Summary
Achtergrond autofluorescence van biologische monsters bemoeilijkt vaak fluorescentie gebaseerde beeldvormingstechnieken, vooral in de leeftijd postmitotic weefsels. Dit protocol beschrijft hoe de autofluorescence van deze monsters effectief kan worden verwijderd met behulp van een commercieel beschikbare licht emitterende diode licht het monster vóór immunokleuring photobleach bron.
Abstract
Immunofluorescentie is een gemeenschappelijke methode gebruikt om te visualiseren subcellular compartimenten en om te bepalen van de lokalisatie van specifieke proteïnen binnen een weefsel monster. Een grote belemmering voor de overname van afbeeldingen van hoge kwaliteit immunofluorescentie is endogene autofluorescence van het weefsel veroorzaakt door veroudering pigmenten zoals lipofuscin of door gemeenschappelijke monster preparatietechnieken zoals fixatie van de aldehyde. Dit protocol beschrijft hoe achtergrond fluorescentie kan sterk worden verminderd door photobleaching gebruik van witte fosfor lichtemitterende diode (LED) arrays voorafgaand aan de behandeling met fluorescerende sondes. De breedspectrum uitstoot van witte fosfor LEDs zorgen voor het bleken van fluorophores in een heel scala van emissie pieken. De photobleaching apparatuur kan worden geconstrueerd van off-the-shelf onderdelen tegen zeer lage kosten en biedt een toegankelijk alternatief voor commercieel beschikbare chemische quenchers. Een photobleaching voorbehandeling van het weefsel gevolgd door conventionele immunofluorescentie kleuring produceert beelden gratis achtergrond autofluorescence. In vergelijking tot stand gebracht van chemische quenchers die verminderd sonde evenals achtergrond signalen, photobleaching behandeling had geen effect op de sonde fluorescentie intensiteit terwijl het effectief verminderd achtergrond en lipofuscin fluorescentie. Hoewel photobleaching meer tijd voor voorbehandeling vereist, kunnen hogere intensiteit LED-arrays worden gebruikt om photobleaching tijd te verminderen. Deze eenvoudige methode kan mogelijk worden toegepast op een verscheidenheid van weefsels, met name postmitotic weefsels die zich ophopen van lipofuscin zoals de hersenen en cardiale of skelet spieren.
Introduction
Microscopie van de fluorescentie met antilichamen gericht op specifieke proteïnen is routinematig gebruikt om te visualiseren van eiwitten van belang in celkweek en weefsels. Een belangrijke complicatie voor de verwerving van duidelijke en definitieve afbeeldingen in immunofluorescentie is autofluorescence, die kan worden veroorzaakt endogeen in zoogdieren weefsel door de leeftijd pigment lipofuscin en eiwitten zoals elastine en collageen1, 2. Andere bronnen van autofluorescence kunnen worden ingevoerd door monster voorbereiding stappen zoals aldehyde fixatie3. Lipofuscin korrels, voornamelijk samengesteld uit oxidatively gemodificeerd eiwit en de residuen van de afbraak van de lipide, accumuleren in lange-levende cellen met toenemende leeftijd2. Dit veroorzaakt problemen in imaging postmitotic weefsels zoals de hersenen en cardiale of skelet spieren, zoals de fluorescentie emissiespectrum van lipofuscin is breed en variabele, vaak samenvalt met de golflengte van de emissie van gemeenschappelijke fluorophores gebruikt voor labelen van4. Deze factoren maken beeldvorming van menselijk hersenweefsel van gevallen van late-onset neurodegeneratieve ziekten zoals Frontotemporale lobar degeneratie (FTLD) bijzonder uitdagend.
Verklein autofluorescence en hebben we een techniek waarbij we de dia gemonteerde weefselsecties bestralen met een wit licht emitterende diode (LED) array gebruikmakend van een huishoudelijke desk lamp5bedacht. Deze eenvoudige techniek biedt een alternatief voor technieken die gebruik maken van chemische quenchers zoals CuSO4 in ammoniumacetaat, of in de handel verkrijgbare blussen kleurstoffen zoals Soedan zwart B en eriochroomzwart T6. Het heeft ook aanzienlijke kostenbesparende over multispectrale LED lamp photobleaching technieken en vermijdt complicaties en artefacten die zijn gegenereerd op basis van digitale autofluorescence verwijdermethoden zoals spectrale un-mix7,8. Witte fosfor LEDs hebben een breed emissiespectrum, hoge helderheid en lage productiekosten, waardoor ze ideaal zijn als een off-the-shelf component voor photobleaching een verscheidenheid van chromophores5,9.
