Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Laser Microirradiation om te studeren In Vivo cellulaire reacties op eenvoudige en complexe DNA-schade

Published: January 31, 2018 doi: 10.3791/56213
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2, 2,3,4, 1
1Department of Biological Chemistry, School of Medicine, University of California, Irvine, 2Beckman Laser Institute and Medical Clinic, University of California, Irvine, 3Department of Developmental and Cell Biology, School of Biological Sciences, University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering and Surgery, University of California, Irvine
* These authors contributed equally

Summary

Het doel van dit protocol is te beschrijven hoe laser microirradiation voor het opwekken van verschillende soorten DNA-beschadiging, met inbegrip van relatief eenvoudige strand einden en complexe schade, aan de studie van DNA schade signalering en reparatie factor montage op schade sites in vivo .

Abstract

DNA-beschadigingen induceert specifieke signalering en reparatie reacties in de cel, die is van cruciaal belang voor de bescherming van de integriteit van het genoom. Laser microirradiation werd een waardevol experimentele instrument te onderzoeken de DNA schade reactie (DDR) in vivo. Hierdoor real-time hoge resolutie eencellige analyse van macromoleculaire dynamiek in reactie op laser-veroorzaakte schade beperkt tot een submicrometer regio in de celkern. Verschillende laser omstandigheden zijn echter gebruikt zonder waardering van verschillen in de soorten schade veroorzaakte. Dientengevolge, de aard van de schade is vaak niet goed gekenmerkt of gecontroleerd, waardoor de schijnbare tegenstrijdigheden in de aanwerving of wijziging profielen. We toonden aan dat verschillende bestraling voorwaarden (d.w.z., verschillende golflengten evenals verschillende input bevoegdheden (irradiances) van een femtoseconde (fs) nabij-infrarood (NIR) laser) proteïne assembly's van verschillende DDR en reparatie geïnduceerde. Dit weerspiegelt het soort DNA schade geproduceerd. Dit protocol beschrijft hoe titratie van laser ingangsvermogen toestaat inductie van verschillende hoeveelheden en complexiteit van de DNA-beschadiging, die gemakkelijk kan worden gecontroleerd door detectie van base en crosslinking schade, differentiële poly (ADP-ribose) (PAR) signalering, en traject-specifieke reparatie factor assemblages op schade sites. Nadat de schade-voorwaarden zijn vastgesteld, is het mogelijk om te onderzoeken van de effecten van verschillende schade complexiteit en differentiële schade signalering en uitputting van de upstream factor(en) op enige factor van belang.

Introduction

In Vivo DNA schade signalering is niet goed begrepen
In vivo, is DNA complexvorm met histonen en andere factoren aan formulier chromatine vezels. Regulering van de structuur van de chromatine is van het allergrootste belang voor DNA-metabolisme. Bijvoorbeeld, is de Histon variant H2AX phosphorylated door Ataxie Teleangiëctasie gemuteerd (ATM) en andere kinases volgende dubbel-strand (DSB) inductie breekt, en is belangrijk voor DSB schade signaal versterking, alsmede het verstrekken van een docking site voor andere factoren. Verspreiding van schade signalering en reparatie traject keuze lijken te kritisch worden beïnvloed door lokale chromatine structuur bij schade sites1. Een aantal chromatine remodeling factoren, histone chaperones en Histon wijzigen enzymen inderdaad schade sites worden gerekruteerd en zijn belangrijk voor efficiënte DNA-reparatie, benadrukken het belang van chromatine verordening in de DDR en2 reparatie , 3 , 4. bovendien schade site clustering of herpositioneren werd waargenomen in gist en drosophila5,6,7,8, die doet denken aan Herlokalisatie van gene loci in de subnuclear compartiment gene verordening9,10is gekoppeld. Recente studies in muizen en menselijke cellen bleek ook mobilisatie van DSB sites, welke invloeden trouw en traject keuze11,12 repareren. Dit leidt tot de mogelijkheid dat DDR/reparatie ook worden nauw met nucleaire architectuur, organisatie van de chromatine van hogere-orde en chromosoom dynamiek in de celkern verbonden kan. Het is dus een kritische studie van de DDR en herstelprocessen in het kader van de endogene nucleaire omgeving in een levende cel om te begrijpen van de korte - en lange termijn gevolgen van DNA-beschadiging high-resolution methoden te ontwikkelen.

Kritische rol van PAR Polymerase (PARP) in het meten van de omvang en de soort schade en het regelen van eiwit vergadering op de Site van de schade
PARP1 is een DNA nick sensor snel geactiveerd door DNA-schade die een cruciale rol in DNA reparatie13 speelt. PARP1 was oorspronkelijk gedacht te functioneren samen met X-Ray repareren Cross aanvulling 1 (XRCC1) ter vergemakkelijking van de base excision repair (BER), maar recente studies onthullen haar rol in andere DNA repair pathways, met inbegrip van DSB reparatie14. PARP1 gebruik nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) geactiveerd als substraat om ADP-ribosylate meerdere doel eiwitten, met inbegrip van zelf. Dit enzym en andere familieleden hebben aangetrokken veel aandacht in de afgelopen jaren als PARP-remmers als veelbelovende therapeutische geneesmiddelen voor kanker opgedoken. Hoewel de PARP-remmers bleken aanvankelijk te worden effectief in het borstkankergen (BRCA)-gemuteerd borstkankercellen, er is nu een overvloed aan bewijs voor de gevolgen daarvan in mono- en combinatie therapieën samen met DNA beschadigen agenten/bestraling tegen een breed spectrum van kanker met mutaties niet beperkt tot BRCA15,16,17,18,19,20.

Op moleculair niveau, werd PARP activering getoond om te spelen belangrijke rol bij het organiseren van de structuur van de lokale chromatine op schade sites. PAR-afhankelijke aanwerving van chromatin wijziging enzymen vergemakkelijkt DSB reparatie en dicteert herstel traject keuzes, suggereren de belangrijke steigers rol van PAR wijziging op schade sites. 13,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31 we onlangs aangetoond de uitsluiting van p53-bindend-proteïne 1 (53BP1) tegen schade door PAR 32, bieden een alternatieve verklaring voor 53BP1-afhankelijke hyperactivering van niet-homologe endjoining (sites NHEJ) door de PARP-remmer en het benadrukken van het belang van PARP in DSB repareren traject keuze33,34. PARP1 ook factoren rechtstreeks PARylates en is van invloed op de activiteit van meerdere DNA repair14.

Met behulp van Laser Microirradiation als een instrument om te studeren DDR/reparatie In Vivo
Laser microirradiation tot sub micron wijzigingen op afzonderlijke chromosomen werd eerst beschreven in 196935 en herzien in detail in 198136. Enkele decennia later, laser microirradiation bleek voor het opwekken van DNA-beschadiging op een gedefinieerde submicrometer regio in de celkern, en bleek te zijn een waardevolle techniek te studeren aanwervings- en wijzigingen van verschillende factoren aan DNA laesies in vivo 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41. deze methode maakt de ontdekking van de factoren die geen aparte bestraling-geïnduceerde foci (IRIF vormen) bij schade sites39,42. Het is ook mogelijk om te onderzoeken de spatio dynamiek van chromatine structurele wijzigingen zowel op schade plaatsen en in de rest van de kern. Wij zorgvuldig ten opzichte van de DDRs die zijn geïnduceerd door verschillende laser-systemen en de inbreng van de bevoegdheden om te evalueren van de relatie tussen het type van DNA-schade en de microirradiation voorwaarden32,43,44, 45. De afwijkende werving patronen van 53BP1 en Telomere Herhaal bindende factor 2 (TRF2) werden waargenomen in de vorige laser schade studies, die vormde de basis voor de terugkerende zorg voor de "niet-fysiologische" aard van de laser-veroorzaakte schade46 ,47,48,49. We vonden dat deze duidelijk verschillen nu kon worden verklaard door differentiële PARP signalering die meters de hoeveelheid en complexiteit van geïnduceerde schade32. We bevestigd dat: 1) laser-microirradiated cellen (zelfs na hoge input-power bestraling) in interfase in een schade checkpoint controle-afhankelijke manier worden gearresteerd en levensvatbaar blijven (minstens tot 48 h)32,50; en 2) reparatie factor werving/wijzigingen getrouw recapituleren die waargenomen met de behandeling met conventionele DNA schadelijke stoffen en DSB inductie door enzym32,39,42, 44,,50,51,52. Deze resultaten is groot voorstander van de fysiologische relevantie van het bestuderen van laser schade-geïnduceerde cellulaire reacties.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. fundamentele cel voorbereiding

Opmerking: Deze stap is voor standaard immunofluorescentie detectie van de endogene eiwit aanwerving of wijziging, en voor het gebruik van een cellijn stabiel uiten een fluorescently tagged recombinant eiwit. Bijvoorbeeld, studie Potorustridactylus (PtK2) buideldier nier epitheliale cellen stabiel uiting van EGFP-53BP11220-1711 of -TRF2-YFP werden gebruikt in onze eerdere (Figuur 1)32. In het eerste geval, de focus vormen van de regio 53BP1 (aminozuur 1220-1711) waarin de oligomerisatie domein, het Tudor domein en het ubiquitylation-afhankelijke werving (UDR) motief, was gesmolten tot verbeterde GFP (EGFP-53BP11220-1711). Deze fusieproteïne recapituleert de aanwerving van de site schade van de full-length 53BP153,54,55. HeLa cellen, moeten fluorescently tagged subeenheden van cohesin (b.v., hSMC1-GFP51, GFP-Scc1 (Rad21)52en GFP-SA2 51) worden stabiel uitgedrukt om efficiënte opneming in het complex en te recapituleren de S/G2 celcyclus fase-specifieke schade site aanwerving van de endogene cohesin51.

  1. Zaad van alle aanhangend celtype op een 35 mm weefselkweek schotel met een gerasterde dekglaasje aan met het oog op identificatie van de individuele cel. Het nummer van de eerste cel om 60% confluentie in 36-48 h op basis van het tarief van de proliferatie van de lijn van bepaalde cel aanpassen. Bijvoorbeeld:
    1. Voor PtK2 buideldier nier epitheliale cellen (wild type of die stabiel uiting van EGFP-53BP11220-1711 of -TRF2-YFP): plaat 2.0 x 104 cellen in 2 mL geavanceerde Minimum essentiële Medium (MEM) aangevuld met 2 mM L-Glutamine, 4% foetale runderen serum (FBS) en antibiotica (100 U/mL penicilline en streptomycine van 100 µg/mL) en Incubeer bij 37 ° C met 7% CO2.
    2. Voor HeLa cellen stabiel tot uitdrukking te brengen fluorescently gelabeld recombinante eiwitten GFP-SA2: zaad 1.0 x 105 cellen in 2 mL Dulbecco van bewerkt Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 10% FBS, 2 mM L-Glutamine 100 U/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine, en Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2. Andere HeLa cellen kunnen ook worden gebruikt met inbegrip van ongewijzigde cellen of cellen hSMC1-GFP uitdrukken.
  2. Toestaan dat cellen vermenigvuldigen voor 36-48 h voordat DNA schade inductie aan 30-60% samenvloeiing (voor visualisatie van het raster nummer) te houden. Ga verder met deel 4.

2. een voorbijgaande transfectie

Opmerking: Soms goede antilichamen zijn niet beschikbaar voor het detecteren van de endogene eiwitten. Als cellijnen stabiel uiten marker eiwitten niet beschikbaar zijn, voert u tijdelijke transfections te volgen van fluorescently geëtiketteerde eiwitten voor levende cellen analyses.

  1. HeLa cellen, op dag 1, 6-8 x 104 cellen in 0,5 mL voedingsbodems in een put van een 24-well-plate zaad en broeden in een 100% bevochtigde incubator bij 37 ° C en met 5% CO2. Zie stap 1.1 kweekmedia voorwaarden.
  2. Dag 2, gebruik een plasmide van de zoogdieren expressie codering een fluorescently tagged DNA repair factor (bijvoorbeeldGFP-NTH1 of GFP-OGG1 voor base schade32,44,56, GFP-Ku voor hoge dosis DSBs57, GFP-53BP1 32 voor relatief eenvoudige DSBs of andere proteïnen van belang gesmolten aan fluorescerende tag) voor het uitvoeren van liposoom-gemedieerde DNA transfectie. 0,3 µg plasmide DNA in 25 µL van voedingsbodems serumvrij in een tube van 1,5 mL verdund.
  3. In een andere tube van 1,5 mL, Verdun 1 µL liposoom gebaseerde DNA transfectiereagens in 25 µL van de serum-vrije cultuur media en meng voorzichtig.
  4. Meng voorzichtig de verdunde DNA en transfectie agent en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT) naar formulier lipide-DNA complexen.
  5. Cellen met 0,5 mL voedingsbodems eenmaal spoelen, verwijder het medium, en 0,5 mL verse cultuurmedia toevoegen aan de cellen (zoals in stap 1.1).
  6. De lipide-DNA complexen aan de cellen toevoegen. Meng voorzichtig door het schommelen van de plaat een paar keer. Zet de cellen terug in de incubator zoals in stap 2.1.
  7. Na 4-6 uur, verwijder het medium van de cultuur van de cellen en voeg 300 µL 0.05% trypsine-EDTA. Verwijderen, voeg 200 µL trypsine-EDTA, en broeden in de incubator van de 37 ° C gedurende 3-4 minuten.
  8. Nadat u hebt bevestigd dat de cellen zijn vrijstaand, voeg 800 µL cultuurmedia en resuspendeer de cellen door zachtjes pipetteren om te breken met de cel klontjes. De celsuspensie overbrengen naar een 35 mm cultuur schotel met een gerasterde dekglaasje aan, en cultuur media toevoegen aan een eindvolume van 2 mL.
  9. Incubeer de cellen in de incubator zoals in stap 2.1 voor 48 h, dan gaat u verder met sectie 4.
    Opmerking: Als de uitdrukking van de recombinante eiwitten giftig is (transfected cellen tonen ronde of onregelmatig morfologie na incubatie in stap 2.8), verkorten expressie, en het uitvoeren van laser microirradiation (afdeling 4) op 16-20 h na transfectie, zolang de eiwit expressie kan worden bevestigd (voor de detectie van de fluorescentie, zie stap 4.3). In dit geval transfectie rechtstreeks in de 35 mm-schotel uitvoeren. Zaad 3.0 x 105 HeLa cellen in een 35 mm-schotel met een gerasterde dekglaasje aan te bereiken ongeveer 50-70% samenvloeiing na 30 h. Transfect DNA-plasmiden, media 2-6 h wijzigen na transfectie. Doorgaan met laser microirradiation 12-20 h later als eiwit expressie redelijk is en cellen gezond lijken.

3. de celcyclus synchronisatie

Opmerking: Voor homologe recombinatie reparatie (HR) eiwitten, zoals Rad51 en cohesin, de aanwerving is meer prominent in de S/G2 fase van de celcyclus, in welke HR reparatie plaats51 neemt. Dus, als u wilt controleren de aanwerving van deze proteïnen, cel synchronisatie naar S/G2 fase noodzakelijk is.

  1. S/G2 fase synchronisatie
    1. Het dubbele thymidine blok protocol gebruiken voor synchronisatie van de cel tot en met S/G2 fase50,51. Na het zaaien van de cellen in een 35 mm gerasterde dekglaasje aan schotel (zie stap 1.1), Incubeer de cellen met thymidine (om een eindconcentratie van 2.5 mM) in kweekmedia (zoals in stap 1.1) voor 17u bij 37 ° C en 5% CO2.
    2. Spoel de cellen met 1 mL thymidine-vrije cultuur media (zoals in stap 1.1) tweemaal, en Incubeer de cellen in 2 mL thymidine-vrije cultuur media voor 9 h zoals in stap 1.1.
    3. 200 µL van 27.5 mM thymidine stockoplossing (ontbonden in kweekmedia) in de voedingsbodems met de cellen toevoegen om een eindconcentratie van 2.5 mM thymidine. Incubeer de cellen zoals in stap 3.1.1 voor een ander 15 h. spoelen en Incubeer de cellen in thymidine-vrije cultuur media voor 4-6 h en induceren van DNA-schade (afdeling 4).
    4. Synchronisatie efficiëntie bevestigen met behulp van de celcyclus markeringen (cycline A2 en B1 voor S/G2 en G2, respectievelijk), S/G2 fase-specifieke DNA schade reparatie factoren (bijvoorbeeld, Rad51 of cohesin), of door IdU/EdU opneming (voor de cellen van de fase van de S)51.
  2. G1 fase synchronisatie
    1. Zaad 6-8 x 104 HeLa cellen in een 35 mm cultuur schotel met gerasterde dekglaasje aan (stap 2.1).
    2. Na 2 dagen, metafasecellen, die lichtjes opgeheven en rond-gevormde, onder een omgekeerde Microscoop via 10 X objectieve en 10 X oogbeschadigingen en/of lenzen worden geïdentificeerd. Verwerven van beelden om op te nemen van de positie van de metafasecellen op het gerasterde dekglaasje aan.
    3. Na 3-4 h, bevestig celdeling in twee dochtercellen (in de G1-fase) en induceren van DNA-schade (afdeling 4).

