Summary
El objetivo de este protocolo es describir cómo utilizar microirradiation de láser para inducir a diferentes tipos de daños en el ADN, como roturas de cadena relativamente simple y complejo daño, para el estudio de ADN daños reparación y señalización de factor Asamblea en sitios de daño en vivo .
Abstract
Daño de la DNA induce respuestas concretas de reparación y señalización de la célula, que es fundamental para la protección de la integridad del genoma. Microirradiation laser se convirtió en una valiosa herramienta experimental para investigar el ADN daños respuesta (DDR) en vivo. Permite análisis unicelular alta resolución en tiempo real de la dinámica macromolecular en respuesta a daño inducido por el láser confinado a una región Submicrométrica en el núcleo celular. Sin embargo, varias condiciones de láser han sido utilizadas sin apreciación de las diferencias en los tipos de daño inducido. Como resultado, la naturaleza de los daños es a menudo no bien caracterizado o controlado, provocando inconsistencias evidentes en los perfiles de contratación o modificación. Hemos demostrado que las condiciones de irradiación diferentes (es decir, diferentes longitudes de onda así como diferentes potencias de entrada (cultivos) de un láser de femtosegundo (fs) y de infrarrojo cercano (NIR)) inducida por distintos conjuntos de proteínas DDR y reparación. Esto refleja el tipo de daño en el ADN producido. Este protocolo describe cómo titulación laser de potencia de entrada permite la inducción de diferentes cantidades y la complejidad del daño de la DNA, que pueden controlarse fácilmente por la detección de daño base y reticulación, diferencial poli (ADP-ribosa) (PAR) de señalización, y Asambleas de factor de reparación específica de la vía en sitios de daño. Una vez determinadas las condiciones de daño, es posible investigar los efectos de daños diferente complejidad y daño diferencial de señalización, así como agotamiento de factor aguas arriba de cualquier factor de interés.
Introduction
En Vivo Señalización de daño de ADN no es haber entendido bien
In vivo, el ADN es acomplejado con histonas y otros factores para formar fibras de cromatina. Regulación de la estructura de la cromatina es de suma importancia para el metabolismo del ADN. Por ejemplo, la variante de la histona H2AX es fosforilada por la ataxia-telangiectasia mutado (ATM) y otras cinasas siguiente doble cadena rompe inducción (DSB) y es importante para la amplificación de la señal de OSD daños así como proporcionar un sitio para otro factores. Difusión de elección de vía de señalización y reparación de daños parecen ser críticamente influenciado por la estructura de la cromatina locales en sitios de daño1. Un número de remodelación factores, histona chaperonas y enzimas modificadoras de histonas de la cromatina son reclutados en efecto dañar sitios y son importante para la reparación del ADN eficiente, destacando la importancia de la regulación de la cromatina en la DDR y reparar2 , 3 , 4. Además, se observó sitio daño clustering o reposicionamiento en levadura y drosophila5,6,7,8, de relocalización de loci de genes en el compartimiento subnuclear asociado con genes regulación9,10. Recientes estudios en ratón y células humanas también revelaron movilización sitios web DSB, que influencias reparación fidelidad y vía elección11,12. Esto plantea la posibilidad que DDR y reparación puede también ser íntimamente arquitectura nuclear, organización de orden superior cromatina y cromosoma dinámica en el núcleo celular. Por lo tanto, es fundamental para desarrollar métodos de alta resolución para estudiar DDR y reparar procesos en el contexto del ambiente endógeno nuclear en una célula viva para entender las consecuencias a corto y largo plazo de daño en el ADN.
Papel crítico de PAR polimerasa (PARP) en medir el grado y tipo de daño y regula el ensamblaje de la proteína en el sitio de daño
PARP1 es un sensor de DNA nick rápidamente activado por daño en el ADN que desempeña un papel crítico en la reparación de ADN13. PARP1 originalmente fue pensado para funcionar junto con rayos x reparar Cruz complementando 1 (XRCC1) para facilitar la reparación de la supresión de base (BER), pero estudios recientes revelan su papel en otras vías de reparación del ADN, incluyendo reparación DSB14. Activa PARP1 utiliza nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) como sustrato a ADP-ribosylate varias proteínas objetivo, incluyendo sí mismo. Esta enzima y otros miembros de la familia han atraído mucha atención en los últimos años como inhibidores de la PARP han surgido como prometedores medicamentos para el cáncer. Aunque los inhibidores de la PARP inicialmente fueron encontrados para ser eficaz en el gen del cáncer de mama (BRCA)-transformado células de cáncer de mama, ahora hay una gran cantidad de evidencia de sus efectos en mono - y combinación de terapias junto con ADN dañando agentes, radiación contra un amplio espectro de cánceres con mutaciones que no se limita a BRCA15,16,17,18,19,20.
A nivel molecular, activación de la PARP fue demostrada que desempeñan un papel crítico en la organización de la estructura de la cromatina locales en sitios de daño. Contratación dependiente del PAR de las enzimas de modificación de la cromatina facilita la reparación DSB y dictados reparacion opciones de camino, sugiriendo el papel importante del andamiaje de modificación PAR en sitios de daño. 13,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31 recientemente demostramos la exclusión de la proteína p53-1 (53BP1) dañen sitios por PAR 32, proporcionando una explicación alternativa para el hyperactivation 53BP1 dependiente de endjoining no homóloga ( NHEJ) por PARP inhibidor y destacando la importancia de PARP en OSD reparación vía elección33,34. PARP1 también directamente PARylates y afecta a la reparación de la actividad de la DNA múltiples factores14.
