Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

الاعتراف الخاصة بتسلسل وانتقائية بالكشف مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل على الكشف واحد-الذين تقطعت بهم السبل بتعديل كيميائيا الببتيد الأحماض النووية

Published: September 21, 2017 doi: 10.3791/56221
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Division of Chemistry and Biological Chemistry, School of Physical and Mathematical Sciences, Nanyang Technological University
* These authors contributed equally

Summary

نحن تقرير البروتوكولات للتوليف وتنقية ليغومرات الببتيد الأحماض النووية (السلطة الفلسطينية) التي تتضمن تعديل للمخلفات. ويرد وصف أساليب البيوكيميائية والفيزيائية لوصف الاعتراف بالجيش الملكي النيبالي الدوبلكس بالمحميات معدلة.

Abstract

الكشف تتضح كالمؤشرات الحيوية الهامة والأهداف العلاجية. وهكذا، هناك إمكانات كبيرة في تطوير المجسات الكيميائية والعلاجية يغاندس للاعتراف بتسلسل الحمض النووي الريبي والهيكل. تعديل الببتيد الحمض النووي (السلطة الفلسطينية) ووضعت مؤخرا ليغومرات التي يمكن التعرف على الحمض النووي الريبي الدوبلكس بطريقة خاصة بتسلسل كيميائيا. المحميات مستقرة كيميائيا مع العمود الفقري مثل الببتيد محايدة. المحميات يمكن توليفها نسبيا بسهولة ببنك الصين-الكيمياء الببتيد الصلبة-مرحلة التوليف الأسلوب اليدوي. يتم تنقيتها المحميات بعكس المرحلة [هبلك]، يليه وصف الوزن الجزيئي بالليزر ساعد مصفوفة الامتزاز/التأين-وقت الرحلة (استخدام-TOF). تقنية التفريد (صفحة) polyacrylamide هلام يشوه عدم يسهل تصوير تشكيل ثلاثي، حيث مصممة بعناية مجانية الرنا المزدوجة بنيات والسلطة الوطنية الفلسطينية ملزمة تريبليكسيس غالباً ما تظهر معدلات الهجرة المختلفة. عدم يشوه الصفحة مع اثيديوم بروميد وظيفة تلطيخ غالباً أسلوب سهلة وغنية بالمعلومات لوصف الانتماءات الملزمة وخصوصيات ليغومرات السلطة الوطنية الفلسطينية. عادة، يمكن استخدام الحمض النووي الريبي دبابيس الشعر أو الدوبلكس مع الطفرات زوج قاعدي واحدة متعددة لتوصيف خصائص ربط السلطة الوطنية الفلسطينية، مثل ربط الصلات وخصوصياتها. 2-أمينوبوريني ايزومير الأدنين (6-أمينوبوريني)؛ كثافة الأسفار 2-أمينوبوريني حساس للتغيرات البيئة الهيكلية المحلية، وهي مناسبة لرصد تشكيل ثلاثي مع بقايا أمينوبوريني 2 أدرجت قرب موقع ربط السلطة الوطنية الفلسطينية. 2-أمينوبوريني fluorescence المعايرة يمكن استخدامها أيضا لتأكيد انتقائية ملزمة للمحميات معدلة نحو الكشف مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل المستهدفة (دسرناس) على واحد--الذين تقطعت بهم السبل الكشف (سرناس). تجارب الصهر الحراري الكشف عن امتصاص الأشعة فوق البنفسجية تسمح بقياس الثبات الحراري للسلطة الوطنية الفلسطينية-الجيش الملكي النيبالي الدوبلكس و PNA· الجيش الملكي النيبالي تريبليكسيس2 . هنا، يمكننا وصف التوليف وتنقية ليغومرات السلطة الوطنية الفلسطينية تتضمن تعديل المخلفات، ووصف الطرق البيوكيميائية والفيزيائية لتوصيف للاعتراف بالجيش الملكي النيبالي الدوبلكس بالمحميات معدلة.

Introduction

الكشف تتضح كالمؤشرات الحيوية الهامة والأهداف العلاجية، نظراً لأوجه التقدم الأخيرة في اكتشافات الأدوار الكشف في اللائحة والحفز للعمليات البيولوجية المتنوعة1،،من23. تقليديا، قد استخدمت العقاقير خيوط لربط سرناس من خلال واتسون-كريك تشكيل الطباعة على الوجهين3،4،5،6،،من78، 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27-في الآونة الأخيرة، وقد صممت تشكيل ثلاثي الببتيد الأحماض النووية (تفبناس) لربط دسرناس عن طريق الهيدروجين هوجستين الرابطة (الشكل 1)3،،من2829. مناطق دسرنا موجودة في أغلبية الكشف antisense استهدف التقليدية، ما فيها قبل مرناس مرناس، ما قبل أو pri-ميرناس3والعديد من أخرى غير الترميز الكشف1،،من2627. استهداف دسرناس من خلال تشكيل اللولب ثلاثية باستخدام تفبناس قد يكون مفيداً بسبب خصوصيته الهيكل وذات إمكانات كبيرة لاستخدامها في استعادة الوظائف الطبيعية للكشف، وهي dysregulated في الأمراض، على سبيل المثال.

نشرت مؤخرا العمل بواسطة روزنيرس et al.، ولنا3،،من2829،30،31،،من3233، 34،35،36،37،،من3839،،من4041، أفادت الجهود على تحسين ربط تفبناس معدلة نحو دسرناس مع تعزيز تقارب انتقائية. قمنا بتطوير أساليب توليف للسلطة الوطنية الفلسطينية مصممة بطريقة رشيدة مونومرات (الشكل 2) بما في ذلك مونومر الايثير-بسيودويسوسيتوسيني (L)30 و 5-ميثيل تعديل غوانيدين السيتوزين (Q) مونومر31. من خلال مختلف أساليب توصيف البيوكيميائية والفيزيائية، لقد أظهرنا أن المحميات قصيرة نسبيا (6-10 البقايا) تضم بقايا L و Q إظهار تحسين الاعتراف بأزواج قاعدة واتسون-كريك ز-ج وج-ز، على التوالي، في دسرناس. وعلاوة على ذلك، مقارنة بغير معدلة المحميات، المحميات التي تحتوي على بقايا L و Q إظهار ملزمة أكثر انتقائية تجاه دسرنا سرنا ودسدنا. تمكن وظيفة غوانيدين42 في قاعدة ف المحميات لإدخال خلايا هيلا31.

في المختبر، ونحن توليف المحميات بدليل بنك الصين-الكيمياء ( tأو بنك-بنك الصين من أجلها ثالثي-بوتيلوكسيكاربوني (انظر الشكل 2) الببتيد الصلبة-مرحلة التوليف الأسلوب4. توليف مركب السلطة الوطنية الفلسطينية مع بنك الصين كأمين حماية الفريق ملاءمة مجموعة بنك الصين ستيريكالي أقل حجماً بالمقارنة مع أمين فلورينيلميثيلوكسيكاربونيل (معتدلاً) حماية الفريق، الذي قد يكون مفيداً خلال مونومر السلطة الوطنية الفلسطينية اقتران دعم متين. مجموعة بنك الصين هو حمض مجا ويمكن إزالتها بسهولة على دعم متين من 20-50% حمض تريفلورواسيتيك (تفا) في الميثان (DCM) خلال التوليف السلطة الوطنية الفلسطينية. يمكن أن تستخدم المزج الآلي ببتيد لتوليف ليغومرات السلطة الوطنية الفلسطينية؛ ومع ذلك، الزائدة 3-5-إضعاف للسلطة الوطنية الفلسطينية مونومر الحاجة إلى المزج الآلي ببتيد. التوليف اليدوي يتطلب أقل بشكل ملحوظ مونومر السلطة الوطنية الفلسطينية (2-3-إضعاف الزائدة)، مع اقتران كل تخضع بسهولة لاختبار كايزر43. وعلاوة على ذلك، العديد من المزج الآلي غير متوافقة مع التوليف استراتيجية بنك الصين بسبب استخدام أكالة تفا أثناء الخطوة إزالة بنك الصين.

يمكن تنقية ليغومرات السلطة الوطنية الفلسطينية بعكس مرحلة عالية الأداء اللوني السائل (RP-[هبلك]) يليه وصف الوزن الجزيئي باستخدام TOF (3 أرقام و 4)30، 31-نحن نوظف غير يشوه صفحة لرصد تشكيل ثلاثي، ويرجع ذلك إلى حقيقة أن الحرة الحمض النووي الريبي مزدوج بنيات والسلطة الوطنية الفلسطينية ملزمة تريبليكسيس غالباً ما تظهر الهجرة مختلف معدلات (الشكل 5)30،31 . لا وسم ضروري إذا أمكن تحقيق كفاءة بعد تلطيخ لكل من الجيش الملكي النيبالي المزدوجة و PNA· الجيش الملكي النيبالي2 ثلاثي العصابات. كمية صغيرة نسبيا من عينة المسبق للتجارب غير يشوه الصفحة. ومع ذلك، في مخازن التحميل (الحضانة) والمخازن المؤقتة قيد التشغيل (درجة الحموضة 8.3) قد لا تكون نفسه، أسفر عن القياسات التي تقتصر على تريبليكسيس كينيتيكالي مستقرة، لأنه قد زعزعة درجة حموضة مرتفعة نسبيا من 8.3 إلى حد كبير ثلاثي.