In dit protocol, we aantonen dat de bouw van een photobleaching-apparaat met behulp van toegankelijke componenten en photobleaching gelden voor een geval van FTLD weefsel bevattende tau-positieve insluitsels (FTLD-T) met behulp van een antilichaam specifiek voor gefosforyleerd tau. We tonen het effect van photobleaching op imaging fluorescently gelabelde antilichamen met twee veelgebruikte chromophores: Alexa 488 en Texas rood. Het effect van photobleaching ten opzichte van de onbehandelde secties of degenen met een commerciële chemische quencher behandeld worden gekwantificeerd en vergeleken. Deze voorbehandeling photobleaching kan worden opgenomen in elk standaard immunofluorescentie kleuring protocol te verwijderen van de autofluorescence in een biologische steekproef.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: het werk gepresenteerd werd uitgevoerd in overeenstemming met erkende internationale normen, met inbegrip van de internationale conferentie voor harmonisatie (ICH), de Raad voor internationale organisaties van medische wetenschappen (CIOMS) , en de beginselen van de verklaring van Helsinki. Gebruik van menselijk weefsel was met de goedkeuring van University Health Network onderzoek Ethics Board. De menselijke hersenen monsters werden verzameld als onderdeel van de maritieme weefselbank van de hersenen. Op het moment van collectie, geïnformeerde toestemming is verkregen van alle patiënten.
1. bouw van photobleaching apparatuur en oplossingen
- voorbereiden stamoplossingen.
- Bereiden 1 L 1 x voorraad Tris-gebufferde zoutoplossing (1 x TBS) oplossing (150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH 7.4) door ontbinding 8.77 g NaCl en 6.06 g van Tris baseren in 800 mL ddH 2 O en breng de pH op 7.4 met behulp van HCl. Breng het volume aan 1 L en autoclaaf. < / Li >
- 10% (200 x stock) natriumazide bereiden door ontbinding van 1 g van natriumazide in 10 mL ddH 2 O (10%, 200 x voorraad).
- Voor 1-3 standaard formaat dia's, een enkele 100 x 100 mm transparant, vierkante petrischaal te gebruiken als een dia-kamer. Toevoegen voor een enkele dia kamer, 0,25 mL 200 x natrium azide voorraad aan 50 mL 1 x TBS om een 0,05% azide-TBS oplossing te maken. 2-3 dia chambers verticaal om te verwerken van extra dia's stapelen. Een extra 50 mL azide-TBS oplossing voorbereiden op elke kamer.
- Maken een steiger te verheffen van de dia kamer (s) zodanig dat een lamp hoofd past onder.
- Voor een 100 mm x 100 mm dia kamer, gesneden openingen in de bodem en zijkanten van een 100 x 100 mm x 30 mm plastic voedsel verpakking en omkeren van de container. Zorgen de openingen kant zijn groot genoeg om te passen van een LED-lichtbron en ervoor zorgen dat de onderste opening groot genoeg zodat het licht uit de lichtbron bereikt de monsterkamer zonder belemmering.
- Toepassing elektrische tape op de steiger te verhogen van de greep tussen de steiger en het monster kamer/benchtop. Gebruik van alternatieve materialen voor de bouw van de steiger zolang het veilig de dia kamer verheft zonder het belemmeren van het licht van het bereiken van het monster.
- Diffusoren of ondoorzichtige plastic verwijderen uit de desk lamp die kan belemmeren het LED-licht direct bereiken het monster (indien mogelijk) en oriënteren van de LED-array naar boven. Plaats de steiger en glijbaan kamer (s) boven de LED-array. Gebruik van een lamp met een flexibele hals voor gemakkelijke manipulatie.
- Construct een reflecterende koepel dekken voor het apparaat door de voering van de binnenkant van een doos groot genoeg ter dekking van de dia kamer en steiger met aluminiumfolie. Gebruik een 1 mL pipet tip doos voor een enkele kamer of een 150 x 150 mm x 150 mm kartonnen doos voor meerdere, verticaal gestapeld chambers.
