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Genetics

अनुक्रम-विशिष्ट और चयनात्मक पहचान डबल-असहाय RNAs पर एकल-असहाय RNAs द्वारा रासायनिक संशोधित पेप्टाइड न्यूक्लिक एसिड

Published: September 21, 2017 doi: 10.3791/56221
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Division of Chemistry and Biological Chemistry, School of Physical and Mathematical Sciences, Nanyang Technological University
* These authors contributed equally

Summary

हम संश्लेषण और पेप्टाइड न्यूक्लिक एसिड (ॄणा) संशोधित अवशेषों को शामिल oligomers के शुद्धिकरण के लिए प्रोटोकॉल की रिपोर्ट । संशोधित PNAs द्वारा आरएनए डुप्लेक्स की पहचान के लक्षण वर्णन के लिए जैव रासायनिक और भौतिक तरीके बताए गए हैं ।

Abstract

RNAs महत्वपूर्ण उपमार्क्स और चिकित्सीय लक्ष्यों के रूप में उभर रहे हैं । इस प्रकार, आरएनए अनुक्रम और संरचना की मांयता के लिए रासायनिक जांच और चिकित्सीय लाइगैंडों के विकास में काफी क्षमता है । रासायनिक संशोधित पेप्टाइड न्यूक्लिक एसिड (ॄणा) oligomers हाल ही में विकसित किया गया है कि एक अनुक्रम विशेष तरीके से आरएनए डुप्लेक्स पहचान कर सकते हैं । PNAs एक तटस्थ पेप्टाइड की तरह रीढ़ के साथ रासायनिक रूप से स्थिर हैं । PNAs मैनुअल बीओसी-रसायन ठोस चरण पेप्टाइड संश्लेषण विधि द्वारा अपेक्षाकृत आसानी से संश्लेषित किया जा सकता है । PNAs रिवर्स चरण HPLC द्वारा शुद्ध कर रहे हैं, मैट्रिक्स द्वारा आणविक वजन लक्षण वर्णन द्वारा पीछा-लेजर desorption/ionization-उड़ान के समय (मालदी-तोफ) । गैर denaturing polyacrylamide जेल ट्रो (पृष्ठ) तकनीक ट्रिपलेक्स गठन के इमेजिंग की सुविधा है, क्योंकि ध्यान से मुक्त आरएनए डुप्लेक्स constructs और ॄणा बाउंड triplexes अक्सर विभिन्न माइग्रेशन दरों दिखा । ethidium ब्रोमाइड पद धुंधला के साथ गैर denaturing पृष्ठ अक्सर निस्र्पक के लिए एक आसान और जानकारीपूर्ण तकनीक है समानताएं ॄणा की बाध्यकारी oligomers और विशिष्टताओं । आम तौर पर, एकाधिक आरएनए hairpins या एक आधार जोड़ी उत्परिवर्तनों के साथ डुप्लेक्स ॄणा बाध्यकारी गुणों, जैसे बाध्यकारी समानताएं और विशिष्टताओं को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । 2-Aminopurine adenine (6-Aminopurine) का एक isomer है; 2-aminopurine प्रतिदीप्ति तीव्रता स्थानीय संरचनात्मक पर्यावरण परिवर्तन के प्रति संवेदनशील है, और 2-aminopurine ॄणा बंधन साइट के पास शामिल अवशेषों के साथ ट्रिपलेक्स गठन की निगरानी के लिए उपयुक्त है । 2-Aminopurine प्रतिदीप्ति अनुमापन भी लक्षित डबल-असहाय PNAs (RNAs) पर एकल-कतरा dsRNAs (RNAs) के प्रति संशोधित ssRNAs की बाध्यकारी selectivity की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यूवी-अवशोषक का पता लगाया थर्मल पिघलने प्रयोगों ॄणा की थर्मल स्थिरता की माप की अनुमति-आरएनए डुप्लेक्स और ॄणा · आरएनए२ triplexes. यहां, हम संश्लेषण और संशोधित अवशेषों को शामिल ॄणा oligomers के शुद्धिकरण का वर्णन, और संशोधित PNAs द्वारा आरएनए द्वैध की मांयता के लक्षण वर्णन के लिए जैव रासायनिक और भौतिक तरीकों का वर्णन ।

Introduction

RNAs के विनियमन और विविध जैविक प्रक्रियाओं के catalysis में RNAs ' भूमिकाओं की खोजों में हाल ही में अग्रिमों के कारण महत्वपूर्ण जैव चिह्नों और चिकित्सीय लक्ष्यों के रूप में उभर रहे हैं,1,2,3. परंपरागत रूप से, antisense किस्में वाट्सन-क्रिकेटरों द्वैध गठन3,4,5,6,7,8, के माध्यम से ssRNAs के लिए बाइंड करने के लिए इस्तेमाल किया गया है 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. हाल ही में, ट्रिपलेक्स-बनाने पेप्टाइड न्यूक्लिक एसिड (TFPNAs) को Hoogsteen हाइड्रोजन बांडिंग (चित्रा 1)3,28,29के माध्यम से dsRNAs को बांध डिजाइन किया गया है । dsRNA क्षेत्रों पारंपरिक antisense-लक्षित RNAs के बहुमत में मौजूद हैं, पूर्व mRNAs और mRNAs सहित, पूर्व या पंचायती राज-miRNAs3, और कई अंय गैर कोडिंग RNAs1,26,27। TFPNAs का उपयोग कर ट्रिपल कुंडलित गठन के माध्यम से dsRNAs लक्ष्यीकरण अपनी संरचना विशिष्टता के कारण लाभप्रद हो सकता है और RNAs, जो रोगों में dysregulated हैं, उदाहरण के लिए के सामान्य कार्यों को बहाल करने में उपयोग के लिए महान क्षमता का है.

हाल ही में प्रकाशित Rozners एट अलद्वारा काम करते हैं, और अमेरिका3,28,29,30,31,३२,३३, ३४,३५,३६,३७,३८,३९,४०,४१, सुधार पर प्रयासों की रिपोर्ट एन्हांस्ड अपनत्व के साथ dsRNAs के प्रति संशोधित TFPNAs का चयनात्मक बंधन. हमने तर्कसंगत रूप से डिजाइन किए ॄणा मोनोमर (चित्रा 2) के लिए संश्लेषण विधियों का विकास किया है जिसमें thio-pseudoisocytosine (L) मोनोमर30 और guanidine-संशोधित 5-मिथाइल cytosine (Q) मोनोमर31शामिल हैं । विभिंन जैव रासायनिक और भौतिक लक्षण वर्णन विधियों के माध्यम से, हम प्रदर्शन किया है कि अपेक्षाकृत कम PNAs (6-10 अवशेषों) शामिल एल और क्यू अवशेषों वाटसन की मांयता में सुधार दिखा-क्रिकेटरों जी सी और सी जी आधार जोड़े, क्रमशः, dsRNAs में । इसके अलावा, unसंशोधित PNAs की तुलना में, एल और क्यू अवशेषों युक्त PNAs ssRNA और dsDNA से अधिक dsRNA की ओर अधिक चयनात्मक बाध्यकारी दिखाते हैं । Q आधार में guanidine कार्यक्षमता४२ हेला कक्ष31दर्ज करने के लिए PNAs सक्षम करता है ।

हमारी प्रयोगशाला में, हम मैनुअल बीओसी-रसायन PNAs द्वारा संश्लेषित (बीओसी या टी-बीओसी टर्ट-butyloxycarbony के लिए खड़ा है ( चित्रा 2) ठोस चरण पेप्टाइड संश्लेषण विधि4देखें. अमीन की रक्षा समूह के रूप में बीओसी के साथ ॄणा मोनोमर के संश्लेषण बीओसी समूह sterically की तुलना में कम भारी fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) अमीन की रक्षा समूह है, जो ॄणा मोनोमर युग्मन के दौरान लाभप्रद हो सकता है के रूप में सुविधाजनक है ठोस समर्थन । बीओसी समूह अम्ल-labile है और dichloromethane संश्लेषण के दौरान ॄणा (डीसीएम) में 20-50% trifluoroacetic अम्ल (TFA) द्वारा ठोस समर्थन पर आसानी से निकाला जा सकता है. एक स्वचालित पेप्टाइड सिंथेसाइज़र ॄणा oligomers संश्लेषित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है; हालांकि, 3-5-गुना अधिक ॄणा मोनोमर एक स्वचालित पेप्टाइड सिंथेसाइज़र के लिए आवश्यक है । मैनुअल संश्लेषण के लिए काफी कम ॄणा मोनोमर (2-3 गुना अधिक), प्रत्येक युग्मन आसानी से कैसर टेस्ट४३द्वारा निगरानी के साथ) की आवश्यकता है. इसके अलावा, कई स्वचालित सिंथेसाइज़र बीओसी हटाने कदम के दौरान संक्षारक TFA के उपयोग के कारण बीओसी रणनीति संश्लेषण के साथ संगत नहीं हैं ।