2-أمينوبوريني ايزومير الأدنين (6-أمينوبوريني)؛ كثافة الأسفار 2-أمينوبوريني (مع ذروة انبعاثات في حوالي 370 نانومتر) حساس للتغيرات البيئة الهيكلية المحلية، وهي مناسبة لرصد تشكيل ثلاثي مع بقايا 2-أمينوبوريني القرب من السلطة الوطنية الفلسطينية ملزمة (الموقع الرقم 6) 31-على عكس العديد من الأصباغ الأخرى التي تظهر الأسفار الانبعاثات في النطاق المرئي، يمكن أن يتعرض الجيش الملكي النيبالي 2-أمينوبوريني-المسمى إلى غرفة الخفيفة دون تبييض الصورة. خلافا لتجربة الصفحة التي غالباً ما تحتاج إلى تشغيل المخزن مؤقت للأس الهيدروجيني 8.3، معايرة الأسفار 2-أمينوبوريني على أساس يسمح بقياس ملزمة في حل واحد في الرقم الهيدروجيني محدد، ومما قد يسمح بالقياس والكشف عن ضعيفة نسبيا و كينيتيكالي غير مستقر ملزم في التوازن.

تجارب الصهر الحراري الكشف عن امتصاص الأشعة فوق البنفسجية تسمح بقياس الثبات الحراري الدوبلكس (الشكل 7)31 وثلاثيللصفيف من نوع plex30،32،،من4445. اعتماداً على تكوين الطول والتسلسل، ذوبان تريبليكسيس قد أو قد لا تظهر تحولاً واضحا. ويمكن الحصول على معلمات دينامي حراري إذا تراكب منحنيات التدفئة والتبريد. ويمكن الحصول على معلمات دينامي حراري دقيقة بمعايرة متحاور القياس (ITC)32؛ ومع ذلك، كميات كبيرة نسبيا من عينات مطلوبة عموما لمركز التجارة الدولية.

Protocol

1-دليل المرحلة الصلبة "الببتيد التوليف للمحميات باستخدام بنك الصين الكيمياء"

ملاحظة: للنجاح وسهولة التوليف oligomer السلطة الوطنية الفلسطينية المرجوة، ينبغي أن تكون جميع المذيبات والمواد الكاشفة اللامائى. إضافة ثقب سيتا الجزيئية الملائمة (4A، حبيبات قطرها 1-2 مم) وأحيانا إزالة غاز النيتروجين الجاف في زجاجات. لتركيب تعديل السلطة الوطنية الفلسطينية مونومرات، يمكن استخدام بروتوكولات تم الإبلاغ عنها في المراجع الخاصة بكل منها 30 ، 31. يمكن شراؤها من مصادر تجارية غير معدلة السلطة الوطنية الفلسطينية مونومرات. في كل خطوة من خطوات الغسيل، يتم إضافة المبلغ المناسب للمذيبات إلى الراتنج، تشكيل الطين، قبل هي تستنزف الجميع