2. Voorbehandeling van het photobleaching van weefselsecties
Opmerking: weefsel sectie voorbereiding kan variëren afhankelijk van de bron van de weefsels en de fixatie en de gebruikte methoden te embedding. Hier, hersenweefsel (orbitofrontale gyri) van een geval van FTLD-T werd bevestigd in formaline, doorlopen een verloop van sacharose, ingebed in de OCT en teruggebracht tot 10 µm dik secties met behulp van een cryostaat dagenlang ~ 2.
- In een 4 ºC koude kamer, koude kabinet of koelkast, oriënteren de lamp onder de steiger en plaats de monsterkamer op het schavot. Giet 50 mL azide-TBS oplossing in de monsterkamer.
- Submerge weefselsecties gemonteerd op standaard glas Microscoop dia's in de zaal van de dia met azide-TBS met behulp van schone pincet. Voor meerdere dia's, zorg er ook voor dat de dia's in de zaal op een enkellaags.
- Betrekking hebben op het apparaat met de reflecterende koepel, inschakelen van de LED-lamp en incubeer gedurende 48 uur bij 4 ° c.
3. Immunofluorescentie
- vlek van het weefsel voor gefosforyleerd tau met behulp van de DAPI counterstain en Alexa 488- en Texas Red-geconjugeerde secundaire antilichamen, eerst voorbereiden oplossingen voor antigeen ophalen, permeabilization, blokkeren en primaire antilichaam-bindende.
- Bereiden 500 mL antigeen ophalen buffer (citroenzuur van 10 mM, 2 mM ethyleendiamminetetra zuur, 0,05% Tween-20; pH 6.2) door het oplossen van 0,92 g citroenzuur en 0,37 g ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) in 500 mL ddH 2 O. aanpassen de pH naar 6.2 met NaOH en Voeg 0,25 mL Tween 20.
- 500 mL van 0,025% bereiden Triton X-100 in TBS oplossing (TBS-Triton) door toevoeging van 0,125 mL van Triton X-100 tot 500 mL 1 x eetlepels
- Voorbereiden een 1% bovien serumalbumine (BSA) oplossing in TBS (BSA-TBS buffer) door het oplossen van 0.1 g BSA 10 ml eetlepels
- Bereid een blokkerende oplossing door toevoeging van 0,2 mL van normale geit serum tot 1.8 mL van de 1% BSA/eetlepels
- Voor elke dia 150 µL van primair antilichaam oplossing (1:100 verdunning) te bereiden door pipetting 1.5 µL van anti-phospho-PHF-tau pSer202 + Thr205 (AT8) antilichaam in 148.5 µL van 1% BSA-TBS buffer en laat op ice.
- Voor het uitvoeren van antigeen ophalen, onderdompelen photobleached dia's verticaal in een dia verzamelaar met 25 mL antigeen ophalen buffer. Beveilig de verzamelaar met tape en/of tekenreeksen zodanig dat de verzamelaar niet in het waterbad valt. Verwarm de verzamelaar in een waterbad bij 90 ° c gedurende 30 minuten en laat de verzamelaar afkoelen tot kamertemperatuur gedurende 30 minuten voordat u de dia's verwijdert. Ken niet verwijderen de dia's onmiddellijk als het leiden de secties tot zal te drogen.
- Overbrengen van de dia's van de verzamelaar van antigeen ophalen in een kleuring pot gevuld met 30 mL TBS-Triton en wassen van de secties gedurende 5 minuten op een roteerschudapparaat met zacht schudden. Herhaal het wassen een keer met vers TBS-Triton. Pit weg overtollige buffer met een stofvrije tissue en schetsen van het weefsel met een hydrofobe pen. Wees voorzichtig niet te laten uitdrogen dia's.
- Voor elke dia blokkeren van het weefsel door pipetting 200 µL van het blokkeren van de oplossing op het weefsel en de dia in een bevochtigde zaal plaats. Construeer de kamer door het plaatsen van een dia-rek in een pipet tip doos met een natte papieren handdoek. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur op een vlakke ondergrond. Zorgen dat de blokkerende oplossing volledig heeft betrekking op het weefsel.
- De blokkerende oplossing verwijderen door aspiratie en Pipetteer 100-150 µL van primair antilichaam oplossing op het weefsel. Zorgen voor voldoende hoeveelheid antistoffen aanwezig is en dat de sectie op een vlakke ondergrond om te voorkomen dat bundeling van antilichaam oplossing aan de ene kant is. Incubeer bij 4 ° c 's nachts in een bevochtigde kamer.
- Het secundair antilichaam mengsel en de DAPI nucleaire counterstain voorbereiden.