ॄणा oligomers से शुद्ध किया जा सकता है रिवर्स चरण उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (आरपी-HPLC) द्वारा आणविक वजन लक्षण वर्णन द्वारा पीछा मालदी-तोफ (आंकड़े 3 और 4)30, 31. हम ट्रिपलेक्स गठन की निगरानी के लिए गैर-denaturing पृष्ठ को नियोजित करते हैं, इस तथ्य के कारण कि मुक्त आरएनए डुप्लेक्स का निर्माण और ॄणा बाउंड triplexes अक्सर विभिन्न माइग्रेशन दरें दर्शाते हैं (चित्र 5)30,31 . कोई लेबलिंग की जरूरत है अगर कुशल पद-धुंधला आरएनए द्वैध और ॄणा के दोनों के लिए प्राप्त किया जा सकता है · आरएनए२ ट्रिपलेक्स बैंड्स. गैर-denaturing पृष्ठ प्रयोगों के लिए नमूना की एक अपेक्षाकृत छोटी राशि की जरूरत है. हालांकि, लोड हो रहा है (मशीन) बफ़र्स और चल रहे बफ़र्स (pH ८.३) वही नहीं हो सकता है, जो माप में जिसके परिणामस्वरूप, काइनेटिक स्थिर triplexes तक सीमित किया जा रहा है, क्योंकि ८.३ के एक अपेक्षाकृत उच्च पीएच काफी एक ट्रिपलेक्स अस्थिर हो सकता है ।

2-Aminopurine adenine (6-Aminopurine) का एक isomer है; 2-aminopurine प्रतिदीप्ति तीव्रता (लगभग ३७० एनएम पर एक उत्सर्जन चोटी के साथ) स्थानीय संरचनात्मक पर्यावरण परिवर्तन के प्रति संवेदनशील है, और 2-aminopurine ॄणा बंधन साइट के पास शामिल अवशेषों के साथ ट्रिपलेक्स गठन की निगरानी के लिए उपयुक्त है ( चित्र 6) 31. कई अन्य रंगों के विपरीत जो दिखाई देने वाले रेंज में प्रतिदीप्ति उत्सर्जन दिखाते हैं, 2-aminopurine-लेबल आरएनए बिना फोटो ब्लीचिंग के कमरे की रोशनी से अवगत कराया जा सकता है । पृष्ठ प्रयोग में जो पीएच ८.३ की एक चल बफर अक्सर जरूरत है विपरीत, 2-aminopurine आधारित प्रतिदीप्ति अनुमापन एक निर्दिष्ट पीएच में एक समाधान में बाध्यकारी की माप की अनुमति देता है, और इस तरह माप और अपेक्षाकृत कमजोर का पता लगाने की अनुमति हो सकती है और संतुलन में काइनेटिक अस्थिर बाध्यकारी ।

यूवी-अवशोषक का पता लगाया थर्मल पिघलने प्रयोगों डुप्लेक्स की थर्मल स्थिरता की माप की अनुमति (चित्रा 7)31 और त्रिकोणीयplexes30,३२,४४,४५. लंबाई और अनुक्रम संरचना पर निर्भर करता है, triplexes के पिघलने या एक स्पष्ट संक्रमण नहीं दिखा सकते हैं । ताप और शीतलन घटता ओवरलैप अगर ऊष्मा मापदंडों प्राप्त किया जा सकता है । सटीक ऊष्मा मापदंडों इज़ोटेर्माल अनुमापन calorimetry (आईटीसी)३२द्वारा प्राप्त किया जा सकता है; हालांकि, अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में नमूनों की आम तौर पर आईटीसी के लिए आवश्यकता होती है ।

Protocol

< p class = "jove_title" > 1. मैनुअल ठोस चरण पेप्टाइड संश्लेषण का उपयोग कर PNAs के बीओसी रसायन

< p class = "jove_content" > नोट: सफलता और सरलता के लिए वांछित ॄणा oligomer संश्लेषण के लिए, सभी सॉल्वैंट्स और रिएजेंट को निर्जल किया जाना चाहिए । उपयुक्त आणविक छलनी (4a, 1-2 मिमी व्यास छर्रों) जोड़ें और कभी-कभार सूखी नाइट्रोजन गैस को बोतलों में पर्ज करें । संशोधित ॄणा मोनोमर के संश्लेषण के लिए, रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल संबंधित संदर्भों में < सुप वर्ग = "xref" > 30 , < सुप वर्ग = "xref" > 31 का उपयोग किया जा सकता है । वाणिज्यिक स्रोतों से अनसंशोधित ॄणा मोनोमर खरीदे जा सकते हैं । धुलाई चरणों में से प्रत्येक में, विलायक के उचित मात्रा में राल के लिए जोड़ा जाता है, एक घोल बनाने, इससे पहले कि यह बंद सूखा है ।