4. titratie van Laser Input vermogen

Opmerking: In dit protocol, veroorzaken we DNA-beschadiging met behulp van een 780 nm gepulseerde fs NIR-lasersysteem is gekoppeld aan een confocal microscoop, of een 800 nm gepulseerde fs NIR laser gekoppeld aan een omgekeerde epi-fluorescentie Microscoop. Hoewel ingangsvermogen (werkelijke bestralingssterkte in het brandpunt van de laser in het model) die nodig zijn voor het opwekken van vergelijkbare DDR anders in deze systemen is, geldt het basisprincipe van ingangsvermogen titratie voor beide, of, NIR systemen32,57 . De in situ energie per laser pols en piek bestralingssterkte bij het centrale punt voor de twee laser-systemen werden in het bereik van 5,33 × 10-2-4 × 10-1 nJ en 7 × 1010-5.24 × 1011 W/cm2, respectievelijk32.

  1. Zet op de NIR-laser en laat het lasersysteem aan warming-up voor 1 uur vóór gebruik.
  2. Plaats een schotel van cellen in een verwarmde (37 ° C) werkgebied in een zaal waarmee CO2 (5%) en controle van de vochtigheid (100%).
    Opmerking: Als een CO2 kamer niet beschikbaar is, gebruikt u CO2-onafhankelijke voedingsbodems voor maximaal 5-6 uur. Als een verwarming stadium niet beschikbaar is, houden van de cellen onder de Microscoop voor < 20 min en onmiddellijk vervangen in de incubator weefselkweek met de juiste temperatuur, CO2, en controle van de vochtigheid. Deze cultuur voorwaarden kunnen variëren afhankelijk van het type van de specifieke cel gebruikt evenals het organisme van afleiding (b.v., zoogdieren versus amfibieën).
  3. Voor de analyse van de levende cel van fluorescently tagged eiwitten, selecteer een GFP filter (450-490 nm excitatie, 515-586 nm emissie) of Cy3 filter (540-552 nm excitatie, > 590 nm emissie) voor GFP of mCherry-gesmolten eiwit, respectievelijk met behulp van een 100 X of 63 X olie-immersie doelstelling.
  4. Zoeken naar cellen die vergelijkbare fluorescentie signalen hebben, als gevolg van vergelijkbaar niveau van eiwit expressie. Vermijd het gebruik cellen die te zwak of te sterk uitdrukking hebben teneinde de cel-naar-cel variabiliteit in fluorescentie metingen.
  5. Titreer de ingangsvermogen van de laser.
    1. 780 nm NIR laser gekoppeld aan een confocal microscoop
      1. Met de functie software bleekmiddel te richten lineaire nummers binnen de celkern voor blootstelling aan één laser scans (resolutie van 512 x 512 beeldpunten, zoom X1, gebleekt regio 50 x 4 pixels, 12,8 µs pixel nadruktijd, iteratie x1) via de doelstelling van de olie (100 X / 1.3 nb).
      2. Pas de laser transmissie percentage (met behulp van de software/hardware ingebouwd in het systeem van de Microscoop laser door de fabrikant) tot 5% zonder alle andere instellingen te wijzigen.
      3. Plaats een cel in het midden van het veld. Klik op het gebied van belang (ROI) tool, een lijn of vak (ongeveer 50 x 4 pixels) tekenen in de kern met behulp van de muis en klik op de knop "Bleekmiddel" DNA-schade veroorzaken.
        Opmerking: In latere bestraling stappen, "bleken" moet worden verhoogd in stappen van 5% tot 40% of tot 100% indien nodig.
      4. 800 nm NIR laser gekoppeld aan epi-fluorescentie Microscoop
      5. Controle van input vermogen via een (63 X / 1.4 nb) fase contrast olie onderdompeling doelstelling door gemotoriseerde rotatie van een polarisatie filter geïntroduceerd in het pad van de lichtbundel en gemonteerd op een computergestuurde gemotoriseerde roterende fase32,39 , 58.
      6. Aanpassen van de polarisator hoek (°) en meet het ingangsvermogen (mW) invoeren van de Microscoop, met behulp van een laser power meter. Het bepalen van de polarisator hoeken waarmee invoer bevoegdheden die variëren van 20 mW-155 mW in stappen van 5-10 mW.
      7. Stel de hoek van de polarisator die overeenkomt met op 20 mW ingangsvermogen.
        Opmerking: Voor onze lasersysteem, als de polarisator hoek 40 °, het ingangsvermogen is 65 mW. Ingangsvermogen met stappen van 5-10 mW te verhogen.
  6. Voor de analyse van de levende cellen, gaat u naar stap 6.1 en 6.3. Voor immunofluorescentie detectie van de endogene proteïnen of wijzigingen gaat u verder met deel 5. Na de analyse, gaat u naar stap 4.7 voor verdere titratie van de kracht van de laser. Voor het analyseren van de upstream factor eis, gaat u naar sectie 7.
    Opmerking: Aanwerving van BER en NHEJ factoren is snel (binnen een paar minuten) en van voorbijgaande aard (< ~ 30 minuten - 1 uur afhankelijk van de factor en < ~ 4 h post schade inductie, respectievelijk). In tegenstelling, de aanwerving van HR factoren Rad51 en cohesin kan worden opgespoord op ~ 30 min - 1 h en ze de neiging om het bestaan van meer dan 8 h bij herstelde DNA laesies44,50,51. Het is dus noodzakelijk te onderzoeken van de verschillende tijd punten na bestraling voor andere reparatie factoren.
  7. Ingangsvermogen verhogen door de gewenste stappen (dat wil zeggen5% voor 780 NIR laser en 5-10 mW voor 800 NIR) zoals in stap 4.4 en herhaalt u stap 4.5-4,7 op een nieuwe serie van cellen om de drempel (50% van de beschadigde cellen Toon werving) en piek (100% van cellen show aanwerving) voor elk eiwit.

5. immunofluorescentie kleuring

Opmerking: voor de detectie van eiwit covalente modificatie, zoals PAR (complexe schade marker) en H2AX fosforylering (γH2AX) (DSB marker), evenals cyclobutaan pyrimidine dimeer (CPD)/(6-4) photoproducts (6-4PP) en 8-oxoguanine (8-oxoG) (crosslinking en schade markers, baseren respectievelijk), cellen moeten worden vastgesteld en kan worden gekleurd met specifieke antilichamen. Daarnaast, is het beste om te bevestigen de resultaten verkregen met de fluorescently tagged recombinante eiwitten door de opsporing van antilichamen van de endogene eiwitten, te onderscheiden van artefacten geïnduceerd door overexpressie van recombinante fusie-eiwitten.

  1. Fix cellen op verschillende tijdstippen na schade inductie (stap 4.5) afhankelijk van de factoren door vervanging van de voedingsbodems (zie stap 1.1) met 1,5 mL van 4% paraformaldehyde/1 X PBS voor 10 min op RT.
    Let op: Paraformaldehyde dampen zijn giftig en al het werk moet worden gedaan in een geventileerde zuurkast.
  2. Verwijderen van 4% paraformaldehyde/PBS en voeg 1 mL 0,5% wasmiddel/PBS voor 10 min op RT.
  3. Verwijderen van 0,5% wasmiddel/PBS en spoel de cellen met 2 mL PBS voor 5 min tweemaal en incubeer cellen in 2 mL zuiver blokkeren oplossing (10% kalfsserum, 1% BSA/PBS) gedurende 1 uur op RT.
  4. Verwijderen van blokkerende oplossing 2 mL PBS aan cellen toevoegen en PBS vervangen door 250 µL primair antilichaam oplossing van 3% BSA/PBS overnacht bij 4 ° C of 1 h op RT. gebruik een 1:200-1:500 verdunning (typisch concentratie ongeveer 1 µg/mL, empirisch bepaald) voor antilichamen specifiek voor verschillende DNA schade merkers (bijv, γH2AX/53BP1 (DSB); Ku (DSB, NHEJ); Rad51/cohesin (DSB, HR); CPD/6-4PP (crosslinking schade); 8-oxoG/DNA glycosylases (bijvoorbeeldNTH1) (baseren schade); PAR (hoge dosis complexe schade)).
  5. De antilichaam-oplossing verwijderen en spoel na met 2 mL PBS voor 5 min tweemaal, verwijderen PBS en incubeer met 250 µL 0,1% secundair antilichaam in 3% BSA/PBS gedurende 1 uur in het donker op RT.
  6. Verwijder de secundair antilichaam-oplossing en voeg toe 2 mL PBS voor 5 min tweemaal en houd van cellen in 1.5-2 mL PBS bij 4 ° C voor imaging in stappen 6.1 en 6.2.

6. kwantitatieve fluorescentie analyse van Immunostained of levende cellen

  1. Foto's vastleggen van gebeitst of levende cellen (n > 10) met behulp van de Microscoop voor bestraling gebruikt. Voor het epi-fluorescentie Microscoop systeem, kiest u de resolutie van 1344 x 1024 pixels en afbeeldingen opslaan als TIFF 16-bits bestanden. Gebruik voor een confocal microscoop, 1 X vergroting; Argon laser voor GFP/FITC, 594 HeNe laser voor Cy3/mCherry; 512 x 512 of 1024 x 1024 pixels voor de resolutie van de afbeelding; Scansnelheid 5, nummer: 1 voor snelle scan of 2 + voor gemiddeld over meerdere scans te verbeteren van de signaal / ruisverhouding.
  2. Gebruik een beeldanalyse programma's ontworpen voor het meten van de intensiteit van de pixel.
    1. Gebruik de knop Volume rechthoek om te tekenen een ROI rond de site van de schade in het beeld van de individuele cel. Gebruik dezelfde grootte ROI voor het meten van het signaal van de fluorescentie achtergrond in de nucleoplasm grenzend aan, maar niet overlappen met de schade-sites. Dit is belangrijk voor de normalisering van photobleaching gekoppeld aan het niet-confocal microscoop systeem.
    2. Voor het meten van signalen van de fluorescentie met behulp van de afbeelding analyseprogramma, klikt u op "Volume analyserapport" gevonden in de werkset. Een nieuw venster zal verschijnen. Schakel alleen de "Naam" en "Dichtheid" selectievakjes onder de sectie "Gegevens voor weergave". Klik vervolgens op "Done" om het visualiseren van de metingen.
    3. De waarden naar een spreadsheetprogramma exporteren door te klikken op het tabelpictogram gevonden aan de onderkant van de Volume rapportvenster en selecteer "Tabs (excel-formaat)" voor veld scheidingstekens en "File" voor Export bestemming.
    4. Relatieve signalen, gebruik de spreadsheetprogramma te verdelen de intensiteit van de fluorescentie op de site (kolom 1) van de schade door die van de controlegroep achtergrond regio (kolom 2) in het nucleoplasm en aftrekken door 1 voor normalisatie.
  3. Real-time kwantitatieve fluorescentie tijdsverloop analyse met behulp van de confocal microscoop
    1. Fluorescently tagged eiwit-positieve cellen met behulp van de Microscoop zoals in stap 4.3 opsporen.
    2. Time-lapse fluorescentie imaging voor schade en op verschillende tijdstippen na schade inductie in sectie 4 uitvoeren. Eerste tekenen van het bleekmiddel ROI (voor schade inductie) en selecteer vervolgens de "ophaal > tijdreeksen" submenu, op het "Nummer" 20 en de "cyclus vertraging" als 30 s, kies "bleekmiddel eenmaal na de eerste scan", en vervolgens te klikken op "start B". In dit geval wordt het eerste beeld verworven vóór schade inductie, gevolgd door 19 afbeelding overnames met een 30 s-interval. Intervallen ("cyclus vertraging") kunnen veranderd worden afhankelijk van het doel van de studie.
    3. Zodra Beeldacquisitie voltooid is, klikt u op "Verstaan", en tekenen van de ROI op de regio van de schade. Klik op "Toon tabel" om een tabel met de intensiteit binnen de geselecteerde ROIs. Normaliseren van de gegevens door het verdelen van de intensiteit van de fluorescentie van de website van de schade op verschillende tijdstippen door de intensiteit van dezelfde regio voordat schade en aftrekken door 1.

7. kleine invloed RNA (siRNA) transfectie

Opmerking: Uitputting van het target-eiwit is een effectieve manier om af te bakenen de eis van de upstream factor voor de aanwerving van de waargenomen eiwit schade sites (afdeling 4). Bovendien, de strategie is de beste manier om aan te pakken van de specificiteit van een antilichaam gebruikt voor detectie van de immunofluorescentie (zie sectie 5).

  1. Dag 1: Voorbereiden 2 putten van HeLa cellen in een 24-well plaat door het zaaien van 6-8 x 104 HeLa cellen in 0,5 mL voedingsbodems in elk putje, één voor controle siRNA transfectie en één voor PARP1 siRNA (5'-CCG AGA AAT CTC TTA CCT CAA-3').
  2. Dag 2: Controleer of de cellen ongeveer 40-50% heuvels zijn. Uitvoeren van de eerste ronde van siRNA transfectie: Verdun 5 pmol siRNA in 25 µL van de serum-vrije cultuur media, voeg 3 µL lipiden baseert transfectiereagens in de buis, meng zachtjes en incubeer gedurende 5-10 min op RT.
  3. Spoel de cellen met 0,5 mL verse voedingsbodems eenmaal, en houden van de cellen in 0,5 mL verse voedingsbodems (zie stap 1.1).
  4. De complexen van RNA-lipide toevoegen aan de cellen, en meng voorzichtig door het kantelen van de schotel heen en weer. Zet de cellen terug in de incubator zoals in stap 2.1.
  5. De transfectie mix gecombineerd, en Voeg 0,5 mL verse voedingsbodems (stap 1.1) na 6 h.
  6. Dag 3: Uitvoeren van de tweede ronde van siRNA transfections (zie stap 7.2). Vervolgens, seed 60-100% van de cellen in een 35 mm gerasterde dekglaasje aan schotel zoals beschreven in stap 2.3.
  7. Dag 5: Doorgaan met laser-microirradiation met behulp van de optimale laser macht voorwaarde voor maximale aanwerving van de factor van belang, zoals bepaald door de sectie 4. Typisch, efficiënte uitputting kan worden waargenomen in ongeveer 60-90% van HeLa cellen.
    Opmerking: Als een alternatieve en complementaire aanpak, remmers, indien beschikbaar, kan worden gebruikt voor de remming van de functie van de factor van belang32,44. Voor het analyseren van het effect van remming van de DDR signalering, 20 µM PARP-remmer, 1 µM PAR glycohydrolase (PARG) remmer of 10 µM DNA-afhankelijk proteïne kinase met katalytische subeenheid (DNA-PKcs) remmer en 10 µM ATM-remmer in dimethylsulfoxide (DMSO) toevoegen aan de gerechten 1 h vóór schade inductie. DMSO alleen toevoegen aan cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

PtK2 cuvetten stabiel uiting van EGFP-53BP11220-1711 of -TRF2-YFP, werd laser ingangsvermogen titratie uitgevoerd om te bepalen van de optimale voorwaarde voor hun werving (Figuur 1)32.