- Voor elke dia 150 µL van secundair antilichaam mengsel (1:100 verdunningen) door toevoeging van 1,5 µL van geit-antimuis Alexa 488 en 1,5 µL van geit-antimuis Texas rood tot 147 µL van BSA-TBS voor te bereiden en laat op ice.
- Voorbereiden 0,1 µg/mL DAPI counterstain door seriële verdunning. Meng de stockoplossing en verdunnen 1 µL van voorraad 5 mg/mL DAPI in 999 van TBS 1 mL 5 µg/mL oplossing maken. Verdun voor elke dia 3 µL van 5 µg/mL oplossing met 147 µL van TBS om een eindconcentratie van 0,1 µg/mL.
Let op: DAPI is een bekende mutagene stof en moet met zorg worden behandeld.
- Verwijderen van het primaire antilichaam door aspiratie. Het onderdompelen van de dia's in een glazen pot met 30 mL TBS-Triton en wassen voor 5 min met zacht mengen op een roteerschudapparaat kleuring. Herhaal de stap wassen met verse TBS-Triton. Pit weg overtollige TBS-Triton en Pipetteer 100 tot 150 µL van secundair antilichaam mengsel aan elke dia.
- Zorg ervoor het weefsel wordt volledig gedekt door het antilichaam-mengsel. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in de bevochtigde zaal in het donker.
- Verwijderen van het secundair antilichaam mengsel door aspiratie en breng de dia in een glazen pot met 30 mL TBS (geen Triton) kleuring. Wassen voor 5 min met zacht mengen op een roteerschudapparaat. Herhaal de stap wassen met verse eetlepels 100 tot 150 µL van 0,1 µg/mL DAPI counterstain toepassen op elke dia en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- De dia's overbrengen in een glazen pot met TBS kleuring en 3 keer wassen met zacht mengen voor 5 minuten elk, met behulp van verse TBS voor elke wasbeurt. Wick weg overtollige buffer.
- Van toepassing 3 druppels van waterige montage middellange tot het weefsel. Met behulp van Tang, zachtjes lager een dekglaasje schoon glas aan op het weefsel, beginnen met een van de randen en langzaam het verlagen van de andere rand te overvullen van luchtbellen vermijden. Wees voorzichtig niet te verjagen van de dekglaasje aan als imaging onmiddellijk. Anders, laat het medium van de montage te drogen voordat u ze opslaat bij 4 ° c in het donker.
4. Fluorescentie microscopie
- beurt de fluorescentie-lamp, de Microscoop en de computer en het toestaan van de lamp tot warm gedurende 15 min. plaats het gekleurd weefsel dia's in de fluorescentie Microscoop fase. Het beeld helder veld gebruiken om te zoeken van het weefsel bij 10 x vergroting.
- Pas een druppel ddH 2 O voor het dekglaasje aan oppervlak en gebruik een objectief van 20 x water onderdompeling (NB = 1.0). Selecteer de 4-regelig gemiddelde vliegtuig scan instellen. Stel de grootte van de pinhole aan 1 luchtige eenheid die een optische segment van ~ 3 micron geeft. Selecteer de laser excitatie en emissie golflengten voor elke fluorophore in afzonderlijke tracks voor beste signaal.
Opmerking: Alexa 488: λ ex = 488 nm (argon laser) λ em = 493-570 nm; Texas rood: λ ex = 561 nm (DPSS 561 nm laser), λ em = 601-635 nm; DAPI: λ ex = 405 nm (laser Diode 405), λ em = 410-507 nm.- Pas de kracht van de laser en krijgen van instellingen voor het optimaliseren van de signaalsterkte voor elke track. De samengestelde afbeelding verzamelen en opslaan. Gebruik van dezelfde laser instellingen te vergelijken van de intensiteit van de fluorescentie in een andere dia.
- Voor visualisering van de intensiteit van de fluorescentie in elk kanaal, installeren de RGB-profiel tools macro voor ImageJ 10. Sla de macro op de webpagina als een tekstbestand (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt). Selecteer in het menu ImageJ Plugins - > macro - > installeren; Selecteer het tekstbestand dat de RGB-profielen hulpprogramma te installeren.
- Open van de confocal afbeeldingsbestand in ImageJ en omzetten in de samengestelde afbeeldingen van de 3 stapeltjes RGB-door het uitvoeren van de volgende: beeld - > Color - > kanaal Tool. Selecteer " composiet " uit het dropdownmenu en controleer alle drie kanalen. Selecteer beeld - > Type - > RGB kleur.