  1. पहले मोनोमर के लदान और राल पर अतिरिक्त नि: शुल्क प्राथमिक अमीन कैपिंग
    1. वजन 30 मिलीग्राम 4-methylbenzhydrylamine हाइडरोक्लॉराइड (मभा & #183; एचसीएल) polystyrene राल (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है; लोडिंग मूल्य 0.7-1.4 mmol/छ; 100-200 मेष आकार), और एक 5 मिलीलीटर ठोस चरण पेप्टाइड प्रतिक्रिया पोत एक टोंटी और ग्लास डाट के साथ सज्जित करने के लिए स्थानांतरण ।
    2. 1 ज के लिए डीसीएम की एक उचित मात्रा में राल सोख, राल प्रफुल्लित करने के लिए और अमीन (एचसीएल नमक) बेनकाब करने की अनुमति ।
      नोट: राल मोती हमेशा पूरी तरह से संश्लेषण में सॉल्वैंट्स में डूबे होना चाहिए.
    3. ड्रेन के ऊपर से निकली सूखी नाइट्रोजन गैस का कोमल प्रवाह लगाने से डीसीएम ने कुप्पी के नीचे उतारा । ५०% (v/v) n, n -diisopropylethylamine (DIPEA) की डीसीएम में 1 मिलीलीटर जोड़ें और इसे 15 मिनट के लिए छोड़ दें । इससे एचसीएल राल पर मुक्त अमीनों से जुड़ी नमक बेअसर हो जाती है.
    4. दोहराएँ कदम 1.1.3. इस बीच, वजन 6 & #181; मोनोमर के मॉल और 6 & #181; मॉल के (benzotriazol-1-yl-ऑक्सी) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP), और एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरण । Add २०० & #181; dimethylformamide (DMF) के L और 12 & #181; DIPEA के मोल. भंवर 3-5 min.
      के लिए युग्मन समाधान नोट: वांछित लदान मूल्य का इस्तेमाल किया है ०.२ mmol/ पहला मोनोमर जोड़ा वांछित ॄणा अनुक्रम के सी-टर्मिनल पर मोनोमर है । पहले अमीनो अम्ल के लोडिंग मूल्य की गणना picric अम्ल विधि से की जा सकती है < सुप वर्ग = "xref" > ४६ .
    5. ड्रेन से DIPEA के पास डीसीएम ने हल निकाला । डीसीएम (एक्स 3) के साथ राल धो, DMF (एक्स 3) के बाद, और टोंटी बंद । राल के लिए तैयार युग्मन समाधान जोड़ें और धीरे से हिला । एक साफ स्टेनलेस स्टील रंग के उपयोग के साथ युग्मन समाधान में पोत के भीतरी दीवारों के साथ राल पुश । ग्लास डाट देते है और एक मशीन में 3 ज के लिए ४० & #176; C.
      में पोत को सुरक्षित नोट: वैकल्पिक रूप से, प्रतिक्रिया पोत 6-8 एच के लिए कमरे के तापमान पर स्थिर रखा जा सकता है पेप्टाइड युग्मन प्रतिक्रिया के पूरा होने की अनुमति है ।
    6. मिश्रण से कैपिंग समाधान तैयार करें २४० & #181; एसिटिक एनहाइड्राइड और ३६० & #181 के मॉल, DIPEA के मॉल २०० & #181; डीसीएम के एल. युग्मन समाधान बंद नाली और DMF (एक्स 3) और डीसीएम (एक्स 3) के साथ राल धो लो । कैपिंग समाधान में जोड़ें और 30 मिनट के लिए पोत छोड़ दो, कभी पोत धीरे मिलाते हुए । मास्क कैपिंग acetylation.
      7. द्वारा रेजिन पर अतिरिक्त नि: शुल्क प्राथमिक अमीन समूहों
    7. दोहराएँ चरण 1.1.6. नाली कैपिंग समाधान और डीसीएम (एक्स 3) के साथ राल धो लो ।
    8. एक पतली केशिका ट्यूब का उपयोग कर राल मोतियों की एक छोटी सी aliquot निकालें, और एक १.५ मिलीलीटर छोटे गिलास शीशी में उन्हें जगह है । कैसर परीक्षण < सुप वर्ग = "xref" > ४३ करते. 15 & #181 जोड़ें; कांच की शीशी और गर्मी में एक गर्मी बंदूक का उपयोग कर कैसर परीक्षण समाधान के प्रत्येक के एल । हीटिंग के बाद मोतियों के रंग का निरीक्षण । मोतियों का रंग अपरिवर्तित रहना चाहिए, राल पर मुक्त अमीन समूहों की कमी का संकेत है.
      नोट: कैसर परीक्षण किट व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है या रिपोर्ट प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार किया जा सकता है । समाधान A: इथेनॉल में ninhydrin; समाधान B: इथेनॉल में phenol; हल ग: पोटेशियम साइनाइड (KCN) में pyridine.
      चेतावनी: KCN अत्यधिक विषाक्त है; उचित सुरक्षात्मक कपड़े पहना जाना चाहिए और हीटिंग एक अच्छी तरह हवादार धुएं हूड में किया जाना चाहिए, ज्वलनशील विलायक या रिएजेंट के अभाव में ।
    9. दोहराने कदम 1.1.6 अगर राल मोती नीले या बेहोश नीले रंग का प्रदर्शन.
  2. हटाने एन टर्मिनल अमीन की रक्षा समूह
    1. प्रतिक्रिया पोत से सॉल्वैंट्स नाली और डीसीएम में trifluoroacetic एसिड (TFA) के ५०% (वी/वी) का समाधान जोड़ने के लिए, सुनिश्चित करना है कि रेजिन पूरी तरह से जलमग्न हैं । 15 मिनट के लिए पोत छोड़ दो, कभी कभार करने के लिए अमीन समूह के संरक्षण की सुविधा मिलाते हुए । दोहराएँ 2 अधिक चक्र.
      चेतावनी: TFA अत्यधिक संक्षारक है । उचित सुरक्षात्मक कपड़े पहना जाना चाहिए जब हैंडलिंग ।
    2. ने डीसीएम (एक्स 3), DMF (एक्स 3), और डीसीएम (एक्स 3) के साथ राल को धो डाला । डीसीएम में 5% DIPEA का सॉल्यूशन जोड़ें । 15 मिनट के लिए पोत छोड़ दें । यह कदम TFA काउंटर ॠणायन को बेअसर कर मुक्त अमीनों को सक्रिय करता है. दोहराएं एक बार और अधिक ।
    3. फ्लश से डीसीएम हल से DIPEA । डीसीएम (एक्स 3) के साथ राल धो लो । प्रदर्शन कैसर टेस्ट (step 1.1.8).
      नोट: अमीना समूहों के सफल संरक्षण मोतियों की नीली रंग उपज जाएगा । एक बार संरक्षण सफल होता है, पेप्टाइड युग्मन द्वारा मोनोमर के बाद युग्मन बाहर किया जा सकता है ।
  3. युग्मन के बाद के मोनोमर
    1. के वजन 18 & #181; मोनोमर के लिए बीओसी-ॄणा-Q-ओह मोनोमर, १३.२ मिलीग्राम मोनोमर का वजन है) और 18 & #181; एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में PyBOP के मॉल । Add २०० & #181; DMF के एल और ३६ & #181; DIPEA के मॉल १.५ एमएल ट्यूब में । भंवर जब तक सभी ठोस यौगिकों भंग कर रहे हैं ।
    2. DMF (एक्स 3) के साथ राल धो लो । प्रतिक्रिया पोत में युग्मन समाधान जोड़ें और धीरे से हिला । एक साफ स्टेनलेस स्टील रंग के उपयोग के साथ युग्मन समाधान में पोत के भीतरी दीवारों के साथ राल पुश । ग्लास डाट देते है और एक मशीन में 3 ज के लिए ४० & #176; C.
      3. में पोत को सुरक्षित
    3. युग्मन समाधान बंद नाली और DMF (एक्स 3) और डीसीएम (एक्स 3) के साथ राल धो लो । चरण 1.1.8 निष्पादित करें । यदि मोतियों का रंग अपरिवर्तित रहता है, तो दोहराएँ कदम 1.2.1-1.3.3 जब तक वांछित ॄणा अनुक्रम पूरा हो गया है. यदि मोतियों का नीला रंग एक मोनोमर के युग्मन के बाद मनाया जाता है, दोहराने कदम 1.3.1-1.3.3 । यदि disease फिर भी बनी रहती है, तो फिर से कैपिंग (step 1.1.6) करें ।
      नोट: युग्मन के साथ समस्या उत्पंन युग्मन समय (3-12 ज) और/या मोनोमर और युग्मन एजेंट के अतिरिक्त समकक्ष के उपयोग की सिफारिश की है ।
    4. एक बार वांछित ॄणा अनुक्रम पूरा हो गया है, DMF (एक्स 3) और डीसीएम (एक्स 3) के साथ राल धो लो । पूरी तरह से 15 मिनट के लिए सूखी नाइट्रोजन गैस की एक सतत प्रवाह लागू करने से राल सूखी । इस सूखी राल विभाजित किया जा सकता है और lysine या cyanine 3 के रूप में एक फ्लोरोसेंट टैग संलग्न करने के लिए इस्तेमाल किया (Cy3) और एन पर carboxyfluorescein-ॄणा के टर्मिनस ।
  4. लगाव के lysine या फ्लोरोसेंट टैग (Cy3, Cy5, या carboxyfluorescein) N करने के लिए-टर्मिनस ॄणा
    1. का वजन 10 राल के मिलीग्राम, पूर्व वांछित ॄणा अनुक्रम के साथ भरी हुई । एक 5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया पोत में स्थानांतरण । 1 घंटे के लिए डीसीएम में राल भिगोना
      2. lysine के मोह के लिए
    2. , कदम 1.2.1-1.3.3, मोनोमर की जगह या तो बीओसी-Lys (Z) के साथ-ओह या Fmoc-Lys (बीओसी)-oh.
      3. carboxyfluorescein के मोह के लिए
    3. , चरणों का प्रदर्शन 1.2.1-1.3.3, के साथ 10 गुना अधिक से अधिक 5 (6)-carboxyfluorescein के रूप में मोनोमर, और n, n & #39; -diisopropylcarbodiimide (DIPC) और hydroxybenzotriazole (HOBt) के रूप में युग्मन रिएजेंट DMF में । युग्मन प्रतिक्रिया ४० & #176 पर मशीनी में रातोंरात छोड़ दो; C.
      नोट: के रूप में carboxyfluorescein संवेदनशील प्रकाश है, प्रतिक्रिया पोत एल्यूमीनियम पंनी के साथ कवर किया जाना चाहिए ।
    4. के लगाव के लिए Cy3 या Cy5 डाई, लेबल क्लिक रसायन विधि द्वारा, कदम 1.2.1-1.3.3, एन के साथ मोनोमर की जगह-बीओसी-2-propargyl-L-glycine । यह functionalizes N-टर्मिनस का ॄणा एक alkyne समूह के साथ होता है । कॉपर-catalyzed क्लिक करें प्रतिक्रिया azide-युक्त Cy3 या Cy5 फ्लोरोसेंट डाई संलग्न करने के लिए प्रदर्शन < सुप वर्ग = "xref" > १२ , < सुप class = "xref" > 47 , < सुप class = "xref" > 48 , < सुप क्लास = "xref" > 49
  5. ॄणा दरार से ठोस समर्थन, शुद्धि, और लक्षण वर्णन
    नोट: यदि किसी भी अमीन समूह Fmoc रक्षा समूह के साथ संरक्षित है, पहले piperdine में 20% DMF के साथ इलाज करके अमीन समूह को बचाना 15 मिनट (2 चक्र) के लिए समाधान । DMF (एक्स 3) के साथ अच्छी तरह से राल धो डीसीएम (एक्स 3) द्वारा पीछा किया । सूखी नाइट्रोजन गैस के 15 मिनट के लिए एक सतत प्रवाह लागू करने से पूरी तरह से राल सूखी ।
    1. हस्तांतरण 5 एक छोटी शीशी में सूखी राल के मिलीग्राम । Add 10 & #181; l का thioanisole और 4 & #181; l का 1, 2-ethanedithiol, यह सुनिश्चित करना कि राल में जलमग्न हो जाता है । 5 min.
      के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब छोड़ें नोट: इन रिएजेंटों मेहतर, जो जाल प्रतिक्रियाशील cationic प्रजातियों कि ॄणा में समूहों की रक्षा हटाने के दौरान गठित कर रहे है के रूप में कार्य करते हैं । उपयुक्त मेहतर पक्ष श्रृंखला समूहों की रक्षा के आधार पर चुना जा सकता है ।
    2. जोड़ें १०० & #181; TFA के एल राल और मेहतरों युक्त ट्यूब में । धीरे भंवर मिश्रण और संक्षिप्त केंद्रापसारक के अधीन । 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब छोड़ दो
      चेतावनी: TFA अत्यधिक संक्षारक है । उचित सुरक्षात्मक कपड़े पहना जाना चाहिए जब हैंडलिंग ।
    3. जतन जोडेर 20 & #181; trifluoromethanesulfonic अम्ल (TFMSA) के ट्यूब को एल. धीरे कमरे के तापमान पर संक्षिप्त केंद्रापसारक के अधीन करने से पहले प्रतिक्रिया मिश्रण आंदोलन । 2 एच
      के लिए कमरे के तापमान पर स्थिर ट्यूब छोड़ दो चेतावनी: TFMSA अत्यधिक संक्षारक है । उचित सुरक्षात्मक कपड़े पहना जाना चाहिए जब हैंडलिंग ।
    4. एक ग्लास पाश्चर पिपेट के उपयोग के साथ एक 5 मिलीलीटर गोल नीचे कुप्पी (RBF) में दरार कॉकटेल बंद फिल्टर कपास के साथ फिट । राल को धोने के लिए TFA की एक छोटी राशि का उपयोग करें ।
    5. एकत्र छानने का के लिए सूखी नाइट्रोजन गैस पर्ज करें जब तक सभी अस्थिर सॉल्वैंट्स काफूर हो जाती है । RBF.
      में ठंड diethyl ईथर के 1 मिलीलीटर जोड़ें नोट: diethyl ईथर ॄणा को हाला करने के लिए कारण होगा ।
      1. एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में बादल हल स्थानांतरित करने से पहले कई बार diethyl ईथर के साथ RBF कुल्ला । विषय ट्यूब को ॄणा को व्यवस्थित करने के लिए वेग की अनुमति देने के लिए । सॉल्वैंट्स को खिचड़ी भाषा और जोड़ 300-500 & #181; autoclaved पानी की हाला के लिए एल । ॄणा को भंग करने के लिए अच्छी तरह से भंवर.
    6. मोबाइल चरण के रूप में जल-HPLC-०.१% acetonitrile का उपयोग कर आरपी-TFA के माध्यम से क्रूड ॄणा नमूना शुद्ध । इसी अंशों लीजिए, autoclaved पानी में शुद्ध ॄणा को फिर से भंग करने से पहले एक वैक्यूम संकेन्द्रण का उपयोग सभी सॉल्वैंट्स लुप्त हो जाना ।
    7. की शुद्धि ॄणा के माध्यम से मालदी-तोफ विश्लेषण के उपयोग के साथ & #945;-cyano-4-hydroxycinnamic एसिड (CHCA) के रूप में नमूना क्रिस्टलीकरण मैट्रिक्स.
    8. ॄणा के यूवी अवशोषक (२६० एनएम) को मापने के लिए ६५ & #176; C. समीकरण के साथ ॄणा की एकाग्रता की गणना:
      < img alt = "समीकरण 1" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221eq1v2.jpg"/>
      नोट: यहां c एकाग्रता है, A है अवशोषक पठन प्राप्त, & #949; आरएनए अनुक्रम का विलुप्त गुणांक है, और l cuvette की ऑप्टिकल पथ लंबाई है (1 cm). ॄणा अनुक्रम का विलुप्त गुणांक व्यक्तिगत मोनोमर के विलुप्त गुणांक का योग है < सुप वर्ग = "xref" > ५० . adenine, cytosine, guanine और thymine के लुप्त गुणांक १५.४, ७.३, ११.७ और ८.८ एमएल/& #181; मॉल & #183; सेमी, क्रमशः । एल के विलुप्त गुणांक और क्ष मोनोमर का इस्तेमाल cytosine (सी) के आधार के रूप में ही माना जाता है.
< p class = "jove_title" > 2. गैर denaturing पेज

  1. आवश्यक बफर समाधान की तैयारी
    1. तैयार करने की मशीन बफर (10 एमएल) का उपयोग कर ११६.८८ मिलीग्राम NaCl (२०० mm), ५० & #181; l के १०० mM ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) (०.५ mm), २०० & #181; 1m शेयर के एल HEPES (२० मि.), ९.७५ एम एच २ हे; बफर समायोजित करने के लिए पीएच ७.५.
    2. तैयार 1x Tris-बोराटे-EDTA (TBE) रनिंग बफर (1 एल) का उपयोग १०० मिलीलीटर 10x Tris-बोराटे-EDTA पर पीएच ८.३ और ९०० एमएल एच 2 ओ.
    3. तैयार 10% अमोनियम persulfate (अनुप) समाधान (३०० & #181; l) का उपयोग कर 30 मिलीग्राम अमोनियम persulfate, और ३०० & #181; l ज 2 ओ.
  2. 12% polyacrylamide जेल की तैयारी
    1. इथेनॉल के साथ अच्छी तरह से बनाने कंघी, ग्लास कास्टिंग प्लेटें, और स्पेसर साफ; अच्छी तरह से बनाने कंघी और स्पेसर 1 मिमी मोटी हैं । जेल विधानसभा सेट अप और जेल सील टेप के साथ सील ।
    2. 22 सेमी x १६.५ cm x 1 मिमी आयाम, जेल समाधान के ५० मिलीलीटर के एक polyacrylamide जेल के लिए पर्याप्त है । n, n & #39;-methylenebisacrylamide (19:1) और एक ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में स्थानांतरण के acrylamide और ०.३ g के ५.७ g बाहर वजन ।
      सावधानी: Acrylamide यलो है । acrylamide से धूल के धुएं में सांस लेने से बचें और सुनिश्चित करें कि उचित सुरक्षात्मक कपड़ों को संभालने पर पहना जाता है ।
    3. ५० मिलीलीटर 1x TBE में ठोस यौगिकों को भंग करने के लिए एक ५० & #176 में केंद्रापसारक ट्यूब रखकर बफर चल रहा है, 15 मिनट के लिए सी जल स्नान या जब तक सभी ठोस यौगिकों भंग कर दिया है । बाहर ले (३,००० rpm, 5 मिनट, 25 & #176; C) समाधान के भीतर सभी हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए । कमरे के तापमान को शांत करने के लिए समाधान की अनुमति दें ।
    4. Add २५० & #181; l का 10% अनुप हल और ५० & #181; l का tetramethylethylenediamine (TEMED) जेल समाधान में और मिश्रण धीरे से एक रंग का उपयोग कर । तुरंत गिलास प्लेटों के बीच समाधान डालो, यकीन है कि किसी भी हवा बुलबुले परिचय नहीं बना । अच्छी तरह से बनाने की कंघी डालें और बहुलकीकरण होने के लिए अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान पर जेल सेटअप को कम से ६० मिनट के लिए छोड़ दें, 4 & #176 पर भंडारण करने से पहले, C का उपयोग करने के लिए तैयार जब तक.
  3. नमूनों की तैयारी
    1. के लिए आवश्यक मात्रा में आरएनए कांटा (1 & #181; M) में मुख्य स्टॉक से एक साफ १.५ एमएल ट्यूब । एक वैक्यूम ध्यानी का उपयोग कर आरएनए समाधान सूखी.
      नोट: प्रत्येक नमूना शामिल है 1 & #181; आरएनए के 20 & #181 में एम; एल मशीन बफर. आमतौर पर, आरएनए के 13 नमूने एक पेज प्रयोग के लिए तैयार किए जाते हैं । सभी नमूनों के लिए आरएनए एक एकल ट्यूब में एक साथ तैयार किया जा सकता है ।
    2. लक्षित ॄणा के आवश्यक संस्करणों को हटाने (अप करने के लिए अंतिम एकाग्रता के साथ ५० & #181; M) मुख्य स्टॉक से और अलग १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में स्थानांतरण. एक वैक्यूम संकेंद्रक का उपयोग कर ॄणा समाधान के पानी लुप्त हो जाना ।
    3. Add २६० & #181; मशीन बफर के एल १.५ मिलीलीटर में सूखी आरएनए युक्त ट्यूब और सभी आरएनए diss है सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह से मिश्रणolved । तस्वीर को ठंडा करने के लिए आरएनए विषय: एक गर्मी ब्लॉक में ट्यूब प्लेस (९५ & #176 के लिए गरम कर लिया है; C) 5 मिनट के लिए तुरंत एक बर्फ स्नान में स्थानांतरण और 10 मिनट के लिए छोड़ दें.
    4. जोड़ 20 & #181; आरएनए के एल १.५ मिलीलीटर में से प्रत्येक में सूखे ॄणा युक्त ट्यूब और अच्छी तरह से मिश्रण । प्रदर्शन एनीलिंग: एक गर्मी ब्लॉक में आरएनए और ॄणा मिश्रण युक्त ट्यूब प्लेस (६५ & #176 करने के लिए पहले से गरम) 10 मिनट के लिए. हीट ब्लॉक की शक्ति बंद करो और नमूने कमरे के तापमान को धीरे से शांत करते हैं । 4 & #176 पर नमूने की मशीन; सी रात भर
  4. जेल के रनिंग और प्रोसेसिंग
      के
    1. शीशे की प्लेट के नीचे की तरफ जेल-सील टेप को हटा दें । माउंट और ऊर्ध्वाधर जेल खड़े प्लास्टिक clamps का उपयोग कर पर कांच की थाली सुरक्षित ।
      नोट: जेल चल रहा है लगभग 4 में एक ठंडे कमरे में किया जाता है & #176; सी । सभी उपकरण, नमूने, और बफ़र्स जेल चलाने से पहले 4 & #176; C पर ठंडा कर रहे हैं ।
    2. 1x TBE के साथ कम बफर जलाशय भरने बफर चल रहा है जब तक प्लेट बफर चल के लगभग 1-2 सेमी में जलमग्न है । बफ़र के स्तर से 1-2 सेमी तक जेल के ऊपर से अधिक है, जब तक चल रहे बफर के साथ ऊपरी बफर जलाशय भरें । धीरे से ठीक है और धीरे से अच्छी तरह बनाने कंघी हटाने, चल रहे बफर कुओं को भरने के लिए अनुमति देता है ।
    3. एक बिजली की आपूर्ति के लिए जेल खड़े कनेक्ट । पूर्व-२५० वी, जो एक 22 सेमी x १६.५ cm x 1 mm gel के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है की एक निरंतर वोल्टेज के साथ ंयूनतम 30 मिनट के लिए जेल चलाते हैं ।
    4. इस बीच, जोड़ 4 & #181; L (नमूना मात्रा का 20%) के ३५% ग्लिसरॉल समाधान के प्रत्येक नमूने और धीरे मिश्रण. एक बार पूर्व चलाने के पूरा हो गया है, लोड 20 & #181; प्रत्येक नमूने के एल (एक आरएनए अकेले नमूना प्लस आरएनए और ॄणा मिश्रण युक्त नमूनों सहित) ध्यान से अच्छी तरह से एक micropipette और जेल लोड हो रहा है सुझावों का उपयोग कर के तल में, किसी भी हवा के बुलबुले का परिचय नहीं यकीन कर रही. २५० V, पूर्व चलाने के लिए इसी तरह की एक स्थिर वोल्टेज पर जेल भागो, 5 घंटे के लिए
    5. 5 ज के बाद बिजली की आपूर्ति बंद कर दें और स्टैंड से शीशे की प्लेट हटा लें । शेष जेल-सील टेप निकालें और कांच की थाली जुदा । धीरे निकालें और एक कंटेनर में डूबे पानी के ३५० मिलीलीटर से भरा में जेल । सावधानी से जोड़ें ३५ & #181; ethidium ब्रोमाइड (10 मिलीग्राम/एमएल) के एल और कंटेनर एक मंच पर (कम गति) शेखर के लिए जगह 30 min.
      सावधानी: Ethidium ब्रोमाइड एक mutagen है । उचित सुरक्षात्मक कपड़े पहना जाना चाहिए जब हैंडलिंग ।
    6. एक निर्दिष्ट अपशिष्ट कंटेनर में ethidium ब्रोमाइड समाधान निपटान । आसुत जल के १.५-2 L के साथ जेल कुल्ला । एक imager का उपयोग कर जेल स्कैन (देखें सामग्री के टेबल) ५३२ एनएम के एक हरे रंग की लेजर और उत्सर्जन फ़िल्टर ६१० एनएम पर सेट के साथ ।
  5. जेल विश्लेषण
    1. एक मुफ्त सॉफ्टवेयर, GelQuant.NET (http://www.biochemlabsolutions.com/GelQuantNET.html) का उपयोग कर जेल बैंड तीव्रता बढ़ाता है । के अनुसार बैंड तीव्रता को सामान्य:
      < img alt = "समीकरण 2" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221eq2v3.jpg"/>
      नोट: यहाँ मैं द्वैध मैक्स कांटा के अलावा बिना अकेले आरएनए ॄणा की बैंड गहनता है, और मैं ट्रिपलेक्स मैक्स ॄणा की सबसे अधिक एकाग्रता के साथ ट्रिपलेक्स बैंड तीव्रता जोड़ा गया है ।
      1. के अनुसार ट्रिपलेक्स गठन के अंश की गणना:
        < img alt = "समीकरण 3" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221eq3v2.jpg"/>
    2. प्लाट ट्रिपलेक्स की एकाग्रता के खिलाफ ॄणा गठन (Y) के अंश जोड़ा गया ( & #181; M). डेटा को पृथक्करण स्थिरांक प्राप्त करने के लिए समीकरण में फ़िट करें ( K d ):
      < img alt = "समीकरण 4" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221eq4v4.jpg"/>
      नोट: यहां आर 0 आरएनए कांटा एकाग्रता (1 & #181; एम) है । यहां Y 0 और B, क्रमशः ट्रिपलेक्स अंश का प्रारंभिक और अधिकतम परिवर्तन है । Y विविध ॄणा एकाग्रता में ट्रिपलेक्स के अंश है । X कुल ॄणा एकाग्रता होती है और K d पृथक्करण स्थिरांक है ।
< p class = "jove_title" > 3.2-Aminopurine प्रतिदीप्ति बाइंडिंग परख

  1. नमूनों की तैयारी (युक्त dsRNA)
    1. की आवश् यक मात्रा 2-Aminopurine (2AP) को दूर करने के लिए लेबल dsRNA (1 & #181; M येक के लिए कतरास) मुख्य शेयर से साफ १.५ एमएल ट्यूब में । एक वैक्यूम ध्यानी का उपयोग कर आरएनए समाधान में पानी लुप्त हो जाना ।
      नोट: प्रत्येक नमूना शामिल है 1 & #181; आरएनए के ७५ & #181 में एम; एल मशीन बफर । आमतौर पर आरएनए के 13 नमूने तैयार किए जाते हैं । सभी नमूनों के लिए आरएनए एक एकल ट्यूब में एक साथ तैयार किया जा सकता है ।
    2. अलग १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में मुख्य स्टॉक और हस्तांतरण से विभिंन सांद्रता के लिए लक्षित ॄणा के आवश्यक संस्करणों को हटा दें । एक वैक्यूम संकेंद्रक का उपयोग कर ॄणा समाधान के पानी लुप्त हो जाना ।
    3. Add ९७५ & #181; में मशीन बफर के एल १.५ मिलीलीटर सूख आरएनए युक्त ट्यूब और सभी आरएनए भंग है सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह से मिश्रण. आरएनए समाधान संक्षिप्त और एनीलिंग करने के लिए यह विषय: एक गर्मी ब्लॉक में ट्यूब प्लेस (९५ & #176 के लिए पहले से गरम) 10 मिनट के लिए । गर्मी ब्लॉक की शक्ति बंद करो और नमूने कमरे के तापमान के लिए धीरे से शांत हो जाओ ।
    4. Add ७५ & #181; आरएनए के एल में से प्रत्येक में १.५ मिलीलीटर ट्यूब सूखे ॄणा युक्त और अच्छी तरह से मिश्रण. नमूने के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दो कम से 1 ज. पर नमूनों की मशीन 4 & #176; ग रात भर.
  2. नमूनों की तैयारी (युक्त ssRNA)
    1. की आवश्यक मात्रा निकाल 2AP-त्यसपछि ssRNA (१ & #181; मी) में मुख्य स्टाक से साफ १.५ एमएल ट्यूबों । मुख्य स्टॉक से विभिंन सांद्रता के लिए लक्षित ॄणा की आवश्यक मात्रा को निकालें और संबंधित १.५ मिलीलीटर ट्यूबों कि ssRNA शामिल में स्थानांतरण । एक वैक्यूम संकेंद्रक का उपयोग करके आरएनए और ॄणा मिश्रण को सुखाएं ।
    2. Add ७५ & #181; हर १.५ एमएल ट्यूबों में मशीन बफर के एल और मिश्रण अच्छी तरह से । एनीलिंग करने के लिए मिश्रण विषय: एक गर्मी ब्लॉक में ट्यूब प्लेस (९५ & #176 के लिए पहले से गरम) 10 मिनट के लिए । बिजली बंद करें और नमूनों को कमरे के तापमान को धीरे से ठंडा होने दें । 4 & #176 पर नमूने की मशीन; सी रात भर
  3. मापन व विश्लेषण
    1. एक प्रतिदीप्ति spectrophotometer का उपयोग करने के लिए 330-550 एनएम के एक तरंग दैर्ध्य सीमा से अधिक उत्सर्जन को मापने । ३०३ एनएम के एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का प्रयोग करें ।
      नोट: नमूनों को कमरे के तापमान पर मापा जाता है और प्रत्येक नमूने 3 बार मापा जाता है, जिसमें औसत लिया जाता है.
    2. Transfer ७० & #181; 1 सेमी स्क्वायर cuvette में मशीन बफर के एल । माप प्रारंभ करें.
    3. cuvette से बफ़र निकालें । आसुत जल के साथ cuvette कुल्ला और सूखी नाइट्रोजन गैस शुद्ध करना । सभी नमूनों के लिए दोहराएँ । सभी नमूनों से बफ़र माप घटाना.
    4. प्रतिदीप्ति तीव्रता (a.u.) तरंग दैर्ध्य (एनएम) के खिलाफ साजिश । सभी नमूनों के लिए ३७० एनएम पर प्रतिदीप्ति तीव्रता रिकॉर्ड । ॄणा की इसी एकाग्रता (& #181; M) के खिलाफ ३७० एनएम (a.u.) पर प्रतिदीप्ति तीव्रता प्लाट ।
    5. पृथक्करण स्थिरांक प्राप्त करने के लिए चरण 2.5.2 से समीकरण में डेटा फ़िट करें ( K d ): y = y 0 + (B/(2R 0 )) (R 0 + x + K d -((R 0 + x + K d ) 2 -4R 0 X) 1/2 ), जहां R 0 2AP-त्यसपछि dsRNA एकाग्रता (1 & #181; M).
      नोट: यहां Y 0 और बी ३७० एनएम में प्रतिदीप्ति तीव्रता के प्रारंभिक और अधिकतम परिवर्तन, क्रमशः कर रहे हैं । Y विविध ॄणा एकाग्रता में ३७० एनएम पर प्रतिदीप्ति तीव्रता है । X कुल ॄणा एकाग्रता होती है और K d पृथक्करण स्थिरांक है ।
< p class = "jove_title" > 4. यूवी-अवशोषक का पता लगाया थर्मल पिघलने के प्रयोगों

  1. नमूनों की तैयारी
    नोट: आरएनए के यूवी अवशोषक (२६० एनएम) को मापने ९५ & #176; सी (आरएनए माध्यमिक संरचनाओं बाधित कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए). समीकरण के साथ आरएनए की एकाग्रता की गणना:
    < img alt = "समीकरण 5" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221eq5v2.jpg"/>
    & #8203; जहाँ सी एकाग्रता है, एक है िारी पढ़ना प्राप्त है, & #949 है; विलुप्त गुणांक है आरएनए अनुक्रम के, और एल cuvette (1 सेमी) के ऑप्टिकल पथ लंबाई है । आरएनए के विलुप्त गुणांक की गणना एक निकटतम-पड़ोसी मॉडल के आधार पर की जाती है MeltWin < सुप वर्ग = "xref" > ५१ , < सुप वर्ग = "xref" > ५२ . कार्यक्रम पैकेज अनुरोध पर प्रदान किया जा सकता है ।
    1. में मुख्य स्टॉक से ssRNA (5 & #181; M) की आवश्यक मात्रा को साफ १.५ एमएल ट्यूबों में निकालें । मुख्य स्टॉक से लक्षित ॄणा (5 & #181; M) के अपेक्षित वॉल्यूम को निकालें और संबंधित १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में अंतरण करें जिनमें ssRNA शामिल हैं । एक वैक्यूम संकेंद्रक का उपयोग करके आरएनए और ॄणा मिश्रण को सुखाएं ।
    2. Add १३० & #181; हर १.५ एमएल ट्यूबों में मशीन बफर के एल और मिश्रण अच्छी तरह से । एनीलिंग करने के लिए मिश्रण विषय: एक गर्मी ब्लॉक में ट्यूब प्लेस (९५ & #176 के लिए पहले से गरम) 10 मिनट के लिए । बिजली बंद करें और नमूनों को कमरे के तापमान को धीरे से ठंडा होने दें । 4 & #176 पर नमूने की मशीन; सी रात भर
  2. मापन तथा विश्लेषण
    1. 1 सेमी का एक पथ लंबाई के साथ एक 8-spectrophotometer हम का उपयोग कर २६० एनएम पर अवशोषक को मापने के लिए एक यूवी विज़ cuvette का उपयोग करें । नमूनों को मापने & #39; absorbances से तापमान में 15 से वृद्धि to ९५ & #176; c, ९५ से तापमान में कमी के बाद 15 & #176; ग में रैंप दर पर ०.५ & #176; c/min.
    2. Transfer १३० & #181; नमूने के एल में से प्रत्येक में अच्छी तरह से, सुनिश्चित करें कि एक अच्छी तरह से मशीन बफर शामिल कर रही है । माप प्रारंभ करें । आवश्यकतानुसार दोहराएं ।
    3. एकता को सामान्यीकृत उच्च तापमान पढ़ने के साथ अवशोषक मूल्यों को सामान्य, और तापमान के खिलाफ सामान्यीकृत अवशोषित पढ़ने की साजिश (& #176; C). पहले curves के व्युत्पंन प्लॉट । एक गाऊसी समारोह के लिए पहली व्युत्पंन curves फिटिंग द्वारा पिघलने तापमान प्राप्त करें ।

Representative Results

रिवर्स-फेज HPLC ॄणा oligomers की शुद्धि की अनुमति देता है । हम HPLC शुद्धि (चित्रा 3) के दो फेरे के साथ शुद्ध ॄणा oligomers प्राप्त कर सकते हैं । PNAs की पहचान मालदी-तोफ एनालिसिस (figure 4) द्वारा पुष्टि की जा सकती है ।

गैर denaturing पृष्ठ ॄणा oligomers के बंधन समानताएं और विशिष्टताओं निस्र्पक के लिए एक आसान और जानकारीपूर्ण तकनीक है । हम आमतौर पर एक आधार जोड़ी उत्परिवर्तनों के साथ एकाधिक आरएनए hairpins या डुप्लेक्स का उपयोग करने के लिए बाध्यकारी गुणों की विशेषताएं (चित्र 5) । आरेख 5 में दिखाया गया गैर-denaturing पृष्ठ डेटा स्पष्ट रूप से सुझाता है कि Q-और L-संशोधित ॄणा एक dsRNA क्षेत्र को C-G pair (figure 5Bके साथ पहचान सकता है, नीचे पैनल) लेकिन एक सी-जी जोड़ी के बिना एक नहीं (चित्रा 5बी, शीर्ष पैनल) । इस विशिष्ट और बढ़ाया मांयता टी के माध्यम से है · अ-य U, L · छ-ग, व Q · प-छ ॄणा · आरएनए2 बेस ट्रिपल (चित्रा 1ए, सी, डी) गठन । एकल या एकाधिक उत्परिवर्तनों के साथ विभिंन PNAs भी एक संशोधित ॄणा के सुधार बाध्यकारी गुणों को प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हमें पता चला है कि जोड़ने 2 मिमी मिलीग्राम2 + में मशीन बफर बाध्यकारी महत्वपूर्ण31को प्रभावित नहीं करता है.

हम 2 द्वारा प्रदर्शन किया है-aminopurine प्रतिदीप्ति अनुमापन कि एक क्ष और एल संशोधित ॄणा एक लक्षित dsRNA क्षेत्र में बांध (चित्रा 6ए, 6C, 6D) लेकिन नहीं ssRNA (चित्रा 6बी, 6E, 6F) । ०.८ ± ०.१ µ एम के एक Kd मान के साथ 2-aminopurine-लेबल्ड dsRNA को ॄणा p बाइंड कर देता है । 2-aminopurine-लेबल ssRNA के लिए ३७० एनएम पर प्रतिदीप्ति तीव्रता विविध पी 3 एकाग्रता के साथ अपेक्षाकृत स्थिर रहता है, ssRNA के लिए ॄणा p के बंधन की कमी का संकेत है ।

Q अवशेषों से युक्त PNAs (P2 और पी 3) कोई थर्मल पिघलने संक्रमण (चित्रा 7) दिखाने के लिए, ssRNA के लिए कोई बंधन का सुझाव. ऐसा क्यू-जी पेयर की तरह वॉटसन-क्रिकेटरों में मौजूद steric क्लैश के कारण हो रहा है । संशोधित ॄणा P1, PNAs पी 4 और संशोधित एल अवशेषों युक्त P5 की तुलना में, लेकिन कोई क्ष अवशेषों, दिखाने के लिए इसी आरएनए-ॄणा steric में उपस्थित संघर्ष के कारण के लिए पिघलने तापमान में कमी आई वाटसन-जी जोड़ी की तरह क्रिकेटरों । यूवी-अवशोषक का पता लगाया थर्मल पिघलने डेटा 2-aminopurine प्रतिदीप्ति अनुमापन डेटा के साथ संगत कर रहे हैं, जो भी पता चलता है कि एक क्ष और एल अवशेषों युक्त ॄणा ssRNA appreciably (चित्रा 6बी, 6E, 6F) को बांध नहीं है । एक क्ष आधार को शामिल एक एल आधार से अधिक स्थिर है, के रूप में एक q आधार एक वाटसन के गठन में एक अधिक महत्वपूर्ण steric टकराव है क्रिकेटरों-q-g जोड़ी (चित्रा 1एफ) की तुलना में एक वाटसन-क्रिकेटरों की तरह एल-जी जोड़ी (चित्रा 1E ).

Figure 1
चित्र 1 : स्थिर बेस ट्रिपल और अस्थिर आधार जोड़ी संरचनाओं के रासायनिक संरचनाओं । (A-D) प्रमुख-नाली ॄणा · आरएनए2 बेस ट्रिपल ऑफ टी · क-भ (क), ग+· जी सी (ख), L · छ-ग (ग), और Q · C-G (D) । (E, F) L-g (E) और Q-g (F) के ॄणा-आरएनए आधार जोड़े की तरह अस्थिर वाट्सन-क्रिकेटरों । पत्र आर आरएनए के चीनी फॉस्फेट रीढ़ का प्रतिनिधित्व करता है । हाइड्रोजन बांड काले डैश्ड लाइनों द्वारा संकेत कर रहे हैं । यह आंकड़ा संदर्भ31से reproduced है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : ॄणा मोनोमर की रासायनिक संरचनाओं । चार ॄणा मोनोमर (टी, सी, एल, और क्यू) दिखाए जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : एक ॄणा oligomer और आरपी-HPLC द्वारा शुद्धि की रासायनिक संरचना । (क) ॄणा अनुक्रम पी पी के रासायनिक संरचना । (B, C) आरपी-क्रूड ॄणा p (B) के HPLC डेटा और पुन: शुद्ध ॄणा पी पी (सी) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : मालदी-प्रशुद्ध ॄणा पी पी पी की तोफ स्पेक्ट्रम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : आरएनए कांटा और ॄणा अनुक्रम और गैर-denaturing पृष्ठ द्वारा बाध्यकारी लक्षण वर्णन। (A) आरएनए hairpins (rHP1 and rHP2), ॄणा p, and A ॄणा · आरएनए 2 ट्रिपलेक्स ॄणा पी3 और rHP2 के बीच गठित । (B) गैर-denaturing पृष्ठ (12%) rHP1 और rHP2 बाइंडिंग के लिए परिणाम ॄणा पी 3 के लिए । इस मशीन बफर २०० mm NaCl, ०.५ mm EDTA, 20 mm HEPES, पीएच ७.५ है । लोडेड आरएनए hairpins (rHP1 और rHP2) २० µ एल में १ µ मीटर पर हैं. बाएं से दाएं गलियों में ॄणा सांद्रता है 0, ०.२, ०.४, 1, १.६, 2, 4, 10, 16, 20, 28, और ५० µ m. ॄणा पी 3 rHP1 (ऊपर पैनल) को बांध नहीं है, लेकिन rHP2 को बांध (नीचे पैनल) । (C) Kd rHP2 के लिए p बाइंडिंग के लिए निर्धारण । ट्रिपलेक्स गठन (वाई) के अंश ॄणा एकाग्रता के खिलाफ साजिश रची गई थी । यह आंकड़ा31संदर्भ से अनुकूलित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6 : प्रतिदीप्ति अनुमापन अध्ययन के ॄणा p बाइंडिंगते २-aminopurine-त्यसपछि RNAs । 2-aminopurine अवशेषों को आरएनए अनुक्रम में ' 2 ' के रूप में नामित किया गया है । इस मशीन बफर २०० mm NaCl, ०.५ mm EDTA, 20 mm HEPES, पीएच ७.५ है । (क) एक ॄणा · आरएनए2 ट्रिपलेक्स और एक 2-aminopurine-लेबल dsRNA (dsRNA2-2AP) के बीच गठित । (B) एक काल्पनिक ॄणा-आरएनए डुप्लेक्स p और A 2-aminopurine-लेबल्ड ssRNA (ssRNA2-2AP) के बीच बनाया गया । (ग, ङ) 2-aminopurine-लेबल आरएनए डुप्लेक्स (1 µ m) और ssRNA (1 µ m) के लिए प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रा, क्रमशः पीएच ७.५ पर विविध पी 3 एकाग्रता के साथ । लगभग ४७५ एनएम पर पीक ॄणा में एल बेस के कमजोर प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के कारण है । (घ, च) कश्मीर 2-aminopurine प्रतिदीप्ति तीव्रता (आरएनए द्वैध और ssRNA के ३७० एनएम) के भूखंडों के आधार पर, क्रमशः ॄणा पी 3 एकाग्रता बनाम निर्धारण । यह आंकड़ा31संदर्भ से अनुकूलित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 : आरएनए-ॄणा डुप्लेक्स के लिए थर्मल पिघलने के परिणाम । इस मशीन बफर २०० mm NaCl, ०.५ mm EDTA, 20 mm2PO4, ७.५ पीएच है । सभी नमूनों में १३० µ एल में एकल-कतरा आरएनए (ssRNA1) और ॄणा के 5 µ एम होते हैं । (क) एकल कतरा आरएनए (ssRNA1), PNAs (P1, P2, पी 4, और P5) और एक काल्पनिक ॄणा-आरएनए द्वैध एक समानांतर अभिविन्यास में ॄणा पी सी और ssRNA1 के बीच का गठन. Q-g और L-g जोड़े की तरह वाट्सन-क्रिकेटरों के लिए steric क्लैश दर्शाया गया है । (ख) ssRNA1 के लिए अलग PNAs बंधन के लिए पिघलने घटता । पिघलने तापमान पिघलने संक्रमण के साथ घटता के लिए दिखाए जाते हैं । यह आंकड़ा31संदर्भ से अनुकूलित है ।

Discussion

आरएनए डुप्लेक्स-बाइंडिंग ॄणा oligomers (उदा., 10-mers) मध्यम आकार के अणुओं वाले हैं और इस प्रकार एक तुलनीय या थोड़ा बड़ा आकार (उदा., ५०-मेर या छोटे) के साथ RNAs के बंधन पर electrophoretic गतिशीलता पारी दिखा सकते हैं । एक आरएनए ॄणा से काफी बड़ा है, तो अनुमापन में ॄणा के एक सीमित जेल गतिशीलता बदलाव के कारण काम नहीं हो सकता है । इस प्रकार, बड़ी आरएनए गैर denaturing पृष्ठ परख के लिए काट दिया जा सकता है । एक fluorophore-लेबल ॄणा में एक बड़ी आरएनए के अनुमापन जेल४०के बीच में लोड नमूना के साथ एक गैर denaturing agarose जेल द्वारा ट्रिपलेक्स गठन की निगरानी के लिए अनुमति देता है ।

आरएनए की एक निरंतर कुल एकाग्रता के साथ गैर-denaturing पृष्ठ द्वारा एक अनुमापन प्रयोग के लिए, हम आम तौर पर ethidium ब्रोमाइड द्वारा मुक्त आरएनए और ट्रिपलेक्स बैंड के दाग कुशल पद के लिए 1 µ एम के एक unलेबलित आरएनए एकाग्रता का उपयोग करें । ०.२ µ मीटर कम के रूप में एक आरएनए एकाग्रता भी आरएनए का निर्माण के आधार पर पर्याप्त हो सकता है31. अनलेबल्ड आरएनए की एकाग्रता (०.२ µ m) निर्धारित करती है कि Kd मान जो सही तरीके से मापा जा सकता है, लगभग ०.२ µ m या बड़ा होना चाहिए । अंय धुंधला रंजक धुंधला दक्षता बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, हमारे अप्रकाशित डेटा का सुझाव है कि Cy3 डाई-लेबल RNAs गैर-denaturing पृष्ठ प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है तंग बाध्यकारी घटनाओं को मापने के लिए ।

तथ्य यह है कि 2-aminopurine केवल मामूली फ्लोरोसेंट है के कारण, 2-aminopurine प्रतिदीप्ति अनुमापन भी ०.२ µ m 31के लिए करीब या ऊपर के पास केd मान के साथ बाइंडिंग की माप तक ही सीमित है । आरएनए या ॄणा प्रतिदीप्ति अनुमापन के माध्यम से समाधान में एक अपेक्षाकृत तंग बंधन को बढ़ाता है के लिए एक अपेक्षाकृत उज्ज्वल डाई के साथ लेबल किया जा सकता है, अगर प्रतिदीप्ति संकेतों में परिवर्तन में बाध्यकारी परिणाम५३,५४, ५५.

dsRNA-binding PNAs द्वारा आरएनए संरचनाओं को लक्षित करने की रणनीति RNAs की एक सीमित संख्या के लिए परीक्षण किया गया है । यह संभव है कि बाइंडिंग गुण भिन्न अनुक्रम और आधार युग्म रचनाओं के साथ dsRNAs के लिए भिन्न हो सकते हैं । एक हमेशा TFPNAs के डिजाइन के लिए एक द्वैध के प्यूरिन अमीर किनारा चुन सकते हैं । यह महत्वपूर्ण है समझने के लिए कैसे लगातार क्यू · C-G ट्रिपल एक ट्रिपलेक्स की स्थिरता को प्रभावित कर सकता है । अधिक व्यापक अनुक्रम-निर्भर अध्ययन स्पष्ट रूप से TFPNAs के अनुक्रम पर निर्भर बाध्यकारी गुणों को समझने की जरूरत है ।

TFPNAs के बंधन संबध और आगे की लंबाई में वृद्धि से बढ़ाया जा सकता है और/या आगे कुर्सियां और रीढ़ की५६,TFPNAs के५७ संशोधित । हालांकि, एक निरंतर डुप्लेक्स क्षेत्र अक्सर गैर-वाट्सन-क्रिकेटरों संरचनाओं द्वारा व्यवधान के बिना 10 से अधिक लगातार आधार जोड़े से मिलकर हो सकता है नहीं है । dsRNA क्षेत्रों से सटे गैर-वाट्सन-क्रिकेटरों संरचनाओं की मांयता के लिए एक छोटे अणुओं के साथ TFPNAs संयुग्म हो सकता है । सिद्धांत रूप में, एक TFPNA-छोटे अणु संयुग्म एक TFPNA या छोटे अणु अकेले की तुलना में बढ़ाया बंधन संबध और विशिष्टता की उंमीद है । हालांकि, विकार५८,५९,६०,६१,६२,६३,६४ के लिए लिंकर के रासायनिक और भौतिक गुण अनुकूलित किया जाना चाहिए ।

तथ्य यह है कि TFPNAs चुनिंदा ssRNAs पर dsRNAs के लिए बाध्य कर सकते है और dsDNAs पता चलता है कि यह आरएनए संरचनात्मक गतिशीलता और साथ बातचीत के विनियमन के माध्यम से बहुत उपयोगी रासायनिक जांच और संभावित चिकित्सीय TFPNAs के रूप में लाइगैंडों विकसित करने के लिए संभव है प्रोटीन्स आणि चयापचयों. सेलुलर TFPNAs के साथ विकार के माध्यम से सुविधा हो सकती है सेल-मर्मज्ञ moieties जैसे छोटे अणुओं, पेप्टाइड्स, और नैनोकणों, या अणुकणिका संरचनाओं के साथ रंग जैसे liposomes5,6 ,12,17,25,31,४१,६५,६६. इसके अलावा fluorophores और radioisotopes जैसे functionalization इमेजिंग टैग के साथ TFPNAs का पता लगाने, इमेजिंग, और रहने वाले जीवों में कार्यात्मक आरएनए संरचनाओं के लक्ष्यीकरण की सुविधा हो सकती है ।

Disclosures

यहां रिपोर्ट किए गए कार्य के आधार पर एक पेटेंट आवेदन (पैट/179/14/15/पीसीटी) दर्ज किया गया है ।

Acknowledgments

इस काम के लिए सिंगापुर शिक्षा मंत्रालय (मो) टियर 1 (RGT3/13 और RG42/15 से k.p.) और मो टीयर 2 (MOE2013-टी-2-024 और MOE2015-टी 1-028 k.p. करने के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Molecular sieves, 4A, 1-2 mm diameter pellets  Alfa Aesar 87956
4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHAŸHCl) Sigma-Aldrich 532444
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) Alfa Aesar A11801
(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP) Alfa Aesar B25251
Acetic anhyride Sigma-Aldrich 320102
Kaiser Test Kit  Sigma-Aldrich 60017
Trifluoroacetic acid (TFA) Alfa Aesar L06374
Unmodified PNA monomers ASM Research Chemicals GmbH 5004007, 5004008, 5004009, 5004010
Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH Sigma-Aldrich B8389 / 47624
Thioanisole Alfa Aesar A14846
1,2-Ethanedithiol Alfa Aesar L12865
Trifluoromethanesulfonic acid Alfa Aesar A10173
LiChrosper® 100 RP-18 endcapped (5 µm) LiChroCART® 250-4 Merck Millipore 150838
RNA Oligos  Sigma-Aldrich Customized 
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) Sigma-Aldrich 39468
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Alfa Aesar J15694
HEPES  Lonza 17-737E
Acrylamide Sigma-Aldrich A8887
N.N'-methylenebisacrylamide Sigma-Aldrich  146072
Ammonium persulfate (APS) Bio-rad 161-0700
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-rad 161-0800
10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3 1st Base BUF-3010-10X1L
Glycerol  Promega  H5433
Ethidium bromide (10 mg/mL) Bio-rad  161-0433
High Precision Cell (Quartz Suprasil, 200-2500 nm) Hellma Analytics  105.250-QS

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आनुवंशिकी मुद्दा १२७ ॄणा ट्रिपलेक्स आरएनए संरचना आरएनए द्वैध आरएनए-बंधन लाइगैंडों ठोस चरण पेप्टाइड संश्लेषण गैर denaturing पृष्ठ 2-Aminopurine यूवी थर्मल पिघलने आणविक मान्यता बंधन संबध प्रमुख नाली
अनुक्रम-विशिष्ट और चयनात्मक पहचान डबल-असहाय RNAs पर एकल-असहाय RNAs द्वारा रासायनिक संशोधित पेप्टाइड न्यूक्लिक एसिड
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