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Genetics

Laser Microirradiation à l’étude In Vivo des réponses cellulaires aux dommages d’ADN simples et complexes

Published: January 31, 2018 doi: 10.3791/56213
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2, 2,3,4, 1
1Department of Biological Chemistry, School of Medicine, University of California, Irvine, 2Beckman Laser Institute and Medical Clinic, University of California, Irvine, 3Department of Developmental and Cell Biology, School of Biological Sciences, University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering and Surgery, University of California, Irvine
* These authors contributed equally

Summary

Ce protocole vise à décrire l’utilisation de laser microirradiation d’induire différents types de lésions de l’ADN, y compris relativement simples brins et lésions complexes, afin d’étudier l’ADN des dommages de signalisation et de réparation facteur Assemblée à sites de dommages in vivo .

Abstract

Dommages à l’ADN induit des réponses spécifiques de réparation et de signalisation dans la cellule, ce qui est essentiel pour la protection de l’intégrité du génome. Laser microirradiation est devenu un outil expérimental pour étudier la réponse (DDR) d’endommager ADN d' in vivo. Il permet en temps réel à haute résolution unicellulaire analyse dynamique macromoléculaires en réponse aux dommages causés par le laser limité à une région de SUBMICROMETRIQUES dans le noyau de la cellule. Cependant, diverses conditions de laser ont été utilisées sans appréciation des différences dans les types de lésions induites. En conséquence, la nature du dommage n’est souvent pas bien caractérisé ou contrôlés, causant des incohérences apparentes dans les profils de recrutement ou de la modification. Nous avons démontré que les conditions d’irradiation différentes (c'est-à-dire, différentes longueurs d’onde ainsi que différentes puissances d’entrée (irradiations) d’un laser femtoseconde (fs) (NIR) à proche infrarouge) induisaient assemblées distinctes de protéines DDR et de la réparation. Cela reflète le type de dommages à l’ADN produites. Ce protocole décrit comment titrage de puissance d’entrée du laser permet d’induction de différentes quantités et de la complexité des lésions de l’ADN, qui peut être facilement contrôlée par détection des dommages de base et réticulation, différentiel poly (ADP-ribose) (PAR) de signalisation, et réparation de voie spécifique les assemblys de facteur sur les sites de dommages. Une fois que les conditions de dommages sont déterminées, il est possible d’étudier les effets de la complexité des différents dommages et dégâts différentielle de signalisation ainsi que l’appauvrissement des facteurs en amont sur n’importe quel facteur d’intérêt.

Introduction

In Vivo Signalisation des dommages ADN, c’est pas bien comprise
In vivo, l’ADN est complexé avec des histones et d’autres facteurs à fibres de chromatine forme. Règlement de la structure de la chromatine est d’une importance primordiale pour le métabolisme de l’ADN. Par exemple, la variante de l’histone H2AX est phosphorylée par l’ataxie-télangiectasie muté (ATM) et d’autres kinases bicaténaires suivant rompt l’induction (ORD) et est important pour l’amplification du signal ORD dommages ainsi que fourniture d’un site d’amarrage pour d’autres facteurs. Propagation de choix de voie de signalisation et de réparation des dommages semblent être gravement influencé par la structure de la chromatine local au dommage sites1. Un certain nombre de remodelage des facteurs, des chaperons d’histone et histone enzymes de modification de la chromatine sont en effet recrutés pour endommager les sites et sont important pour la réparation de l’ADN efficace, soulignant l’importance de la régulation de la chromatine dans le DDR et de réparation2 , 3 , 4. en outre, site de dommages de clustering ou de repositionnement a été observé dans la levure et les drosophiles5,6,7,8, réminiscence de relocalisation du locus du gène dans le compartiment subnucléaire associé à gène règlement9,10. Études récentes chez les souris et les cellules humaines a également révèlent la mobilisation des sites de l’ORD, quelles influences réparer fidélité et voie de choix11,12. Cela soulève la possibilité que DDR/réparation peut également être intimement liée à l’architecture nucléaire, organisation d’ordre supérieur la chromatine et chromosome dynamique dans le noyau de la cellule. Ainsi, il est essentiel d’élaborer des méthodes à haute résolution pour étudier les DDR et processus dans le contexte de l’environnement nucléaire endogène dans une cellule direct de réparation afin de comprendre les conséquences à court et à long terme des dommages à l’ADN.

Critical Role of PAR polymérase (PARP) dans jauger l’étendue et le Type de dommage et la régulation des protéines Assemblée sur le Site de dommages
PARP1 est un capteur de nick ADN rapidement activé par des lésions de l’ADN qui joue un rôle essentiel dans la réparation de l’ADN13. PARP1 pensait à l’origine pour fonctionner avec rayons x réparer Cross complément 1 (XRCC1) pour faciliter la réparation d’excision de base (BER), mais des études récentes révèlent son rôle dans d’autres voies de réparation de l’ADN, y compris ORD réparation14. Activés PARP1 utilisations nicotinamide adénine dinucléotide (NAD+) comme substrat pour ADP-ribosylation des protéines cibles multiples, y compris lui-même. Cette enzyme et autres membres de la famille ont attiré beaucoup d’attention ces dernières années comme inhibiteurs de PARP ont émergé des médicaments thérapeutiques aussi prometteurs pour les cancers. Bien que les inhibiteurs de PARP trouvées au départ pour être efficace dans le gène du cancer du sein (BRCA)-mutation des cellules cancéreuses du sein, il y a maintenant une pléthore de preuves de leurs effets dans les thérapies de mono - et combinaison avec ADN, endommageant des agents/irradiation contre un large spectre de cancers présentant des mutations, sans s’y limitées BRCA15,16,17,18,19,20.

Au niveau moléculaire, activation de PARP s’est avérée un rôle essentiel dans l’organisation de la structure de la chromatine locaux sur les sites de dommages. Recrutement PAR dépendant des enzymes de modification de la chromatine facilite la réparation de l’ORD et préceptes réparer choix de voie, ce qui suggère le rôle important d’échafaudages de modification nominale sur les sites de dommages. 13,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31 , nous avons récemment démontré que l’exclusion de la protéine p53-1 (53BP1) contre les dommages des sites par 32, fournissant une autre explication pour l’hyperactivation de 53BP1 dépendant d’endjoining non homologue ( NHEJ) de PARP inhibiteur et soulignant l’importance de PARP en ORD réparation voie choix33,34. PARP1 également directement PARylates et affecte l’activité de plusieurs ADN réparation facteurs14.

À l’aide de Laser Microirradiation comme un outil pour étudier la DDR/réparation In Vivo
Microirradiation laser pour produire des altérations de la sub-micronique sur chromosomes individuels a été d’abord décrite en 1969,35 et a examiné en détail en 1981,36. Plusieurs décennies plus tard, microirradiation laser a été montrée pour induire des lésions de l’ADN dans une région définie SUBMICROMETRIQUES dans le noyau de la cellule et il a été prouvée comme une technique précieuse pour l’étude de recrutement ou modifications des différents facteurs de lésions de l’ADN in vivo 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41. cette méthode permet de détecter les facteurs qui ne font pas les foyers distincts d’induite par l’irradiation (IRIF) dommages sites39,,42. Il est également possible d’examiner la dynamique spatio-temporelle des changements structuraux de la chromatine au sites de dégâts et dans le reste du noyau. Nous avons comparé soigneusement la DDR induite par les systèmes laser différentes et pouvoirs pour évaluer la relation entre le type de dommages à l’ADN et le microirradiation des conditions32,43,44, l’entrée 45. Les patrons de recrutement aberrant de 53BP1 et télomériques répéter facteur obligatoire 2 (TRF2) ont été observés dans les études précédentes de dommages laser, qui constituait la base de la préoccupation récurrente du caractère « non physiologique » de dommages causés par le laser46 ,47,48,49. Nous avons constaté que ces divergences apparentes maintenant s’expliquerait par différentiel PARP signalisation qui évalue la quantité et la complexité des dommages induits32. Nous avons confirmé que : 1) cellules laser-microirradiated (même après l’irradiation haute-puissance d’entrée) sont arrêtés en interphase en dommages checkpoint-fonction de contrôle et demeurer viables (au moins jusqu'à 48 h)32,50; et 2) réparation facteur recrutement/modification récapituler fidèlement ceux observés avec le traitement par des agents nocifs ADN conventionnels et l’induction de l’ORD par endonucléases32,39,,42, 44,50,51,52. Ces résultats appuient fortement la pertinence physiologique d’étudier les réponses cellulaires induites par des dommages de laser.

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Protocol

1. base cellulaire préparation

Remarque : Cette étape est pour détection par immunofluorescence standard du recrutement des protéines endogènes ou modification et l’utilisation d’une lignée de cellules exprimant une protéine recombinante fluorescent étiquetée de manière stable. Par exemple, les cellules épithéliales de rein marsupial de Potorustridactylus (PtK2) exprimant de manière stable EGFP-53BP11220-1711 ou TRF2-YFP ont été utilisés dans notre précédente étudient (Figure 1)32. Dans le premier cas, l’accent formant la région de 53BP1 (acide aminé 1220-1711) qui contient le domaine d’oligomérisation, le domaine de Tudor et le motif de recrutement non-dégradante-dépendante (UDR), a été fondue à GFP améliorée (EGFP-53BP11220-1711). Cette protéine de fusion récapitule le recrutement de site de dommages de la pleine longueur 53BP153,54,,55. Dans les cellules HeLa, fluorescent étiquetées sous-unités de cohesin (par exemple, hSMC1-GFP51, GFP-Scc1 (Rad21)52et 51de la GFP-SA2) doivent être stablement exprimées pour assurer l’intégration efficace dans le complexe et récapituler le S/G2 cycle cellulaire des dommages spécifiques phase site recrutement endogène cohesin51.

  1. Graines de n’importe quel type de cellules adhérentes sur un plat de vitroplants de 35 mm avec une lamelle maillé pour permettre l’identification de cellules individuelles. Ajuster le nombre de cellule initiale pour atteindre 60 % confluence en 36 à 48 heures selon le taux de prolifération de la lignée cellulaire particulier. Par exemple :
    1. Pour les cellules épithéliales des reins marsupial PtK2 (type sauvage ou ceux exprimant de manière stable EGFP-53BP11220-1711 ou TRF2-YFP) : plaque 2,0 x 104 cellules dans 2 mL milieu essentiel Minimum avancée (MEM) additionné de 2 mM de L-Glutamine, les foetus bovin 4 % sérum (FBS) et des antibiotiques (100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine) et incuber à 37 ° C, avec 7 % de CO2.
    2. Pour HeLa cellules exprimant de manière stable fluorescent tag protéines recombinantes GFP-SA2 : semences 1,0 x 105 cellules dans 2 mL moyen de (DMEM de l’aigle de la modification de Dulbecco) additionné de 10 % FBS, 2 mM de L-Glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine, et incuber à 37 ° C, avec 5 % de CO2. Autres cellules HeLa peuvent également être utilisés, y compris les cellules non modifiés ou cellules exprimant hSMC1-GFP.
  2. Permettre aux cellules d’adhérer et de proliférer pendant 36 à 48 heures avant l’induction de dommages d’ADN au confluent de 30 à 60 % (pour permettre la visualisation du nombre grille). Passez à la Section 4.

2. transitoire Transfection

Remarque : Parfois bons anticorps ne sont pas disponibles pour détecter les protéines endogènes. Si n’existent pas de lignées de cellules exprimant de manière stable des protéines de marqueur, effectuer des transfections transitoires pour surveiller les protéines fluorescent étiquetés pour les analyses de cellules vivantes.

  1. Pour les cellules HeLa, jour 1, 6-8 x 104 cellules dans 0,5 mL de milieu de culture dans un puits d’une plaque 24 puits de graines et incuber dans un incubateur humidifié à 100 % à 37 ° C et avec 5 % de CO2. Reportez-vous à l’étape 1.1 pour des conditions de milieux de culture.
  2. Jour 2, utilisation réparer un plasmide d’expression mammifère codant un ADN fluorescent étiqueté facteur (par exemple, GFP-NTH1 ou GFP-OGG1 pour dégâts de base32,44,56, GFP-Ku à haute dose DSBs57, GFP-53BP1 32 pour DSBs relativement simples, ou d’autres protéines d’intérêt fusionné au tag fluorescent) pour effectuer la transfection d’ADN induite par le liposome. Diluer à 0,3 µg ADN plasmidique, dans 25 µL de milieux de culture sans sérum dans un tube de 1,5 mL.
  3. Dans un autre tube de 1,5 mL, diluer 1 réactif transfection µL ADN à base de liposomes dans 25 µL de milieux de culture sans sérum et mélanger doucement.
  4. Mélanger l’agent dilué de l’ADN et transfection doucement et incuber pendant 10 min à température ambiante (RT) pour former des complexes ADN-lipides.
  5. Rincer les cellules avec 0,5 mL de milieu de culture une fois, retirez le support et ajouter 0,5 mL frais milieux de culture pour les cellules (comme à l’étape 1.1).
  6. Ajouter les complexes ADN-lipides dans les cellules. Mélanger doucement à la plaque à bascule quelques fois. Remettre les cellules dans l’incubateur comme à l’étape 2.1.
  7. Après 4 à 6 h, retirez le support de culture des cellules et ajouter 300 µL 0.05 % trypsine-EDTA. Supprimer, ajouter 200 µL trypsine-EDTA et incuber dans un incubateur à 37 ° C pendant 3-4 min.
  8. Après avoir vérifié que les cellules sont détachent, ajouter des milieux de culture 800 µL et remettre en suspension les cellules par pipetage doucement pour briser les agrégats de cellules. Transférer la suspension cellulaire dans une boîte de Petri 35 mm avec une lamelle de maille et ajouter des milieux de culture pour un volume final de 2 mL.
  9. Incuber les cellules dans un incubateur comme à l’étape 2.1 pendant 48 h, puis passez à la Section 4.
    Remarque : Si l’expression de la protéine recombinante est toxique (cellules transfectées Voir la morphologie ronde ou irrégulière après incubation à l’étape 2.8), raccourcir le temps d’expression et effectuer le laser microirradiation (Section 4) à 16-20 h après la transfection, aussi longtemps que la expression de la protéine peut être confirmée (pour la détection de la fluorescence, reportez-vous à l’étape 4.3). Dans ce cas, effectuer la transfection directement dans le plat de 35 mm. Semences 3.0 x 105 HeLa cells dans un plat de 35 mm avec une lamelle maillé pour atteindre environ 50-70 % confluent après plasmides d’ADN à transfecter h. 30 et changer les médias 2 à 6 h après la transfection. Poursuivez le laser microirradiation 12-20 h plus tard si l’expression de la protéine est raisonnable et cellules apparemment en bonne santés.

3. Cycle cellulaire synchronisation

Remarque : Pour la recombinaison de réparation (HR) protéines, telles que Rad51 et cohesin, le recrutement est plus important dans la phase S/G2 du cycle cellulaire, dans laquelle HR réparation prend place51. Ainsi, pour surveiller le recrutement de ces protéines, synchronisation cellulaire à la phase S/G2 est nécessaire.

  1. Synchronisation de phase S/G2
    1. Utiliser le protocole de bloc de thymidine double pour la synchronisation de la cellule à S/G2 phase50,,51. Après l’ensemencement les cellules dans un plat de lamelle maille de 35 mm (Voir l’étape 1.1), incuber les cellules avec la thymidine (pour une concentration finale de 2,5 mM) dans les milieux de culture (comme à l’étape 1.1) pendant 17 h à 37 ° C et 5 % de CO2.
    2. Rincer les cellules avec 1 mL exempt de thymidine des milieux de culture (comme à l’étape 1.1) deux fois et incuber les cellules dans les milieux de culture exempte de thymidine 2 mL pendant 9 h comme à l’étape 1.1.
    3. Ajouter 200 µL de solution mère de thymidine 27,5 mM (dissoute dans les milieux de culture) dans les milieux de culture avec les cellules à une concentration finale de thymidine 2,5 mM. Incuber les cellules comme au point 3.1.1 pour un autre 15 h. rinçage et incuber les cellules dans des milieux de culture sans thymidine pour 4 à 6 h et induire des lésions de l’ADN (Section 4).
    4. Confirmer l’efficacité de synchronisation à l’aide de marqueurs du cycle cellulaire (cycline A2 et B1 pour S/G2 et G2, respectivement), S/G2 phase ADN dommages réparation des facteurs spécifiques (p. ex., Rad51 ou cohesin), ou par l’UDI/EdU incorporation (pour les cellules en phase S)51.
  2. Synchronisation de phase G1
    1. Graines de 6-8 x 104 les cellules HeLa dans une boîte de Petri 35 mm avec lamelle maillé (étape 2.1).
    2. Après 2 jours, identifier les cellules en métaphase, qui sont légèrement relevée et ronds, sous un microscope inversé en utilisant l’objectif 10 X et 10 X oculaires lentilles. Acquisition d’images pour enregistrer la position des cellules en métaphase sur la lamelle maille.
    3. Après 3-4 h, confirmer la division cellulaire en deux cellules filles (en phase G1) et induire des lésions de l’ADN (Section 4).

4. titrage d’un Laser de puissance absorbée

Remarque : Dans ce protocole, nous induire des lésions de l’ADN à l’aide d’un 780 nm pulsé système de laser NIR fs attaché à un microscope confocal, ou un 800 nm laser NIR de fs couplé à un microscope inversé épifluorescente pulsé. Bien que la puissance d’entrée nécessaire pour induire la DDR comparable (irradiance réelle au point focal laser dans l’échantillon) est différente dans ces systèmes, le principe de base du titrage de puissance d’entrée est applicable pour les deux, ou n’importe quel, NIR systèmes32,57 . L’énergie in situ par l’irradiance laser pulse et pointe au point focal pour les systèmes deux laser étaient de l’ordre de 5,33 × 10-2-4 × 10-1 nJ et 7 × 1010-5.24 × 1011 W/cm2, respectivement32.

  1. Allumer l’appareil NIR et permettre au système de laser de warm-up pendant 1 h avant utilisation.
  2. Placez un plat de cellules sur une scène de chaud (37 ° C) dans une chambre qui permet de CO2 (5 %) et le contrôle de l’humidité (100 %).
    Remarque : Si une chambre de CO2 n’est pas disponible, utilisez CO2-milieux de culture indépendante jusqu'à 5-6 h. Si une phase de chauffage n’est pas disponible, garder les cellules au microscope pour < 20 min et remplacer immédiatement dans l’incubateur de culture de tissus avec une température adéquate, CO2et contrôle de l’humidité. Ces conditions de culture peuvent varier selon le type de cellule spécifique utilisé ainsi que l’organisme de dérivation (par exemple, les mammifères et les amphibiens).
  3. Pour l’analyse de cellules vivantes des protéines fluorescent étiquetées, sélectionnez un filtre GFP (excitation de 450-490 nm, émission de 515-586 nm) ou Cy3 (540-552 nm excitation, émission de > 590 nm) pour GFP ou fusionnés avec le mCherry protéines, respectivement, à l’aide d’un 100 X ou immersion dans l’huile X 63 objectif.
  4. Recherche de cellules qui contiennent des signaux de fluorescence comparables, reflétant des niveaux comparables d’expression de la protéine. Évitez les cellules qui ont une expression trop faible ou trop forte afin de réduire la variabilité des mesures de fluorescence cellule-cellule.
  5. Titrer la puissance d’entrée du laser.
    1. laser NIR 780 nm attaché à un microscope confocal
      1. Utiliser la fonction logicielle de l’eau de Javel pour cibler les titres linéaires à l’intérieur du noyau de la cellule d’exposition aux scans laser unique (résolution 512 x 512 pixels, zoom X1, blanchi région 50 x 4 pixels, temps de pause pour le pixel 12,8 µs, itération x1) par le biais de l’objectif de l’huile (100 X / 1.3 NA).
      2. Ajustez le pourcentage de transmission de laser (en utilisant le logiciel/matériel intégré dans le système de microscope laser par le fabricant) à 5 % sans changer d’autres paramètres.
      3. Placer une cellule dans le centre du champ. Cliquez sur la zone d’outil d’intérêt (ROI) et dessiner une ligne ou une zone (environ 50 x 4 pixels) dans le noyau à l’aide de la souris et cliquez sur le bouton « Bleach » pour provoquer des dommages à l’ADN.
        Remarque : Dans les étapes ultérieures de l’irradiation, « blanchiment » devrait être augmenté par tranches de 5 % à 40 % ou à 100 % si nécessaire.
      4. laser NIR 800 nm attaché au microscope à fluorescence-epi
      5. Contrôler l’alimentation d’entrée à travers un (63 X / 1.4 NA) objectif à immersion d’huile contraste phase de rotation motorisée d’un filtre de polarisation introduite dans la marche des rayons et monté sur une platine de rotation motorisée commandée par ordinateur32,39 , 58.
      6. Ajustez l’angle de polariseur (°) et mesurer la puissance d’entrée (mW) entrant dans le microscope, à l’aide d’un mesureur de puissance de laser. Déterminer les angles de polariseur qui fournissent des puissances d’entrée qui vont de 20 mW-155 mW par tranches de 5 à 10 mW.
      7. Régler l’angle de polariseur qui correspond à la puissance d’entrée de 20 mW.
        Remarque : Pour notre système de laser, si l’angle de polariseur est 40 °, la puissance d’entrée est de 65 mW. Augmenter la puissance d’entrée avec des incréments de 5 à 10 mW.
  6. Pour l’analyse des cellules vivantes, aller aux étapes 6.1 et 6.3. Pour la détection par immunofluorescence des protéines endogènes ou modifications, passez à la Section 5. Après l’analyse, passez à l’étape 4.7 titrages outre de la puissance du laser. Pour analyser l’exigence de facteur en amont, allez à la Section 7.
    Remarque : Le recrutement des facteurs BER et NHEJ est rapide (en quelques minutes) et transitoires (< ~ 30 min - 1 h selon le poste de facteur et ~ 4 h < endommager induction, respectivement). En revanche, le recrutement des facteurs HR Rad51 et cohesin est détectable à ~ 30 min - 1 h et ils ont tendance à persister plus de 8 h à44,de la lésions de l’ADN non réparé50,51. Ainsi, il est nécessaire d’examiner les différents temps points après irradiation pour réparation de différents facteurs.
  7. Augmenter la puissance d’entrée de désiré (c.-à-d., 5 % pour 780 laser NIR et 5 à 10 mW pour 800 NIR) comme au point 4.4 et répétez les étapes 4.5-4.7 sur une nouvelle série de cellules afin de déterminer le seuil (50 % des cellules endommagées Voir la recrutement) et maximale (100 % des cellules Voir la recrutement) pour chaque protéine.

5. immunofluorescence souillant

Remarque : pour la détection de modification covalente de protéines, tels que nominale (marqueur de dégâts complexes) et de la phosphorylation de H2AX (γH2AX) (marqueur de l’ORD), ainsi que les dimères de pyrimidine de cyclobutane (CPD)/(6-4) photoproduits (6-4PP) et 8-oxoguanine (8-oxoG) (réticulation et base des marqueurs de dégâts, respectivement), les cellules doivent être fixées et colorées avec les anticorps spécifiques. En outre, il est préférable de confirmer les résultats obtenus avec les protéines recombinantes fluorescent étiquetés par détection d’anticorps des protéines endogènes, pour distinguer les artefacts induites par la surexpression de protéines de fusion recombinantes.

  1. Difficulté des cellules à des moments différents après induction de dommages (étape 4.5) selon les facteurs en remplaçant les milieux de culture (voir étape 1.1) avec 1,5 mL de 4 % paraformaldéhyde/1 X PBS pendant 10 min à température ambiante.
    ATTENTION : Paraformaldéhyde vapeurs sont toxiques et tous les travaux devraient être effectués sous une hotte ventilée.
  2. Retirez les 4 % paraformaldéhyde/PBS et ajouter 1 mL de détergent/PBS de 0,5 % pendant 10 min à température ambiante.
  3. Éliminer les cellules de détergent/PBS et rinçage de 0,5 % avec 2 mL de PBS pendant 5 minutes deux fois et incuber les cellules dans 2 mL de solution de blocage (sérum de veau de 10 %, 1 % BSA/PBS) pendant 1 h à température ambiante.
  4. Enlever la solution de saturation et ajouter 2 mL de PBS aux cellules et remplacer les PBS avec 250 µL de solution de l’anticorps primaire de 3 % BSA/PBS pendant la nuit à 4 ° C ou 1 h à RT. utilisation un 1 : 200-dilution 1/500 (concentration typique environ 1 µg/mL, déterminé empiriquement) pour les anticorps spécifique pour les différents dommages marqueurs (par exemple, γH2AX/53BP1 (ORD) ; Ku (DSB, NHEJ) ; RAD51/cohesin (DSB, HR) ; 6-CPD/4PP (dégâts de réticulation) ; 8-oxoG/DNA glycosylases (p. ex., NTH1) (dommages de base) ; PAR (dégâts complexe haute dose)).
  5. Supprimer la solution d’anticorps et rincez avec 2 mL de PBS pendant 5 minutes deux fois, enlever PBS et incuber avec 250 anticorps secondaire de µL 0,1 % à 3 % BSA/PBS pendant 1 h dans l’obscurité à température ambiante.
  6. Enlever la solution de l’anticorps secondaire et ajouter 2 mL de PBS pendant 5 minutes deux fois et maintenir les cellules en 1,5 à 2 mL de PBS à 4 ° C pour l’imagerie en étapes 6.1 et 6.2.

6. quantitative Fluorescence analyse d’immunomarquage ou des cellules vivantes

  1. Capturer des images de cellules colorées ou en direct (n > 10) à l’aide de microscope utilisé pour l’irradiation. Pour le système de microscopie épifluorescente, utilisez la résolution de 1 344 x 1 024 pixels et enregistrer les images sous forme de fichiers TIFF 16 bits. Pour un microscope confocal, utiliser 1 X grossissement ; Laser à argon pour GFP/FITC, laser HeNe 594 pour Cy3/mCherry ; 512 x 512 ou 1 024 x 1 024 pixels pour la résolution de l’image ; vitesse 5, nombre de numérisation : 1 pour un balayage rapide ou 2 + pour une moyenne de plus de scans multiples pour améliorer le rapport signal sur bruit.
  2. Utiliser une analyse de l’image les programmes conçus pour mesurer l’intensité du pixel.
    1. Utilisez l’outil Rectangle de Volume pour dessiner un ROI autour du site de dommages à l’image de la cellule individuelle. Utilisez la même taille ROI pour mesurer le signal de fluorescence de fond dans le nucléoplasme adjacent à, mais ne pas de chevauchement avec les sites de dommages. C’est important pour la normalisation de photoblanchiment associé au système de microscope confocal-non.
    2. Pour mesurer des signaux de fluorescence à l’aide du programme d’analyse de l’image, cliquez sur « Rapport d’analyse Volume » dans la boîte à outils. Une nouvelle fenêtre apparaîtra. Dans la section « Données à l’écran », ne vérifiez que les cases « Nom » et la « Densité ». Puis cliquez sur « Done » pour visualiser les mesures.
    3. Exporter les valeurs vers un tableur en cliquant sur l’icône du tableau au bas de la fenêtre rapport de Volume et sélectionnez « onglets (format excel) » pour les séparateurs de champs et « File » à Destination de l’exportation.
    4. Pour obtenir les signaux relatifs, utiliser le tableur pour diviser l’intensité de la fluorescence sur le site de dommages (colonne 1) par qui, dans le contrôle arrière-plan région (colonne 2) dans le nucléoplasme et soustraire 1 à la normalisation.
  3. Analyse temporelle de fluorescence quantitative en temps réel à l’aide de la microscopie confocale
    1. Identifier des cellules positives à protéines fluorescent étiquetés en utilisant le microscope comme au point 4.3.
    2. Effectuer imagerie de fluorescence Time-lapse avant dommage et à des moments différents après induction de dommages à la Section 4. Commencez par dessiner le ROI de l’eau de Javel (pour l’induction de dommages), puis sélectionnez le « Acquire > séries chronologiques » sous-menu, définir « Numéro » comme 20 et le « retard de cycle » comme 30 s, choisissez « eau de Javel une fois après la première analyse » et puis en cliquant sur « start B ». Dans ce cas, la première image est acquis immédiatement avant induction de dommages, suivie de 19 acquisitions d’image à un intervalle de s 30. Intervalles (« retard de cycle ») peuvent être changés selon le but de l’étude.
    3. Une fois que l’acquisition d’image est terminée, cliquez sur « Signifie » et dessiner le ROI à la région de dommages. Cliquez sur « Afficher la Table » pour obtenir un tableau énumérant l’intensité dans la ROIs sélectionnée. Normaliser les données en divisant l’intensité de la fluorescence de l’emplacement des dommages à différents moments par l’intensité de la même région avant de dommages et soustraire 1.

7. small Interfering RNA (siRNA) Transfection

Remarque : L’appauvrissement de la protéine cible est un moyen efficace pour délimiter l’exigence de facteur en amont pour le recrutement de protéines observées à endommager les sites (Section 4). En outre, la stratégie est la meilleure façon d’aborder la spécificité d’un anticorps de détection par immunofluorescence (voir la Section 5).

  1. Jour 1 : Préparer 2 puits de cellules HeLa dans une plaque 24 puits par ensemencement 6-8 x 104 les cellules HeLa dans 0,5 mL de milieu de culture dans chaque puits, un pour la transfection de siARN contrôle et l’autre pour PARP1 siARN (5'-GCC AGA AAT CCT TTA TDC CAA-3').
  2. Jour 2 : Confirment que les cellules sont environ 40-50 % anastomosé. Effectuer le premier tour de la transfection des siARN : diluer 5 pmol siRNA dans 25 µL de milieux de culture sans sérum, ajouter 3 lipides µL réactif de transfection, basées dans le tube, mélanger doucement et incuber pendant 5-10 min à température ambiante.
  3. Rincer les cellules avec les milieux de culture fraîche 0,5 mL une fois et de garder les cellules dans 0,5 mL de milieu de culture fraîche (voir étape 1.1).
  4. Ajouter les complexes de RNA-lipides dans les cellules et mélanger doucement en inclinant le plat en arrière. Remettre les cellules dans l’incubateur comme à l’étape 2.1.
  5. Aspirer le mélange de transfection et ajouter des milieux de culture fraîche 0,5 mL (étape 1.1) après 6 h.
  6. Jour 3 : Effectuer le second tour des siARN transfections (voir étape 7.2). Ensuite, les semences 60-100 % des cellules dans un plat de lamelle maille 35 mm comme indiqué au point 2.3.
  7. Jour 5 : Aller de l’avant avec laser microirradiation à l’aide de l’état de puissance laser optimale pour un recrutement maximum du facteur d’intérêt, tel que déterminé par l’article 4. En règle générale, l’appauvrissement efficace s’observe chez environ 60-90 % des cellules HeLa.
    Remarque : Comme alternative et complémentaire approche, inhibiteurs, si disponible, permet d’inhiber la fonction du facteur d’intérêt32,44. Pour analyser l’effet d’inhibition de la signalisation de DDR, ajouter 20 inhibiteur PARP µM 1 µM PAR glycohydrolase (PARG) inhibiteur ou 10 µM ADN-dépendante protéine kinase avec inhibiteur de la sous-unité catalytique (ADN-PKcs) et inhibiteur de ATM 10 µM dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) à la plats 1 h avant l’induction de dommages. Ajouter DMSO uniquement aux cellules de contrôle.

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Representative Results

À l’aide de PtK2 cellules exprimant de manière stable EGFP-53BP11220-1711 ou TRF2-YFP, titrage de puissance d’entrée de laser a été réalisée afin de déterminer les conditions optimales pour leur recrutement (Figure 1)32.

Sites de laser de haute puissance d’entrée de dommages, le regroupement significatif des CPD (réticulation dommages typiquement généré par des dommages ultraviolet (UV)) ainsi que de la GFP-NTH1 DNA glycosylase qui reconnaît spécifiquement les dégâts de base ont été vus. En outre, des signaux XRCC1 et CtIP plus élevés ont été observés, reflétant l’augmentation du nombre de brins et démontrent que les dommages à l’ADN complexes sont induit dans ces conditions (Figure 2 a). Autres DNA glycosylases fusionnée à protéines fluorescentes (p. ex., GFP-nei endonucléase VIII-comme 2 (NEIL2) et GFP-8-Oxoguanine glycosylase (OGG1)) ainsi que condensin je peux aussi être utilisé comme marqueurs de dégâts de base44,59. Conformément à cela, nous avons constaté que la réponse PAR est induite significativement par laser de haute puissance d’entrée (p. ex., énergie et rayonnement dans le foyer dans l’échantillon), mais seulement faiblement par laser de faible puissance dans le foyer (Figure 2 b, en haut à gauche). PAR signaux, mais pas PARP1 localisation des protéines, aux sites de dommages ont été sensibles à l’inhibiteur PARP (données non présentées). En outre, siARN spécifique de PARP1 diminuée PAR tant de PARP1 dans les sites de dommages (Figure 2 b, coin supérieur droit)32. En vertu de la condition de haute puissance d’entrée, γH2AX apparaît d’abord sur les sites de dommages et se propage rapidement vers le noyau entier d’une manière dépendante de ATM/DNA-PK (Figure 2 b, en bas). ATM/DNA-PK-dépendante similaire propagation de γH2AX a été signalé pour irradiation γ60. Conforme obtenus avec 800 et 780 nm NIR laser systèmes32. Pris ensemble, les résultats révèlent qu’il est possible de titrer laser puissance d’entrée (et par conséquent, l’énergie et rayonnement dans le foyer dans la cellule) de trouver les conditions qui induisent des différents degrés de réponse PARP mise en corrélation avec le nombre des CDB et le complexité des dommages de l’ADN.

Les résultats ci-dessus initialement suggèrent que la présence de lésions de l’ADN complexes pourrait avoir causé recrutement différentiel de 53BP1 et TRF2. Fait intéressant, toutefois, le recrutement de1220-1711 53BP1 vers un site de dommages de faible puissance a été efficacement inhibé par la présence du deuxième site dommages induit par l’entrée haute-puissance dans un même noyau cellulaire (Figure 3 a , à la différence de Figure 3 b ). Les résultats indiquent que les dommages laser haute-puissance d’entrée supprime 53BP1 recrutement en trans. Inhibition du fer par l’inhibiteur PARP ainsi que l’inhibition du nucléaire à l’échelle γH2AX qui se propage par restauration inhibiteurs ATM/DNA-PK ce recrutement même sur le site de dommages de haute puissance d’entrée (Figure 3 a). C’est distincte de l’embauche de médiateur des dommages ADN Checkpoint 1 (MDC1) aux sites de dommages, qui était principalement inhibée par dispersion de γH2AX et par conséquent, a été restauré par les inhibiteurs de l’ATM/DNA-PK, pas des inhibiteurs PARP (Figure 3 a, en bas). Ce qui est important, l’hyperactivation du fer par l’inhibition PARG (sans affecter le statut γH2AX) effectivement supprimée recrutement initial 53BP1 même sur les sites de faible puissance entrée dommage que normalement recruter 53BP1 efficacement (Figure 3 b)32. Pris ensemble, ces résultats indiquent que PAR la signalisation et pas le type de dégâts en soi, interfère avec le recrutement de 53BP132. Il s’agit d’un exemple de la polyvalence du laser microirradiation, qui nous permet d’examiner comment les divers sites de dommages influencent et interagissent avec les autres.

Figure 1
Figure 1 : Titrage de laser de puissance absorbée. Pour déterminer la puissance du laser à utiliser pour de futures expériences, PtK2 cellules exprimant de manière stable EGFP-53BP1 et TRF2-YFP ont été soumis à la pour microirradiation du laser avec des puissances d’entrée variant entre 20 mW et 155 mW utilisant le 800 nm NIR laser/inversé épifluorescente système de microscope. Recrutement 53BP1-EGFP a été suivie pendant 15 min après irradiation (p.i.), tandis que les cellules TRF2-YFP ont été suivis pendant 6 min p.i. Les nombres directement au-dessus des barres représentent le nombre de cellules qui ont montré positif recrutement EGFP-53BP1 ou TRF2-YFP vers les sites de dommages sur le nombre total de cellules testées. Ce chiffre a été modifié de Saquilabon Cruz,32. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Induction de dommages complex et robuste DDR signalisation par laser de haute puissance entrée. (A) entrée haute-puissance laser microirradiation induit des dommages complexes notamment des ruptures de brins (SSBs et CDB) réticulation et dégâts de base. CPD, XRCC1 (CSB et CDB réparer), NTH1 DNA glycosylase (BER) et CtIP (alternative NHEJ et RH) sont illustrées (seulement GFP-NTH1 est une image de cellules vivantes, et le reste sont observées après immunofluorescence souillant). Mesures d’intensité de fluorescence quantitatives du recrutement site dommage ont été effectués comme indiqué dans le protocole, l’article 7 et sont indiquées dans les boîtes. Le nombre total de cellules (n) testé peut être vu sous chaque protéine quantifié. p-valeur < 0,05. (B) Top (à gauche) : signaux PAR robuste et PARP1 dans les sites des dégâts élevés de puissance d’entrée. Haut (à droite) : PARP1 siARN épuisement ne suffit pas d’abolir le PAR signal32,44. En bas : Analyse des parcours chronologiques de γH2AX dans les cellules avec le bas (en haut) et haut (en bas) entrée dégâts des pouvoirs comme indiqué. Barreaux de l’échelle = 10 µm. Ce chiffre a été modifié de Saquilabon Cruz,32. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Différentiels d’activation de la signalisation de la DDR affectent 53BP1 recrutement pour endommager des sites. Haut (A) : PtK2 de cellules exprimant de manière stable EGFP-53BP11220-1711 ont été microirradiated à la fois faible (15 %) et élevée (25 %) puissance d’entrée (blanc et jaune des pointes de flèches, respectivement) dans un même noyau en utilisant le système de microscope confocal/NIR 780 nm. Cela s’est déroulée en présence de DMSO, PARP inhibiteur (Pi), ou la combinaison de l’ATM, ADN-PK et les inhibiteurs de PARP (Ai + Di + Pi) comme indiqué. Imagerie de cellules vivantes de EGFP-53BP11220-1711 , est capturé à 30 min après l’induction de l’ORD. Cellules étaient ensuite fixés et colorées avec un anticorps spécifiques pour γH2AX comme un marqueur de l’ORD. Changements de l’intensité de la fluorescence de EGFP-53BP11220-1711 sites dommages apparaissent sur la droite avec p-valeurs (valeurs moyennes sont : DMSO, ± 0,03 0,02 ; Pi, 0,34 ± 0,19 ; IA + Di + Pi, 0,98 ± 0,23). En bas : L’effet du traitement Pi et Ai + Di sur MDC1 localisation avec des dégâts élevés de puissance d’entrée comme indiqué. Barre d’échelle est 10 µm. A droite : Modifications du signal de fluorescence de MDC1 à haute puissance entrée endommagent sites en présence de DMSO, Pi ou Ai + Di avec p-valeurs (valeurs moyennes sont : DMSO, ± 0,07 0,10 ; Pi, ± 0,05 0,07 ; Ai + Di, 0.86 ± 0,26). Echelle = 10 µm. N = 10 pour chaque mesure de l’intensité. (B) l’effet de l’amélioration du fer de signaux par le PARGi traitement sur le recrutement endogène 53BP1 vers des sites de faible puissance entrée dommage. A droite : Boîtes représentant l’analyse quantitative de recrutement 53BP1 endogène (détecté par immunofluorescence souillant) avec faible entrée puissance laser (60 mW dans le 800 nm NIR laser/inversé épifluorescente microscope système) 15 min après l’irradiation en présence de DMSO ou le PARGi comme indiqué. A gauche : Pair et 53BP1 immunofluorescence souillant les images des cellules endommagées dans les mêmes conditions avec le DMSO ou le PARGi traitement. Pour le traitement de DMSO, 100 % des cellules examinées (N = 25) exposées robuste 53BP1 recrutement (à droite). En revanche, 20/25 a montré aucun recrutement 53BP1 en présence le PARGi (en bas à droite) et 5 cellules ont montré des recrutements faibles. Echelle = 10 µm. Ce chiffre a été modifié de Saquilabon Cruz,32. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Les avantages de l’utilisation de laser microirradiation pour recherche DDR sont :

1. il est possible d’induire différents types et quantités d’ADN dommages causés par les cassures simple brin pour dommages à l’ADN complexes, et pour détecter les réparation différents facteurs à l’ADN endommagent sites en ajustant les paramètres de l’irradiation laser. Il est également possible d’infliger des dommages à plusieurs reprises dans un même noyau de cellule afin d’évaluer les effets de trans (comme sur la Figure 3).

2. ce qui est important, Evénements à dommages sites et les événements secondaires qui se produisent ailleurs dans le noyau peuvent facilement être distinguées.

3. il est possible d’effectuer des mesures en temps réel à haute résolution de la dynamique des protéines fluorescent étiqueté en réponse aux dommages causés à un niveau cellulaire unique, y compris, sans s’y limiter : Förster Resonance Energy Transfer (FRET), (Fluorescence Lifetime Imaging FLIM), fonction de corrélation de paires (pCF), etc., pour capturer des DDR dans des cellules vivantes.

2 h La combinaison avec un traitement RNA interference ou inhibiteur, il est relativement simple tester l’exigence facteur en amont dans un petit nombre de cellules.

5. il devrait être noté que NIR (ou vert) rayonnement laser ne nécessite pas de sensibilisation préalable de l’ADN avec analogues nucléotidiques ou colorants intercalant de l’ADN, évitant ainsi les indésirables effets secondaires sur l’emballage de la chromatine. C’est à l’opposé le système de laser UV qui nécessite une sensibilisation à faible dose et cause aberrante DDR à dose élevée39,49,61.

Des étapes cruciales dans les protocole/Modifications et dépannage
Il est important que les cellules sont dans des conditions saines lorsque DDR analyses sont effectuées afin de minimiser les artéfacts et les variations expérimentales. Les cellules transfectées de DNA ou de siARN sont généralement plus sensibles ou facilement détaché lorsque de plus en plus sur la lamelle maille. Il aide à maintenir les cellules des temps plus courts dans le réactif de transfection tant que la transfection fonctionne et plus les cellules transfectées sur le plat de lamelle maillées comparées aux cellules celllulaire des graines. Ceci est nécessaire pour atteindre les confluences de cellule comparable pour les expériences.

Il a été signalé que le bloc de thymidine conduit à des niveaux accrus de γH2AX dans les cellules synchrones62, qui peuvent affecter les DDR et fausser les résultats. En outre, le signal de γH2AX de ligne de base s’est avéré plus élevé en phase S et G2/M même sans n’importe quel dommage exogène63,64. Nous, cependant, ne respectent pas synchronisé de tout signal de γH2AX significative dans le nucléoplasme qui affectent ou interférer avec la réponse de γH2AX spécifiques aux sites de lésion induite par laser dans les cellules en phase S/G2 par une thymidine double bloc51.

Afin d’obtenir des résultats cohérents, il est nécessaire de vérifier périodiquement les paramètres de sortie de système laser (toutes les 2 à 4 semaines) et l’alignement optique (tous les 2 mois). Au fil du temps, les composants de système laser peuvent devoir être réalignés, objectif peuvent être endommagés et doivent être remplacés et la stabilité de la puissance d’entrée totale peut changer. La clé consiste à évaluer la présence de dommages (réticulation (CPD et/ou 6-4PP) et les dégâts de base (8-oxoG)), marqueur protéines (p. ex., DNA glycosylases, Rad51, cohesin et Ku) et modification PAR décrites dans le présent protocole pour déterminer la posologie et complexité des lésions de l’ADN induite par le système de microscope laser utilisé.

Limites de la Technique
Laser microirradiation a ses limites. Lésions de l’ADN induite par le faisceau laser sont très regroupées dans une zone dans le noyau par rapport à l’origine naturelle des dommages qui peuvent se propager dans tout le noyau. Cela peut changer comment dommages signalisation est propagée dans la chromatine voisine ou dans le noyau. Puisqu’un nombre relativement faible de cellules peut être irradié en même temps, basée sur la population des épreuves biochimiques (par exemple, Western blot, purification des protéines complexes, immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)) ne peuvent être facilement effectuées. Recours aux protéines fluorescent étiquetées (avec surexpression de protéines recombinantes exogènes ou même avec ceux exprimés endogène à l’aide d’insertion CRISPR induite par la balise) pour imagerie dynamique rend les études vulnérables à la protéine induite par la fusion artefacts. La nature unique de lésion induite par laser et des effets potentiels artéfactuelle de tagged protéines, par conséquent, doivent être évalués par comparaison avec les résultats en utilisant l’ADN classique endommager les méthodes (IR, chimique, endommageant des agents) et avec l’endogène protéines non balisés (bien que parfois il n’est pas possible d’effectuer des expériences parallèles complets).

Signification en ce qui concerne les méthodes existantes
L’utilisation des endonucléases séquence-spécifique comme I-SceI, FokI, AsiSI et j’ai-PpoI fournit une stratégie alternative pour induire la CDB in situ (DSBs strictement simples). Recrutement de facteur ou des modifications peuvent être analysées par propres au site ou de tout le génome puce analyse65,66,67,,du6869. Induction relativement synchrone des CDB peut être réalisée par le marquage de l’endonucléase avec un récepteur de l’hormone stéroïde et un signal de dégradation (degron) pour une translocation nucléaire rapide et dégradation, respectivement65,66 , 67 , 68 , 69. on doit tenir compte, cependant, que l’efficacité d’expression de l’endonucléase et accessibilité des sites cibles, et de statut en cours de réparation peut être variable dans différentes cellules et aux sites des cibles différentes. Ces hétérogénéités seront moyennées dans l’analyse de la puce sur la population, qui peut fausser les résultats. Laser microirradiation, d’autre part, offre la meilleure résolution temporelle fournie (en millisecondes) ainsi que de la résolution spatiale (SUBMICROMETRIQUES) de la dynamique de réponse de dommages, qui peut être analysée au niveau unicellulaire. La densité des dégâts importants, cependant, peut-être influencer le résultat. Ces deux stratégies peuvent être sensibles aux artefacts causés par anticorps accessibilité et/ou de marquage de peptide. Par conséquent, il est important de comprendre les avantages et les inconvénients de ces deux stratégies, qui peuvent potentiellement servir à se compléter mutuellement.

Applications futures
Avec les progrès rapides de l’imagerie de fluorescence et des techniques de dynamique, polyvalence des systèmes laser pour induire différents montants et types de lésions de l’ADN à des endroits précis et l’étape de cycle de cellules fournit une précieuse occasion d’interroger le cellulaire et les réponses moléculaires d’ADN endommagent avec haute résolution spatio-temporelle à un niveau de cellule unique. Il sera possible, par exemple, pour isoler les dommages spécifiques au site et noyau - et cellule large DDR transduction milliseconde-résolution du signal (par exemple, détecter les interactions moléculaires ou des modifications qui se produisent exclusivement, aux sites de dommages, examiner des changements dynamiques de la structure de la chromatine en temps réel, ou d’observer en temps réel de propagation des dommages provenant de sites de dommages de signalisation vers le noyau entier). Il est également possible de suivre la même cellule sur une longue période de temps pour examiner les effets des dommages à l’ADN sur le sort de la cellule. Nous envisageons que les méthodes de microirradiation laser, si utilisé correctement, continuera à contribuer significativement à l’avancement du domaine de réparation de l’ADN.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions le Dr Akira Yasui à l’Université de Tohoku, Japon pour le plasmide d’expression de GFP-NTH1 et Dr. Eros Lazzerini Denchi au Scripps Research Institute, La Jolla, en Californie, pour la TRF2-YFP et EGFP-53BP11220-1711 plasmides d’expression. Ce travail a été soutenu par l’Air Force Office of Scientific Research (FA9550-04-1-0101) et la Fondation Beckman Laser Institut Inc. (pour M.W.B), la Ford Foundation Fellowship de la National Academy of Sciences (d’après) et NSF MCB-1615701 et CRCC CRR-17-426665 (de K. Y.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ti:Sapphire NIR pulsed femtosecond laser Mira-900 Coherent Inc. Mira 900
Inverted microscope  Carl Zeiss Axiovert 200M
63X/1.4 NA objective Zeiss APOCHROMAT Ph3 
Compact Rotation Stage  Newport Corp PR50PP
Temperature Controller Warner TC-344B
Heating System Ibidi  10918
Gas Incubation System Ibidi  11920
Laser Power and Energy Meter (RoHS) Coherent FieldMaxII-TOP 
ORCA-R2 Digital CCD Camera Hamamatsu C10600
LSM 510 META Laser Scanning Microscopes Carl Zeiss
100X/1.3 NA Zeiss Plan APO Carl Zeiss
35mm Gridded Dishes  MatTek P35G-1.5-14-CGRD-D
PtK2 kidney epithelial cells ATCC CCL 56 
HeLa cells ATCC CCL-2
DMEM Life Technologies 11885-092
CO2-Independent Medium  Life Technologies 18045-088
Advanced MEM  Life Technologies 12492-013 supplemented with L-Glutamine, 4% FBS
penicillin/streptomycin Fisher Scientific 15140122
L-Glutamine Fisher Scientific 25030081
FBS Omega Scientific FB-02
Thymidine   SIGMA T9250
serum free media     (Opti-MEM I Reduced Serum Media) Fisher Scientific 11058021
Anti-Cycolbutance pyrimidine dimer (CPD) (mouse) Kamiya Biomedical Company MC-062
Anti-XRCC1 (mouse ) Gene Tex Inc GTX72311
Anti-53BP1 (rabbit) Santa Cruz Biotech sc-22760
Anti-CtIP (rabbit) Abcam ab70163
Anti-PAR polymers (mouse) Enzo Life Sciences BML-SA216-0100
Anti-PAR (rabbit) Trevigen 4336-BPC-100
Anti-TRF2 (mouse) Novus Biological  NB100-56506
Anti 6-4PP (mouse) Kamiya Biomedical
Anti-Rad21 (Rabbit)                     (for cohesin detection) generated in Yokomori (KY) lab
Anti-Rad51 (Rabbit) Santa Cruz Biotechnology SC-8349
Anti-Ku70 (mouse)  Novus Biologicals NB100-102
8-oxiguanine  Trevigen, Inc.
Anti-PARP1  (Rabbit)                     generated in KY lab ref 43
 Anti-hCAPG (Rabbit)                    (for condensin detection) generated in KY lab ref 42
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG  Jackson ImmunoResearch Inc 711-165-152
Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgG Thermo Fisher Scientific A-21202
HiPerFect siRNA Transfection Reagent Qiagen 301705
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
GFP-SMC1 stable cell line     generated in KY lab ref 49 
GFP-NEIL2 stable cell line generated in KY lab ref 54
GFP-NTH1 stable cell line generated in KY lab ref 32
GFP-SMC1 plasmid generated in KY lab
GFP-Ku plasmid generated in KY lab
Anti-MDC1 (rabbit)  Novus Biologicals NB100–395
Anti-gH2AX (rabbit)  Millipore 07–164
EGFP-53BP1(1220-1711) PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
TRF2-YFP PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
DMSO Sigma D2650-100ML
PARG inhibitor Trevigen 4680-096-03
DNA–PKcs inhibitor  NU7026  Sigma N1537
ATM inhibitor KU55933  Calbiochem 118500
Olaparib  Apexbio Technology A4154
Paraformaldehyde  ELECTRON MICROSCOPY SCIENC MS 100503-916 (EA)
Quantity One 1-D Analysis Software Version 4.6.9 Bio-Rad SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC  image analysis program
Excel microsoft spreadsheet program
Triton X100 Fisher Scientific BP151-500 detergent
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 10X without calcium and magnesium Fisher Scientific 14200166 dilute to 1X 

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Kong, X., Cruz, G. M. S., Silva, B. A., Wakida, N. M., Khatibzadeh, N., Berns, M. W., Yokomori, K. Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage. J. Vis. Exp. (131), e56213, doi:10.3791/56213 (2018).

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