- Selecteer het pictogram hulpprogramma's van RGB-profiel en een lijn aanzuigen en de sectie in de afbeelding om te worden geprofileerd. De intensiteit-gegevens opslaan als een spreadsheet voor het plotten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De stap van de voorbehandeling photobleaching kan worden toegevoegd aan een standaard immunofluorescentie protocol onmiddellijk voorafgaand aan de herwinning van het antigeen en immunokleuring (figuur 1A). Vergadering van het photobleaching apparaat kan ook worden uitgevoerd met behulp van diverse, goedkoop, overal verkrijgbare componenten (figuur 1B). Het emissiespectrum van witte fosfor LEDs bestrijkt een breed scala van golflengtes, waardoor ze geschikt is voor breed scala photobleaching, eens met vorige verslagen (Figuur 1 c)5,11. Na 48u photobleaching, werd de intensiteit van autofluorescent spikkels die lijken op zowel lipofuscin als algemene achtergrond fluorescentie aanzienlijk verminderd in beide emissie golflengten in een onbevlekt sectie van FTLD-T (Figuur 1 d). De werkzaamheid van photobleaching aangetoond, gekleurd we voor hyperphosphorylated tau te visualiseren pathologische tau inclusies in een geval van FTLD-T, met twee verschillende secundaire antilichamen. De aparte vorm van insluitsels van tau en het gebruik van twee chromophores voor het labelen van ook kunnen we vol vertrouwen onderscheiden autofluorescent kenmerken van de beoogde doelstellingen voor het valideren van de techniek.
In de samengestelde afbeeldingen bij lagere vergroting, de morfologie van de tau-positieve insluitsels, gekleurd geel uit de combinatie van Alexa 488 en Texas Red kanalen, bestaat uit ringvormig collecties van korte cel processen die worden aangeduid als ' astrocytic plaques' (Figuur 2a-c). Deze morfologie is kenmerkend voor corticobasal degeneratie (CBD)12,13, die met het verslag van de pathologie van deze zaak instemt. Het onbehandelde monster, talrijke structuren in de samengestelde afbeelding die deed niet lijken op tau insluitsels, en toonde fluorescentie vooral in het rode kanaal, wat suggereert dat er autofluorescence aanwezig zijn in plaats van beoogde antilichaam kleuring. Een merkbare hoeveelheid fluorescentie van de achtergrond is ook zichtbaar in dit kanaal in het gezichtsveld (Figuur 2a). Deze autofluorescent-functies zijn verwijderd en het algemene beeld verschijnt veel schoner wanneer monsters werden behandeld met photobleaching (PB) en de chemische quencher (Figuur 2b-c).
We vervolgens de fluorescentie verschillen in deze monsters gekwantificeerd door profilering van een kleiner gebied in elk monster. Een enkele astrocytic plaque wordt gepresenteerd in elke behandeling staat voor vergelijking (figuur 2d-r). In het onbehandelde monster, achtergrond fluorescentie is aanwezig in alle drie kanalen, maar secundair antilichaam fluorescentie voor zowel Alexa 488 en Texas Red antilichamen was relatief hoog (Fig 2h). Echter, had de autofluorescent structuren aanwezig in het monster van onbehandeld fluorescentie intensiteiten in de Texas rood kanaal vergelijkbaar met de Texas Red secundair antilichaam dat gekleurd voor tau (Figuur 2 h). Als het doel-eiwit niet een duidelijke, voorspelbare morfologie zoals tau in ons geval hebben, zou het autofluorescence in het weefsel hebben gemaakt de afbeelding uninterpretable.
Daarentegen wanneer de voorbehandeling photobleaching werd toegepast vóór immunokleuring, achtergrond fluorescentie in de Alexa-488 en Texas rode kanaal was aanzienlijk verminderd ten opzichte van de onbehandelde monster en de fluorescentie van immunostained tau bleef onaangetast (figuur 2i-m). De commerciële chemische quencher uitgeblust net zo effectief als photobleaching de autofluorescence in de Alexa 488-kanaal. Het onderdrukt ook de DAPI achtergrond fluorescentie, die niet werd beïnvloed door de 48u photobleaching behandeling (Figuur 2 m). Echter, de chemische quencher ook verminderd de intensiteit van de Texas Red secundaire en DAPI signalen, suggereren een zekere mate van contraproductief blussen (figuur 2n-r).
Figuur 1 : Toepassing van de voorbehandeling van het photobleaching in een werkstroom standaard immunofluorescentie. A) vereenvoudigd schema van het protocol van de standaard immunofluorescentie uit weefsel verwerving aan imaging. Toepassing van primaire en secundaire fluorescerende antilichamen wordt vertegenwoordigd door cartoons. De afbeelding van een representatieve Microscoop wordt geproduceerd. Schaal bar = 100 µm. B) een representatieve photobleaching apparaat gebouwd met behulp van off-the-shelf onderdelen (reflecterende deksel is niet afgebeeld). C) emissie spectrum van witte LED-array. Een smalle uitstoot piek bij 450 nm en een brede piek bij 550 nm in acht worden genomen. D) effect van photobleaching op endogene achtergrond fluorescentie van FTLD-T weefsel op Alexa 488 (493-570 nm) en Texas rode (601-635 nm) emissie golflengten. Autofluorescent spikkels lijkend op lipofuscin zijn zichtbaar na 48u photobleaching gereduceerd. Schaal bar = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2:Effect van verwijdering van de autofluorescence op de beeldkwaliteit van een geval van FTLD-T weefsel met anti-phosphorylated tau immunokleuring. a-c) lage vergroting, samengestelde immunofluorescentie beelden van representatieve gezichtsveld in onbehandelde (a), photobleached voor 48 h (b) en chemische quencher behandeld (c) monsters. De kleuren vertegenwoordigen fluorescentie in de volgende kanalen via excitatie door hun respectieve lichtbronnen: Alexa 488 (groen): λex = 488 nm (argon laser) λem = 493-570 nm; Texas Red (rood): λex = 561 nm (DPSS 561 nm laser), λem = 601-635 nm; DAPI (blauw): λex = 405 nm (laser Diode 405), λem = 410-507 nm. Schaal bar = 100 µm. d-r) beelden met een hogere vergroting van de gestippelde gebieden in onbehandeld (d-g), photobleached (i-l) en chemische quencher behandeld (n-q) monsters, met aparte fluorescentie kanalen, afbeelding samengevoegd en gekwantificeerd fluorescentie signaal profielen. Stippellijnen in de samengevoegde kanalen (g, l, q) vertegenwoordigen de lijn op welke signaal profielen (h, m, r) zijn gegenereerd. Schaal bar = 50 µm. Autofluorescent deeltjes (af),immunolabeled tau fluorescentie (tau) en nucleus signaal (NOC) worden vermeld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De photobleaching voorbehandeling van weefsels die worden beschreven in dit manuscript zorgt voor effectieve eliminatie van autofluorescence overal verkrijgbare componenten gebruiken. Het protocol beschrijft immunofluorescentie beeldvorming van gefosforyleerd tau aggregaten in formaline-vaste menselijk hersenweefsel met behulp van secundaire antilichamen zijn geconjugeerd met Alexa 488 en Texas rood, met DAPI als een nucleaire counterstain. Om de methode toepassen op andere weefsels, is het raadzaam voor het uitvoeren van een 48u photobleaching voorbehandeling aan het monster als uitgangspunt. Voer na photobleaching, de standaard immunofluorescentie kleuring protocol voor de functies van belang met behulp van antilichaam verdunningen na aanbevelingen van de fabrikant. Als achtergrond fluorescentie nog steeds aanwezig is, moet de photobleaching duur en/of het antilichaam kleuring stappen worden gewijzigd. De duur van photobleaching hangt af van de lamp geselecteerd voor de bouw van de apparatuur en het niveau van autofluorescence in de steekproef. De optimale bleken tijd voor elke unieke lamp-apparatuur moet worden bepaald. Dit kan gebeuren door photobleaching een onbevlekt, coverslipped weefselsectie gemonteerd in TBS-azide en het meten van de endogene fluorescentie van de dia tussenpozen 12u met behulp van een fluorescentie Microscoop. In eerdere verslagen, gecontroleerd we lipofuscin photobleaching door deeltjes analyse en kromme montage op exponentiële afname5functies, maar voor eenvoud, visuele waarneming van de secties op gezette tijden kan even effectief te beoordelen de duur op die de meeste van de fluorescentie wordt uitgeblust. In ons geval van leeftijd hersenweefsel met grote hoeveelheden lipofuscin pigmenten, was 48 uur incubatie met een 800 lux lamp voldoende. Als het specifieke signaal zwak in vergelijking met de achtergrond na photobleaching blijft, kunt u overwegen verhoging van de concentratie van primaire en secundaire antilichamen tijdens kleuring. Het is ook belangrijk voor het uitvoeren van een tweede antilichaam-alleen controle om ervoor te zorgen dat het signaal van de achtergrond wordt niet veroorzaakt door niet-specifieke secundaire antilichaam binding. Zorg om te selecteren van antilichamen die niet cross-react, vooral wanneer kleuring voor meerdere doelen. Bovendien zorgen dat de specifieke signalen niet per ongeluk de kleuring tijdens zijn uitgeblust. Bijvoorbeeld, is Nissl vlekken (voor vlekken neuronen) uitgeblust door BSA. In dit geval moet de BSA-component van de blokkerende oplossing worden vervangen door alternatieven zoals gelatine5van de huid van de vis.
Het gebruik van witte fosfor LEDs voor photobleaching heeft bepaalde beperkingen als gevolg van het emissiespectrum van 420 nm tot 650 nm. Geen significante photobleaching in de UV-golflengtes is dus mogelijk. Ook vanwege het brede spectrum van de emissie, photobleaching chromophores van specifieke golflengten vereist wijzigingen zoals bedekken kleurenfilter vellen boven de LED-arrays op het uitfilteren van ongewenste emissie golflengten. Bovendien, photobleaching van weefsel mogelijk langere doorlooptijden dan andere methoden. In dit geval, als gevolg van de leeftijd van het hersenweefsel (van een individu van de 89-jarige) en de lange aldehyde fixatie periode van meer dan 2 dagen was een 48u photobleaching duur nodig. Hoewel geen actieve verwerkingstijd vereist is, moet men rekening houden met de tijd photobleaching en plan de kleuring sessie dienovereenkomstig. LED-lampen van hogere lichtsterkte of het gebruik van meerdere lampen kan aanzienlijk minder tijd in photobleaching door de eenvoudige stijging foton-flux.
In vergelijking met bestaande methoden, biedt onze techniek een aantal significante voordelen. In tegenstelling tot photobleaching scannen lasers met fluorescentie microscopie, vastgesteld we hebben geen tekenen van foto-veroorzaakte schade van onze voorbeelden met behulp van LED photobleaching. Een ander groot voordeel van onze toestellen is de aanzienlijke afname van de kosten over andere technieken. De kosten van de vergadering van onze toestellen is ongeveer $10 USD, en de vergadering van het apparaat is flexibel genoeg dat elk laboratorium hun eigen versie van de photobleacher nemen kan. Ter vergelijking: andere methoden met behulp van multispectrale leidde matrices met aangepaste dia houders en koeling kamers tot $1000 USD voor de bouw van8vereist. Daarnaast zijn commerciële chemische quenchers verbruiksgoederen die kosten $120 USD voor 100 dia's en de invoering van ongewenste verbindingen in het monster. De chemische quencher gebruikt voor de vergelijking in de huidige studie waarschijnlijk bevat de lipide-bindende Sudan Black kleurstof, die met immunokleuring van lipoproteïnen interfereren kan.
Over het algemeen de meest kritische stappen in de photobleaching voorbehandeling en immunokleuring van het model omvat de behandeling van de sectie tijdens immunokleuring. Het is belangrijk dat zodra het sectie is gerehydrateerd tijdens photobleaching, is het niet toegestaan te drogen in een van de volgende stappen. Drogen van de dia zal leiden tot ongelijke verdeling van antilichamen en uninterpretable artefacten. Om te voorkomen dat het verlies van tijd en potentieel waardevolle monsters, moet worden gezorgd bij de verschillende stappen in het protocol. Na antigeen ophalen, kunt u het weefsel afkoelen voordat de overdracht aan de TBS-Triton permeabilization oplossing. Zelfs kortstondige blootstelling aan lucht wanneer het monster wordt verwarmd tot hoge temperaturen zal veroorzaken momentane drogen van het weefsel. Ook voor zorgen dat antilichaam, blokkeren of counterstain oplossingen volledig te de weefsels tijdens de toepassing dekken. Dit kan worden bereikt door ervoor te zorgen dat het weefsel volledig is geschetst door de hydrofobe pen om te voorkomen dat de afspoeling van de oplossing en dat alle oplossingen worden toegepast in een bevochtigde kamer op een vlakke ondergrond. Dit is vooral belangrijk tijdens nachtelijke incubations (primair antilichaam binding).
De succesvolle toepassing van photobleaching gebruik van witte fosfor LEDs voorafgaand aan kleuring kan het vergemakkelijken van de toepassing van immunofluorescentie methoden voor gearchiveerde weefsels. Het is een veelzijdige en goedkope behandeling die we verwachten in de toekomst vatbaar voor een breed scala van specimens. Hoewel we deze methode alleen op menselijk hersenweefsel toegepast hebben, deze techniek gemakkelijk kan worden opgenomen in elk kleuring protocol in welke autofluorescence is het voorkomen van wenselijk resultaten, met name in postmitotic weefsel zoals cardiale of skelet spieren waar lipofucin is meer kans om te accumuleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund in geheel of gedeeltelijk door de Canadese Consortium van neurodegeneratie en veroudering (CCNA), het Canadese Instituut van gezondheid onderzoek (CIHR), de ALS Society of Canada (ALS Canada), en de maatschappij van Alzheimer van Canada (ASC). De auteurs bedank Sultan Darvesh en Andrew Reid van de maritieme weefselbank van de hersenen voor het verstrekken van de FTLD hersenen weefsels, Milaan Ganguly uit de Spatio-temporele Targeting en versterking van straling reactie (STTARR) programma en haar verbonden financiering van agentschappen voor weefsel insluiten en segmenteren van diensten, en de geavanceerde optische microscopie Facility (AOMF) voor het verstrekken van microscopie instrumenten. Kevin Hadley is bedankte voor kritische evaluatie van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Sodium Choloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Hydrochloric Acid | Caledon Laboratory Chemicals | 1506656 | |
| Sodium Azide | BioShop Canada | SAZ001 | |
| 100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish | Sarstedt | 82.9923.422 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| 6 W LED Dimmable Desk Lamp | DBPower | DS501 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| Citric Acid | Sigma-Aldrich | C-2404 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop Canada | EDT001 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| Sodium Hydroxide | BioShop Canada | SHY700.1 | |
| Water bath | Haake Fisons | K15 | |
| Slide collector | FisherScientific | 12-587-17B | |
| Staining Jar | FisherScientific | E94 | |
| Orbital Shaker | Bellco Glass | 7744-08115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T7878 | |
| Bovine Serum Albumin | FisherScientific | BP1600-1 | |
| Normal Goat Serum | Aurion | 905.002 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z672548-1EA | |
| Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8) | ThermoFisher | MN1020 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X | ThermoFisher | T862 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-11029 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | ThermoScientific | 28-600-42 | |
| Glass soverslip | |||
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | |
| Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0 | Zeiss | LSM710 | Software accompanies the Confocal Microscope |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| RGB Profile Tools macro | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt | |
| Commercial chemical quencher | Biotum | 23007 |
References
- Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. J Investig Med. 47 (6), 326-332 (1999).
- Terman, A., Brunk, U. T.
- Del Castillo, P., Llorente, A. R., Stockert, J. C. Influence of fixation, exciting light and section thickness on the primary fluorescence of samples for microfluorometric analysis. Basic Appl Histochem. 33 (3), 251-257 (1989).
- Ottis, P., Koppe, K., et al.
- Sun, Y., Chakrabartty, A. Cost-effective elimination of lipofuscin fluorescence from formalin-fixed brain tissue by white phosphor light emitting diode array. Biochem Cell Biol. 94 (6), 545-550 (2016).
- Davis, A. S., Richter, A., et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Pepperkok, R. Spectral imaging and its applications in live cell microscopy. FEBS Lett. 546 (1), 87-92 (2003).
- Duong, H., Han, M. A multispectral LED array for the reduction of background autofluorescence in brain tissue. J Neurosci Methods. 220 (1), 46-54 (2013).
- Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS One. 3 (5), 1-7 (2008).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Robertson, J. B., Zhang, Y., Johnson, C. H. Light-emitting diode flashlights as effective and inexpensive light sources for fluorescence microscopy. J Microsc. 236 (1), 1-4 (2009).
- Mackenzie, I. R. A., Neumann, M. Molecular neuropathology of frontotemporal dementia: insights into disease mechanisms from postmortem studies. J Neurochem. 138 (S1), 54-70 (2016).
- Kouri, N., Whitwell, J. L., Josephs, K. A., Rademakers, R., Dickson, D. W. Corticobasal degeneration: a pathologically distinct 4R tauopathy. Nat Rev Neurol. 7 (5), 263-272 (2011).