Usando Microirradiation de láser como una herramienta para estudiar DDR y reparación en Vivo
Microirradiation láser para producir sub-micron alteraciones en cromosomas individuales primero fue descrito en 196935 y revisado en detalle en 198136. Varias décadas más tarde, microirradiation laser fue demostrado para inducir daño de la DNA en una región definida Submicrométrica en el núcleo celular y fue demostrado para ser una técnica valiosa para el estudio de reclutamiento o modificaciones de los diversos factores de lesiones del ADN in vivo 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41. este método permite la detección de aquellos factores que no forman distintos focos inducido por irradiación (IRIF) en sitios de daño39,42. También es posible examinar la dinámica espacio-temporal de los cambios estructurales de la cromatina en los sitios de daño y en el resto del núcleo. Cuidadosamente comparamos el DDR inducida por láser diferentes sistemas y poder evaluar la relación entre el tipo de daño en el ADN y el microirradiation condiciones32,43,44, 45. Los patrones de reclutamiento aberrante de 53BP1 y telomeric repetición factor de Unión 2 (TRF2) fueron observados en los estudios previos de daños del láser, que sirvió de base para la preocupación recurrente por la naturaleza "non-physiological" del daño inducido por el láser46 ,47,48,49. Encontramos que estas aparentes discrepancias podrían explicarse ahora por PARP diferencial señalización que indicadores de la cantidad y la complejidad del daño inducido32. Confirmamos que: 1) laser-microirradiated las células (incluso después de la irradiación de energía de entrada alta) son arrestadas en interfase en una forma de control dependiente del checkpoint de daños y permanecer viables (al menos hasta 48 h)32,50; y 2) contratación de factor de reparación o modificaciones fielmente lo observado con el tratamiento con agentes perjudiciales convencionales de ADN y la inducción de OSD por endonucleasas32,39,42, recapitular 44,50,51,52. Estos resultados apoyan fuertemente la relevancia fisiológica de estudiar respuestas celulares inducidas por daños de láser.
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Protocol
1. preparación de la célula básica
Nota: Este paso es para detección de inmunofluorescencia estándar del reclutamiento de la proteína endógena o modificación y para el uso de una línea celular estable expresar una proteína recombinante fluorescente etiquetada. Por ejemplo, las células epiteliales del riñón marsupial Potorustridactylus (PtK2) estable expresan EGFP 53BP11220-1711 o TRF2 YFP se utilizaron en nuestro anterior estudian (figura 1)32. En el caso anterior, el enfoque de formación región de 53BP1 (aminoácido 1220-1711) que contiene el dominio de Oligomerización del dominio Tudor y el motivo de la contratación ubiquitylation dependiente (UDR), fue fusionada a GFP mejorada (EGFP 53BP11220-1711). Esta proteína de fusión recapitula el reclutamiento de sitio de daño de los larga duración 53BP153,54,55. En células HeLa, fluorescencia etiquetados subunidades de cohesinas (p. ej., hSMC1-GFP51, GFP-Scc1 (Rad21)52y GFP-SA2 51) deberán ser estable expresadas para asegurar la incorporación eficaz en el complejo y recapitular S/G2 ciclo celular fase específico daño sitio reclutamiento de la cohesina endógeno51.
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Cualquier tipo de células adherentes sobre un plato de cultivo de tejidos de 35 mm con un cubreobjetos cuadriculado para permitir la identificación de la célula individual de la semilla. Ajustar el número inicial de la célula para alcanzar el 60% de confluencia en 36-48 h en la tasa de proliferación de la línea celular particular. Por ejemplo:
- De células epiteliales del riñón marsupial PtK2 (tipo salvaje o los estable expresan EGFP 53BP11220-1711 o TRF2 YFP):4 células en 2 mL de la placa de 2.0 x 10 avanzado mínimo esencial Medium (MEM) suplementado con 2 mM L-glutamina, bovino fetal 4% suero (FBS) y antibióticos (100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL estreptomicina) e incubar a 37 ° C con 7% CO2.
- Para HeLa células con expresión estable de fluorescencia con la etiqueta proteínas recombinantes GFP-SA2: semillas 1.0 x 105 células en 2 mL Medium (DMEM modificado Eagle de Dulbecco) suplementado con 10% SFB, 2 mM L-glutamina, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina 100 μg/mL, e incubar a 37 ° C con 5% CO2. Otras células HeLa pueden usarse incluso sin modificar las células o las células que expresan hSMC1-GFP.
- Permitir a las células para adherirse y proliferar por 36-48 h antes de la inducción de daño de DNA en 30-60% de confluencia (para permitir la visualización del número de red). Proceder a la sección 4.
2. transitorios de la transfección
Nota: A veces buenos anticuerpos no están disponibles para detectar las proteínas endógenas. Si no existen líneas celulares de expresión estable de proteínas marcadoras, llevar a cabo de transfecciones transitorias para controlar la fluorescencia de etiquetado proteínas para análisis de células vivas.
- Para las células HeLa, el día 1, semillas de 6-8 x 104 células en medios de cultivo de 0.5 mL en un pocillo de una placa de 24 pocillos e incubar en una 100% humidificado incubadora a 37 ° C y con 5% CO2. Consulte el paso 1.1 para las condiciones de los medios de cultivo.
- Día 2, uso de un plásmido de expresión mamíferos codifican un ADN fluorescente etiquetado reparar factor (por ejemplo, GFP-NTH1 o GFP-OGG1 daño base32,44,56, GFP-Ku para dosis alta distritales57, GFP-53BP1 32 para distritales relativamente simples, u otras proteínas de interés sobre etiqueta fluorescente) para realizar la transfección de ADN mediada por liposomas. Diluir 0,3 μg ADN plásmido en 25 μl de medio de cultivo libre de suero en un tubo de 1,5 mL.
- En otro tubo de 1.5 mL, diluir 1 μl basadas en liposomas DNA transfección de reactivo en 25 μl de medio de cultivo libre de suero y mezcle suavemente.
- Mezclar suavemente el agente diluido de ADN y transfección e incubar 10 min a temperatura ambiente (RT) para formar complejos ADN-lípidos.
- Lavar las células con medios de cultivo de 0, 5 mL una vez, eliminar los medios de comunicación y añadir 0.5 mL medio de cultivo fresco a las células (como en el paso 1.1).
- Añadir los complejos DNA-lípidos a las células. Mezclar suavemente, meciendo la placa varias veces. Volver a poner las células en la incubadora como en el paso 2.1.
- Después de 4-6 h, eliminar los medios de cultivo de las células y añadir 300 μL 0.05% tripsina-EDTA. Quitar, añadir 200 μL de tripsina-EDTA e incubar en la incubadora de 37 ° C durante 3-4 minutos.
- Después de confirmar que las células son separadas, añadir 800 μl medios de cultivo y resuspender las células mediante pipeteo suavemente para dispersar los grumos de células. Transferir la suspensión a una placa de cultivo de 35 mm con un cubreobjetos cuadriculada y añadir los medios de cultivo a un volumen final de 2 mL.
- Incubar las células en la incubadora como en el paso 2.1 durante 48 h, luego proceda a la sección 4.
Nota: Si la expresión de la proteína recombinante es tóxica (células transfected muestran morfología redonda o irregular después de la incubación en el paso 2.8), acortar el tiempo de expresión y realizar láser microirradiation (sección 4) a 16-20 h después de tan larga como la transfección del expresión de la proteína puede ser confirmada (para la detección de la fluorescencia, vea el paso 4.3). En este caso, realizar la transfección directamente en el plato de 35 mm. Semilla de 3.0 x 105 HeLa células en un plato de 35 mm con un cubreobjetos cuadriculado para lograr aproximadamente el 50-70% confluencia después de plásmidos de ADN transfectar h. 30 y cambiar medios de 2-6 h después de transfección. Proceder con láser microirradiation 12-20 h más tarde si es razonable expresión de la proteína y las células aparecen sanas.
3. ciclo celular sincronización
Nota: Para la recombinación homóloga reparación (HR) proteínas, tales como Rad51 y cohesin, el reclutamiento es más prominente en la fase S/G2 del ciclo celular, en que hora reparación toma lugar51. Así, para supervisar la contratación de estas proteínas, sincronización de células en fase S/G2 es necesario.
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Sincronización de fase S/G2
- Utilizar el protocolo de bloque de timidina doble para sincronización celular en S/G2 fase50,51. Después de la siembra de las células en un plato de 35 mm cuadriculada cubreobjetos (ver paso 1.1), incubar las células con timidina (a una concentración final de 2, 5 mM) en medios de cultivo (como en el paso 1.1) de 17 h a 37 ° C y con 5% CO2.
- Lavar las células con 1 mL medio de cultivo libre de timidina (como en el paso 1.1) dos veces e incubar las células en medios de cultivo libres de timidina de 2 mL para 9 h como en el paso 1.1.
- Añadir 200 μL de solución stock de 27,5 mM timidina (disuelto en medios de cultivo) en los medios de cultivo con las células a una concentración final de timidina 2,5 mM. Incube las células como en el paso 3.1.1 para h. 15 otro enjuague e incubar las células en medios de cultivo libres de timidina para 4-6 h, inducir daño en el ADN (sección 4).
- Confirmar la eficiencia de sincronización mediante el uso de marcadores de ciclo celular (ciclina A2 y B1-S/G2 y G2, respectivamente), S/G2 fase específica DNA daños reparación factores (e.g., Rad51 o cohesinas), o por el IdU/EdU incorporación (de células en fase S)51.
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Sincronización de fase G1
- Semillas 6-8 x 104 células HeLa en una placa de cultivo de 35 mm con cuadriculada cubreobjetos (paso 2.1).
- Después de 2 días, identificar las células en metafase, que están un poco levantado y en forma redonda, debajo de un microscopio invertido con objetivo de 10 X y 10 X oculares lentes. Adquisición de imágenes para registrar la posición de las células en metafase en el cubreobjetos cuadriculada.
- Después de 3-4 h, confirman División de la célula en dos células hijas (en fase G1) e inducir daño al ADN (sección 4).
4. valoración del Laser de potencia de entrada
Nota: En el presente Protocolo, inducir daño en el ADN utilizando un 780 nm pulsado sistema de láser NIR fs conectado a un microscopio confocal, o un 800 nm pulsos fs NIR láser acoplado a un microscopio de epifluorescencia invertida. Aunque de entrada potencia (irradiancia real en el punto focal del láser en la muestra) necesaria para inducir DDR comparable es diferente en estos sistemas, el principio básico de valoración de la potencia de entrada es aplicable a ambas, o ninguna, NIR sistemas32,57 . La energía en situ por el láser pulso y pico de intensidad de radiación en el punto focal para los sistemas de dos láser estaban en la gama de 5.33 × 10-2-4 × 10-1 de nJ y de 7 × 1010-5.24 × 1011 W/cm2, respectivamente,32.
- Encienda el láser NIR y permitir que el sistema láser calentamiento durante 1 hora antes de su uso.
- Coloque un plato de las células en una fase caliente (37 ° C) en una cámara que permite CO2 (5%) y control de humedad (100%).
Nota: Si una cámara de CO2 no está disponible, use CO2-medios de cultivo independiente para un máximo de 5-6 h. Si no hay una fase de calentamiento, mantener las células bajo el microscopio para < 20 minutos y vuelva a colocar inmediatamente en la incubadora de cultivo de tejidos con control de humedad, temperatura adecuada y CO2. Estas condiciones de cultivo pueden variar dependiendo del tipo de célula específico utilizado así como el organismo de derivación (por ejemplo, mamíferos y anfibios). - Para análisis de células vivas de fluorescencia etiquetas proteínas, seleccione un filtro GFP (excitación de 450-490 nm, 515-586 nm de emisión) o Cy3 (540-552 nm excitación, emisión de > 590 nm) para GFP o proteína fusionada mCherry, respectivamente, con un 100 X o inmersión de aceite X 63 objetivo.
- La búsqueda de células que tienen señales de fluorescencia comparable, lo que refleja niveles comparables de expresión de la proteína. Evitar que las células que tienen expresión demasiado débil o demasiado fuerte con el fin de reducir la variabilidad de la célula a célula en las mediciones de fluorescencia.
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Valorar la potencia de entrada del láser.
- 780 nm láser NIR conectado a un microscopio confocal
- Utilice la función de bleach software para apuntar pistas lineales dentro del núcleo celular por exposición a los escáneres de láser (resolución 512 x 512 píxeles, zoom X1, blanqueado región 50 x 4 píxeles, 12,8 μs tiempo de permanencia de pixel, iteración x1) a través del objetivo de aceite (100 X / 1.3 NA).
- Ajustar el porcentaje de transmisión de láser (mediante el software y hardware integrado en el sistema de microscopio láser por el fabricante) al 5% sin cambiar ningún otro ajuste.
- Colocar una célula en el centro del campo. Haga clic en la región de herramienta de interés (ROI), dibujar una línea o cuadro (aproximadamente 50 x 4 píxeles) en el núcleo usando el ratón y haga clic en el botón de "Bleach" para inducir daño en el ADN.