Op hoge input-vermogen laser schade sites, de aanzienlijke clustering van BPR (crosslinking schade meestal gegenereerd door ultraviolet (UV) schade) evenals GFP-NTH1 DNA-glycosylase die specifiek base schade herkent werden waargenomen. Daarnaast werden hogere XRCC1 en CtIP signalen waargenomen, als gevolg van het toegenomen aantal einden van het strand, en is aangetoond dat complexe DNA-schade is veroorzaakt onder deze voorwaarde (figuur 2A). Andere DNA glycosylases gesmolten aan fluorescerende eiwitten (bijvoorbeeld, GFP-nei endonuclease VIII-achtige 2 (NEIL2) en GFP-8-Oxoguanine glycosylase (OGG1)) evenals condensin kan ik ook worden gebruikt als base schade markeringen44,59. In overeenstemming met dit, we vonden dat het antwoord van de PAR aanzienlijk wordt veroorzaakt door hoge input-vermogen laser (d.w.z., energie en bestralingssterkte op de focal plek in het model), maar slechts zwak door lage laser macht in de focal plek (figuur 2B, links boven). PAR signalen, maar niet PARP1 eiwit lokalisatie, op schade sites waren gevoelig voor de PARP-remmer (gegevens niet worden weergegeven). Bovendien, siRNA specifiek voor PARP1 verminderd PAR zowel PARP1 op schade sites (figuur 2B, rechtsboven)32. Onder de hoge ingangsvermogen voorwaarde, γH2AX in eerste instantie wordt weergegeven op de sites van de schade, en zich snel uitbreidt tot de hele kern in een ATM/DNA-PK-afhankelijke manier (figuur 2B, bodem). Soortgelijke ATM/DNA-PK-afhankelijke verspreiding van γH2AX werd gemeld voor γ-bestraling60. Consistente resultaten werden bekomen met zowel 800 en 780 nm NIR laser systemen32. Samen genomen, de resultaten blijkt dat het mogelijk is te Titreer ingangsvermogen van de laser (en dus energie en straling in de focal plek in de cel) om te vinden van de voorwaarden die het induceren van verschillende graden van PARP reactie correleren met het aantal DSBs en de complexiteit van de DNA-beschadiging.

De bovenstaande resultaten stelde aanvankelijk dat de aanwezigheid van complexe DNA-schade zou kunnen hebben veroorzaakt differentiële werving van 53BP1 en TRF2. Interessant, echter was de 53BP11220-1711 aanwerving op de site van een spaarstand schade effectief geremd door de aanwezigheid van de tweede plaats van de schade veroorzaakt door hoge-input-power in de dezelfde celkern (figuur 3A in tegenstelling tot de figuur 3B ). De resultaten wijzen erop dat high-input-power laser schade 53BP1 werving in transonderdrukt. Remming van de PAR door PARP-remmer evenals remming van nucleaire bestrijkende γH2AX verspreiding door ATM/DNA-PK remmers herstellen deze aanwerving zelfs aan de hoge ingangsvermogen schade site (figuur 3A). Dit is verschillend van de aanwerving van bemiddelaar van DNA schade Checkpoint 1 (MDC1) aan schade sites, die was voornamelijk geremd door γH2AX dispersie, en daarom werd gerestaureerd door ATM/DNA-PK-remmers, niet PARP inhibitor van de omwenteling (figuur 3A, bodem). Nog belangrijker is, de hyperactivering voor PAR door PARG remming (zonder dat de status van de γH2AX) effectief onderdrukt eerste 53BP1 recruitment zelfs de lage input-power schade sites die normaal 53BP1 efficiënt werven (figuur 3B)32. Samen genomen, deze resultaten aangeven dat PAR signalering, en niet het soort schade per se, interfereert met de aanwerving van 53BP132. Dit is een voorbeeld van de veelzijdigheid van de laser microirradiation, die ons toelaat om te onderzoeken hoe meerdere sites van de schade beïnvloeden en communiceren met elkaar.

Figure 1
Figuur 1 : Titratie van laser input vermogen. Om te bepalen de kracht van de laser te gebruiken voor toekomstige experimenten, PtK2 cellen stabiel uiting van EGFP-53BP1 en TRF2-YFP werden onderworpen om te microirradiation laser met input bevoegdheden variërend tussen 20 mW en 155 mW met behulp van de 800 nm NIR laser/omgekeerde epi-fluorescentie Microscoop systeem. EGFP-53BP1 werving werd gecontroleerd voor 15 min post bestraling (p.i.), terwijl TRF2-YFP cellen werden gevolgd voor 6 min p.i. De nummers direct boven de bars staan voor het aantal cellen dat positieve aanwerving van EGFP-53BP1 of TRF2-YFP naar de sites van de schade over het totale aantal cellen getest toonde. Dit cijfer werd vanaf Saquilabon Cruz32gewijzigd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Inductie van complexe schade en robuuste DDR signalering door hoge input-vermogen laser. (A) High-input-power laser microirradiation induceert complexe schade met inbegrip van strand einden (SSBs en DSBs), crosslinking en base schade. CPD, XRCC1 (SSB en DSB repareren), NTH1 DNA glycosylase (BER) en CtIP (alternatieve NHEJ en HR) weergegeven (alleen GFP-NTH1 een levende cel beeld is en de rest worden waargenomen na immunofluorescentie kleuring). Kwantitatieve fluorescentie intensiteit metingen van de aanwerving van de site schade werden gedaan zoals vermeld in protocol sectie 7 en in de boxplots worden weergegeven. Het totale aantal cellen (n) getest kan worden gezien onder elke gekwantificeerde proteïne. p-waarde < 0.05. (B) (linksboven): robuuste PAR en PARP1 signalen op hoge input-power schade sites. (Rechtsboven): PARP1 siRNA uitputting is voldoende om de afschaffing van de PAR signaal32,44. Bodem: Time cursus analyse van γH2AX in cellen met de laag (boven) en hoog (onder) vermogen macht schade zoals aangegeven. Schaal bars = 10 µm. Dit cijfer werd vanaf Saquilabon Cruz32gewijzigd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Differentiële activering van DDR signalering is van invloed op 53BP1 werving schade sites. (A) Top: PtK2 cellen stabiel uiten EGFP-53BP11220-1711 werden microirradiated met zowel laag (15%) en hoog (25%) input vermogen (witte en gele pijlpunten, respectievelijk) in de dezelfde kern met behulp van de 780 nm NIR/confocal microscoop systeem. Dit werd uitgevoerd in het bijzijn van DMSO, PARP-remmer (Pi), of de combinatie van ATM, DNA-PK en PARP-remmers (Ai + Di + Pi) zoals aangegeven. Live-cel beeldvorming van EGFP-53BP11220-1711 werd gevangen bij 30 min na DSB inductie. Cellen werden vervolgens vast en gekleurd met een antilichaam specifiek voor γH2AX als een DSB-marker. Wijzigingen van de intensiteit van de fluorescentie van EGFP-53BP11220-1711 op locaties schade worden weergegeven aan de rechterkant met p-waarden (waarden zijn: DMSO, 0.03 ± 0,02; Pi, 0,34 ± 0,19; AI + Di + Pi, 0.98 ± 0.23). Bodem: Het effect van Pi en Ai + Di behandeling voort MDC1 localization met hoge input-power schade zoals aangegeven. De bar van de schaal is 10 µm. Rechts: Wijzigingen van signalen van de fluorescentie van MDC1 op input-hoogvermogen schade sites in het bijzijn van DMSO, Pi of Ai + Di met p-waarden (waarden zijn: DMSO, 0,07 ± 0,10; Pi, 0,05 ± 0,07; AI + Di, 0,86 ± 0,26). Schaal bar = 10 µm. N = 10 voor elke meting van intensiteit. (B) het effect van de verhoging van de PAR signalen door PARGi behandeling op de werving van de endogene 53BP1 naar lage input-power schade sites. Rechts: Boxplots vertegenwoordigen de kwantitatieve analyse van endogene 53BP1 werving (gedetecteerd door immunofluorescentie kleuring) met lage input-vermogen laser (60 mW in de 800 nm NIR laser/omgekeerde epi-fluorescentie Microscoop systeem) op 15 min post bestraling in aanwezigheid van DMSO of PARGi zoals aangegeven. Links: PAR en 53BP1 immunofluorescentie kleuring van foto's van cellen beschadigd onder dezelfde voorwaarden met DMSO of PARGi behandeling. Voor behandeling van DMSO, 100% van de cellen onderzocht (N = 25) tentoongesteld robuuste 53BP1 werving (rechts). 20/25 toonde daarentegen geen werving 53BP1 in aanwezigheid van PARGi (rechtsonder) en 5 cellen bleek zwak werving. Schaal bar = 10 µm. Dit cijfer werd vanaf Saquilabon Cruz32gewijzigd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De voordelen van het gebruik van laser microirradiation voor DDR onderzoek zijn:

1. het is haalbaar voor het opwekken van verschillende typen en hoeveelheden DNA schade van eenvoudige strand einden aan complexe DNA-beschadiging op te sporen verschillende reparatie factoren op het DNA beschadigen sites door de laser bestraling parameters aan te passen. Het is ook mogelijk om meerdere keren in de dezelfde celkern schade toebrengen, teneinde de trans effecten (zoals in Figuur 3).

2. belangrijker, kunnen gebeurtenissen op de sites van de schade en de secundaire gebeurtenissen die zich elders in de kern gemakkelijk worden onderscheiden.

3. is het mogelijk om hoge resolutie real-time metingen van fluorescently tagged eiwit dynamiek in reactie op schade op een enkele cel-niveau, waaronder, maar niet beperkt tot: Förster Resonance Energy Transfer (FRET), fluorescentie levensduur Imaging ( FLIM), paar correlatiefunctie (pCF), enz., om vast te leggen van de DDR in levende cellen.

4. Combineren met RNA interferentie of remmer behandeling, is het betrekkelijk eenvoudig voor het testen van upstream factor eis in een klein aantal cellen.

5. het moet ook worden opgemerkt dat NIR (of groen) laserstraling vereist geen pre sensibilisatie van DNA met nucleotide-analogen of DNA-intercalating kleurstoffen, dus het vermijden van ongewenste bijwerkingen op chromatin verpakking. Dit is in tegenstelling tot de UV-lasersysteem dat vereist van overgevoeligheid bij lage dosis en de oorzaken van afwijkend DDR bij hoge dosis39,49,61.

Kritische stappen binnen het Protocol/wijzigingen en probleemoplossing
Het is belangrijk dat de cellen in gezonde omstandigheden zijn wanneer DDR analyses worden uitgevoerd om te minimaliseren van artefact en experimentele variaties. DNA - of siRNA-transfected cellen zijn meestal gevoeliger of gemakkelijk vrijstaand bij het kweken op het gerasterde dekglaasje aan. Het helpt om cellen voor kortere tijden in het transfectiereagens te houden zo lang als de transfectie werkt en zaad meer transfected cellen op de gerasterde dekglaasje aan schotel t.o.v. de untransfected cellen. Dit is noodzakelijk met het oog op een vergelijkbare cel confluences voor de experimenten.

Er werd gemeld dat het blok thymidine leidt tot verhoogde niveaus van γH2AX in de gesynchroniseerde cellen62, die kunnen beïnvloeden van de DDR en scheeftrekken van de resultaten. Bovendien was het honk-lijn γH2AX signaal aangetoond dat hogere in S en G2/M fase zelfs zonder een exogeen schade63,64. Wij, echter respecteren niet geen significante γH2AX signaal in de nucleoplasm die zou beïnvloeden of verstoren van de specifieke γH2AX reactie op laser-veroorzaakte schade sites in de cellen gesynchroniseerd in S/G2 fase door een dubbele thymidine blok51.

Met het oog op een consistente resultaten, is het nodig regelmatig te controleren of de laser systeem output-parameters (elke 2 tot 4 weken) en de optische uitlijning (om de 2 maanden). Na verloop van tijd de onderdelen van het systeem van de laser kunnen moeten opnieuw uitgelijnd, objectief mogelijk is beschadigd en moet worden vervangen en de stabiliteit van de totale input vermogen kan veranderen. De sleutel is om te evalueren van de aanwezigheid van schade (crosslinking (CPD en/of 6-4PP) en base schade (8-oxoG)), marker eiwitten (bijvoorbeeld, DNA-glycosylases, Rad51, cohesin en Ku) en PAR modificatie beschreven in dit protocol om te bepalen van de dosering en complexiteit van DNA-schade veroorzaakt door het lasersysteem Microscoop gebruikt.

Beperkingen van de techniek
Laser microirradiation heeft beperkingen. DNA-schade veroorzaakt door de laserstraal is zeer geclusterd in één gebied in de kern ten opzichte van nature voorkomende schade die kan worden verspreid over de kern. Dit kan veranderen hoe schade signalering wordt doorgegeven in de naburige chromatine of in de kern. Omdat een relatief laag aantal cellen kan in één keer bestraald worden, de bevolking gebaseerde biochemische tests (bv, westelijke vlek, complexe EiwitReiniging, chromatine immunoprecipitation (ChIP)) gemakkelijk kunnen niet worden uitgevoerd. Afhankelijkheid van fluorescently tagged eiwitten (met over de expressie van de exogene recombinante eiwitten of zelfs met die uitgedrukt endogeen met behulp van CRISPR-gemedieerde label invoegen) voor dynamische imaging studies aan eiwit fusion-geïnduceerde kwetsbaar maakt artefacten. Het unieke karakter van de laser-veroorzaakte schade en potentiële artefactuele effecten van tagged eiwitten, daarom, moeten worden beoordeeld ten opzichte van de resultaten met behulp van conventionele DNA beschadigen methoden (IR, chemische beschadiging van agenten) en met de endogene niet-gelabelde proteïnen (hoewel soms is het niet mogelijk om uit te voeren volledige parallelle experimenten).

Betekenis ten opzichte van bestaande methoden
Het gebruik van sequentie-specifieke enzym zoals ik-SceI, FokI, AsiSI en PpoI biedt een alternatieve strategie te induceren site-specific DSBs (strikt eenvoudige DSBs). Factor aanwerving of wijzigingen kunnen door sitespecifieke of genoom-brede ChIP analyse65,66,,67,68,69te worden geanalyseerd. Relatief synchrone inductie van DSBs kan worden bereikt door het labelen van de endonuclease met een steroïde hormoon-receptor en een aantasting van het signaal (degron) voor snelle nucleaire translocatie en afbraak, respectievelijk65,66 , 67 , 68 , 69. een rekening moet houden, echter dat de efficiëntie van endonuclease expressie en doel site toegankelijkheid, en voortdurende herstelstatus kan variabele in verschillende cellen en op sites van de verschillende doelgroepen. Deze heterogeniteiten zal worden gemiddeld in de bevolking gebaseerde ChIP analyse, die de resultaten kan scheeftrekken. Laser microirradiation, aan de andere kant, biedt de hoogst mogelijke temporele resolutie (milliseconden) en ruimtelijke resolutie (submicrometer) van schade antwoord dynamiek, die kan worden geanalyseerd op het niveau van één cel. Hoge schade dichtheid, echter kan invloed hebben op het resultaat. Beide strategieën kunnen gevoelig zijn voor artefacten, veroorzaakt door antilichaam toegankelijkheid en/of peptide tagging. Het is daarom belangrijk om te begrijpen van de voors en tegens van beide strategieën, die mogelijk kunnen worden gebruikt om elkaar aanvullen.

Toekomstige toepassingen
Met de snelle vooruitgang van de fluorescentie beeldvorming en dynamiek technieken, veelzijdigheid van de laser-systemen voor het opwekken van verschillende hoeveelheden en soorten DNA-beschadiging op specifieke locaties en fase van de celcyclus biedt een waardevolle gelegenheid om het ondervragen van de cellulaire en moleculaire reacties op DNA beschadigen met hoge Spatio resolutie op het niveau van een enkele cel. Het zal mogelijk zijn, bijvoorbeeld om pesten uit schade sitespecifiek en kern - en cel-dekkende DDR signaal transductie met milliseconde-resolutie (bijvoorbeelddetecteren moleculaire interacties of wijzigingen die exclusief bij schade sites optreden, onderzoeken dynamische veranderingen in de structuur van de chromatine in real-time, of observeren real-time verspreiding van schade aan de hele kern van schade sites signalering). Het is ook mogelijk om te volgen dezelfde cel gedurende een lange periode van tijd om te onderzoeken wat de gevolgen van DNA-schade over lot van de cel. Wij voorzien dat de laser microirradiation methoden, indien goed gebruikt, zal aanzienlijk bijdragen aan de vooruitgang van het DNA-reparatie-veld.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken Dr. Akira Yasui bij Universiteit van Tohoku, Japan voor het GFP-NTH1 expressie plasmide, en Dr. Eros Lazzerini Denchi aan het The Scripps Research Institute, La Jolla, Californië voor de TRF2-YFP en EGFP-53BP11220-1711 expressie plasmiden. Dit werk werd gesteund door de Air Force Office voor wetenschappelijk onderzoek (FA9550-04-1-0101) en de Beckman Laser Institute Inc Foundation (M.W.B), de Ford Foundation Fellowship van de nationale Academie van Wetenschappen (aan B.A.S), en NSF MCB-1615701 en CRCC CTR-17-426665 (naar K. Y.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ti:Sapphire NIR pulsed femtosecond laser Mira-900 Coherent Inc. Mira 900
Inverted microscope  Carl Zeiss Axiovert 200M
63X/1.4 NA objective Zeiss APOCHROMAT Ph3 
Compact Rotation Stage  Newport Corp PR50PP
Temperature Controller Warner TC-344B
Heating System Ibidi  10918
Gas Incubation System Ibidi  11920
Laser Power and Energy Meter (RoHS) Coherent FieldMaxII-TOP 
ORCA-R2 Digital CCD Camera Hamamatsu C10600
LSM 510 META Laser Scanning Microscopes Carl Zeiss
100X/1.3 NA Zeiss Plan APO Carl Zeiss
35mm Gridded Dishes  MatTek P35G-1.5-14-CGRD-D
PtK2 kidney epithelial cells ATCC CCL 56 
HeLa cells ATCC CCL-2
DMEM Life Technologies 11885-092
CO2-Independent Medium  Life Technologies 18045-088
Advanced MEM  Life Technologies 12492-013 supplemented with L-Glutamine, 4% FBS
penicillin/streptomycin Fisher Scientific 15140122
L-Glutamine Fisher Scientific 25030081
FBS Omega Scientific FB-02
Thymidine   SIGMA T9250
serum free media     (Opti-MEM I Reduced Serum Media) Fisher Scientific 11058021
Anti-Cycolbutance pyrimidine dimer (CPD) (mouse) Kamiya Biomedical Company MC-062
Anti-XRCC1 (mouse ) Gene Tex Inc GTX72311
Anti-53BP1 (rabbit) Santa Cruz Biotech sc-22760
Anti-CtIP (rabbit) Abcam ab70163
Anti-PAR polymers (mouse) Enzo Life Sciences BML-SA216-0100
Anti-PAR (rabbit) Trevigen 4336-BPC-100
Anti-TRF2 (mouse) Novus Biological  NB100-56506
Anti 6-4PP (mouse) Kamiya Biomedical
Anti-Rad21 (Rabbit)                     (for cohesin detection) generated in Yokomori (KY) lab
Anti-Rad51 (Rabbit) Santa Cruz Biotechnology SC-8349
Anti-Ku70 (mouse)  Novus Biologicals NB100-102
8-oxiguanine  Trevigen, Inc.
Anti-PARP1  (Rabbit)                     generated in KY lab ref 43
 Anti-hCAPG (Rabbit)                    (for condensin detection) generated in KY lab ref 42
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG  Jackson ImmunoResearch Inc 711-165-152
Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgG Thermo Fisher Scientific A-21202
HiPerFect siRNA Transfection Reagent Qiagen 301705
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
GFP-SMC1 stable cell line     generated in KY lab ref 49 
GFP-NEIL2 stable cell line generated in KY lab ref 54
GFP-NTH1 stable cell line generated in KY lab ref 32
GFP-SMC1 plasmid generated in KY lab
GFP-Ku plasmid generated in KY lab
Anti-MDC1 (rabbit)  Novus Biologicals NB100–395
Anti-gH2AX (rabbit)  Millipore 07–164
EGFP-53BP1(1220-1711) PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
TRF2-YFP PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
DMSO Sigma D2650-100ML
PARG inhibitor Trevigen 4680-096-03
DNA–PKcs inhibitor  NU7026  Sigma N1537
ATM inhibitor KU55933  Calbiochem 118500
Olaparib  Apexbio Technology A4154
Paraformaldehyde  ELECTRON MICROSCOPY SCIENC MS 100503-916 (EA)
Quantity One 1-D Analysis Software Version 4.6.9 Bio-Rad SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC  image analysis program
Excel microsoft spreadsheet program
Triton X100 Fisher Scientific BP151-500 detergent
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 10X without calcium and magnesium Fisher Scientific 14200166 dilute to 1X 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Altmeyer, M., Lukas, J. To spread or not to spread--chromatin modifications in response to DNA damage. Curr. Opin. Genet. Dev. 23 (2), 156-165 (2013).
  2. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  3. Misteli, T., Soutoglou, E. The emerging role of nuclear architecture in DNA repair and genome maintenance. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10 (4), 243-254 (2009).
  4. van Attikum, H., Gasser, S. M. Crosstalk between histone modifications during the DNA damage response. Trends Cell Biol. 19 (5), 207-217 (2009).
  5. Chiolo, I., et al. Double-strand breaks in heterochromatin move outside of a dynamic HP1a domain to complete recombinational repair. Cell. 144 (5), 732-744 (2011).
  6. Lisby, M., Mortensen, U. H., Rothstein, R. Colocalization of multiple DNA double-strand breaks at a single Rad52 repair centre. Nat. Cell Biol. 5 (6), 572-577 (2003).
  7. Ryu, T., et al. Heterochromatic breaks move to the nuclear periphery to continue recombinational repair. Nat. Cell Biol. 17 (11), 1401-1411 (2015).
  8. Torres-Rosell, J., et al. The Smc5-Smc6 complex and SUMO modification of Rad52 regulates recombinational repair at the ribosomal gene locus. Nat. Cell Biol. 9 (8), 923-931 (2007).
  9. Chakalova, L., Debrand, E., Mitchell, J. A., Osborne, C. S., Fraser, P. Replication and transcription: Shaping the landscape of the genome. Nat. Rev. Genet. 6 (9), 669-678 (2005).
  10. Schoenfelder, S., et al. Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells. Nat. Genet. 42 (1), 53-61 (2010).
  11. Gelot, C., et al. The Cohesin Complex Prevents the End Joining of Distant DNA Double-Strand Ends. Mol. Cell. 61 (1), 15-26 (2015).
  12. Lottersberger, F., Karssemeijer, R. A., Dimitrova, N., de Lange, T. 53BP1 and the LINC Complex Promote Microtubule-Dependent DSB Mobility and DNA Repair. Cell. 163 (4), 880-893 (2015).
  13. Ball, A. R. Jr, Yokomori, K. Damage site chromatin: open or closed? Curr. Opin. Cell Biol. 23 (3), 277-283 (2011).
  14. Beck, C., Robert, I., Reina-San-Martin, B., Schreiber, V., Dantzer, F. Poly(ADP-ribose) polymerases in double-strand break repair: Focus on PARP1, PARP2 and PARP3. Exp. Cell Res. 329 (1), 18-25 (2014).
  15. Basu, B., Sandhu, S. K., de Bono, J. S. PARP inhibitors: mechanism of action and their potential role in the prevention and treatment of cancer. Drugs. 72 (12), 1579-1590 (2012).
  16. Deeks, E. D. Olaparib: first global approval. Drugs. 75 (2), 231-240 (2015).
  17. Sonnenblick, A., de Azambuja, E., Azim, H. A. Jr, Piccart, M. An update on PARP inhibitors--moving to the adjuvant setting. Nat. Rev. Clin. Oncol. 12 (1), 27-41 (2015).
  18. Garber, K. PARP inhibitors bounce back. Nat. Rev. Drug Discov. 12 (10), 725-727 (2013).
  19. Lord, C. J., Tutt, A. N., Ashworth, A. Synthetic lethality and cancer therapy: lessons learned from the development of PARP inhibitors. Annu. Rev. Med. 66, 455-470 (2015).
  20. Feng, F. Y., de Bono, J. S., Rubin, M. A., Knudsen, K. E. Chromatin to Clinic: The Molecular Rationale for PARP1 Inhibitor Function. Mol. Cell. 58 (6), 925-934 (2015).
  21. Patel, A. G., Sarkaria, J. N., Kaufmann, S. H. Nonhomologous end joining drives poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitor lethality in homologous recombination-deficient cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (8), 3406-3411 (2011).
  22. Ahel, D., et al. Poly(ADP-ribose)-dependent regulation of DNA repair by the chromatin remodeling enzyme ALC1. Science. 325 (5945), 1240-1243 (2009).
  23. Gottschalk, A. J., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (33), 13770-13774 (2009).
  24. Sun, Y., et al. Histone H3 methylation links DNA damage detection to activation of the tumour suppressor Tip60. Nat. Cell Biol. 11 (11), 1376-1382 (2009).
  25. Ayrapetov, M. K., Gursoy-Yuzugullu, O., Xu, C., Xu, Y., Price, B. D. DNA double-strand breaks promote methylation of histone H3 on lysine 9 and transient formation of repressive chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (25), 9169-9174 (2014).
  26. Khoury-Haddad, H., et al. PARP1-dependent recruitment of KDM4D histone demethylase to DNA damage sites promotes double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (7), E728-E737 (2014).
  27. Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (43), 18475-18480 (2010).
  28. Larsen, D. H., et al. The chromatin-remodeling factor CHD4 coordinates signaling and repair after DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 731-740 (2010).
  29. Polo, S. E., Kaidi, A., Baskcomb, L., Galanty, Y., Jackson, S. P. Regulation of DNA-damage responses and cell-cycle progression by the chromatin remodelling factor CHD4. EMBO J. 29 (18), 3130-3139 (2010).
  30. Smeenk, G., et al. The NuRD chromatin-remodeling complex regulates signaling and repair of DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 741-749 (2010).
  31. Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Rep. 11 (9), 1486-1500 (2015).
  32. Saquilabon Cruz, G. M., et al. Femtosecond near-infrared laser microirradiation reveals a crucial role for PARP signaling on factor assemblies at DNA damage sites. Nuc. Acids Res. 44 (3), e27 (2015).
  33. Bouwman, P., et al. 53BP1 loss rescues BRCA1 deficiency and is associated with triple-negative and BRCA-mutated breast cancers. Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (6), 688-695 (2010).
  34. Jaspers, J. E., et al. Loss of 53BP1 causes PARP inhibitor resistance in Brca1-mutated mouse mammary tumors. Cancer Discov. 3 (1), 68-81 (2013).
  35. Berns, M. W., Olson, R. S., Rounds, D. E. In vitro production of chromosomal lesions with an argon laser microbeam. Nature. 221 (5175), 74-75 (1969).
  36. Berns, M. W., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213 (4507), 505-513 (1981).
  37. Botchway, S. W., Reynolds, P., Parker, A. W., O'Neill, P. Laser-induced radiation microbeam technology and simultaneous real-time fluorescence imaging in live cells. Methods Enzymol. 504, 3-28 (2012).
  38. Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Front Genet. 4, 135 (2013).
  39. Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 37 (9), e68 (2009).
  40. Kruhlak, M. J., Celeste, A., Nussenzweig, A. Monitoring DNA breaks in optically highlighted chromatin in living cells by laser scanning confocal microscopy. Methods Mol. Biol. 523, 125-140 (2009).
  41. Walter, J., Cremer, T., Miyagawa, K., Tashiro, S. A new system for laser-UVA-microirradiation of living cells. J. Microsc. 209 (2), 71-75 (2003).
  42. Kim, J. S., et al. In situ analysis of DNA damage response and repair using laser microirradiation. Methods Cell Biol. 82, 377-407 (2007).
  43. Kim, J. S., Krasieva, T. B., LaMorte, V. J., Taylor, A. M. R., Yokomori, K. Specific recruitment of human cohesin to laser-induced DNA damage. J. Biol. Chem. 277 (47), 45149-45153 (2002).
  44. Kong, X., et al. Condensin I Recruitment to Base Damage-Enriched DNA Lesions Is Modulated by PARP1. PLoS One. 6 (8), e23548 (2011).
  45. Heale, J. T., et al. Condensin I interacts with the PARP-1-XRCC1 complex and functions in DNA single-stranded break repair. Mol. Cell. 21 (6), 837-848 (2006).
  46. Bradshaw, P. S., Stavropoulos, D. J., Meyn, M. S. Human telomeric protein TRF2 associates with genomic double-strand breaks as an early response to DNA damage. Nat. Genet. 37 (2), 193-197 (2005).
  47. Huda, N., et al. Recruitment of TRF2 to laser-induced DNA damage sites. Free Radic. Biol. Med. 53 (5), 1192-1197 (2012).
  48. Williams, E. S., et al. DNA double-strand breaks are not sufficient to initiate recruitment of TRF2. Nat. Genet. 39, 696-698 (2007).
  49. Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. J. Cell Biol. 173 (2), 195-206 (2006).
  50. Kim, J. S., et al. Independent and sequential recruitment of NHEJ and HR factors to DNA damage sites in mammalian cells. J. Cell Biol. 170 (3), 341-347 (2005).
  51. Kong, X., et al. Distinct functions of human cohesin-SA1 and cohesin-SA2 in double-strand break repair. Mol. Cell Biol. 34 (4), 685-698 (2014).
  52. Wu, N., et al. Scc1 sumoylation by Mms21 promotes sister chromatid recombination through counteracting Wapl. Genes Dev. 26 (13), 1473-1485 (2012).
  53. Fradet-Turcotte, A., et al. 53BP1 is a reader of the DNA-damage-induced H2A Lys 15 ubiquitin mark. Nature. 499, 50-54 (2013).
  54. Pryde, F., et al. 53BP1 exchanges slowly at the sites of DNA damage and appears to require RNA for its association with chromatin. J. Cell Sci. 118, 2043-2055 (2005).
  55. Zgheib, O., Pataky, K., Brugger, J., Halazonetis, T. D. An oligomerized 53BP1 tudor domain suffices for recognition of DNA double-strand breaks. Mol. Cell. Biol. 29, 1050-1058 (2009).
  56. Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (38), 13738-13743 (2004).
  57. Hinde, E., Kong, X., Yokomori, K., Gratton, E. Chromatin dynamics during DNA repair revealed by pair correlation analysis of molecular flow in the nucleus. Biophys. J. 107 (1), 55-65 (2014).
  58. Silva, B. A., Stambaugh, J. R., Yokomori, K., Shah, J. V., Berns, M. W. DNA damage to a single chromosome end delays anaphase onset. J. Biol. Chem. 289 (33), 22771-22784 (2014).
  59. Hinde, E., Yokomori, K., Gaus, K., Hahn, K. M., Gratton, E. Fluctuation-based imaging of nuclear Rac1 activation by protein oligomerisation. Sci. Rep. 4, 4219 (2014).
  60. Meyer, B., et al. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nuc. Acids Res. 41 (12), 6109-6118 (2013).
  61. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146 (5), 905-915 (1999).
  62. Kurose, A., Tanaka, T., Huang, X., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Synchronization in the cell cycle by inhibitors of DNA replication induces histone H2AX phosphorylation: an indication of DNA damage. Cell Prolif. 39 (3), 231-240 (2006).
  63. Huang, X., Tanaka, T., Kurose, A., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Constitutive histone H2AX phosphorylation on Ser-139 in cells untreated by genotoxic agents is cell-cycle phase specific and attenuated by scavenging reactive oxygen species. Int. J. Oncol. 29 (2), 495-501 (2006).
  64. MacPhail, S. H., Banáth, J. P., Yu, Y., Chu, E., Olive, P. L. Cell cycle-dependent expression of phosphorylated histone H2AX: reduced expression in unirradiated but not X-irradiated G1-phase cells. Radiat. Res. 159 (6), 759-767 (2003).
  65. Aymard, F., et al. Transcriptionally active chromatin recruits homologous recombination at DNA double-strand breaks. Nat. Struc. Mol. Biol. 21 (4), 366-374 (2014).
  66. Berkovich, E., Monnat, R. J. J., Kastan, M. B. Roles of ATM and NBS1 in chromatin structure modulation and DNA double-strand break repair. Nat. Cell Biol. 9 (6), 683-690 (2007).
  67. Caron, P., et al. Cohesin protects genes against γH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genet. 8 (1), e1002460 (2012).
  68. Goldstein, M., Derheimer, F. A., Tait-Mulder, J., Kastan, M. B. Nucleolin mediates nucleosome disruption critical for DNA double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (42), 16874-16879 (2013).
  69. Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO J. 29 (8), 1446-1457 (2010).

Tags

Genetica kwestie 131 Laser microirradiation lasers in geneeskunde DNA schade DNA schade reactie DNA-reparatie poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) complexe schade strand einden base schade
Laser Microirradiation om te studeren <em>In Vivo</em> cellulaire reacties op eenvoudige en complexe DNA-schade
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kong, X., Cruz, G. M. S., Silva, B.… More

Kong, X., Cruz, G. M. S., Silva, B. A., Wakida, N. M., Khatibzadeh, N., Berns, M. W., Yokomori, K. Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage. J. Vis. Exp. (131), e56213, doi:10.3791/56213 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter