 aya kadar 4 ° C'de mağaza.
- qRT-PCR doğrulama
- seçin genler tarafından qRT-PCR RNA sıralama sonuçları doğrulamak için. Genler yüksek kat değişiklikleri ifade tanımlar. Bu bol ifade belirttiği gibi bu genlerin de yüksek okuma sayıları içeren belirlemek.
- 10-12 hedefleri yüksek kat üstü genler yüksek okuma sayısı listesini seçin. Tasarım en az 1 intron exon sınır yayılan hedef genlerin yükseltmek için astar.
- Gen veya gen hedeflenen bölgeye qPCR astar tasarım sitesi 14 girin. Seçin " 2 qPCR astar tasarım " ve astar kümesi oluşturmak için site ister.
Not: örnekleri arasında karşılaştırmalar normalize etmek gibi β-aktin, iç kontrol astar eklediğinizden emin olun. β-aktin astar F: 5 olan ' - TCGAGCTGTCTTCCCATCCA - 3 ' ve R: 5 ' - TCACCAACGTAGCTGTCTTTCTG - 3 '. - CDNA, ileri astar, ters astar ve polimeraz birleştirir. Genler 15 göreli ifade belirlemek için qRT-PCR güçlendirme gerçekleştirmek.
- Göreli mRNA ifade ilgi genlerin göreli miktar tayini 15 tarafından analiz.
- QRT-PCR fark ifade yön tutarlı olduğundan emin olmak için RNASeq sonuçları karşılaştırmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Differentially sıralanması genlerin ifade:
Alström sendromu ve Bardet-Biedl Sendromu (BBS) Zebra balığı modellerinin larva aşamasında differentially ifade genlerin tanımlamak için biz de alms1 hedef veya ek yeri engelleme-ecek içine enjekte edilerek bbs1 transkript önceden doğrulanmış vahşi-türü Zebra balığı embriyo16,17. Fertilizasyon (dpf) 5 gün post, RNA'ın iki çoğaltır MO, denetimle enjekte embriyo yanı sıra her koşul yukarıdaki Bölüm 3'te açıklandığı gibi elde. RNA her örnekten bir derinliğe kadar sıralı ~ 120 milyon okur ile ~ 107 milyon Zebra balığı genom hizalanmış okur. Genom eksonik bölgeler için eşlenen hizalanmış okuma % 85-90 arasında.
1.348 toplam genler Alström modelinde önemli ölçüde değiştirildi ve 471 toplam genler BBS modelinde önemli ölçüde değişti. Gen ifadesinin modelleri veya değişiklikleri modellerinden birini benzersiz arasında paylaşılan değişiklikleri Bölüm 4.2 anlatıldığı tespit edilmiştir. 1,084 toplam genler Alström modelinde benzersiz olarak değiştirildi, 612 yukarı düzenlenmekte ve 472 aşağı düzenlenmekte ve 207 genler BBS modeli, 176 yukarı düzenlenir ve down-regüle 31 (Şekil 2, Tablo S1ve Tablo S2) benzersiz olarak değiştirildi. Her iki model önemli ölçüde değiştirilecek 264 genler bulundu, 73 yukarı düzenlenir ve 182 aşağı düzenlenir ve 9 ters değişiklikleri ifade (Şekil 2, Tablo S1ve S2 tablo (bkz: iki model arasında gösterdi Ek Tables.xlsx)). İki model arasında differentially ifade gen tutarsız numaraları bbs1 ve alms1 farklı geliştirme aşamalarında etkileme öneririz.
İlginçtir, daha az sayıda gen değişiklikleri BBS modelindeki önermek o alms1 5 dpf aşamada gelişiminde önemli bir rol rol şilep ile adaya Alström modelindeki differentially ifade genler çok sayıda öneririz bbs1 bu saat noktada önemli olmayabilir. Buna ek olarak, önceki transcriptomic analizleri 2 dpf, ters18önerdi.
Zenginleştirilmiş yolları ve gen kaynakta Alström sendromu, Zebra balığı modeli belirlenmesi:
Daha iyi bir şekilde Alström modeli moleküler profil aydınlatmak için yollar ve zenginleştirilmiş differentially ifade genlerinde gen kaynakta tespit edilmiştir. Zenginleştirilmiş yolları ConsensusPathDB sorgulayarak belirlenmiştir ve zenginleştirilmiş Gene kaynakta bölümleri 4.3-4.5 içinde açıklandığı gibi Gene Ontoloji Konsorsiyumu sorgulayarak belirlenmiştir. Alström içinde yukarı düzenlenir genler arasında en yüksek oranda zenginleştirilmiş, model tarafından genlerin numarası veya zenginleştirme, etmedik analiz edildi. 31 toplam yolları Alström modelinde yukarı düzenlenir. "Metabolizma" geniş gruplama bir yana, en çok etkilenen yolları 32 ile 20 gen, doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık sistemiyle idi (şekil 3A). Olaylar da vardı sinyal aşağı akım β-hücre reseptör bağışıklık sistemi up-yönetmelikte bu model öne zenginleştirilmiş. Birkaç sinyal yolları da Alström modelindeki Alström Sendromu Derneği ile birincil cilium disfonksiyon, hücre (şekil 3A) önemli bir sinyal gönderme Merkezi ile tutarlı yukarı düzenlenir genler arasında zenginleştirilmiş. Buna ek olarak, yukarı düzenlenmiş üç yolları insülin salgılanması ile ilişkili: yağ asitleri bağlı GPR40, serbest yağ asitleri ve asetilkolin (şekil 3A). Bu son derece penetrant insülin direnci ve tip 2 diyabet fenotipleri Alström hastalarda ile tutarlıdır. Altı git şartları Alström modelinde, eritrosit farklılaşma, eritrosit Homeostazı, myeloid hücre homeostazı ve homeostatik işlemleri (şekil 3B) de dahil olmak üzere yukarı düzenlenir genler arasında zenginleştirilmiş. Yukarı düzenlenir yolları içe değerlendirmek için modeli yukarı düzenlenir yolları yapıldı Alström yol ağının (şekil 3 c) oluşturulur. Birbirine bağlı yollar büyük düğüm bağlantısı bağışıklık sistemi ile ilgili ve küçük düğümlerden biri üç insülin yasal yolları arasındaki bağlantıyı ortaya iken sinyal yolları arasında yüksek derecede saptandı. Son olarak, her iki up - veya aşağı-düzenlenmiş Alström modeldir idi 5 gen hedefleri değerlendirilmesi RNASeq tarafından tanımlanan gen ifade değişiklikleri doğrulanmadı. Gen ifade değişiklik yapmasına qRT-PCR atıklarla, gck, bmb, btr26, ve ifi35, denetime göre yön RNASeq (şekil 4A-B) tarafından gözlenen recapitulated.
Şekil 1. Gen ifade analiz sonra çekirdek veya satıcı tarafından sağlanan RNASeq temsilcisi çıktı. Özellik kimliği ENSEMBL gen kimlik numarasını gösterir. Okuma sayıları okuma Denetim veya genom bu gen için hizalı deneysel örnekleri sayısı gösterir. Kat değişim ve kat değişim günlüğü deneysel arasında gen ifade değişiklik derecesini belirtmek ve örnek'a deneysel örnek yönde ifade pozitif (artış) kontrol veya ifadede (azalış) negatif deneysel örnek yönde. P-değeri ve FDR sonuçları önemini belirlemek için istatistiksel testler. RNASeq deneyler için daha sıkı FDR değeri 0,05 önem belirlemek için kullanılır. Gene_symbol NCBI gen kimliği gösterir ve gene_name gen tam adını listeler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Differentially ifade BBS ve Alström modelleri genlerinde. Genler yukarı düzenlenir (kırmızı) veya aşağı düzenlenir (sarı) alms1 enjekte MO (yeşil) embriyo, bbs1 enjekte MO (turuncu) embriyo veya standart kontrol enjekte MO embriyolar için karşılaştırıldığında her iki numarası. * Genleri ikimiz de değişti ama ifade değişimler karşısında olan süreyi gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Fkullanarak 3. Upregulated yolları ve zenginleştirilmiş GO açısından Alström modeli. (A)Upregulated yolları genler sayısına göre. (B) Upregulated gidin kat zenginleştirme tarafından şart. (C) yolu bağlantısı upregulated yollar Alström modeldir. En az %20 tarafından belirlenen yol bağlantıları yolları arasında gen paylaşılan ve en az 2 genlerin örtüşmesi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. gen ifade değişiklikleri doğrulanmasını qRT-PCR. Gen ifadesinin RNASeq tarafından tanımlanan değişimler 5 dpf embriyo yaş ve tedavi eşleşen denetim, alms1 veya bbs1 mo(a)alt mRNA ifade qRT-PCR kullanarak genlerin gösterilen genlerin ile enjekte teyit edildi. (B) eşdeğer veriler okunur gösteren RNASeq dataset nesnesinden sayar. Tüm veri denetimi göre vardır ve qRT-PCR aktin için normalleştirilmiş. atıklarla, asteroit homolog 1; Gck, glucokinase; BMB, brambleberry; btr26, kana susamış ilgili gen ailesi, üye 26; ifi35, interferon kaynaklı protein 35. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol için açıklanan yaklaşım nispeten hızlı ve düşük maliyetli strateji bütün hayvanlar veya belirli sıralanmış hücre popülasyonlarının transcriptome düzeyi analizi için sunuyor. Zebra balığı avantajlı modeli çalışması bu tür için kolaylık ve malzeme, genetik uygulama kolaylığı veya çevre deneysel koşullar ve bir büyük kullanılabilirliğini başlayan büyük miktarda üreten içinde hız nedeniyle sağlar spektrum transgenik muhabir satır için hücre tipi özel ve doku özel örneğin alınma olasılığını izolasyon sağlar.
Burada ayrıntılı değil iken, bu yöntem doku bölümleri çocuk ya da yetişkin balık FACs ve toplama bir alternatif olarak toplanan kolayca alabilecek. Biz de sadece temel elektronik tablo komutları ve önceden varolan yol ve gitmek veritabanları kullanımına dayanıyor bir temel izleme analiz stratejisi geliştirdi. Bu yaklaşımın önemli avantajı bilgisayar programlama veya veritabanı yönetimi'nde üst düzey uzmanlık gerektiren olmadan erişilebilirlik kolaylığıdır. Bu nedenle, bu strateji tüm arka planlar büyük gen ifade veri kümelerinin bilgilendirici analiz için araştırmacılar için geçerlidir.
Bizim yaklaşım temel Zebra balığı embriyo ve larva kültür RNASeq tarafından izlenen standart RNA ayıklama teknikleri ile birleştirir. RNASeq yüksek kaliteli başlangıç malzeme büyük miktarda gerektirir; bazı satıcılar toplam RNA'ın 2 µg gerektirir. Sonuç olarak, nadir/kesintili hücre türleri veya tek tek embriyo analiz dışarı-in uzanmak var. Ancak, son beş yıldır düşük verimli analizleri, daha küçük örnekleri ve düşük RNA miktarlarda, üretilen veri kümeleri dramatik gelişmeler göstermiştir ve bu uygulamaların yakın gelecekte mümkün olacaktır bekliyoruz. Doğru sonuçlar, her iki teknik çoğaltır, Yani, ek sağlamak için tek bir örnek ve biyolojik çoğaltır, Yani, birden çok matings, üzerinden toplama embriyo iki RNA kitaplıkları oluşturma idealdir. Varyasyon örneklerinde için araştırmacılar denetlemek için aşağıdaki adımları izin ve tüm örneklerinde tanımlanan dizileri gerçek sonuçları, daha düşük bir okuma sayısı sonucu eksik düşük olasılığı daha yüksektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.) ve T32DK098107 tarafından desteklenmiştir (T.L.H. ve J.E.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial Reagents | |||
| TriZol | Thermo Scientific | 15596026 | lysis reagent |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | dissociation buffer 1 |
| FACSMax | Genlantis | T200100 | dissociation buffer 2 |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| FirstStrand cDNA conversion | Thermo Scientific | K1621 | cDNA conversion kit |
| 2X SYBR Green Master Mix | Roche | 4707516001 | qRT-PCR Master Mix |
| FACS buffer | Fisher Scientific | 50-105-9042 | |
| chloroform | Sigma Aldrich | 288306 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Strains | |||
| Tuebingen | ZIRC | ZL57 | |
| ins2a:mCherry | ZIRC | ZL1483 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 40 micron cell strainer | Sigma | CLS431750 | |
| FACS tube | BD Falcon | 352063 | |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Inverted Microscope | Zeiss | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Illumina HiSeq | Illumina | ||
| LightCycler 480 | Roche | ||
| Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set | Aquaneering | ZHCT100 | |
| FACS tube 5 mL polypropylene tube | BD Falcon | 352063 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | ||
| Consensus Path DB | http://cpdb.molgen.mpg.de/ | ||
| GO Enrichment Analysis | http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis |
References
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
- Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , 4th ed, Academic Press. (2017).
- Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. The Zebrafish: Genetics, Genomics, and Transcriptomics. , 4th ed, Academic Press. (2016).
- Detrich, H. W. The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , 3rd ed, Academic Press. (2011).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J Vis Exp. (109), (2016).
- MPIMG. ConsenusPathDB. , Available from: http://cpdb.molgen.mpg.de/ (2017).
- Consortium, G. O. Enrichment analysis Tool. , Available from: http://www.geneontology.org/ (2017).
- IDT. IDT Primerquest Tool. , Available from: https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index (2017).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).
- Leitch, C. C., Lodh, S., Prieto-Echague, V., Badano, J. L., Zaghloul, N. A. Basal body proteins regulate Notch signaling through endosomal trafficking. J Cell Sci. 127 (Pt 11), 2407-2419 (2014).
- Lodh, S., Hostelley, T. L., Leitch, C. C., O'Hare, E. A., Zaghloul, N. A. Differential effects on beta-cell mass by disruption of Bardet-Biedl syndrome or Alstrom syndrome genes. Hum Mol Genet. 25 (1), 57-68 (2016).
- Hostelley, T. L., Lodh, S., Zaghloul, N. A. Whole organism transcriptome analysis of zebrafish models of Bardet-Biedl Syndrome and Alstrom Syndrome provides mechanistic insight into shared and divergent phenotypes. BMC Genomics. 17, 318 (2016).