Nota: En los pasos de la irradiación posterior, "blanqueo" debe aumentarse en incrementos de 5% a 40% o hasta 100% si es necesario. - 800 nm láser NIR al microscopio de epifluorescencia
- Control de potencia de entrada a través de una (63 X / 1.4 NA) objetivo de inmersión de aceite fase contraste por rotación motorizada de un filtro de polarización introdujo en la trayectoria de viga y montado sobre un escenario rotatorio motorizado controlado por ordenador32,39 , 58.
- Ajuste el ángulo del polarizador (°) y medir la energía de entrada (mW) en el microscopio, usando un medidor de potencia láser. Determinar los ángulos de polarizador que proporcionan potencias de entrada que van desde los 20 mW mW-155 en incrementos de 5-10 mW.
- Ajuste el ángulo del polarizador que corresponde a la potencia de entrada 20 mW.
Nota: Para nuestro sistema de láser, si el ángulo del polarizador es 40 º, la potencia de entrada es de 65 mW. Aumentar la potencia de entrada con incrementos de 5-10 mW.
- 780 nm láser NIR conectado a un microscopio confocal
- Para el análisis de células vivas, vaya a pasos 6.1 y 6.3. Para la detección de inmunofluorescencia de las proteínas endógenas o modificaciones proceda a la sección 5. Después del análisis, vaya al paso 4.7 para más valoración de la potencia del láser. Para analizar el requisito de factor aguas arriba, vaya a la sección 7.
Nota: Contratación de factores BER y NHEJ es rápido (dentro de unos minutos) y transitorio (< ~ 30 min - 1 h dependiendo el puesto factor y < ~ 4 h dañar inducción, respectivamente). En contraste, la contratación de recursos humanos factores Rad51 y cohesin es detectable en ~ 30 min - 1 h y tienden a persistir más de 8 h a las rupturas ADN lesiones44,50,51. Por lo tanto, es necesario examinar otra vez puntos post irradiación para reparación de diferentes factores. - Aumentar la potencia de entrada en incrementos deseadas (es decir, 5% para 780 láser NIR y 5-10 mW para 800 NIR) como en el paso 4.4 y repita los pasos 4.5-4.7 en un nuevo conjunto de células para determinar el umbral (50% de células dañadas Mostrar reclutamiento) y máximo (100% de células ver contratación) para cada proteína.
5. tinción de inmunofluorescencia
Nota: para la detección de la modificación covalente de la proteína, como PAR (marcador de daño complejo) y fosforilación de H2AX (γH2AX) (marcador de OSD), así como dímeros de pirimidina ciclobutano (CPD)/(6-4) photoproducts (6-4PP) y 8-oxoguanine (8-oxoG) (reticulación y base de marcadores de daño, respectivamente), las células deben fijarse y teñidas con anticuerpos específicos. Además, es mejor confirmar los resultados obtenidos con las fluorescencia de etiquetado proteínas recombinantes por la detección de anticuerpos de las proteínas endógenas, para distinguir artefactos inducidas por la sobreexpresión de proteínas de fusión recombinantes.
- Fijar las células en diferentes momentos después de la inducción de daño (paso 4.5) dependiendo de los factores mediante la sustitución de los medios de cultivo (véase el paso 1.1) con 1,5 mL de paraformaldehído al 4% / 1 X PBS durante 10 min a TA.
PRECAUCIÓN: Los vapores de paraformaldehido son tóxicos y todo trabajo debe hacerse de una campana ventilada. - Extraiga a paraformaldehído al 4% / PBS y añadir 1 mL de 0.5% de detergente/PBS por 10 min a TA.
- Eliminar 0.5% detergente/PBS y enjuague las células con 2 mL de PBS durante 5 minutos dos veces e incubar las células en 2 mL de solución de bloqueo (suero de 10%, 1% BSA/PBS) durante 1 h a TA.
- Eliminar bloqueo de la solución y añadir 2 mL de PBS a las células y reemplazar PBS solución de anticuerpo primario de 250 μl del 3% BSA/PBS durante la noche a 4 ° C o 1 h a RT. uso un 1: 200-dilución 1: 500 (típica concentración aproximadamente 1 μg/mL, determinado empíricamente) para anticuerpos específicos para diferentes marcadores de daño ADN (p. ej., γH2AX/53BP1 (OSD); Ku (DSB, NHEJ); Rad51/cohesinas (DSB, HR); 6/CPD-4PP (reticulación daño); 8-oxoG ADN glicosilasas (e.g., NTH1) (daño base); PAR (daños complejos de alta dosis)).
- Retirar la solución de anticuerpo y lavar con 2 mL de PBS durante 5 minutos dos veces, quitar PBS e incubar con 250 μl 0.1% de anticuerpo secundario en 3% BSA/PBS para 1 h en la oscuridad a TA.
- Retirar la solución de anticuerpo secundario y agregar 2 mL de PBS durante 5 minutos dos veces y mantener las células en 1.5-2 mL PBS a 4 ° C para la proyección de imagen en pasos 6.1 y 6.2.
6. Análisis de fluorescencia cuantitativo de Immunostained o células vivas
- Capturar imágenes de las células manchadas o vivo (n > 10) utilizando microscopio utilizado para la irradiación. Para el sistema de microscopio de epifluorescencia, utilice la resolución de 1.344 x 1.024 píxeles y guardar imágenes como archivos TIFF de 16 bits. Para un microscopio confocal, utilice 1 aumentos; Láser de argón para la GFP/FITC, láser de HeNe 594 para Cy3/mCherry; 512 x 512 o 1.024 x 1.024 píxeles de resolución de la imagen; escaneo velocidad 5, número: 1 para exploración rápida o 2 + para un promedio de más de múltiples para mejorar la relación señal a ruido.
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Utilice un análisis de la imagen programas diseñados para medir la intensidad del pixel.
- Utilice la herramienta de rectángulo volumen para dibujar un ROI alrededor del sitio del daño en la imagen de célula individual. Use el mismo tamaño ROI para medir la señal de fluorescencia de fondo en el nucleoplasia adyacente a, pero no superpuestos con los sitios de daño. Esto es importante para la normalización de fotoblanqueo asociado con el sistema de microscopio no confocal.
- Para medir las señales de fluorescencia usando el programa de análisis de imagen, haga clic en "Informe de análisis de volumen" en la caja de herramientas. Aparecerá una nueva ventana. En la sección de "Datos para mostrar", casillas sólo el "Nombre" y "Densidad". Haga clic en "Terminado" para visualizar las medidas.
- Los valores de exportación a un programa de hoja de cálculo haciendo clic en el icono de tabla encontrado en la parte inferior de la ventana Informe de volumen y seleccionadas "(formato excel) las pestañas" para separadores de campo y "Archivo" para el destino de la exportación.
- Para obtener señales de relativa, utilice el programa de hoja de cálculo para dividir la intensidad de fluorescencia en el sitio del daño (columna 1) por que en el control del región (columna 2) en el nucleoplasia de fondo y restar por 1 para la normalización.
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Análisis de tiempo-curso de fluorescencia cuantitativa en tiempo real con el microscopio confocal
- Identificar células de proteína-positivas fluorescente etiquetas utilizando el microscopio como en el paso 4.3.
- Realizar imágenes de fluorescencia Time-lapse antes del daño y en diferentes momentos después de la inducción de daño en la sección 4. Primero dibujar el blanqueador ROI (para la inducción de daño), a continuación, seleccione la "adquisición > serie" submenú configurar "Número" como 20 y el "retardo" como 30 s, elegir "blanqueador una vez después de la primera exploración" y haciendo clic en "start B". En este caso, la primera imagen es adquirida inmediatamente antes de la inducción de daño, seguida por 19 adquisición de imagen en un intervalo de 30 s. Intervalos ("retardo") se pueden modificar según el propósito del estudio.
- Una vez completada la adquisición de la imagen, haga clic en "Significa" y dibujar el retorno de la inversión en la región de daño. Haga clic en "Mostrar tabla" para obtener una tabla la intensidad en el ROIs seleccionadas. Normalizar los datos, dividiendo la intensidad de la fluorescencia del sitio daños en diferentes puntos temporales por la intensidad de la misma región antes del daño y restar 1.
7. pequeño interferir ARN (siRNA) transfección
Nota: El agotamiento de la proteína Diana es una manera eficaz para delinear el requisito de factor aguas arriba para el reclutamiento de la proteína observados dañar sitios (sección 4). Además, la estrategia es la mejor manera de abordar la especificidad de un anticuerpo que se utiliza para la detección de inmunofluorescencia (ver sección 5).
- Día 1: Preparar 2 pozos de células HeLa en una placa de 24 pozos de siembra 6-8 x 104 células HeLa en medios de cultivo de 0.5 mL en cada pocillo, uno para la transfección de siRNA control y uno para PARP1 siRNA (AGA AAT CTC TTA CCT CAA de 5'-CCG-3').
- Día 2: Confirmar que las células son aproximadamente 40-50% confluente. Realizar la primera ronda de la transfección de siRNA: diluir 5 pmol siRNA en 25 μl de medio de cultivo libre de suero, añadir lípidos μl 3 basaron de reactivo de transfección en el tubo, mezclar suavemente e incube durante 5-10 min a TA.
- Lavar las células con medio de cultivo fresco 0,5 mL de una vez y mantener las células en medios de cultivo fresco de 0,5 mL (véase el paso 1.1).
- Añadir los complejos RNA-lípidos a las células y mezclar suavemente inclinando el plato hacia delante y hacia atrás. Volver a poner las células en la incubadora como en el paso 2.1.
- Aspire la mezcla de transfección y agregar 0,5 mL medio de cultivo fresco (paso 1.1) después de 6 h.
- Día 3: Realizar la segunda ronda de transfecciones siRNA (vea el paso 7.2). Entonces, la semilla 60-100% de las células en una placa de 35 mm cubreobjetos cuadriculada como se describe en el paso 2.3.
- Día 5: Continuar con la microirradiation de láser con la condición de potencia de láser óptimo para reclutamiento máximo del factor de interés, según lo determinado por la sección 4. Por lo general, agotamiento eficiente puede observarse en aproximadamente el 60-90% de las células HeLa.
Nota: Como alternativa y complementaria enfoque, inhibidores, si está disponible, puede utilizarse para inhibir la función del factor de interés32,44. Para analizar el efecto de inhibir la señalización de la DDR, agregar inhibidor PARP de 20 μm, 1 μm PAR glycohydrolase (PARG) inhibidor o a 10 μm dependiente de DNA proteína quinasa con inhibidor de la subunidad catalítica (DNA-PKcs) y el inhibidor de ATM de 10 μm en dimetil sulfóxido (DMSO) a la platos 1 h antes de la inducción de daño. Agregue el DMSO sólo a las células del control.
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Representative Results
Usando células PtK2 estable expresaban EGFP 53BP11220-1711 o TRF2 YFP, láser alimentación valoración se llevó a cabo para determinar las condiciones óptimas para su contratación (figura 1)32.
En los sitios de daño del láser de alta potencia de input, el agrupamiento significativo de CPD (daño reticulando típicamente generado por daño ultravioleta (UV)) así como GFP-NTH1 ADN glicosilasa que específicamente reconoce el daño de base fueron observados. Además, se observaron señales más altas de XRCC1 y CtIP, reflejando el aumento del número de roturas del filamento y que demuestre que el daño del ADN complejo es induce bajo esta condición (figura 2A). Otros glicosilasas del ADN unido a proteínas fluorescentes (p. ej., GFP-nei endonuclease VIII-como 2 (NEIL2) y GFP-8-Oxoguanine glicosilasa (OGG1)) así como condensin yo también puedo ser utilizado como marcadores de daño base44,59. De acuerdo con esto, encontramos que la respuesta PAR es inducida significativamente por láser de alta potencia de input (es decir, energía y radiación en el punto focal de la muestra), pero sólo débilmente por la energía láser de baja en el punto focal (figura 2B, arriba a la izquierda). POR señales, pero no PARP1 proteína localización, en los sitios de daño fueron sensibles a los inhibidores PARP (datos no mostrados). Además, siRNA para PARP1 disminuido tanto PAR como PARP1 en sitios de daño (figura 2B, arriba a la derecha)32. Bajo la condición de alta potencia de entrada, γH2AX aparece inicialmente en los sitios de daño y rápidamente se extiende hacia el núcleo entero de manera ATM/ADN-PK-dependiente (figura 2B, parte inferior). ATM/ADN-PK-dependiente similar separarse de γH2AX fue divulgado para γ-radiación60. Resultados se obtuvieron con 800 y 780 nm NIR láser sistemas32. Tomados en conjunto, los resultados revelan que es posible valorar alimentación láser (y por lo tanto, energía y radiación en el punto focal de la célula) para encontrar las condiciones que inducen a diferentes grados de respuesta PARP la correlación con el número de consejos escolares distritales y la complejidad de los daños en el ADN.
Inicialmente los resultados anteriores sugieren que la presencia de daño de ADN complejo pudo haber causado reclutamiento diferencial de 53BP1 y TRF2. Curiosamente, sin embargo, el reclutamiento de1220-1711 53BP1 a un sitio de baja potencia daño fue efectivamente inhibido por la presencia del segundo sitio de daño inducido por la alta entrada de potencia en el mismo núcleo de la célula (Figura 3A , en contraste con figura 3B ). Los resultados indican que daños de láser de alta energía de entrada suprime 53BP1 reclutamiento en trans. Inhibición de PAR por inhibidor de la PARP, así como inhibición de la γH2AX nuclear todo el separarse por restaurar inhibidores de ATM/ADN-PK este reclutamiento hasta el sitio de daño de alta potencia de entrada (Figura 3A). Esto es distinto de la contratación de mediador de DNA daños de control 1 (MDC1) a los sitios de daño, que principalmente fue inhibida por la dispersión de γH2AX y por lo tanto, fue restaurado por los inhibidores de la ATM, DNA-PK, no inhibidor de la PARP (Figura 3A, parte inferior). Lo importante, hyperactivation de PAR por la inhibición de PARG (sin afectar el estado de γH2AX) con eficacia suprimido reclutamiento inicial 53BP1 incluso en los sitios de daño bajo energía de entrada que normalmente reclutan 53BP1 eficientemente (figura 3B)32. Tomados en conjunto, estos resultados indican PAR las señales y no el tipo de daño por sí, interfiere con el reclutamiento de 53BP132. Este es un ejemplo de la versatilidad del láser microirradiation, que nos permite examinar cómo múltiples daños influyen e interactuar con los demás.
Figura 1 : Valoración del laser de potencia de entrada. Para determinar la potencia del láser para futuros experimentos, las células PtK2 estable expresaban EGFP 53BP1 y TRF2 YFP sometieron a láser microirradiation con entrada potencias comprendidas entre los 20 mW y 155 mW utilizando la 800 nm NIR láser/invertida epi-fluorescencia sistema de microscopio. EGFP 53BP1 reclutamiento fue supervisado por 15 min post irradiación (p.i.), mientras que las células TRF2 YFP fueron seguidas durante 6 min p.i. Los números directamente encima de las barras representan el número de células que mostraron reclutamiento positivo de EGFP 53BP1 o TRF2 YFP a los sitios de daño sobre el número total de células probado. Esta figura fue modificada de Saquilabon Cruz32. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Inducción de daño complejo y robusto DDR señalización por láser de alta potencia de input. (A) microirradiation de láser de alta energía de entrada induce daños complejos incluyendo roturas del filamento (SSBs y distritales), reticulación y el daño de base. CPD, XRCC1 (SSB y OSD de reparación), NTH1 ADN glicosilasa (Azufaifas) y CtIP (alternativa NHEJ y HR) aparecen (solo GFP-NTH1 es una imagen viva de la célula y el resto se observan tras tinción de inmunofluorescencia). Las mediciones de intensidad de fluorescencia cuantitativa de la selección de sitio de daño fueron hechas según lo indicado en el protocolo artículo 7 y se muestran en los boxplots. El número total de células (n) prueba puede verse en cada proteína cuantificado. p-valor < 0.05. (B) arriba (izquierda): PAR robusto y PARP1 señales en sitios de alto daño de energía de entrada. Parte superior (derecha): PARP1 siRNA agotamiento es suficiente para suprimir la señal PAR32,44. Abajo: Curso de análisis de tiempo de γH2AX en células con baja (arriba) y alta (abajo) entrada daños de alimentación como se indica. Barras de la escala = 10 μm. Esta figura fue modificada de Saquilabon Cruz32. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Activación diferencial de DDR señalización afecta 53BP1 reclutamiento dañar sitios. Parte superior (A): las células PtK2 estable expresaban EGFP 53BP11220-1711 fueron microirradiated con bajo (15%) y alto (25%) potencia de entrada (blanco y amarillo las puntas de flecha, respectivamente) en el mismo núcleo usando el sistema de microscopio confocal/NIR 780 nm. Esto se realizó en presencia de DMSO, PARP inhibidor (Pi), o la combinación de ATM, DNA-PK y los inhibidores de PARP (Ai + Di + Pi) como se indica. Imágenes de células vivas de EGFP 53BP11220-1711 fue capturada a los 30 min después de la inducción de OSD. Las células fueron fijas y teñidas con un anticuerpo específicas para γH2AX como un marcador de OSD. Cambios de intensidad de fluorescencia de EGFP 53BP11220-1711 en sitios de daño aparecen a la derecha con p-valores (significa que los valores son: DMSO, 0.03 ± 0,02; PI, ± 0,34 0,19; AI + Di + Pi, 0,98 ± 0,23). Abajo: El efecto del tratamiento de Pi y Ai + Di sobre localización MDC1 con alto daño de energía de entrada como se indica. Barra de escala es 10 μm. Derecha: Cambios de las señales de fluorescencia de MDC1 en alta potencia de input dañan sitios en presencia de DMSO, Pi o Ai + Di p-valores (significa que los valores son: DMSO, 0,07 ± 0,10; PI, ± 0.05 0.07; AI + Di, 0.86 ± 0.26). Barra de escala = 10 μm. N = 10 para cada medida de intensidad. (B) el efecto de la mejora de PAR las señales por el tratamiento de la PARGi sobre el reclutamiento de 53BP1 endógenos a los sitios de daño bajo energía de entrada. Derecha: Boxplots que representa el análisis cuantitativo de reclutamiento 53BP1 endógena (detectada por tinción de inmunofluorescencia) con láser de baja energía de entrada (60 mW de los 800 nm NIR láser/invertida epi-fluorescencia microscopio sistema) en 15 min post irradiación en presencia de DMSO o PARGi como se indica. Izquierda: PAR y 53BP1 inmunofluorescencia que manchaba fotos de células dañadas en las mismas condiciones con tratamiento DMSO o PARGi. Para el tratamiento de DMSO, 100% de las células examinadas (N = 25) exhiben reclutamiento 53BP1 robusto (derecha). En contraste, 20/25 demostró no reclutamiento 53BP1 en presencia de PARGi (abajo a la derecha) y 5 células mostraron captación débil. Barra de escala = 10 μm. Esta figura fue modificada de Saquilabon Cruz32. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Las ventajas de la utilización de láser microirradiation para la investigación DDR son:
1. es factible inducir diferentes tipos y cantidades de ADN dañan por roturas de cadena simple a complejo daño en el ADN, y para detectar factores de reparación diferentes a la DNA dañan sitios mediante el ajuste de los parámetros de la irradiación láser. También es posible infligir daño varias veces en el mismo núcleo de la célula con el fin de evaluar los efectos de transporte (como en la figura 3).
2. importante, eventos que ocurren en sitios de daño y los eventos secundarios que se producen en otros lugares en el núcleo pueden ser distinguidos fácilmente.
3. es posible llevar a cabo medidas en tiempo real de alta resolución de la dinámica de la proteína fluorescente etiquetado en respuesta al daño a nivel unicelular, incluyendo pero no limitado a: Förster Resonancia energética transferencia (traste), (imagen de vida de fluorescencia FLIM), función de correlación par (pCF), etc., para capturar DDR en células vivas.
4. La combinación con tratamiento de interferencias o inhibidor de la RNA, es relativamente sencillo probar el requisito de factor aguas arriba en un pequeño número de células.
5. también debe ser observado que NIR (o verde) radiación láser no requiere sensibilización previa del ADN con análogos de nucleótido o colorantes intercalantes de ADN, evitando indeseables efectos secundarios en el embalaje de la cromatina. Esto está en contraste con el sistema de láser UV que requiere sensibilización en dosis baja y causa aberrante DDR en dosis alta39,49,61.
Pasos críticos en el protocolo o modificaciones y resolución de problemas
Es importante que las células estén en condiciones saludables cuando se realizaron análisis de DDR para minimizar el artefacto y variaciones experimentales. ADN o siRNA transfected las células suelen ser más sensibles o fácilmente separadas cuando se cultiva en el cubreobjetos cuadriculado. Ayuda a mantener las células para tiempos más cortos en el reactivo de transfección como trabaja la transfección y más transfected las células sobre el plato de cubreobjetos cuadriculada en comparación con las células untransfected de la semilla. Esto es necesario para lograr confluencias célula comparable para los experimentos.
Se ha informado de que el bloque de timidina conduce a mayores niveles de γH2AX en las células sincronizadas62, que pueden afectar la DDR y sesgar los resultados. Además, la señal de γH2AX de línea de base fue demostrada para ser superior en la fase S y G2/M sin cualquier daño exógeno63,64. Sin embargo, no observamos ninguna señal importante γH2AX en el nucleoplasia que afectan o interfieren con la respuesta de γH2AX específicas en sitios de daño inducido por el láser en las células sincronizados en S/G2 fase por una timidina doble bloque51.
Para obtener resultados consistentes, es necesario comprobar periódicamente los parámetros de salida del sistema de láser (cada 2 a 4 semanas) y alineación óptica (cada 2 meses). Con el tiempo, componentes del sistema de láser pueden necesitar ser nuevamente alineado objetivo puede dañarse y necesitan ser reemplazados y la estabilidad de la energía de entrada total puede cambiar. La clave está en evaluar la presencia de daños (daño base (8-oxoG) y reticulación (CPD o 6-4PP)), proteínas marcadoras (p. ej., ADN glicosilasas, Rad51, cohesin y Ku) y modificación de PAR se describe en este protocolo para determinar la dosificación y complejidad del daño del ADN inducido por el sistema de microscopio de láser utilizado.
Limitaciones de la técnica
Microirradiation de láser tiene limitaciones. Daño de ADN inducido por el rayo láser es altamente agrupado en una zona en el núcleo en comparación con natural daño que se puede propagar a lo largo del núcleo. Esto puede cambiar cómo se propaga el daño de señalización en la cromatina vecina o en el núcleo. Puesto que un número relativamente bajo de células puede ser irradiado a la vez, no pueden realizarse fácilmente ensayos bioquímicos basados en la población (por ejemplo, Western blot, purificación de complejos de proteínas, inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)). Dependencia de proteínas fluorescencia etiquetas (con sobre la expresión de las proteínas recombinantes exógenas o incluso con los expresados endógenamente utilizando inserción CRISPR-mediada de la etiqueta) para la proyección de imagen dinámica los estudios los hace vulnerables a la proteína inducida por el fusión artefactos. La naturaleza única del daño inducido por el láser y efectos potenciales artifactual de etiquetado las proteínas, por lo tanto, deben evaluarse por comparación con los resultados usando la DNA convencional perjudicial métodos (IR, químicos dañinos agentes) y con la endógena proteínas sin etiquetar (aunque a veces no resulta posible realizar experimentos paralelos completos).
Importancia con respecto a los métodos existentes
El uso de endonucleasas específicas de secuencia como SceI, FokI, AsiSI-PpoI provee una estrategia alternativa para inducir específicas distritales (consejos escolares distritales estrictamente simples). Contratación de factor o modificaciones pueden ser analizadas por sitio específico o genoma ChIP análisis65,66,67,68,69. Inducción relativamente sincrónica de distritales puede lograrse mediante etiquetado la endonucleasa con un receptor de la hormona esteroide y una señal de degradación (degron) de rápida translocación nuclear y degradación, respectivamente65,66 , 67 , 68 , 69. se debe tener en cuenta, sin embargo, que la eficacia de la expresión de la endonucleasa y accesibilidad del sitio de destino, y el constante estado de reparación puede ser variable en las diferentes células y en diferentes sitios. Estas heterogeneidades se promedió en el población-análisis basado en ChIP, que puede sesgar los resultados. Láser microirradiation, por otro lado, ofrece la más alta resolución temporal (milisegundos) así como de resolución espacial (submarinoMicrómetro) de la dinámica de respuesta de daño, que puede ser analizada a nivel unicelular. Densidad de daño, sin embargo, puede influir en el resultado. Ambas estrategias pueden ser sensibles a los artefactos provocados por el acceso del anticuerpo o péptido marcado. Por lo tanto, es importante entender las ventajas y desventajas de ambas estrategias, que potencialmente pueden utilizarse para complementarse mutuamente.
Futuras aplicaciones
Con el adelanto rápido de imágenes por fluorescencia y las técnicas de dinámica, versatilidad de sistemas láser para inducir diferentes cantidades y tipos de daños en el ADN en lugares específicos y ciclo celular ofrece una valiosa oportunidad para interrogar el celular y las respuestas moleculares para ADN dañan con alta resolución espacio-temporal a nivel unicelular. Será posible, por ejemplo, para un daño específico y DDR de núcleo y célula toda señal de transducción de señales con resolución de milisegundos (por ejemplo, detectar interacciones moleculares o modificaciones que se producen exclusivamente en los sitios de daño, examinar cambios dinámicos de la estructura de la cromatina en tiempo real, u observar la difusión en tiempo real de daños a la señalización de sitios de daño del núcleo entero). También es posible seguir la misma celda durante un largo período de tiempo para examinar los efectos del daño de la DNA en el destino de la célula. Nuestra visión es que los métodos de microirradiation de láser, si se utiliza correctamente, continuará contribuir significativamente al avance en el campo de reparación de ADN.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos al Dr. Akira Yasui en la Universidad de Tohoku, Japón para el plásmido de expresión de GFP-NTH1 y Dr. Eros Lazzerini Denchi en el Scripps Research Institute, La Jolla, California de TRF2 YFP y plásmidos de expresión de EGFP 53BP11220-1711 . Este trabajo fue financiado por la oficina de investigación científica de la fuerza aérea (FA9550-04-1-0101) y la Fundación Beckman Laser Institute Inc. (a M.W.B), la beca de la Fundación Ford de la Academia Nacional de Ciencias (B.A.S) y MCB NSF-1615701 y CRCC CRR-17-426665 (a. K. Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ti:Sapphire NIR pulsed femtosecond laser Mira-900 | Coherent Inc. | Mira 900 | |
| Inverted microscope | Carl Zeiss | Axiovert 200M | |
| 63X/1.4 NA objective | Zeiss | APOCHROMAT Ph3 | |
| Compact Rotation Stage | Newport Corp | PR50PP | |
| Temperature Controller | Warner | TC-344B | |
| Heating System | Ibidi | 10918 | |
| Gas Incubation System | Ibidi | 11920 | |
| Laser Power and Energy Meter (RoHS) | Coherent | FieldMaxII-TOP | |
| ORCA-R2 Digital CCD Camera | Hamamatsu | C10600 | |
| LSM 510 META Laser Scanning Microscopes | Carl Zeiss | ||
| 100X/1.3 NA Zeiss Plan APO | Carl Zeiss | ||
| 35mm Gridded Dishes | MatTek | P35G-1.5-14-CGRD-D | |
| PtK2 kidney epithelial cells | ATCC | CCL 56 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| DMEM | Life Technologies | 11885-092 | |
| CO2-Independent Medium | Life Technologies | 18045-088 | |
| Advanced MEM | Life Technologies | 12492-013 | supplemented with L-Glutamine, 4% FBS |
| penicillin/streptomycin | Fisher Scientific | 15140122 | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | 25030081 | |
| FBS | Omega Scientific | FB-02 | |
| Thymidine | SIGMA | T9250 | |
| serum free media (Opti-MEM I Reduced Serum Media) | Fisher Scientific | 11058021 | |
| Anti-Cycolbutance pyrimidine dimer (CPD) (mouse) | Kamiya Biomedical Company | MC-062 | |
| Anti-XRCC1 (mouse ) | Gene Tex Inc | GTX72311 | |
| Anti-53BP1 (rabbit) | Santa Cruz Biotech | sc-22760 | |
| Anti-CtIP (rabbit) | Abcam | ab70163 | |
| Anti-PAR polymers (mouse) | Enzo Life Sciences | BML-SA216-0100 | |
| Anti-PAR (rabbit) | Trevigen | 4336-BPC-100 | |
| Anti-TRF2 (mouse) | Novus Biological | NB100-56506 | |
| Anti 6-4PP (mouse) | Kamiya Biomedical | ||
| Anti-Rad21 (Rabbit) (for cohesin detection) | generated in Yokomori (KY) lab | ||
| Anti-Rad51 (Rabbit) | Santa Cruz Biotechnology | SC-8349 | |
| Anti-Ku70 (mouse) | Novus Biologicals | NB100-102 | |
| 8-oxiguanine | Trevigen, Inc. | ||
| Anti-PARP1 (Rabbit) | generated in KY lab | ref 43 | |
| Anti-hCAPG (Rabbit) (for condensin detection) | generated in KY lab | ref 42 | |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Inc | 711-165-152 | |
| Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | |
| HiPerFect siRNA Transfection Reagent | Qiagen | 301705 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| GFP-SMC1 stable cell line | generated in KY lab | ref 49 | |
| GFP-NEIL2 stable cell line | generated in KY lab | ref 54 | |
| GFP-NTH1 stable cell line | generated in KY lab | ref 32 | |
| GFP-SMC1 plasmid | generated in KY lab | ||
| GFP-Ku plasmid | generated in KY lab | ||
| Anti-MDC1 (rabbit) | Novus Biologicals | NB100–395 | |
| Anti-gH2AX (rabbit) | Millipore | 07–164 | |
| EGFP-53BP1(1220-1711) PtK2 stable cell line | generated in Berns lab | ref 32 | |
| TRF2-YFP PtK2 stable cell line | generated in Berns lab | ref 32 | |
| DMSO | Sigma | D2650-100ML | |
| PARG inhibitor | Trevigen | 4680-096-03 | |
| DNA–PKcs inhibitor NU7026 | Sigma | N1537 | |
| ATM inhibitor KU55933 | Calbiochem | 118500 | |
| Olaparib | Apexbio Technology | A4154 | |
| Paraformaldehyde | ELECTRON MICROSCOPY SCIENC MS | 100503-916 (EA) | |
| Quantity One 1-D Analysis Software Version 4.6.9 | Bio-Rad | SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC | image analysis program |
| Excel | microsoft | spreadsheet program | |
| Triton X100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 10X without calcium and magnesium | Fisher Scientific | 14200166 | dilute to 1X |
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