الراتنج البوليسترين
  1. تحميل مونومر الأولى ووضع حد أقصى للأمينات الأولية مجانية الزائدة على الراتنج
    1. تزن 30 ملغ هيدروكلوريد 4-ميثيلبينزيدريلاميني (MBHA·HCl) (المتاحة تجارياً؛ تحميل قيمة 0.7-1.4 mmol/ز؛ حجم فتحات الشباك 100-200)، ونقل إلى مل 5 المرحلة الصلبة الببتيد رد فعل سفينة مزودة بسداده محبس الحنفية والزجاج-
    2. نقع الراتنج في مبلغ DCM مناسبة ح 1، يسمح الراتنج لتضخم وفضح الأمينات (الملح HCl)-
      ملاحظة: حبات راتنج ينبغي دائماً أن تماما غارقة في المذيبات في جميع أنحاء التوليف.
    3. استنزاف قبالة DCM بتطبيق لطيف تدفق غاز النيتروجين الجاف عبر الجزء العلوي من قارورة. أضف 1 مل من 50% (v/v) ن، ن-دييسوبروبيليثيلاميني (ديبا) في DCM واتركه لمدة 15 دقيقة. هذا تحييد الملح HCl يعلق على الأمينات مجاناً على الراتنج.
    4. كرر الخطوة 1-1-3. وفي الوقت نفسه، وزن µmol 6 من مونومر و µmol 6 من تريبيروليدينوفوسفونيوم (بينزوتريازول-1-يل-أوكسي) سداسي فلوروفوسفات (بيبوب)، ونقل في أنبوب 1.5 مل. إضافة 200 ميليلتر من dimethylformamide (DMF) و 12 µmol من ديبيا. دوامة الحل اقتران للحد الأدنى 3-5
      ملاحظة: التحميل المطلوب القيمة المستخدمة 0.2 ميللي مول/غرام. مونومر الأولى أضيف هو مونومر في ج--المحطة الطرفية لتسلسل السلطة الوطنية الفلسطينية المرجوة. يمكن حساب قيمة الشحن من الأحماض الأمينية الأولى ب طريقة حمض البكريك 46-
    5. استنزاف قبالة ديبيا من DCM الحل. أغسل الراتنج مع DCM (x 3)، تليها DMF (x 3)، وأغلق في محبس الحنفية. إضافة حل اقتران مستعدة إلى الراتنج وهزه برفق. دفع الراتنج على طول الجدران الداخلية للسفينة إلى الحل اقتران باستخدام ملعقة نظيفة من الفولاذ المقاوم للصدأ. إرفاق سداده زجاجية وتأمين السفينة في شاكر حاضنة ح 3 في 40 درجة مئوية.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، وعاء التفاعل يمكن أن تظل ثابتة في درجة حرارة الغرفة ح 6-8 للسماح بإكمال الببتيد اقتران رد فعل-
    6. إعداد الحل متوجا بخلط µmol 240 أنهيدريد الخل و µmol 360 من ديبا إلى 200 ميليلتر من DCM. واستنزاف قبالة الحل اقتران يغسل الراتنج مع DMF (x 3) و DCM (x 3). إضافة في الحل متوجا ومغادرة السفينة مدة 30 دقيقة، أحياناً تهتز السفينة برفق. وضع سقف لأقنعة المجموعات الزائدة أمين الابتدائي مجاناً على الراتنجات واسطة acetylation.
    7. كرر الخطوة 1.1.6. واستنزاف الحل متوجا يغسل الراتنج مع DCM (x 3).
    8. إزالة قاسمة صغيرة من الراتنج الخرز باستخدام أنبوب شعري رفيع، ووضعها في قنينة زجاجية صغيرة 1.5 مل. إجراء اختبار كايزر 43. إضافة 15 ميليلتر من كل من القيصر فيال اختبار حلول في الزجاج والحرارة باستخدام بندقية حرارة. مراقبة لون الخرز بعد التدفئة. لون الخرز ينبغي أن يظل دون تغيير، مما يشير إلى عدم وجود مجموعات أمين مجاناً على الراتنج.
      ملاحظة: يتوفر تجارياً طقم اختبار كايزر أو يمكن إعدادها وفقا لبروتوكول تم الإبلاغ عنها. الحل ج: نينهيدرين في الإيثانول؛ حل ب: الفينول في الإيثانول؛ الحل c: سيانيد البوتاسيوم (KCN) في بيريدين-
      تنبيه: KCN شديدة السمية؛ يجب أن تلبس ملابس واقية مناسبة، وينبغي أن يقوم تدفئة في غطاء دخان جيد التهوية، في غياب المذيبات القابلة للاشتعال أو المواد الكاشفة.
    9. كرر الخطوة 1.1.6 إذا عرض الراتنج الخرز الأزرق أو باهتة اللون الأزرق-
  2. إزالة من الطرفي ن أمين مجموعة حماية
    1. استنزاف المذيبات من وعاء التفاعل وإضافة حل 50% (v/v) من حامض trifluoroacetic (تفا) في DCM، ضمان الراتنجات مغمورة تماما. مغادرة السفينة لمدة 15 دقيقة، أحياناً تهتز لتسهيل deprotection المجموعات أمين. كرر 2 دورات أكثر.
      تنبيه: تفا التآكل العالية. يجب ارتداء الملابس الواقية المناسبة عند التعامل مع-
      2. أغسل
    2. الراتنج مع DCM (x 3) و DMF (x 3) DCM (x 3). إضافة حل 5% ديبا في DCM. مغادرة السفينة لمدة 15 دقيقة. تنشيط هذه الخطوة الأمينات مجاناً بتحييد الأنيونات العداد تفا. كرر مرة أخرى.
    3. طرد ديبا من الحل DCM. أغسل الراتنج مع DCM (x 3). إجراء اختبار كايزر (الخطوة 1.1.8)-
      ملاحظة: سوف تسفر عن deprotection نجاح المجموعات أمين تلون الخرز الأزرق. بمجرد deprotection بنجاح، يمكن القيام باقتران اللاحقة من مونومرات باقتران الببتيد.
  3. اقتران من مونومرات اللاحقة
    1. µmol تزن 18 من المطلوب مونومر (ليتم وزن مونومر بنك الصين-السلطة الوطنية الفلسطينية-Q--أوه، 13.2 مغ مونومر) و 18 µmol من بيبوب في أنبوب 1.5 مل. إضافة 200 ميليلتر من DMF و µmol 36 من ديبا في أنبوب 1.5 مل. دوامة حتى يتم حل جميع مركبات صلبة.
      2. أغسل
    2. الراتنج مع DMF (x 3). إضافة اقتران الحل إلى وعاء التفاعل وهزه برفق. دفع الراتنج على طول الجدران الداخلية للسفينة إلى الحل اقتران باستخدام ملعقة نظيفة من الفولاذ المقاوم للصدأ. إرفاق سداده زجاجية وتأمين السفينة في شاكر حاضنة ح 3 في 40 درجة مئوية.
    3. استنزاف قبالة الحل اقتران ويغسل الراتنج مع DMF (x 3) و DCM (x 3). نفذ الخطوة 1.1.8. إذا لم يتغير لون بقايا الخرز، كرر الخطوات 1.2.1-1.3.3 حتى يتم إكمال تسلسل السلطة الوطنية الفلسطينية المرجوة. إذا لوحظ تلون الخرز الأزرق بعد اقتران مونومر، كرر الخطوات 1.3.1-1.3.3. إذا تلون لا يزال قائما، القيام وضع سقف مرة أخرى (الخطوة 1.1.6)-
      ملاحظة: يوصي اقتران الوقت (ح 3-12) و/أو استخدام فائض يعادل مونومر الموسعة واقتران الكواشف إذا تنشأ مشاكل مع اقتران.
      4. أغسل
    4. بمجرد الانتهاء من تسلسل السلطة الوطنية الفلسطينية المنشودة، الراتنج مع DMF (x 3) و DCM (x 3). جاف تماما الراتنج بتطبيق تدفق مستمر لغاز النيتروجين الجاف لمدة 15 دقيقة. يمكن تقسيم هذا الراتنج الجافة ويستخدم لإرفاق يسين أو علامة نيون مثل سينين 3 (Cy3) وكاربوكسيفلوريسسين في ن-المحطة للسلطة الوطنية الفلسطينية-
  4. الحجز على العلامة يسين أو الفلوريسنت (Cy3، Cy5، أو كاربوكسيفلوريسسين) إلى N-المحطة من السلطة الوطنية الفلسطينية
    1. تزن 10 مغ راتنج، محملة مسبقاً مع تسلسل السلطة الوطنية الفلسطينية المرجوة. نقل داخل وعاء تفاعل 5 مل. نقع الراتنج في DCM حاء 1
    2. المرفق ليسين، القيام بخطوات 1.2.1-1.3.3، استبدال مونومر أما يا بنك الصين--ليز (ض)-أوه أو معتدلاً-ليز (بنك)--
    3. لإلحاق كاربوكسيفلوريسسين، القيام بالخطوات 1.2.1-1.3.3، مع فائض الوقت من 5 6-كاربوكسيفلوريسسين مونومر، و ن، ن '-دييسوبروبيلكاربودييميدي (ديبك) وهيدروكسيبينزوتريازولي (هوبت) الكواشف اقتران في DMF. اترك رد فعل اقتران بين عشية وضحاها في شاكر حاضنة في 40 درجة مئوية.
      ملاحظة: كما كاربوكسيفلوريسسين حساسة للضوء، وعاء التفاعل ينبغي أن تغطي برقائق الألومنيوم.
    4. للمرفق لصبغ Cy3 أو Cy5، التسمية بواسطة الأسلوب انقر فوق الكيمياء، القيام بالخطوات 1.2.1-1.3.3، استبدال مونومر مع N-Boc-2-propargyl-L-glycine. وهذا فونكتيوناليزيس ن-المحطة من السلطة الوطنية الفلسطينية مع جماعة ألكاين. القيام برد فعل حفزت النحاس انقر فوق إرفاق Cy3 المحتوية على أزيد أو صبغ فلوري Cy5 12 ، ، من 47 48 ، 49
  5. الانقسام السلطة الوطنية الفلسطينية من دعم قوي وتنقيتها، وتوصيف
    ملاحظة: إذا كان أي فريق أمين محمي مع معتدلاً حماية المجموعة، ديبروتيكت أول مجموعة أمين بالتعامل مع بيبيرديني 20% في DMF الحل لمدة 15 دقيقة (دورتان). أغسل الراتنج جيدا مع DMF (x 3) تليها DCM (x 3). جاف على راتنج تماما بتطبيق تدفق مستمر لغاز النيتروجين الجاف لمدة 15 دقيقة.
    1. نقل 5 ملغ من الراتنج الجافة في قنينة صغيرة. إضافة 10 ميليلتر من ثيوانيسولي و 4 ميليلتر من 1، 2-اثانيديثيول، ضمان أن الراتنج هو غارقة في الكواشف. ترك الأنبوب في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5
      ملاحظة: تعمل هذه الكواشف كجمع القمامة، التي فخ رد الفعل الأنواع الموجبة التي يتم تشكيلها من خلال إزالة حماية المجموعات في السلطة الوطنية الفلسطينية. يمكن اختيار الزبالين المناسبة استناداً إلى سلسلة الجانب حماية الفئات.
    2. إضافة 100 ميليلتر من تفا في أنبوب يحتوي على الراتنج وجمع القمامة. بلطف دوامة الخليط والموضوع للطرد المركزي موجزة. ترك الأنبوب في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 10
      تنبيه: تفا التآكل العالية. يجب ارتداء الملابس الواقية المناسبة عند التعامل مع-
    3. بعناية إضافة 20 ميليلتر من حمض تريفلوروميثانيسولفونيك (تفمسا) إلى الأنبوبة. بلطف تحرض الخليط رد فعل قبل إخضاع للطرد المركزي موجزة في درجة حرارة الغرفة. اترك الأنبوب مطردا في درجة حرارة الغرفة حاء 2
      تنبيه: تفمسا التآكل العالية. يجب ارتداء الملابس الواقية المناسبة عند التعامل مع-
      4. ماصة
    4. مرشح إيقاف الانقسام كوكتيل في قارورة أسفل المائدة مستديرة 5 مل (المصرف) مع استخدام الزجاج باستور مزودة بالقطن. استخدام كمية صغيرة من تفا ليغسل الراتنج.
    5. تطهير غاز النيتروجين الجاف إلى فيلتراتي التي تم جمعها حتى يتم تبخر جميع المذيبات المتطايرة. أضف 1 مل من البرد إثيل الاثير إلى المصرف.
      ملاحظة: سيؤدي الاثير ثنائي إثيل تعمد إلى السلطة الوطنية الفلسطينية.
      1. شطف المصرف بثنائي إثيل الاثير عدة مرات قبل نقل الحل غائم في أنبوب 1.5 مل. موضوع أنبوب للطرد المركزي للسماح لترسبات السلطة الوطنية الفلسطينية تسوية. صب المذيبات وإضافة 300-500 ميليلتر من الماء يعقم متسرعا. دوامة تماما بحل السلطة الوطنية الفلسطينية-
    6. تنقية العينة السلطة الوطنية الفلسطينية النفط الخام عن طريق البرنامج العادي-[هبلك] باستخدام water-acetonitrile-0.1% تفا كمرحلة المتنقلة. جمع الكسور المقابلة، وتتبخر جميع المذيبات باستخدام مركز فراغ قبل إعادة حل السلطة الوطنية الفلسطينية المنقاة في الماء يعقم.
    7. وصف السلطة الوطنية الفلسطينية النقية عن طريق تحليل استخدام TOF مع استخدام حمض α-سينو-4-هيدروكسيسيناميك (شكا) كمصفوفة تبلور عينة-
    8. قياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية (260 nm) للسلطة الوطنية الفلسطينية في 65 ° جيم حساب تركيز السلطة الوطنية الفلسطينية مع المعادلة:
      Equation 1
      ملاحظة: هنا c هو التركيز وهو امتصاص القراءة التي تم الحصول عليها، واليورو هو معامل الانقراض من تسلسل الحمض النووي الريبي و l هو طول مسار بصري ومبومو (1 سم)-معامل الانقراض تسلسل السلطة الوطنية الفلسطينية هو مجموع معامل الانقراض مونومرات الفردية 50. معاملات الانقراض من الأدنين وسيتوزين جوانين ثايمين هي 15.4 بوصة، 7.3، 11.7 و 8.8 مل/µmol·cm، على التوالي. معامل الانقراض مونومرات L و Q استخدامه يفترض أن تكون نفس من السيتوزين (C) قاعدة.

2. عدم يشوه الصفحة

    1. من إعداد المخزن المؤقت المطلوب إيجاد حلول "احتضان إعداد" المخزن المؤقت (10 مل) باستخدام mg 116.88 كلوريد الصوديوم (200 ملم)، 50 ميليلتر من 100 ملم حمض الإيثيلين (يدتا) (0.5 ملم)، 200 ميليلتر من الأسهم م 1 هيبيس (20 مم)، 9.75 م ح 2 س؛ ضبط المخزن المؤقت على درجة الحموضة 7.5.
    2. تحضير 1 × تريس-بورات-يدتا (TBE) تشغيل المخزن المؤقت (1 لتر) باستخدام 100 مل 10 × تريس-بورات-يدتا على درجة الحموضة 8.3 و 900 مل ح 2 أولمبيك
    3. استخدام إعداد الأمونيوم 10% فوق كبريتات (الجزائرية) الحل (300 ميليلتر) فوق كبريتات الأمونيوم 30 ملغ، و 300 ميليلتر ح 2 o.
  2. إعداد 12% polyacrylamide هلام
    1. تنظيف مشط تشكيل جيدا، وألواح الزجاج الصب، والفواصل مع الإيثانول؛ ومشط تشكيل جيدا والفواصل 1 مم. أنشأت الجمعية العامة جل وختم مع الشريط الختم هلام.
    2. لجل بولياكريلاميدي من 22 سم × 16.5 سم × 1 مم البعد، 50 مل من محلول جل كافية. تزن بها ز 5.7 من الاكريلاميد و 0.3 ز ن، ن '-ميثيلينيبيساكريلاميدي (19:1)، ونقل إلى أجهزة الطرد مركزي 50 مل الأنبوبة.
      تنبيه: الاكريلاميد المسببة للسرطان. تجنب التنفس في أبخرة الغبار من الاكريلاميد، وضمان أن يتم ارتداء الملابس الواقية المناسبة عند التعامل مع-
    3. تذوب المركبات الصلبة في 50 مل 1 X TBE تشغيل المخزن المؤقت عن طريق وضع أنبوب الطرد المركزي في حمام مائي 50 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، أو حتى قد حلت جميع مركبات صلبة. القيام بالطرد المركزي (3000 دورة في الدقيقة، 5 دقيقة، 25 درجة مئوية) لإزالة جميع فقاعات الهواء داخل الحل. السماح بأن الحل لتبرد بدرجة حرارة الغرفة-
      4. إضافة 250 ميليلتر من محلول APS 10% و 50 ميليلتر من تيتراميثيليثيلينيدياميني (تيميد) إلى حل جل
    4. وتخلط برفق باستخدام ملعقة. فورا من أجل الحل بين ألواح زجاجية، مع التأكد من عدم إدخال أي فقاعات الهواء. إدراج مشط تشكيل جيدا وترك الإعداد جل في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة على الأقل السماح بلمرة تحدث، قبل تخزينها في 4 درجات مئوية حتى جاهزة للاستخدام-
  3. إعداد عينات
    1. إزالة الكمية المطلوبة من الجيش الملكي النيبالي دبوس (1 ميكرومتر) من الأسهم الرئيسية في أنبوب نظيف 1.5 مل. الجاف للحمض النووي الريبي الحل باستخدام مركز فراغ.
      ملاحظة: كل نموذج يحتوي على 1 ميكرومتر من الجيش الملكي النيبالي في المخزن المؤقت لحضانة ميليلتر 20. عادة، يتم إعداد 13 عينات من الحمض النووي الريبي لتجربة صفحة واحدة. يمكن إعداد الجيش الملكي النيبالي لجميع العينات معا في أنبوب واحد.
    2. إزالة وحدات التخزين المطلوبة للسلطة الوطنية الفلسطينية المستهدفة (مع التركيز النهائي لتصل إلى 50 ميكرومتر) من الأسهم الرئيسية ونقل إلى أنابيب منفصلة 1.5 مل. يتبخر ماء الحلول السلطة الوطنية الفلسطينية باستخدام مركز فراغ.
      3. التي تحتوي على أنبوب
    3. ميليلتر إضافة 260 من المخزن المؤقت للحضانة إلى 1.5 مل المجففة الجيش الملكي النيبالي ومزيج دقيق لضمان كل من الجيش الملكي النيبالي ديسأولفيد. إخضاع الجيش الملكي النيبالي لانجذاب التبريد: مكان الأنبوب إلى كتلة حرارة (يسخن إلى 95 درجة مئوية) على الفور 5 دقيقة نقل في حمام الثلج وترك للحد الأدنى 10
      4. المجففة
    4. إضافة 20 ميليلتر من الحمض النووي الريبي في كل مل 1.5 الأنابيب التي تحتوي على السلطة الوطنية الفلسطينية ومزيج دقيق. أداء الصلب: مكان الأنبوب الذي يحتوي على خليط من الجيش الملكي النيبالي، والسلطة الوطنية الفلسطينية إلى كتلة حرارة (يسخن إلى 65 درجة مئوية) 10 دقيقة تشغيل إيقاف الطاقة كتلة الحرارة واسمحوا تبرد العينات ببطء إلى درجة حرارة الغرفة. احتضان هذه العينات في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
  4. قيد التشغيل والتجهيز لجل
    1. إزالة الشريط الختم هلام على الجانب السفلي من اللوحة الزجاجية. جبل وتأمين لوحة الزجاج على موقف جل الرأسية تستخدم المشابك البلاستيكية.
      ملاحظة: جل تشغيل يتم الاضطلاع في غرفة باردة في حوالي 4 درجات مئوية. جميع المعدات، والعينات، ومخازن تبريد في 4 درجات مئوية قبل تشغيل الهلام.
    2. ملء الخزان المخزن السفلي مع 1 x TBE المخزن المؤقت قيد التشغيل حتى اللوحة هي غارقة في حوالي 1-2 سم من تشغيل المخزن المؤقت. ملء الخزان العلوي المخزن المؤقت مع تشغيل المخزن المؤقت حتى مستوى المخزن المؤقت يتجاوز الأعلى من الجل من 1-2 سم-ببطء ولطف إزالة المشط تشكيل جيدا، مما يتيح تشغيل المخزن المؤقت لملء الآبار.
      3. الاتصال
    3. الوقوف جل لإمدادات طاقة. قبل تشغيل هلام مدة 30 دقيقة على الأقل مع جهد مستمر من 250 الخامس، الذي هو الأمثل 22 سم × 16.5 سم × 1 مم جل.
      4. وفي الوقت نفسه،
    4. إضافة 4 ميليلتر (20% حجم العينة) لحل والغليسيرول 35% لكل من العينات وتخلط برفق. وبمجرد الانتهاء من قبل تشغيل، تحميل 20 ميليلتر لكل عينة (بما في ذلك واحد عينة الحمض النووي الريبي وحدها بالإضافة إلى العينات التي تحتوي على خليط من الجيش الملكي النيبالي، والسلطة الوطنية الفلسطينية) بعناية إلى أسفل شكل جيد باستخدام ميكروبيبيتي وجل تحميل نصائح، مع التأكد من عدم إدخال أي فقاعات الهواء. تشغيل الهلام في جهد مستمر من 250 الخامس، مماثلة لما قبل التشغيل، ل 5 h.
      5. وقف الإمداد بالطاقة بعد ح 5
    5. وإزالة لوحة زجاج من الموقف. إزالة الشريط الختم هلام المتبقية وتفكيك اللوحة الزجاجية. بلطف إزالة وتزج الهلام في حاوية مليئة 350 مل مياه. إضافة 35 ميليلتر اثيديوم بروميد (10 مغ/مل) بعناية ووضع الحاوية على منصة شاكر (سرعة منخفضة) عن 30 دقيقة
      تنبيه: اثيديوم بروميد مطفر. يجب ارتداء الملابس الواقية المناسبة عند التعامل مع-
    6. التصرف في حل اثيديوم بروميد في حاوية نفايات معينة. شطف الجل مع 1.5-2 لتر ماء المقطر. مسح هلام تصوير باستخدام (انظر الجدول للمواد) مع ليزر أخضر من 532 نانومتر والانبعاث تصفية مجموعة في 610 نانومتر.
  5. هلام التحليل
    1. قياس كثافة الفرقة جل استخدام برمجيات حرة، GelQuant.NET (http://www.biochemlabsolutions.com/GelQuantNET.html). تطبيع كثافات الفرقة وفقا ل:
      Equation 2
      ملاحظة: هنا أنا ماكس المزدوجة هو كثافة الفرقة دبوس الحمض النووي الريبي وحدها دون الإضافة للسلطة الوطنية الفلسطينية، وأنا ماكس ثلاثي شدة الفرقة ثلاثي مع أعلى تركيز للسلطة الوطنية الفلسطينية وأضاف.
      1. جزء تشكيل ثلاثي وفقا لحساب:
        Equation 3
    2. الأرض جزء صغير تشكيل ثلاثي (Y) ضد تركيز السلطة الوطنية وأضاف ( ميكرومتر). احتواء البيانات إلى المعادلة للحصول على ثابت التفكك (ك د):
      Equation 4
      ملاحظة: هنا R 0 هو تركيز دبوس الحمض النووي الريبي (1 ميكرومتر). هنا Y 0 و B هي الأولى وتغيير الحد الأقصى للكسر ثلاثي، على التوالي. Y هو جزء صغير ثلاثي في تركيز السلطة الوطنية الفلسطينية المتنوعة. X هو مجموع تركيز السلطة الوطنية الفلسطينية وك د هو ثابت التفكك.

3. 2-أمينوبوريني Fluorescence ملزمة الإنزيم

  1. إعداد العينات (التي تحتوي على دسرنا)
    1. إزالة الكمية المطلوبة من 2-أمينوبوريني (2AP) المسمى دسرنا (1 ميكرون لكل ستراند) من الأسهم الرئيسية في أنبوب نظيف 1.5 مل. يتبخر الماء في الجيش الملكي النيبالي الحلول باستخدام مركز فراغ.
      ملاحظة: كل نموذج يحتوي على 1 ميكرومتر من الجيش الملكي النيبالي في المخزن المؤقت لحضانة ميليلتر 75. عادة، يتم إعداد 13 عينات من الحمض النووي الريبي. يمكن تحضير الحمض النووي الريبي لجميع العينات معا في أنبوب واحد.
    2. إزالة وحدات التخزين المطلوبة للسلطة الوطنية الفلسطينية المستهدفة لتركيزات مختلفة من الأسهم الرئيسية ونقل إلى أنابيب منفصلة 1.5 مل. يتبخر ماء الحلول السلطة الوطنية الفلسطينية باستخدام مركز فراغ.
      3. التي تحتوي على أنبوب
    3. ميليلتر 975 إضافة لاحتضان المخزن المؤقت 1.5 مل المجففة الجيش الملكي النيبالي ومزيج دقيق لضمان حل جميع الجيش الملكي النيبالي. الطرد المركزي في حل الجيش الملكي النيبالي بإيجاز وإخضاعها للصلب: وضع الأنبوب في كتلة حرارة (يسخن إلى 95 درجة مئوية) لأدنى 10 دورة إيقاف الطاقة كتلة الحرارة واسمحوا تبرد العينات ببطء إلى درجة حرارة الغرفة.
      4. المجففة
    4. ميليلتر إضافة 75 من الحمض النووي الريبي في كل مل 1.5 الأنابيب التي تحتوي على السلطة الوطنية الفلسطينية ومزيج دقيق. اترك هذه العينات في درجة حرارة الغرفة على الأقل 1 h. إينكوباتي العينات عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  2. إعداد العينات (التي تحتوي على سرنا)
    1. إزالة الكمية المطلوبة من سرنا المسمى 2AP (1 ميكرومتر) من الأسهم الرئيسية في أنابيب نظيفة 1.5 مل. استخراج الكميات المطلوبة من السلطة الوطنية الفلسطينية المستهدفة لتركيزات مختلفة من الأسهم الرئيسية ونقل إلى كل منهما 1.5 مل الأنابيب التي تحتوي سرنا. الجاف الخليط الجيش الملكي النيبالي، والسلطة الوطنية الفلسطينية باستخدام مركز فراغ.
      2. المخزن المؤقت في كل واحدة من هذه الأنابيب 1.5 مل
    2. ميليلتر 75 إضافة للحضانة ومزيج دقيق. رهنا بالخليط الصلب: ضع الأنبوبة في كتلة حرارة (يسخن إلى 95 درجة مئوية) لأدنى 10 بدوره بعيداً عن السلطة والسماح العينات تبرد ببطء إلى درجة حرارة الغرفة. احتضان هذه العينات في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
  3. القياس والتحليل
    1. استخدام جهاز المطياف الضوئي الأسفار لقياس الانبعاثات على مدى نطاق الطول موجي نانومتر 330-550. استخدام الطول موجي إثارة 303 نيوتن متر.
      ملاحظة: يتم قياس العينات في درجة حرارة الغرفة، ويقاس كل عينة 3 مرات، الذي أخذ المتوسط.
      2. المخزن المؤقت
    2. ميليلتر 70 نقل الحضانة ومبومو مربع 1 سم. بدء القياس.
    3. إزالة المخزن المؤقت من ومبومو. شطف ومبومو مع الماء المقطر وتطهير غاز النيتروجين الجاف. تكرار لجميع العينات. طرح القياسات العازلة من جميع العينات-
    4. مؤامرة كثافة الفلورية (a.u.) ضد الطول الموجي (نانومتر). سجل كثافة الفلورية في 370 نانومتر لجميع العينات. ارسم كثافة الفلورية في 370 نانومتر (a.u.) ضد تركيز المقابلة للسلطة الوطنية الفلسطينية وأضاف (ميكرومتر).
    5. تناسب البيانات إلى المعادلة من الخطوة 2.5.2 للحصول على ثابت التفكك (ك د): Y = Y 0 + (ب/(2R 0)) (ص 0 + X + K د-((ص 0 + X + ك د) 2 -4R 0 X) 1/2)، حيث R 0 هو تركيز المسمى 2AP دسرنا (1 ميكرومتر).
      ملاحظة: هنا Y 0 و B هي التغيير الأولى والحد الأقصى لكثافة الفلورية في 370 نانومتر، على التوالي. Y هو كثافة الفلورية في 370 نانومتر في تركيز السلطة الوطنية الفلسطينية المتنوعة. X هو مجموع تركيز السلطة الوطنية الفلسطينية وك د هو ثابت التفكك.

4. الكشف عن امتصاص الأشعة فوق البنفسجية "التجارب ذوبان الحرارية"

  1. إعداد عينات
    ملاحظة: قياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية (260 nm) من الجيش الملكي النيبالي في 95 درجة مئوية (للتأكد من أن تتعطل هياكل الحمض النووي الريبي الثانوي). حساب تركيز الجيش الملكي النيبالي بالمعادلة:
    Equation 5
    ​ حيث c هو التركيز، بامتصاص القراءة التي تم الحصول عليها، واليورو هو معامل الانقراض تسلسل الحمض النووي الريبي، و l هو طول مسار بصري ومبومو (1 سم). معامل الانقراض من الجيش الملكي النيبالي يحسب على أساس نموذج أقرب جاره باستخدام ميلتون ، من 51 52. قد يتم توفير حزمة برنامج عند الطلب. أنابيب
    1. إزالة الكمية المطلوبة من سرنا (5 ميكرومتر) من الأسهم الرئيسية في تنظيف 1.5 مل. إزالة وحدات التخزين المطلوبة للسلطة الوطنية الفلسطينية المستهدفة (5 ميكرومتر) من الأسهم الرئيسية ونقل إلى كل منهما 1.5 مل الأنابيب التي تحتوي سرنا. الجاف الخليط الجيش الملكي النيبالي، والسلطة الوطنية الفلسطينية باستخدام مركز فراغ.
      2. المخزن المؤقت في كل واحدة من هذه الأنابيب 1.5 مل
    2. ميليلتر إضافة 130 من الحضانة ومزيج دقيق. رهنا بالخليط الصلب: ضع الأنبوبة في كتلة حرارة (يسخن إلى 95 درجة مئوية) لأدنى 10 بدوره بعيداً عن السلطة والسماح العينات تبرد ببطء إلى درجة حرارة الغرفة. احتضان هذه العينات في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
  2. القياس والتحليل
    1. استخدام جهاز المطياف الضوئي الأشعة فوق البنفسجية بالنسبة لقياس امتصاص في 260 قياس العينات من شمال البحر الأبيض المتوسط باستخدام ومبومو 8-microcell بطول مسار من 1 سم. ' أبسوربانسيس في ارتفاع درجة الحرارة من 15 إلى 95 درجة مئوية، متبوعاً بانخفاض درجة الحرارة إلى 15 درجة مئوية بمعدل 0.5 درجة مئوية/دقيقة منحدر من 95
    2. نقل 130 ميكروليتر من عينة في كل من البئر، مع التأكد من أن أحد جيدا يحتوي على المخزن المؤقت الحضانة. بدء القياس. كرر حسب الاقتضاء.
    3. تطبيع قيم امتصاص مع درجة حرارة عالية قراءة طبيعية للوحدة، والأرض امتصاص تطبيع قراءة ضد درجة الحرارة (درجة مئوية). ارسم على أول مشتق من المنحنيات. الحصول على درجات حرارة ذوبان بتركيب منحنيات المشتقة الأولى لدالة ضبابي.

Representative Results

[هبلك] عكس المرحلة يتيح تنقية ليغومرات السلطة الوطنية الفلسطينية. يمكننا الحصول على نقي ليغومرات السلطة الوطنية الفلسطينية بجولتين من تنقية [هبلك] (الشكل 3). يمكن تأكيد هوية المحميات بتحليل استخدام TOF (الشكل 4).

عدم يشوه الصفحة تقنية سهلة وغنية بالمعلومات لوصف الانتماءات الملزمة وخصوصيات ليغومرات السلطة الوطنية الفلسطينية. ونحن عادة استخدام متعددة من الحمض النووي الريبي دبابيس الشعر أو الدوبلكس مع الطفرات واحد زوج قاعدي لتوصيف خصائص الربط (الشكل 5). غير يشوه صفحة البيانات هو موضح في الشكل 5 تشير بوضوح أن س-L-تعديل والسلطة الوطنية الفلسطينية يمكن التعرف على منطقة دسرنا مع زوج ج-ز (الشكل 5بمن اللوحة السفلية) لكن لا أحد دون زوج ج-ز (الشكل 5بمن أعلى الفريق). هذا الاعتراف محددة وتعزيز من خلال T· أ-يو، L· ز-C، و Q· ج-ز PNA· الجيش الملكي النيبالي2 تشكيل قاعدة ثلاثية (الشكل 1أ، ج، د). قد تستعمل أيضا المحميات المختلفة مع الطفرات مفردة أو متعددة لإظهار خصائص محسنة ملزمة تعديل السلطة الوطنية الفلسطينية. وقد أظهرنا أن إضافة 2 مم Mg2 + في المخزن المؤقت للحضانة لا يؤثر في الربط إلى حد كبير31.

لقد أظهرنا بمعايرة الأسفار 2-أمينوبوريني الذي يربط بين السلطة الوطنية الفلسطينية تعديل ف ول المنطقة المستهدفة دسرنا (الشكل 6أ، ج 6، 6 د) ولكن لا سرنا (الشكل 6ب، 6E 6F). السلطة الوطنية الفلسطينية P3 يربط دسرنا 2-أمينوبوريني-المسمى بقيمة 0.8 ± 0.1 ميكرومترد ك. كثافة الفلورية في 370 نانومتر لسرنا 2-أمينوبوريني-المسمى تظل ثابتة نسبيا مع تركيز P3 المتنوعة، مما يشير إلى عدم وجود ربط P3 السلطة الوطنية الفلسطينية إلى سرنا.

المحميات التي تحتوي على عرض البقايا (P2 و P3) Q الحرارية لا انصهار التحولات (الشكل 7)، مما يوحي لا ربط لسرنا. هذا سبب الصدام الفراغية موجودة في واتسون-كريك مثل زوج س-ز. مقارنة بغير معدلة السلطة الوطنية الفلسطينية P1، تعديل P4 المحميات و P5 التي تحتوي على بقايا L ولكن لا توجد بقايا ف، إظهار انخفضت درجات الحرارة ذوبان الدوبلكس الجيش الملكي النيبالي-السلطة الوطنية الفلسطينية المقابلة بسبب اشتباك الفراغية موجودة في واتسون-كريك مثل زوج لز. البيانات الصهر الحراري الكشف عن امتصاص الأشعة فوق البنفسجية تتسق مع البيانات المعايرة الأسفار 2-أمينوبوريني، والتي تظهر أيضا أن السلطة الوطنية الفلسطينية التي تحتوي على مخلفات ف ول لا ربط سرنا ملحوظ (الشكل 6ب، 6E 6F). تتضمن قاعدة ف زعزعة الاستقرار أكثر من قاعدة للأم، قاعدة ف حدث اشتباك الفراغية أكثر أهمية في تشكيل زوج واتسون-كريك-مثل فز (الشكل 1و) بالمقارنة مع زوج واتسون-كريك-مثل لام-ز (الشكل 1ه ).

Figure 1
الشكل 1 : الهياكل الكيميائية هياكل مستقرة قاعدة ثلاثية وغير مستقرة زوج قاعدي. (أ-د) PNA· الرئيسية--الاخدود الجيش الملكي النيبالي2 قاعدة ثلاثة أمثاله من T· أ-U ()، ج+· ز-ج (ب)، L· ز-ج (C)، و Q· ج-ز (د). (ه، و) غير مستقرة واتسون-كريك مثل السلطة الوطنية الفلسطينية-الجيش الملكي النيبالي قاعدة أزواج لز (ه) وفز (F). ويمثل الحرف R السكر – فوسفات العمود الفقري للجيش الملكي النيبالي. الإشارة السندات الهيدروجين بواسطة خطوط متقطعة سوداء. ويرد هذا الرقم من مرجع31. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : الهياكل الكيميائية للسلطة الوطنية الفلسطينية مونومرات. تظهر أربعة مونومرات السلطة الوطنية الفلسطينية (ر، ج ول و Q). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : التركيب الكيميائي أوليجومير السلطة الوطنية الفلسطينية وتنقية بالبرنامج العادي [هبلك]- (أ) التركيب الكيميائي لتسلسل السلطة الوطنية الفلسطينية P3. (ب، ج) بيانات RP-[هبلك] من النفط الخام السلطة الوطنية الفلسطينية P3 (ب) وإعادة تنقية P3 السلطة الوطنية الفلسطينية (ج). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : TOF استخدام الطيف لتنقية السلطة الوطنية الفلسطينية P3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : دبوس الجيش الملكي النيبالي وتسلسل السلطة الوطنية الفلسطينية وتوصيف ملزم بغير يشوه الصفحة. (أ) الجيش الملكي النيبالي دبابيس الشعر (rHP1 و rHP2)، P3 السلطة الوطنية الفلسطينية، و PNA· تشكيل الجيش الملكي النيبالي2 ثلاثي بين السلطة الوطنية الفلسطينية P3 و rHP2. (ب) عدم يشوه الصفحة (12 في المائة) نتائج rHP1 و rHP2 ملزم للسلطة الوطنية الفلسطينية P3. المخزن المؤقت الحضانة 200 ملم كلوريد الصوديوم، 0.5 مم يدتا، 20 مم حبيس، درجة الحموضة 7.5. دبابيس الشعر تحميل الجيش الملكي النيبالي (rHP1 و rHP2) على 1 ميكرومتر في 20 ميليلتر. السلطة الوطنية الفلسطينية وتركيزات في الممرات من اليسار إلى اليمين هي 0، 0.2، 0.4، 1، 1.6، 2، 4، 10، 16، 20، 28، 50 ميكرومتر. P3 السلطة الوطنية الفلسطينية عدم ربط rHP1 بربط (اللوحة العلوية) لكن rHP2 (أسفل اللوحة). (ج) كد عزم للربط P3 ل rHP2. وكان رسم جزء صغير تشكيل ثلاثي (Y) مقابل تركيز السلطة الوطنية الفلسطينية. هذا الرقم مقتبس من مرجع31. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الرقم 6 : دراسة المعايرة fluorescence P3 السلطة الفلسطينية ملزمةللكشف 2-أمينوبوريني-المسمى. '2' في تسلسل الحمض النووي الريبي يعين بقايا 2-أمينوبوريني. المخزن المؤقت الحضانة 200 ملم كلوريد الصوديوم، 0.5 مم يدتا، 20 مم حبيس، درجة الحموضة 7.5. (أ) PNA· تشكيل الجيش الملكي النيبالي2 ثلاثي بين P3 ودسرنا 2-أمينوبوريني-المسمى (dsRNA2-2AP). (ب) افتراضية السلطة الوطنية الفلسطينية-الحمض النووي الريبي مزدوج شكلت بين P3 وسرنا 2-أمينوبوريني-المسمى (ssRNA2-2AP). (ج، ه) أطياف الانبعاث الأسفار 2-أمينوبوريني--يسمى الرنا المزدوجة (1 ميكرومتر) وسرنا (1 ميكرومتر)، على التوالي، مع تفاوت تركيز P3 في درجة الحموضة 7.5. الذروة في حوالي 475 نيوتن متر سبب انبعاث fluorescence ضعف قاعدة L في السلطة الوطنية الفلسطينية. (د، و) ك يستند تحديد د قطع 2-أمينوبوريني fluorescence كثافة (في 370 نانومتر) من الحمض النووي الريبي مزدوج وسرنا، على التوالي، مقابل تركيز P3 السلطة الوطنية الفلسطينية. هذا الرقم مقتبس من مرجع31. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
الشكل 7 : الحراري ذوبان النتائج للجيش الملكي النيبالي-السلطة الوطنية الفلسطينية الدوبلكس- المخزن المؤقت الحضانة 200 ملم كلوريد الصوديوم، 0.5 مم يدتا، 20 مم نة2بو4، درجة الحموضة 7.5. جميع العينات تحتوي على 5 ميكرومتر واحد-الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي (ssRNA1) والسلطة الوطنية الفلسطينية في واحد--الذين تقطعت بهم السبل رنا 130 ميليلتر. (A) (ssRNA1) والمحميات (P1 و P2، P3, P4 و P5) والوجهين السلطة الوطنية الفلسطينية-الجيش الملكي النيبالي افتراضية شكلت بين السلطة الوطنية الفلسطينية P3 و ssRNA1 في اتجاه مواز. يشار الصدام الفراغية لواطسون-كريك مثل فز وأزواج لز. انصهار (ب) منحنيات للمحميات المختلفة الملزمة إلى ssRNA1. يتم عرض درجات الحرارة ذوبان للمنحنيات مع ذوبان التحولات. هذا الرقم مقتبس من مرجع31.

Discussion

ليغومرات السلطة الوطنية الفلسطينية المزدوجة-ربط الحمض النووي الريبي (مثلاً، 10-الصرف) هي جزيئات متوسطة الحجم، ويمكن أن تظهر هكذا تحول التنقل الغرواني الكهربي عند الربط للكشف مع حجم مماثل أو أكبر قليلاً (مثلاً، 50-مير أو أصغر). إذا الجيش الملكي النيبالي أكبر بكثير من السلطة الوطنية الفلسطينية، قد لا تعمل المعايرة للسلطة الوطنية الفلسطينية في الجيش الملكي النيبالي بسبب تحول تنقل جل محدودة. وبالتالي، قد يتم اقتطاعها كبير الجيش الملكي النيبالي لفحوصات الصفحة غير يشوه. المعايرة الحمض النووي الريبي الكبيرة إلى السلطة الوطنية الفلسطينية المسماة فلوروفوري يسمح برصد تشكيل ثلاثي غير يشوه [اغروس] هلام مع العينة محملة في وسط جل40.

لتجربة معايرة بصفحة غير يشوه بتركيز مجموع ثابت من الجيش الملكي النيبالي، نستخدم عادة بتركيز الحمض النووي الريبي غير مسمى من 1 ميكرومتر لتلطيخ كفاءة وظيفة حرة الجيش الملكي النيبالي وعصابات ثلاثي اثيديوم بروميد. كما قد تكون بتركيز الحمض النووي الريبي منخفضة تصل إلى 0.2 ميكرون كافية اعتماداً على بنية الحمض النووي الريبي31. تمركز الجيش الملكي النيبالي غير مسمى (0.2 ميكرومتر) يحدد أند كالقيم التي يمكن أن تقاس بدقة عن 0.2 ميكرون أو أكبر. يمكن استخدام الأصباغ المصبوغة الأخرى لتعزيز كفاءة المصبوغة. وبدلاً من ذلك، لدينا معطيات غير منشورة تشير إلى أن Cy3 صبغ المسمى الكشف يمكن استخدامها في صفحة غير يشوه تجارب لقياس الأحداث ملزم ضيق.

يرجع ذلك إلى حقيقة أن 2-أمينوبوريني فقط معتدلة الفلورسنت، أيضا محدودة بالقياس للربط مع القيمد كقريبة أو فوق 0.2 ميكرون312-أمينوبوريني fluorescence المعايرة. الجيش الملكي النيبالي أو السلطة الوطنية الفلسطينية قد يكون المسمى مع صبغة زاهية نسبيا للتحديد الكمي ملزم ضيق نسبيا في الحل من خلال المعايرة الأسفار، إذا كان الربط يؤدي إلى تغييرات في الأسفار إشارات53،54، 55.

تم اختبار استراتيجية تستهدف هياكل الحمض النووي الريبي بالمحميات دسرنا الملزمة لعدد محدود من الكشف. ومن المرجح أن ربط خصائص قد تختلف عن دسرناس مع تركيبات مختلفة من تسلسل وزوج قاعدي. قد تختار واحدة دائماً حبلا الغنية البيورين من الوجهين لتصميم تفبناس. من الأهمية بمكان أن نفهم كيف على التوالي Q· ج-ز ثلاثية قد يؤثر على استقرار ثلاثي. وضوح أكثر شمولاً تعتمد على تسلسل الدراسات مطلوبة لفهم خصائص الربط تعتمد على تسلسل تفبناس.

يمكن زيادة تعزيز تقارب ملزم من تفبناس بزيادة الطول و/أو مواصلة تعديل القواعد والعمود الفقري56،57 من تفبناس. ومع ذلك، منطقة الطباعة على الوجهين مستمر قد لا تتكون غالباً من أكثر من 10 أزواج قاعدة متتالية دون انقطاع بهياكل غير واتسون-كريك. واحد قد متزاوجة تفبناس مع جزيئات صغيرة للاعتراف بالهياكل غير واتسون-كريك المتاخمة لمناطق دسرنا. من حيث المبدأ، يتوقع المتقارن جزيء تفبنا صغيرة تعزيز تقارب ملزم وخصوصية بالمقارنة إلى تفبنا أو جزيء الصغيرة وحدها. ومع ذلك، الخصائص الكيميائية والفيزيائية للرابط لتصريف58،،من5960،61،62،63،64 يجب أن يكون الأمثل.

حقيقة أن ربط تفبناس بشكل انتقائي إلى دسرناس أكثر من سرناس ودسدناس تشير إلى أنه من الممكن تطوير تفبناس كمجسات كيميائية مفيدة جداً ويغاندس العلاجية المحتملة من خلال تنظيم ديناميات هيكلية الجيش الملكي النيبالي والتفاعلات مع البروتينات ونواتج الأيض. ويمكن تسهيل امتصاص الخلوية من تفبناس من خلال الاقتران باختراق الخلية مويتيس مثل الجزيئات الصغيرة، الببتيدات، وجسيمات نانوية، أو كومبليكسيشن مع هياكل supramolecular مثل الدهنية5،6 12، ،،من1731،25،41،،من6566. كذلك الروغان تفبناس مع العلامات بيويماجينج مثل فلوروفوريس والنظائر المشعة قد تيسير الكشف عن، التصوير، واستهداف هياكل الحمض النووي الريبي الوظيفية في الكائنات الحية.

Disclosures

قدم طلب براءة (بات/179/14/15/PCT) استناداً إلى الأعمال التي ذكرت هنا.

Acknowledgments

كان يدعمها هذا العمل في سنغافورة وزارة التعليم (وزارة التربية والتعليم) المستوى 1 (RGT3/13 و RG42/15 للمقاول) ووزارة التربية والتعليم المستوى 2 (MOE2013-T2-2-024 و MOE2015-T2-1-028 للمقاول).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Molecular sieves, 4A, 1-2 mm diameter pellets  Alfa Aesar 87956
4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHAŸHCl) Sigma-Aldrich 532444
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) Alfa Aesar A11801
(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP) Alfa Aesar B25251
Acetic anhyride Sigma-Aldrich 320102
Kaiser Test Kit  Sigma-Aldrich 60017
Trifluoroacetic acid (TFA) Alfa Aesar L06374
Unmodified PNA monomers ASM Research Chemicals GmbH 5004007, 5004008, 5004009, 5004010
Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH Sigma-Aldrich B8389 / 47624
Thioanisole Alfa Aesar A14846
1,2-Ethanedithiol Alfa Aesar L12865
Trifluoromethanesulfonic acid Alfa Aesar A10173
LiChrosper® 100 RP-18 endcapped (5 µm) LiChroCART® 250-4 Merck Millipore 150838
RNA Oligos  Sigma-Aldrich Customized 
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) Sigma-Aldrich 39468
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Alfa Aesar J15694
HEPES  Lonza 17-737E
Acrylamide Sigma-Aldrich A8887
N.N'-methylenebisacrylamide Sigma-Aldrich  146072
Ammonium persulfate (APS) Bio-rad 161-0700
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-rad 161-0800
10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3 1st Base BUF-3010-10X1L
Glycerol  Promega  H5433
Ethidium bromide (10 mg/mL) Bio-rad  161-0433
High Precision Cell (Quartz Suprasil, 200-2500 nm) Hellma Analytics  105.250-QS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cech, T. R., Steitz, J. A. The noncoding RNA revolution-trashing old rules to forge new ones. Cell. 157 (1), 77-94 (2014).
  2. Velagapudi, S. P., Gallo, S. M., Disney, M. D. Sequence-based design of bioactive small molecules that target precursor microRNAs. Nat Chem Biol. 10, 291-297 (2014).
  3. Patil, K. M., Chen, G. Modified Nucleic Acids in Biology and Medicine. Jurga, S., Erdmann, V. A., Barciszewski, J. , Springer International Publishing. 299-317 (2016).
  4. Hyrup, B., Nielsen, P. E. Peptide nucleic acids (PNA): synthesis, properties and potential applications. Bioorg Med Chem. 4 (1), 5-23 (1996).
  5. Shiraishi, T., Nielsen, P. E. Improved cellular uptake of antisense peptide nucleic acids by conjugation to a cell-penetrating peptide and a lipid domain. Methods Mol Biol. 751, 209-221 (2011).
  6. Shiraishi, T., Nielsen, P. E. Nanomolar cellular antisense activity of peptide nucleic acid (PNA) cholic acid ("umbrella") and cholesterol conjugates delivered by cationic lipids. Bioconjugate Chem. 23 (2), 196-202 (2012).
  7. Khoo, B., Roca, X., Chew, S. L., Krainer, A. R. Antisense oligonucleotide-induced alternative splicing of the APOB mRNA generates a novel isoform of APOB. BMC Mol Biol. 8, 3 (2007).
  8. Stein, C. A., et al. Efficient gene silencing by delivery of locked nucleic acid antisense oligonucleotides, unassisted by transfection reagents. Nucleic Acids Res. 38 (1), 3 (2010).
  9. Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nat Rev Drug Discov. 11 (2), 125-140 (2012).
  10. Peacey, E., Rodriguez, L., Liu, Y., Wolfe, M. S. Targeting a pre-mRNA structure with bipartite antisense molecules modulates tau alternative splicing. Nucleic Acids Res. 40 (19), 9836-9849 (2012).
  11. Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3 (1), 1 (2012).
  12. Ma, X., et al. Intracellular delivery of antisense peptide nucleic acid by fluorescent mesoporous silica nanoparticles. Bioconjugate Chem. 25 (8), 1412-1420 (2014).
  13. Wojtkowiak-Szlachcic, A., et al. Short antisense-locked nucleic acids (all-LNAs) correct alternative splicing abnormalities in myotonic dystrophy. Nucleic Acids Res. 43 (6), 3318-3331 (2015).
  14. Lenartowicz, E., et al. Antisense Oligonucleotides Targeting Influenza A Segment 8 Genomic RNA Inhibit Viral Replication. Nucleic Acid Ther. 26 (5), 277-285 (2016).
  15. Avitabile, C., et al. Targeting pre-miRNA by peptide nucleic acids: a new strategy to interfere in the miRNA maturation. Artif DNA PNA XNA. 3 (2), 88-96 (2012).
  16. Barczak, A. K., et al. RNA signatures allow rapid identification of pathogens and antibiotic susceptibilities. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (16), 6217-6222 (2012).
  17. Das, I., et al. A peptide nucleic acid-aminosugar conjugate targeting transactivation response element of HIV-1 RNA genome shows a high bioavailability in human cells and strongly inhibits tat-mediated transactivation of HIV-1 transcription. J Med Chem. 55 (13), 6021-6032 (2012).
  18. Fabani, M. M., et al. Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids. Nucleic Acids Res. 38 (13), 4466-4475 (2010).
  19. Riguet, E., et al. A peptide nucleic acid-neamine conjugate that targets and cleaves HIV-1 TAR RNA inhibits viral replication. J Med Chem. 47 (20), 4806-4809 (2004).
  20. Torres, A. G., et al. Chemical structure requirements and cellular targeting of microRNA-122 by peptide nucleic acids anti-miRs. Nucleic Acids Res. 40 (5), 2152-2167 (2012).
  21. Upadhyay, A., Dixit, U., Manvar, D., Chaturvedi, N., Pandey, V. N. Affinity capture and identification of host cell factors associated with hepatitis C virus (+) strand subgenomic RNA. Mol Cell Proteomics. 12 (6), 1539-1552 (2013).
  22. Wesolowski, D., et al. Basic peptide-morpholino oligomer conjugate that is very effective in killing bacteria by gene-specific and nonspecific modes. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (40), 16582-16587 (2011).
  23. Armitage, B. A. The impact of nucleic acid secondary structure on PNA hybridization. Drug Discov Today. 8 (5), 222-228 (2003).
  24. Thomas, S. M., et al. Antitumor effects of EGFR antisense guanidine-based peptide nucleic acids in cancer models. ACS Chem Biol. 8 (2), 345-352 (2013).
  25. Bahal, R., McNeer, N. A., Ly, D. H., Saltzman, W. M., Glazer, P. M. Nanoparticle for delivery of antisense gammaPNA oligomers targeting CCR5. Artif DNA PNA XNA. 4 (2), 49-57 (2013).
  26. Adams, B. D., Parsons, C., Walker, L., Zhang, W. C., Slack, F. J. Targeting noncoding RNAs in disease. J. Clin. Invest. 127 (3), 761-771 (2017).
  27. Matsui, M., Corey, D. R. Non-coding RNAs as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 16 (3), 167-179 (2017).
  28. Devi, G., Zhou, Y., Zhong, Z., Toh, D. -F. K., Chen, G. RNA triplexes: from structural principles to biological and biotech applications. Wiley Interdiscip Rev RNA. 6 (1), 111-128 (2015).
  29. Rozners, E. Recent Advances in Chemical Modification of Peptide Nucleic Acids. J Nucleic Acids. 2012, 8 (2012).
  30. Devi, G., Yuan, Z., Lu, Y., Zhao, Y., Chen, G. Incorporation of thio-pseudoisocytosine into triplex-forming peptide nucleic acids for enhanced recognition of RNA duplexes. Nucleic Acids Res. 42 (6), 4008-4018 (2014).
  31. Toh, D. K., et al. Incorporating a guanidine-modified cytosine base into triplex-forming PNAs for the recognition of a C-G pyrimidine-purine inversion site of an RNA duplex. Nucleic Acids Res. 44 (19), 9071-9082 (2016).
  32. Li, M., Zengeya, T., Rozners, E. Short peptide nucleic acids bind strongly to homopurine tract of double helical RNA at pH 5.5. J Am Chem Soc. 132 (25), 8676-8681 (2010).
  33. Gupta, P., Zengeya, T., Rozners, E. Triple helical recognition of pyrimidine inversions in polypurine tracts of RNA by nucleobase-modified PNA. Chem Commun. 47 (39), 11125-11127 (2011).
  34. Zengeya, T., Li, M., Rozners, E. PNA containing isocytidine nucleobase: synthesis and recognition of double helical RNA. Bioorg Med Chem Lett. 21 (7), 2121-2124 (2011).
  35. Gupta, P., Muse, O., Rozners, E. Recognition of double-stranded RNA by guanidine-modified peptide nucleic acids. Biochemistry. 51 (1), 63-73 (2012).
  36. Zengeya, T., Gupta, P., Rozners, E. Triple-helical recognition of RNA using 2-aminopyridine-modified PNA at physiologically relevant conditions. Angew Chem Int Ed. 51 (50), 12593-12596 (2012).
  37. Muse, O., et al. Sequence selective recognition of double-stranded RNA at physiologically relevant conditions using PNA-peptide conjugates. ACS Chem Biol. 8 (8), 1683-1686 (2013).
  38. Hnedzko, D., Cheruiyot, S. K., Rozners, E. Using Triple Helix Forming Peptide Nucleic Acids for Sequence-selective Recognition of Double-stranded RNA. Curr Protoc Nucleic Acid Chem. 58, 61-64 (2014).
  39. Zengeya, T., Gupta, P., Rozners, E. Sequence selective recognition of double-stranded RNA using triple helix-forming peptide nucleic acids. Methods Mol Biol. 1050, 83-94 (2014).
  40. Endoh, T., Hnedzko, D., Rozners, E., Sugimoto, N. Nucleobase-Modified PNA Suppresses Translation by Forming a Triple Helix with a Hairpin Structure in mRNA In Vitro and in Cells. Angew Chem Int Ed. 55 (3), 899-903 (2016).
  41. Hnedzko, D., McGee, D. W., Karamitas, Y. A., Rozners, E. Sequence-selective recognition of double-stranded RNA and enhanced cellular uptake of cationic nucleobase and backbone-modified peptide nucleic acids. RNA. 23 (1), 58-69 (2017).
  42. Wexselblatt, E., Esko, J. D., Tor, Y. On guanidinium and cellular uptake. J Org Chem. 79 (15), 6766-6774 (2014).
  43. Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal. Biochem. 34 (2), 595-598 (1970).
  44. Roberts, R. W., Crothers, D. M. Stability and properties of double and triple helices: dramatic effects of RNA or DNA backbone composition. Science. 258 (5087), 1463-1466 (1992).
  45. Zhou, Y., et al. Recognition of RNA duplexes by chemically modified triplex-forming oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 41 (13), 6664-6673 (2013).
  46. Gisin, B. F. The monitoring of reactions in solid-phase peptide synthesis with picric acid. Anal. Chim. Acta. 58 (1), 248-249 (1972).
  47. Gogoi, K., Mane, M. V., Kunte, S. S., Kumar, V. A. A versatile method for the preparation of conjugates of peptides with DNA/PNA/analog by employing chemo-selective click reaction in water. Nucleic Acids Res. 35 (21), 139 (2007).
  48. Shabanpoor, F., Gait, M. J. Development of a general methodology for labelling peptide-morpholino oligonucleotide conjugates using alkyne-azide click chemistry. Chem Commun. 49 (87), 10260-10262 (2013).
  49. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A Stepwise Huisgen Cycloaddition Process: Copper(I)-Catalyzed Regioselective "Ligation" of Azides and Terminal Alkynes. Angew Chem Int Ed. 41 (14), 2596-2599 (2002).
  50. Haaima, G., Hansen, F. H., Christensen, L., Dahl, O., Nielsen, P. E. Increased DNA binding and sequence discrimination of PNA oligomers containing 2,6-diaminopurine. Nucleic Acids Res. 25 (22), 4639-4643 (1997).
  51. Schroeder, S. J., Turner, D. H. Methods Enzymol. 468, Academic Press. 371-387 (2009).
  52. McDowell, J. A., Turner, D. H. Investigation of the Structural Basis for Thermodynamic Stabilities of Tandem GU Mismatches: Solution Structure of (rGAGGUCUC)2 by Two-Dimensional NMR and Simulated Annealing. Biochemistry. 35 (45), 14077-14089 (1996).
  53. Sato, T., Sato, Y., Nishizawa, S. Triplex-Forming Peptide Nucleic Acid Probe Having Thiazole Orange as a Base Surrogate for Fluorescence Sensing of Double-stranded RNA. J Am Chem Soc. 138 (30), 9397-9400 (2016).
  54. Cheruiyot, S. K., Rozners, E. Fluorescent 2-Aminopyridine Nucleobases for Triplex-Forming Peptide Nucleic Acids. ChemBioChem. 17 (16), 1558-1562 (2016).
  55. Sato, T., Sato, Y., Nishizawa, S. Optimization of the Alkyl Linker of TO Base Surrogate in Triplex-Forming PNA for Enhanced Binding to Double-Stranded RNA. Chem Eur J. 23 (17), 4079-4088 (2017).
  56. Virta, P. M., Tahtinen, V., Granqvist, L., Murtola, M., Stromberg, R. 19F NMR spectroscopic analysis of the binding modes in triple helical PNA/microRNA-complexes. Chem Eur J. , (2017).
  57. Zengeya, T., Gindin, A., Rozners, E. Improvement of sequence selectivity in triple helical recognition of RNA by phenylalanine-derived PNA. Artif DNA PNA XNA. 4 (3), 69-76 (2013).
  58. Moses, A. C., Huang, S. W., Schepartz, A. Inhibition of Rev.RRE complexation by triplex tethered oligonucleotide probes. Bioorg Med Chem. 5 (6), 1123-1129 (1997).
  59. Ben Gaied, N., Zhao, Z., Gerrard, S. R., Fox, K. R., Brown, T. Potent triple helix stabilization by 5',3'-modified triplex-forming oligonucleotides. ChemBioChem. 10 (11), 1839-1851 (2009).
  60. Grimm, G. N., Boutorine, A. S., Lincoln, P., Norden, B., Helene, C. Formation of DNA triple helices by an oligonucleotide conjugated to a fluorescent ruthenium complex. ChemBioChem. 3 (4), 324-331 (2002).
  61. Tran, T., et al. Targeting the r(CGG) Repeats That Cause FXTAS with Modularly Assembled Small Molecules and Oligonucleotides. ACS Chem Biol. , (2014).
  62. Gianolio, D. A., Segismundo, J. M., McLaughlin, L. W. Tethered naphthalene diimide-based intercalators for DNA triplex stabilization. Nucleic Acids Res. 28 (10), 2128-2134 (2000).
  63. Rumney, S., Kool, E. T. Structural Optimization of Non-Nucleotide Loop Replacements for Duplex and Triplex DNAs. J Am Chem Soc. 117, 5635-5646 (1995).
  64. Stafford, R. L., Dervan, P. B. The reach of linear protein-DNA dimerizers. J Am Chem Soc. 129 (45), 14026-14033 (2007).
  65. Gupta, A., Bahal, R., Gupta, M., Glazer, P. M., Saltzman, W. M. Nanotechnology for delivery of peptide nucleic acids (PNAs). J Control Release. 240, 302-311 (2016).
  66. Avitabile, C., et al. Incorporation of Naked Peptide Nucleic Acids into Liposomes Leads to Fast and Efficient Delivery. Bioconjugate Chem. 26 (8), 1533-1541 (2015).

Tags

علم الوراثة، العدد 127، السلطة الوطنية الفلسطينية، ثلاثي، بنية الحمض النووي الريبي، الحمض النووي الريبي مزدوج، يغاندس ملزم الجيش الملكي النيبالي، توليف الببتيد المرحلة الصلبة، غير يشوه الصفحة، 2-أمينوبوريني، وذوبان الحراري الأشعة فوق البنفسجية، التعرف الجزيئي، وتقارب ملزم، groove الرئيسية
الاعتراف الخاصة بتسلسل وانتقائية بالكشف مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل على الكشف واحد-الذين تقطعت بهم السبل بتعديل كيميائيا الببتيد الأحماض النووية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Toh, D. F. K., Patil, K. M., Chen,… More

Toh, D. F. K., Patil, K. M., Chen, G. Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (127), e56221, doi:10.3791/56221 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter