Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Sekvens-spesifikke og selektiv anerkjennelse av Double-strandet RNAs over Single-strandet RNAs av kjemisk endret peptid nukleinsyrer

Published: September 21, 2017 doi: 10.3791/56221
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Division of Chemistry and Biological Chemistry, School of Physical and Mathematical Sciences, Nanyang Technological University
* These authors contributed equally

Summary

Vi rapporterer protokollene for syntese og rensing av peptid Nucleic Acid (PNA) oligomers omfatter endret rester. Biokjemiske og Biofysiske metodene for karakterisering av anerkjennelse av RNA duplexes av de endrede PNAs er beskrevet.

Abstract

RNAs dukker opp som viktige biomarkers og terapeutiske mål. Dermed er det stort potensial i å utvikle kjemiske sonder og terapeutiske ligander for anerkjennelse av RNA sekvens og struktur. Kjemisk endret peptid Nucleic Acid (PNA) oligomers er nylig utviklet som kan gjenkjenne RNA duplexes på sekvens-spesifikk måte. PNAs er kjemisk stabil med en nøytral peptid som ryggrad. PNAs kan syntetiseres relativt lett av manuell Boc-kjemi solid-fase peptid syntese metoden. PNAs blir renset ved omvendt-fase HPLC, etterfulgt av molekylvekt karakterisering av matrix-assistert laser desorpsjon/ionisering-tiden for flygningen (MALDI-TOF). Non-denaturing polyakrylamid gel geleelektroforese (side) teknikk forenkler avbilding av triplex dannelsen, fordi nøye utformet gratis RNA dobbeltsidig konstruerer og PNA bundet etasjer ofte viser forskjellige overføring priser. Non-denaturing side med ethidium bromide innlegget flekker er ofte en lett og informativ teknikk for å karakterisere bindende slektskap og særegenheter av PNA oligomers. Vanligvis kan flere RNA hårnåler eller duplexes enkelt base par mutasjoner brukes til å beskrive PNA bindende egenskaper, for eksempel bindende slektskap og særegenheter. 2-Aminopurine er en isomer av adenine (6-aminopurine); 2-aminopurine fluorescens intensiteten er følsom for lokale strukturelle endringer, og er egnet for overvåking av triplex dannelse med 2-aminopurine rester innlemmet i nærheten av PNA binding området. 2-Aminopurine fluorescens titrering kan også brukes til å bekrefte binding selektivitet av endrede PNAs mot målrettet double-strandet RNAs (dsRNAs) over single-strandet RNAs (ssRNAs). UV-absorbansen-oppdaget termisk smeltende eksperimenter tillate måling av termisk stabilitet av PNA-RNA duplexes og PNA· RNA2 etasjer. Her beskriver vi syntese og rensing av PNA oligomers omfatter endret rester og beskrive biokjemiske og Biofysiske metoder for kategorisering av anerkjennelse av RNA duplexes av de endrede PNAs.

Introduction

RNAs dukker opp som viktige biomarkers og terapeutiske mål, på grunn av den siste utviklingen i funn av de RNAs roller i regulering og katalyse ulike biologiske prosesser1,2,3. Tradisjonelt har antisense tråder blitt brukt til å binde til ssRNAs til Watson-Crick dobbeltsidig formasjon3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. nylig tripleks-forming peptid nucleic syrer (TFPNAs) er utformet for å binde til dsRNAs via Hoogsteen hydrogen bånd (figur 1)3,28,29. dsRNA områder finnes i fleste tradisjonelle antisense-målrettet RNAs, inkludert pre-mRNAs, mRNAs, pre eller pri-miRNAs3og mange andre ikke-koding RNAs1,26,27. Målretting dsRNAs gjennom trippel helix dannelsen ved hjelp av TFPNAs kan være en fordel på grunn av sin struktur spesifisitet og er stort potensial for bruk i å gjenopprette normal funksjonene av RNAs, som er dysregulated i sykdommer, for eksempel.

Den nylig publiserte arbeider av Rozners et al., og oss3,28,29,30,31,32,33, 34,35,36,37,38,39,40,41, rapporterte innsatsen på å forbedre selektiv binding av modifisert TFPNAs mot dsRNAs med forbedret affinitet. Vi har utviklet syntese metoder for rasjonelt designet PNA monomerer (figur 2), inkludert deg selv thio-pseudoisocytosine (L) monomer30 og guanidine endret 5-methyl cytosine (Q) monomer31. Gjennom ulike biokjemiske og Biofysiske karakterisering metoder, har vi vist at relativt kort PNAs (6-10 rester) omfatter L og Q rester vise økt anerkjennelse av Watson-Crick G-C og C-G base parene, henholdsvis i dsRNAs. Videre viser sammenlignet med uforandret PNAs, PNAs inneholder L og Q rester mer selektiv binding mot dsRNA ssRNA og dsDNA. Guanidine funksjonalitet42 i Q-base gir PNAs inn HeLa celler31.

I vårt laboratorium, vi syntetisere PNAs ved manuell Boc-kjemi (Boc eller t- Boc står for tert-butyloxycarbony (se figur 2) solid-fase peptid syntese metode4. Syntese av PNA monomer med Boc som Amin beskytte gruppen er praktisk som gruppen Boc er sterically mindre klumpete i forhold til fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) Amin beskytte group, som kan være fordelaktig under PNA monomer kobling den solid støtte. Gruppen Boc er syre-labilt og kan lett fjernes med solid støtte av 20-50% trifluoroacetic syre (TFA) i diklormetan (DCM) under PNA syntese. En automatisert peptid synthesizer kan benyttes til å syntetisere PNA oligomers; 3-5-fold overskudd av PNA monomer er imidlertid nødvendig for en automatisert peptid synthesizer. Manuell syntesen krever betydelig mindre PNA monomer (2-3-fold overkant), med hver kobling lett overvåkes ved Kaiser test43. Videre er mange automatisert synthesizer ikke kompatible med Boc strategi syntese skyldes bruk av etsende TFA i Boc fjerning trinn.

PNA-oligomers kan renses omvendt-fase høyytelses flytende kromatografi (RP-HPLC) etterfulgt av molekylvekt karakterisering av MALDI-TOF (tall 3 og 4)30, 31. vi bruker ikke-denaturing side å overvåke triplex formasjon, skyldes det faktum at gratis RNA dupleks konstruerer og PNA bundet etasjer ofte vise forskjellige overføring priser (figur 5)30,31 . Ingen merking er nødvendig hvis effektiv etter farging kan oppnås både RNA dupleks og PNA· RNA2 triplex band. En relativt liten mengde utvalg er nødvendig for ikke-denaturing siden eksperimenter. Men lasting (inkubasjon) bufferne og kjører bufferne (pH 8.3) kan ikke være det samme, som resulterer i målingene blir begrenset til kinetically stabil etasjer, fordi en relativt høy pH av 8.3 kan betydelig destabilisere et tripleks.

2-Aminopurine er en isomer av adenine (6-aminopurine); 2-aminopurine fluorescens intensiteten (med et utslipp peak på rundt 370 nm) er følsom for lokale strukturelle endringer, og er egnet for overvåking av triplex formasjon med 2-aminopurine rester innlemmet i nærheten PNA bindende område ( Figur 6) 31. i motsetning til mange andre fargestoffer som viser fluorescens utslipp i det synlige området, 2-aminopurine-merket RNA kan bli utsatt for vanlig lys uten bilde bleking. I motsetning til siden eksperiment der en kjører buffer av pH 8.3 er ofte nødvendig, 2-aminopurine basert fluorescens titrering kan måling av binding i en løsning på en angitt pH, og dermed kan tillate måling og påvisning av relativt svake og Kinetically ustabil bindende på likevekt.

UV-absorbansen-oppdaget termisk smeltende eksperimenter tillate måling av termisk stabilitet duplexes (figur 7)31 og tripleksisett30,32,44,45. Avhengig av lengden og rekkefølgen sammensetningen, smelting av etasjer kan eller kan ikke vise en klar overgang. Termodynamisk parametere kan oppnås hvis oppvarming og kjøling kurvene overlapper. Nøyaktig termodynamisk parametere kan fås ved isotermiske titrering calorimetry (ITC)32; men er relativt store mengder prøver vanligvis nødvendig for ITC.

Protocol

1. manuell Solid-fase peptid syntese av PNAs bruker Boc kjemi

Merk: For suksess og brukervennlighet ønsket PNA oligomer syntese, alle løsemidler og Rea bør være vannfri. Legge til de aktuelle molekylær sikter (4A, 1-2 mm diameter pellets) og noen ganger tømme tørr nitrogen gass i flasker. For syntese av endrede PNA monomerer, kan rapporterte protokoller i respektive referanser 30 , 31 brukes. Uforandret PNA monomerer kan kjøpes fra kommersielle kilder. I hvert av trinnene vask, riktig mengde løsemiddel legges til harpiks, danner en slurry, før den er tømt av

  1. Lasting av den første monomer og capping de overskytende gratis primære aminer på harpiks
    1. veier 30 mg av 4-methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHA·HCl) polystyren harpiks (kommersielt tilgjengelig; lasting verdien 0,7-1.4 mmol/g; 100-200 mesh størrelsen), og overføre til en 5 mL solid fase peptid reaksjon fartøyet utstyrt med en stopcock og glass stopperen.
    2. Suge harpiks i en passende mengde DCM 1t, slik at skal svelle og utsette aminer (HCl salt).
      Merk: Harpiks perler bør alltid fullt dyppes i løsemidler i syntesen.
    3. Renne av DCM ved å bruke en mild flyt av tørr nitrogen gass over toppen av flasken. Legge 1 mL av 50% (v/v) N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) i DCM og la den i 15 min. Dette nøytraliserer HCl salt knyttet til de gratis aminer på harpiks.
    4. Gjenta trinn 1.1.3. I mellomtiden, 6 µmol av monomer og 6 µmol av (benzotriazol-1-yl-oxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP), og overføre til en 1,5 mL tube. Legge til 200 µL av vannistedenfor (DMF) og 12 µmol av DIPEA. Vortex kobling løsningen for 3-5 min.
      Merk: Ønsket lasting feltverdi er 0,2 mmol/g. Den første monomer lagt er monomer på C-terminalen av ønsket PNA sekvensen. Lasting verdien av den første aminosyren kan beregnes med pikrinsyre metoden 46.
    5. Renne av DIPEA fra DCM løsning. Vask harpiks med DCM (x 3), etterfulgt av DMF (x 3), og Lukk stopcock. Legg forberedt kobling løsningen til harpiks og riste forsiktig. Skyv harpiks langs indre veggene i fartøyet inn kopling løsningen med bruk av en ren rustfritt stål slikkepott. Knytte glass stopperen og sikre fartøyet i en inkubator shaker for 3t på 40 ° C.
      Merk: Alternativt reaksjonen fartøyet kan holdt jevn ved romtemperatur for 6-8 h å tillate fullføring av peptid kopling reaksjon.
    6. Forberede lokkpåsettingsmaskiner løsningen ved å blande 240 µmol av eddiksyre og 360 µmol av DIPEA i 200 µL av DCM. Renne av kobling løsningen og vask harpiks DMF (x 3) og DCM (x 3). Legg i lokkpåsettingsmaskiner løsningen og la fartøyet for 30 min, noen ganger risting fartøyet forsiktig. Capping masker overflødig gratis primære Amin gruppene i harpiks ved acetylation.
    7. Gjenta trinn 1.1.6. Avløp lokkpåsettingsmaskiner løsningen og vaske harpiks med DCM (x 3).
    8. Fjern en liten aliquot av harpiks perler med en tynn kapillær slange, og plassere dem i en 1,5 mL små hetteglass. Utføre Kaiser test 43. Legge til 15 µL av Kaiser test løsninger i glasset medisinglass og varme ved hjelp av en varmepistol. Observere fargen på perlene etter oppvarming. Fargen på perlene bør forbli uendret, indikerer mangel på gratis Amin grupper på harpiks.
      Merk: Kaiser test kit er kommersielt tilgjengelig eller kan tilberedes rapporterte protokollen. Løsning A: ninhydrin i etanol; løsning B: fenol i etanol; løsning C: kalium cyanid (KCN) i pyridine.
      FORSIKTIG: KCN er svært giftig; riktig verneklær bør brukes og oppvarming skal utføres i godt ventilert avtrekksvifte, i fravær av brannfarlige løsemidler eller reagenser.
    9. Gjenta trinn 1.1.6 Hvis harpiks perlene viser blå eller svakt blått.
  2. Fjerning av N-terminal Amin beskytte gruppe
    1. avløp løsemidlene fra reaksjonen fartøyet og legge til en løsning av 50% (v/v) av trifluoroacetic syre (TFA) i DCM, sikre at harpiks helt senkes. La fartøyet i 15 min, noen ganger risting for å lette deprotection Amin gruppene. Gjenta 2 flere sykluser.
      FORSIKTIG: TFA er svært etsende. Riktig verneklær bør brukes ved håndtering.
    2. Vask harpiks DCM (x 3), DMF (x 3) og DCM (x 3). Legge til en løsning på 5% DIPEA i DCM. La fartøyet i 15 min. Dette trinnet aktiverer de gratis aminer ved å nøytralisere TFA counter anioner. Gjenta igjen.
    3. Skylle ut DIPEA fra DCM løsning. Vask harpiks med DCM (x 3). Utføre Kaiser testen (trinn 1.1.8).
      Merk: Vellykket deprotection Amin gruppene vil gi blå misfarging av perler. Når deprotection er vellykket, etterfølgende koblingen av monomerer av peptid kobling kan utføres.
  3. Kobling av påfølgende monomerer
    1. veie 18 µmol av ønsket monomer (for Boc-PNA-Q-OH monomer, 13,2 mg monomer veies) og 18 µmol i PyBOP i en 1,5 mL tube. Legge til 200 µL av DMF og 36 µmol av DIPEA inn i 1,5 mL røret. Vortex til alle solid forbindelser er oppløst.
    2. Vask harpiks med DMF (x 3). Legg til kobling løsningen i reaksjonen fartøyet og riste forsiktig. Skyv harpiks langs indre veggene i fartøyet inn kopling løsningen med bruk av en ren rustfritt stål slikkepott. Knytte glass stopperen og sikre fartøyet i en inkubator shaker for 3t på 40 ° C.
    3. Renne av kopling løsning og vask harpiks DMF (x 3) og DCM (x 3). Utfør trinn 1.1.8. Hvis fargen på perlene forblir uendret, gjentar du trinn 1.2.1-1.3.3 til den ønskede PNA sekvensen fullføres. Hvis blå misfarging av perler er observert etter koblingen av en monomer, gjentar du trinn 1.3.1-1.3.3. Hvis misfarging vedvarer, utføre capping igjen (trinn 1.1.6).
      Merk: Utvidet kopling tid (3-12 h) og/eller bruk av overflødig tilsvarer monomer og kopling reagenser anbefales hvis det oppstår problemer med koblingen.
    4. Når ønsket PNA sekvensen er fullført, vask harpiks DMF (x 3) og DCM (x 3). Helt tørr harpiks ved å bruke en kontinuerlig strøm av tørr nitrogen gass i 15 min. Denne tørr harpiks, deles og brukes til å feste lysin eller fluorescerende koder som cyanine 3 (Cy3) og carboxyfluorescein på N-terminus i PNA.
  4. Vedlegg lysin eller fluorescerende tag (Cy3, Cy5, eller carboxyfluorescein) til N-terminus av PNA
    1. veier 10 mg av harpiks, pre-lastet med ønsket PNA sekvensen. Overføre til en 5 mL reaksjonen fartøyet. Suge harpiks i DCM 1 h.
    2. Til å feste lysin, utføre skritt 1.2.1-1.3.3, erstatter monomer med enten Boc-Lys (Z) - OH eller Fmoc-Lys (Boc) - OH.
    3. Til å feste carboxyfluorescein, utføre trinn 1.2.1-1.3.3, med 10 ganger overskudd av 5 (6)-carboxyfluorescein som monomer, og N, N '-diisopropylcarbodiimide (DIPC) og hydroxybenzotriazole (HOBt) som kobling reagenser i DMF. La koblingen reaksjonen over natten i inkubator shaker på 40 ° C.
      Merk: Carboxyfluorescein er følsomt for lys, reaksjonen fartøyet skal være dekket med aluminiumsfolie.
    4. Til å feste Cy3 eller Cy5 fargestoff, etiketten av metoden Klikk kjemi utføre skritt 1.2.1-1.3.3, erstatter monomer med N-Boc-2-propargyl-L-glycine. Dette functionalizes N-terminus i PNA med en alkyne gruppe. Utføre kobber-katalysert Klikk reaksjonen å knytte til azide som inneholder Cy3 eller Cy5 fluorescerende farge 12 , 47 , 48 , 49
  5. PNA cleavage fra solid støtte, rensing, og karakterisering
    Merk: Hvis noen Amin gruppen er beskyttet med Fmoc beskytte gruppen, først deprotect Amin gruppen ved å behandle med 20% piperdine i DMF løsning for 15 min (2 sykluser). Vask harpiks grundig med DMF (x 3) etterfulgt av DCM (x 3). Tørke harpiks ved å bruke en kontinuerlig strøm av tørr nitrogen gass i 15 min.
    1. Overføre 5 mg av tørr harpiks i en liten flaske. Legge til 10 µL av thioanisole og 4 µL av 1,2-ethanedithiol, sikre at harpiksen er neddykket i reagenser. La røret ved romtemperatur for 5 min.
      Merk: Disse reagensene fungere som åtseldyr, som felle reaktive kationisk arter som er dannet under fjerning av beskytte grupper i PNA. Aktuelle renovasjonsarbeider kan velges basert på siden kjeden beskytte grupper.
    2. Legge til 100 µL av TFA inn i røret som inneholder harpiks og åtseldyr. Forsiktig virvle blandingen og emne kort sentrifugering. La røret ved romtemperatur for 10 min.
      FORSIKTIG: TFA er svært etsende. Riktig verneklær bør brukes ved håndtering.
    3. Nøye legge til 20 µL av trifluoromethanesulfonic syre (TFMSA) til røret. Forsiktig agitere reaksjonsblandingen før utsette til kort sentrifugering ved romtemperatur. La røret jevn ved romtemperatur for 2 h.
      FORSIKTIG: TFMSA er svært etsende. Riktig verneklær bør brukes ved håndtering.
    4. Filter av cleavage cocktail i en 5 mL runde bunn kolbe (RBF) med bruk av et glass Pasteur pipette utstyrt med bomull. Bruk en liten mengde TFA vask harpiks.
    5. Tømme tørr nitrogen gassen til det samlet filtratet til alle flyktige løsemidler er fordampet. Legg 1 mL kaldt diethyl Ether til RBF.
      Merk: Diethyl Eter føre PNA å utløse.
      1. Skyll RBF med diethyl Eter flere ganger før du overfører skyet løsningen i en 1,5 mL tube. Underlagt røret sentrifugering at PNA utløse å avgjøre. Dekanter løsemidlene og legge til 300-500 µL autoklaveres vann utløse. Vortex grundig å oppløse PNA.
    6. Rense råolje PNA prøven via RP-HPLC med water-acetonitrile-0.1% TFA som den mobile fasen. Samle tilsvarende fraksjoner, fordampe alle løsemidler ved hjelp av en vakuum konsentrator før re oppløsende renset PNA i autoklaveres vann.
    7. Karakteriserer renset PNA via MALDI-TOF analyse med bruk av α-cyano-4-hydroxycinnamic syre (CHCA) som eksempel krystallisering matrix.
    8. Måle UV absorbansen (260 nm) i PNA på 65 ° C. Beregn konsentrasjonen av PNA med ligningen:
      Equation 1
      Merk: her c er konsentrasjonen, er absorbansen lesing innhentet, ε er utryddelse koeffisient av RNA sekvensen og l er optisk bane cuvette (1 cm). utryddelse koeffisient av PNA sekvensen er summering av utryddelse koeffisient personlige monomerer 50. Utryddelse koeffisientene av adenine, cytosine, guanine og thymine er 15,4, 7.3, 11,7 og 8,8 mL/µmol·cm, henholdsvis. Utryddelse koeffisient L og Q monomerer brukes antas for å være den samme som for cytosine (C) base.

2. Non-denaturing side

  1. utarbeidelse av nødvendige buffer løsninger
    1. forberede inkubasjon buffer (10 mL) ved hjelp 116.88 mg NaCl (200 mM), 50 µL av 100 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) (0,5 mM), 200 µL av 1 M lager HEPES (20 mM), H 9.75 m 2 O; justere buffer pH 7.5.
    2. Forberede 1 x Tris Borate EDTA (TBE) kjører buffer (1 L) med 100 mL 10 x Tris-Borate-EDTA pH 8.3 og 900 mL H 2 O.
    3. Forbered 10% Ammonium persulfate (APS) løsning (300 µL) bruker 30 mg ammonium persulfate, og 300 µL H 2 O.
  2. Utarbeidelse av 12% polyakrylamid gel
    1. Rengjør godt danner kam, støping glassplater, og avstandsstykker med etanol, godt danner kam og avstandsstykker 1 mm tykk. Sette opp samlingen gel og forsegle med gel-tetting tape.
    2. For en polyakrylamid gel 22 cm x 16,5 cm x 1 mm dimensjon, 50 mL av gel løsning er tilstrekkelig. Veie ut 5.7 g av akrylamid og 0,3 g N, N '-methylenebisacrylamide (19:1) og overføring til en 50 mL sentrifuge rør.
      FORSIKTIG: Akrylamid er kreftfremkallende. Unngå å puste inn støv røyk fra akrylamid og sikre at riktig klær er slitt når du håndterer.
    3. Løses solid forbindelser i 50 mL 1 X TBE kjører bufferen ved å plassere sentrifuge røret i et 50 ° C vannbad i 15 minutter eller til alle solid forbindelser har oppløst. Utføre sentrifugering (3000 rpm, 5 min, 25 ° C) for å fjerne alle luftbobler i løsningen. Tillate løsningen avkjøles til romtemperatur.
    4. Legg 250 µL av 10% APS løsning og 50 µL av tetramethylethylenediamine (TEMED) i gel løsningen og bland forsiktig ved hjelp av en slikkepott. Umiddelbart hell løsningen mellom glassplater, pass på ikke å innføre noen luftbobler. Sett inn godt danner kammen og la gel oppsettet ved romtemperatur for minst 60 min tillate polymerisasjon skje, før lagring på 4 ° C til klar til bruk.
  3. Forberedelse av prøver
    1. fjerne nødvendige antallet av RNA hårnål (1 µM) fra viktigste lager i en ren 1,5 mL tube. Tørr RNA løsningen bruker en vakuum konsentrator.
      Merk: Hver prøve inneholder 1 µM av 20 µL inkubasjon buffer. Vanligvis er 13 prøver av RNA forberedt på én side eksperimentere. RNA for alle utvalg kan være forberedt sammen i et enkelt rør.
    2. Fjerne de nødvendige mengder målrettet PNA (med siste konsentrasjonen av opptil 50 µM) fra hovedkomponenten og overføring til separate 1,5 mL rør. Fordampe vannet av PNA løsninger ved hjelp av en vakuum konsentrator.
    3. Legge til 260 µL inkubasjon bufferen i 1,5 mL tube som inneholder tørket RNA og bland grundig for å sikre alle RNA dissolved. Underlagt RNA for å feste kjøling: røret til en varme (forvarmet til 95 ° C) i 5 min. umiddelbart overføre til en isbadet og la stå i 10 min.
    4. Legge til 20 µL av i hver av det 1,5 mL rør som inneholder tørket PNA og bland godt. Utføre annealing: sett røret som inneholder RNA og PNA blanding til en varme (forvarmet til 65 ° C) i 10 min. slå av strømmen av varme blokk og la prøvene kule sakte til romtemperatur. Inkuber prøvene på 4 ° C over natten.
  4. Kjører og behandling av gel
    1. fjerne gel-tetting tape på undersiden av glassplaten. Montere og sikre glassplaten på loddrett gel stativet ved hjelp av plast klemmer.
      Merk: Gel kjører er utført i et kaldt rom på ca 4 ° C. Alle utstyr, prøver og buffere er avkjølt ved 4 ° C før du kjører gel.
    2. Fyll lavere buffer tanken med 1 x TBE kjører buffer til platen er neddykket i ca 1-2 cm kjøre buffer. Fyll øvre buffer tanken med kjøre buffer til nivået av buffer overstiger toppen av gel av 1-2 cm. sakte og forsiktig fjerne godt danner kammen, slik at den kjørende bufferen fylle brønnene.
    3. Koble gel standen til en strømforsyning. Pre kjøre gel for minst 30 min med en konstant spenning på 250 V, som er optimalisert for en 22 cm x 16,5 cm x 1 mm gel.
    4. Samtidig legge 4 µL (20% for eksempel volum) av 35% glyserol løsning til hver av prøvene og bland forsiktig. Når før kjøringen er fullført, laste 20 µL av hvert utvalg (inkludert én RNA alene eksempel pluss prøver som inneholder RNA og PNA blanding) nøye inn i bunnen av den godt med brønnene og gel lasting tips, pass på ikke å innføre noen luftbobler. Kjøre gel med en konstant spenning på 250 V, ligner det pre løp for 5 h.
    5. Stopper strømforsyningen etter 5 h og fjerne glassplaten fra stativet. Fjern gjenværende gel-tetting tape og demontere glassplaten. Forsiktig fjerne og fordype gel i en container fylt med 350 mL deionisert vann. Forsiktig legge til 35 µL av ethidium bromide (10 mg/mL) og Plasser beholderen på en plattform shaker (lav hastighet) for 30 min.
      FORSIKTIG: Ethidium bromide er en mutagen. Riktig verneklær bør brukes ved håndtering.
    6. Kast ethidium bromide løsningen i en angitt avfallsbeholderen. Skyll gel med 1.5-2 L destillert vann. Skanne gel bruker en imager (se Tabell for materiale) med en grønn laser av 532 nm og utslipp filtrere sett på 610 nm.
  5. Gel analyse
    1. kvantifisere gel bandet intensiteten benytter en ledig programvare, GelQuant.NET (http://www.biochemlabsolutions.com/GelQuantNET.html). Normalisere bandet intensiteten i henhold til:
      Equation 2
      Merk: her jeg dobbeltsidig max er bandet intensiteten av RNA hårnål alene uten tilsetning av PNA, og jeg triplex max er triplex bandet intensiteten med den høyeste konsentrasjonen av PNA lagt.
      1. Beregner brøkdelen av triplex formasjon ifølge:
        Equation 3
    2. Plot brøkdel av triplex dannelse (Y) mot konsentrasjonen av PNA lagt () ΜM). Gi plass til dataene i formelen hente dissosiasjon konstant (K d):
      Equation 4
      Merk: her R 0 er den RNA hårnål konsentrasjonen (1 µM). Her er Y 0 og B første og maksimal endring av triplex brøkdel, henholdsvis. Y er en brøkdel av tripleks på varierte PNA konsentrasjon. X er den totale PNA konsentrasjonen og K d er dissosiasjon konstant.

3. 2-Aminopurine fluorescens bindende analysen

  1. forberedelse av prøver (med dsRNA)
    1. fjerne det nødvendige antallet av 2-aminopurine (2AP) kalt dsRNA (1 µM for hver tråd) fra viktigste lager i en ren 1,5 mL tube. Fordampe vannet i RNA løsninger ved hjelp av en vakuum konsentrator.
      Merk: Hver prøve inneholder 1 µM av 75 µL inkubasjon buffer. Vanligvis tilberedes 13 prøver av RNA. RNA for alle utvalg kan være forberedt sammen i et enkelt rør.
    2. Fjerne de nødvendige mengder målrettet PNA for ulike konsentrasjoner fra hovedkomponenten og overføring til separate 1,5 mL rør. Fordampe vannet av PNA løsninger ved hjelp av en vakuum konsentrator.
    3. Legge til 975 µL inkubasjon bufferen i 1,5 mL tube som inneholder tørket RNA og bland grundig for å sikre alle RNA er oppløst. Sentrifuge RNA løsningen kort og utsett den for avspenning: sett røret til en varme (forvarmet til 95 ° C) i 10 min. slå av strømmen av varme blokk og la prøvene kule sakte til romtemperatur.
    4. Legge til 75 µL av i hver av det 1,5 mL rør som inneholder tørket PNA og bland godt. La prøvene ved romtemperatur for minst 1 h. Incubate prøvene på 4 ° C over natten.
  2. Forberedelse av prøver (med ssRNA)
    1. fjerne nødvendige antallet av 2AP-merket ssRNA (1 µM) fra viktigste lager i ren 1,5 mL rør. Pakk ut de nødvendige mengder målrettet PNA for ulike konsentrasjoner fra hovedkomponenten og overføring til den respektive 1,5 mL rør som inneholder ssRNA. Tørr RNA og PNA blandingen med en vakuum konsentrator.
    2. Legge til 75 µL av inkubasjon buffer i hver av 1,5 mL rør og bland godt. Underlagt blandingen annealing: sett røret til en varme (forvarmet til 95 ° C) i 10 min. slå av strøm og la prøvene sakte avkjøles til romtemperatur. Inkuber prøvene på 4 ° C over natten.
  3. Måling og analyse
    1. bruker et fluorescens spektrofotometer måle utslippet over en bølgelengde rekke 330-550 nm. Bruke en eksitasjon bølgelengden til 303 nm.
      Merk: Prøvene er målt ved romtemperatur og hvert utvalg måles 3 timene, gjennomsnittlig tas som.
    2. Overføre 70 µL av inkubasjon buffer i 1 cm firkantet cuvette. Starte målingen.
    3. Fjerner bufferen fra cuvette. Skyll cuvette med destillert vann og tømme nitrogen gass tørke. Gjenta for alle prøvene. Trekke buffer målinger fra alle prøvene.
    4. Plot fluorescens intensiteten (a.u.) mot bølgelengde (nm). Registrere fluorescens intensiteten på 370 nm for alle utvalg. Plot fluorescens intensiteten på 370 nm (a.u.) mot tilsvarende konsentrasjonen av PNA lagt (µM).
    5. Gi plass til dataene i formelen fra trinn 2.5.2 hente dissosiasjon konstant (K d): Y = Y 0 + (B / (2R 0)) (R 0 + X + K d-((R 0 + X + K d) 2 -4R 0 X) 1/2), der R 0 er 2AP-merket dsRNA konsentrasjonen (1 µM).
      Merk: Her Y 0 og B er første og maksimal endring av fluorescens intensitet på 370 nm, henholdsvis. Y er fluorescens intensiteten på 370 nm på varierte PNA konsentrasjon. X er den totale PNA konsentrasjonen og K d er dissosiasjon konstant.

4. UV-Absorbance-oppdaget termisk smelter eksperimenter

  1. forberedelse av prøver
    Merk: måle UV absorbansen (260 nm) av RNA 95 ° c (for å sikre RNA sekundære strukturer avbrutt). Beregn konsentrasjonen RNA med ligningen:
    Equation 5
    ​ der c er konsentrasjonen, er absorbansen lesing innhentet, ε er utryddelse koeffisient av RNA sekvensen, og l er optisk bane cuvette (1 cm). Utryddelse koeffisient av RNA beregnes basert på nærmeste nabo modell med MeltWin 51 , 52. Programpakken kan leveres på forespørsel.
    1. Fjerne nødvendige antallet ssRNA (5 µM) fra viktigste lager i ren 1,5 mL rør. Fjerne de nødvendige mengder målrettet PNA (5 µM) fra hovedkomponenten og overføring til den respektive 1,5 mL rør som inneholder ssRNA. Tørr RNA og PNA blandingen med en vakuum konsentrator.
    2. Legge til 130 µL av inkubasjon buffer i hver av 1,5 mL rør og bland godt. Underlagt blandingen annealing: sett røret til en varme (forvarmet til 95 ° C) i 10 min. slå av strøm og la prøvene sakte avkjøles til romtemperatur. Inkuber prøvene på 4 ° C over natten.
  2. Måling og analyse
    1. bruker et UV-Vis spektrofotometer måle absorbansen på 260 nm med en banelengde på 1 cm. et 8-microcell cuvette måle prøvene ' absorbances på økende temperatur 15 95 ° C, etterfulgt av redusere temperaturen fra 95 til 15 ° C med en rampe hastighet på 0,5 ° C/min.
    2. Overføre 130 µL av prøve i hver av brønnen, gjør at den også inneholder inkubasjon bufferen. Starte målingen. Gjenta etter behov.
    3. Normalisere absorbansen verdiene med høy temperatur lesing normalisert Unity og plotte normalisert absorbansen ved avlesning mot temperatur (° C). Tegne inn den første deriverte av kurver. Få de smeltingen temperaturene ved å montere den første avledede kurver til en Gaussisk funksjon.

Representative Results

Omvendt-fase HPLC gjør rensing av PNA oligomers. Vi kan få ren PNA oligomers med to runder av HPLC rensing (Figur 3). Identiteten til PNAs kan bli bekreftet av MALDI-TOF analyse (Figur 4).

Non-denaturing side er en enkel og informativ teknikk for å karakterisere bindende slektskap og særegenheter av PNA oligomers. Vi bruker vanligvis flere RNA hårnåler eller duplexes enkelt base par mutasjoner som karakteriserer bindingsegenskapene (figur 5). Ikke-denaturing siden dataene vist i figur 5 foreslå klart at den Q - og L-endret PNA kan gjenkjenne et dsRNA område med en C-G (figur 5B, nedre panelet) men ikke en uten noen C-G (figur 5B, øverst til panel). Dette bestemte og forbedret anerkjennelse er gjennom T· A-U, L· G-C og Q· C-G PNA· RNA2 base triple (figur 1A, C, D) formasjon. Ulike PNAs ett eller flere mutasjoner kan også brukes til å vise forbedrede Bindingsegenskapene for en modifisert PNA. Vi har vist at å legge 2 mM Mg2 + i inkubasjon bufferen ikke påvirker bindingen betydelig31.

Vi har vist av 2-aminopurine fluorescens titrering som en Q - og L-endret PNA binder til en målrettet dsRNA regionen (figur 6A, 6 C, 6 D), men ikke ssRNA (figur 6B, 6E, 6F). PNA P3 binder til 2-aminopurine-merket dsRNA med Kd verdien 0,8 ± 0,1 µM. Fluorescens intensiteten på 370 nm for 2-aminopurine-merket ssRNA forblir relativt konstant med variert P3 konsentrasjon, som indikerer manglende binding av PNA P3 å ssRNA.

PNAs som inneholder Q rester (P2 og P3) viser ingen termisk smelter overganger (figur 7), foreslår ingen binding til ssRNA. Dette skyldes steric clash stede i Watson-Crick som Q-G par. Sammenlignet med uforandret PNA P1, PNAs P4 og P5 inneholder endret L rester men ingen Q rester, viser redusert smeltingen temperaturer for de tilsvarende RNA-PNA duplexes på grunn av steric clash stede i Watson-Crick som L-G par. UV-absorbansen-oppdaget termisk smeltende dataene er i samsvar med 2-aminopurine fluorescens titrering dataene, som viser at en PNA som inneholder Q og L rester ikke kan bindes til ssRNA merkbart (figur 6B, 6E, 6F). Omfatter en Q base er mer destabiliserende enn en L base, som Q base har en mer betydelig steric sammenstøt i dannelsen av en Watson-Crick som Q-G par (figur 1F) sammenlignet med en Watson-Crick som L-G par (figur 1E ).

Figure 1
Figur 1 : Kjemiske strukturer av stabil base tremannsrom og ustabil base par strukturer. (A-D) Major-groove PNA· RNA2 base tremannsrom av T· A-U (en), C+· G-C (B), L· G-C (C) og Q· C-G (D). (E, F) Ustabil Watson-Crick som PNA-RNA base parene av L-G (E) og Q-G (F). Bokstavene representerer sukker-fosfat ryggraden i RNA. Hydrogenbindinger angis av svart stiplede linjer. Figuren er gjengitt fra referanse31. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Kjemiske strukturer av PNA monomerer. Fire PNA monomerer (T, C, L og Q) vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Kjemisk struktur av PNA oligomer og rensing av RP-HPLC. (A) kjemisk struktur av PNA sekvensen P3. (B, C) RP-HPLC data av råolje PNA P3 (B) og nytt renset PNA P3 (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : MALDI-TOF spekteret av renset PNA P3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : RNA hårnål og PNA sekvenser og bindende karakterisering av ikke-denaturing side. (A) RNA hårnåler (rHP1 og rHP2), PNA P3 og en PNA· RNA2 triplex dannet mellom PNA P3 og rHP2. (B) ikke-denaturing siden (12%) resultater for rHP1 og rHP2 binding til PNA P3. Inkubasjon bufferen er 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7.5. De lastet RNA hårnåler (rHP1 og rHP2) er på 1 µM i 20 µL. De PNA konsentrasjonene i baner fra venstre til høyre er 0, 0,2, 0,4, 1, 1.6, 2, 4, 10, 16, 20, 28 og 50 µM. PNA P3 ikke kan bindes til rHP1 (toppanelet) men binder seg til rHP2 (nedre panelet). (C) Kd besluttsomhet for P3 binding til rHP2. Brøkdel av triplex dannelse (Y) var plottet mot PNA konsentrasjonen. Figuren er tilpasset fra referanse31. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Fluorescens titrering studie av PNA P3 bindendetil 2-aminopurine-merket RNAs. 2-aminopurine rester er utpekt som '2' i RNA sekvensen. Inkubasjon bufferen er 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7.5. (A) en PNA· RNA2 triplex dannet mellom P3 og en 2-aminopurine-merket dsRNA (dsRNA2-2AP). (B) en hypotetisk PNA-RNA dupleks dannet mellom P3 og en 2-aminopurine-merket ssRNA (ssRNA2-2AP). (C, E) Fluorescens utslipp spectra for 2-aminopurine-merket RNA dobbeltsidig (1 µM) og ssRNA (1 µM), henholdsvis variert med P3 konsentrasjon ved pH 7.5. En topp på rundt 475 nm er svak fluorescens utslipp av L base i PNA. (D, F) K d fastsettelse basert på plott av 2-aminopurine fluorescens intensitet (på 370 nm) av RNA dupleks og ssRNA, henholdsvis versus PNA P3 konsentrasjon. Figuren er tilpasset fra referanse31. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7 : Thermal smelter resultater for RNA-PNA duplexes. Inkubasjon bufferen er 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM NaH2PO4, pH 7.5. Alle prøver inneholder 5 µM single-strandet RNA (ssRNA1) og PNA i 130 µL. (A) Single-strandet RNA (ssRNA1), PNAs (P1, P2, P3, P4 og P5) og en hypotetisk PNA-RNA tosidig dannet mellom PNA P3 og ssRNA1 i en parallell retning. Steric clash er indisert for Watson-ballen som Q-G og L-G par. (B) smelter kurver for ulike PNAs binding til ssRNA1. De smeltingen temperaturene vises for kurver med smeltende overganger. Figuren er tilpasset fra referanse31.

Discussion

RNA dupleks-bindende PNA oligomers (f.eks, 10-mers) er mellomstore molekyler og dermed kan vise electrophoretic mobilitet Skift ved binding til RNAs med en tilsvarende eller litt større størrelse (f.eks, 50-mer eller mindre). Hvis en RNA er betydelig større enn PNA, fungerer ikke titrering av PNA i RNA på grunn av en begrenset gel mobilitet SKIFT. Dermed kan den store RNA bli avkortet for ikke-denaturing side analyser. Titrering av en stor i en fluorophore-merket PNA lar for overvåking av triplex dannelsen av en ikke-denaturing agarose gel med prøven lastet i gel40.

For en titrering eksperiment av ikke-denaturing siden med en konstant totale konsentrasjonen av RNA bruker vi vanligvis en umerket RNA konsentrasjon på 1 µM til effektiv innlegget farging av gratis RNA og triplex band av ethidium bromide. En RNA konsentrasjon så lavt som 0,2 µM kan også være tilstrekkelig avhengig RNA konstruere31. Konsentrasjonen av den umerkede RNA (0,2 µM) bestemmer at Kd verdiene som kan måles nøyaktig skal om lag 0,2 µM eller større. Andre flekker fargestoffer kan brukes til å forbedre flekker effektiviteten. Alternativt tyder våre upubliserte data på at Cy3 dye-merket RNAs kan brukes i ikke-denaturing siden eksperimenter for å måle stramt bindende hendelsene.

På grunn av at 2-aminopurine er bare moderat fluorescerende, er 2-aminopurine fluorescens titrering også begrenset til måling av bindingen med Kd verdier nær eller over 0,2 µM31. RNA eller PNA kan merkes med en relativt lys fargestoff for kvantifisering av en relativt stramt bindende i løsning gjennom fluorescens titrering, hvis bindingen resulterer i endringer i fluorescens signaler53,54, 55.

Strategien for målretting RNA strukturer av dsRNA-binding PNAs er testet for et begrenset antall RNAs. Det er sannsynlig at bindende egenskaper kan variere for dsRNAs med forskjellige sekvenser og base par komposisjoner. Man kan alltid velge den purine-rik stranden av en tosidig for design av TFPNAs. Det er viktig å forstå hvordan påfølgende Q· C-G tremannsrom kan påvirke stabiliteten av et tripleks. Mer omfattende sekvens-avhengige studier er et klart behov å forstå egenskapene sekvens-avhengige bindende TFPNAs.

Den forpliktende tilhørighet av TFPNAs kan styrkes ytterligere ved å øke lengden og ytterligere modifisering av baser og stamnett56,57 av TFPNAs. Men kan en kontinuerlig dobbeltsidig region ikke ofte består av mer enn 10 sammenhengende base parene uten avbrudd av ikke-Watson-Crick strukturer. En kan bøye TFPNAs med små molekyler for anerkjennelse av ikke-Watson-Crick strukturer tilstøtende til dsRNA områder. I prinsippet forventes en TFPNA-små molekyl konjugert å har forbedret forpliktende tilhørighet og spesifisitet sammenlignet en TFPNA eller små molekyl alene. Men de kjemiske og fysiske egenskapene av linker for den Bøyning58,59,60,61,62,63,64 må være optimalisert.

Det faktum at TFPNAs kan selektivt binde til dsRNAs ssRNAs og dsDNAs antyder at det er mulig å utvikle TFPNAs som svært nyttig kjemiske sonder og potensielle terapeutiske ligander gjennom regulering av RNA strukturelle dynamikk og interaksjon med proteiner og metabolitter. Mobilnettet opptak av TFPNAs kan bli lettere gjennom Bøyning med celle-gjennomtrengende moieties som små molekyler, peptider og nanopartikler eller complexation med supramolecular strukturer som liposomer5,6 ,12,17,25,31,41,65,66. Ytterligere kan functionalization av TFPNAs med bioimaging koder som fluorophores og radioisotopes forenkle deteksjon, imaging og målretting av funksjonelle RNA strukturer i levende organismer.

Disclosures

En patentsøknad (PAT/179/14/15/PCT) basert på arbeidet rapporterte her er inngitt.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Singapore departementet for utdanning (MOE) Tier 1 (RGT3/13 og RG42/15 til G.H.) og MOE Tier 2 (MOE2013-T2-2-024 og MOE2015-T2-1-028 til G.H.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Molecular sieves, 4A, 1-2 mm diameter pellets  Alfa Aesar 87956
4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHAŸHCl) Sigma-Aldrich 532444
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) Alfa Aesar A11801
(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP) Alfa Aesar B25251
Acetic anhyride Sigma-Aldrich 320102
Kaiser Test Kit  Sigma-Aldrich 60017
Trifluoroacetic acid (TFA) Alfa Aesar L06374
Unmodified PNA monomers ASM Research Chemicals GmbH 5004007, 5004008, 5004009, 5004010
Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH Sigma-Aldrich B8389 / 47624
Thioanisole Alfa Aesar A14846
1,2-Ethanedithiol Alfa Aesar L12865
Trifluoromethanesulfonic acid Alfa Aesar A10173
LiChrosper® 100 RP-18 endcapped (5 µm) LiChroCART® 250-4 Merck Millipore 150838
RNA Oligos  Sigma-Aldrich Customized 
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) Sigma-Aldrich 39468
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Alfa Aesar J15694
HEPES  Lonza 17-737E
Acrylamide Sigma-Aldrich A8887
N.N'-methylenebisacrylamide Sigma-Aldrich  146072
Ammonium persulfate (APS) Bio-rad 161-0700
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-rad 161-0800
10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3 1st Base BUF-3010-10X1L
Glycerol  Promega  H5433
Ethidium bromide (10 mg/mL) Bio-rad  161-0433
High Precision Cell (Quartz Suprasil, 200-2500 nm) Hellma Analytics  105.250-QS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cech, T. R., Steitz, J. A. The noncoding RNA revolution-trashing old rules to forge new ones. Cell. 157 (1), 77-94 (2014).
  2. Velagapudi, S. P., Gallo, S. M., Disney, M. D. Sequence-based design of bioactive small molecules that target precursor microRNAs. Nat Chem Biol. 10, 291-297 (2014).
  3. Patil, K. M., Chen, G. Modified Nucleic Acids in Biology and Medicine. Jurga, S., Erdmann, V. A., Barciszewski, J. , Springer International Publishing. 299-317 (2016).
  4. Hyrup, B., Nielsen, P. E. Peptide nucleic acids (PNA): synthesis, properties and potential applications. Bioorg Med Chem. 4 (1), 5-23 (1996).
  5. Shiraishi, T., Nielsen, P. E. Improved cellular uptake of antisense peptide nucleic acids by conjugation to a cell-penetrating peptide and a lipid domain. Methods Mol Biol. 751, 209-221 (2011).
  6. Shiraishi, T., Nielsen, P. E. Nanomolar cellular antisense activity of peptide nucleic acid (PNA) cholic acid ("umbrella") and cholesterol conjugates delivered by cationic lipids. Bioconjugate Chem. 23 (2), 196-202 (2012).
  7. Khoo, B., Roca, X., Chew, S. L., Krainer, A. R. Antisense oligonucleotide-induced alternative splicing of the APOB mRNA generates a novel isoform of APOB. BMC Mol Biol. 8, 3 (2007).
  8. Stein, C. A., et al. Efficient gene silencing by delivery of locked nucleic acid antisense oligonucleotides, unassisted by transfection reagents. Nucleic Acids Res. 38 (1), 3 (2010).
  9. Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nat Rev Drug Discov. 11 (2), 125-140 (2012).
  10. Peacey, E., Rodriguez, L., Liu, Y., Wolfe, M. S. Targeting a pre-mRNA structure with bipartite antisense molecules modulates tau alternative splicing. Nucleic Acids Res. 40 (19), 9836-9849 (2012).
  11. Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3 (1), 1 (2012).
  12. Ma, X., et al. Intracellular delivery of antisense peptide nucleic acid by fluorescent mesoporous silica nanoparticles. Bioconjugate Chem. 25 (8), 1412-1420 (2014).
  13. Wojtkowiak-Szlachcic, A., et al. Short antisense-locked nucleic acids (all-LNAs) correct alternative splicing abnormalities in myotonic dystrophy. Nucleic Acids Res. 43 (6), 3318-3331 (2015).
  14. Lenartowicz, E., et al. Antisense Oligonucleotides Targeting Influenza A Segment 8 Genomic RNA Inhibit Viral Replication. Nucleic Acid Ther. 26 (5), 277-285 (2016).
  15. Avitabile, C., et al. Targeting pre-miRNA by peptide nucleic acids: a new strategy to interfere in the miRNA maturation. Artif DNA PNA XNA. 3 (2), 88-96 (2012).
  16. Barczak, A. K., et al. RNA signatures allow rapid identification of pathogens and antibiotic susceptibilities. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (16), 6217-6222 (2012).
  17. Das, I., et al. A peptide nucleic acid-aminosugar conjugate targeting transactivation response element of HIV-1 RNA genome shows a high bioavailability in human cells and strongly inhibits tat-mediated transactivation of HIV-1 transcription. J Med Chem. 55 (13), 6021-6032 (2012).
  18. Fabani, M. M., et al. Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids. Nucleic Acids Res. 38 (13), 4466-4475 (2010).
  19. Riguet, E., et al. A peptide nucleic acid-neamine conjugate that targets and cleaves HIV-1 TAR RNA inhibits viral replication. J Med Chem. 47 (20), 4806-4809 (2004).
  20. Torres, A. G., et al. Chemical structure requirements and cellular targeting of microRNA-122 by peptide nucleic acids anti-miRs. Nucleic Acids Res. 40 (5), 2152-2167 (2012).
  21. Upadhyay, A., Dixit, U., Manvar, D., Chaturvedi, N., Pandey, V. N. Affinity capture and identification of host cell factors associated with hepatitis C virus (+) strand subgenomic RNA. Mol Cell Proteomics. 12 (6), 1539-1552 (2013).
  22. Wesolowski, D., et al. Basic peptide-morpholino oligomer conjugate that is very effective in killing bacteria by gene-specific and nonspecific modes. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (40), 16582-16587 (2011).
  23. Armitage, B. A. The impact of nucleic acid secondary structure on PNA hybridization. Drug Discov Today. 8 (5), 222-228 (2003).
  24. Thomas, S. M., et al. Antitumor effects of EGFR antisense guanidine-based peptide nucleic acids in cancer models. ACS Chem Biol. 8 (2), 345-352 (2013).
  25. Bahal, R., McNeer, N. A., Ly, D. H., Saltzman, W. M., Glazer, P. M. Nanoparticle for delivery of antisense gammaPNA oligomers targeting CCR5. Artif DNA PNA XNA. 4 (2), 49-57 (2013).
  26. Adams, B. D., Parsons, C., Walker, L., Zhang, W. C., Slack, F. J. Targeting noncoding RNAs in disease. J. Clin. Invest. 127 (3), 761-771 (2017).
  27. Matsui, M., Corey, D. R. Non-coding RNAs as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 16 (3), 167-179 (2017).
  28. Devi, G., Zhou, Y., Zhong, Z., Toh, D. -F. K., Chen, G. RNA triplexes: from structural principles to biological and biotech applications. Wiley Interdiscip Rev RNA. 6 (1), 111-128 (2015).
  29. Rozners, E. Recent Advances in Chemical Modification of Peptide Nucleic Acids. J Nucleic Acids. 2012, 8 (2012).
  30. Devi, G., Yuan, Z., Lu, Y., Zhao, Y., Chen, G. Incorporation of thio-pseudoisocytosine into triplex-forming peptide nucleic acids for enhanced recognition of RNA duplexes. Nucleic Acids Res. 42 (6), 4008-4018 (2014).
  31. Toh, D. K., et al. Incorporating a guanidine-modified cytosine base into triplex-forming PNAs for the recognition of a C-G pyrimidine-purine inversion site of an RNA duplex. Nucleic Acids Res. 44 (19), 9071-9082 (2016).
  32. Li, M., Zengeya, T., Rozners, E. Short peptide nucleic acids bind strongly to homopurine tract of double helical RNA at pH 5.5. J Am Chem Soc. 132 (25), 8676-8681 (2010).
  33. Gupta, P., Zengeya, T., Rozners, E. Triple helical recognition of pyrimidine inversions in polypurine tracts of RNA by nucleobase-modified PNA. Chem Commun. 47 (39), 11125-11127 (2011).
  34. Zengeya, T., Li, M., Rozners, E. PNA containing isocytidine nucleobase: synthesis and recognition of double helical RNA. Bioorg Med Chem Lett. 21 (7), 2121-2124 (2011).
  35. Gupta, P., Muse, O., Rozners, E. Recognition of double-stranded RNA by guanidine-modified peptide nucleic acids. Biochemistry. 51 (1), 63-73 (2012).
  36. Zengeya, T., Gupta, P., Rozners, E. Triple-helical recognition of RNA using 2-aminopyridine-modified PNA at physiologically relevant conditions. Angew Chem Int Ed. 51 (50), 12593-12596 (2012).
  37. Muse, O., et al. Sequence selective recognition of double-stranded RNA at physiologically relevant conditions using PNA-peptide conjugates. ACS Chem Biol. 8 (8), 1683-1686 (2013).
  38. Hnedzko, D., Cheruiyot, S. K., Rozners, E. Using Triple Helix Forming Peptide Nucleic Acids for Sequence-selective Recognition of Double-stranded RNA. Curr Protoc Nucleic Acid Chem. 58, 61-64 (2014).
  39. Zengeya, T., Gupta, P., Rozners, E. Sequence selective recognition of double-stranded RNA using triple helix-forming peptide nucleic acids. Methods Mol Biol. 1050, 83-94 (2014).
  40. Endoh, T., Hnedzko, D., Rozners, E., Sugimoto, N. Nucleobase-Modified PNA Suppresses Translation by Forming a Triple Helix with a Hairpin Structure in mRNA In Vitro and in Cells. Angew Chem Int Ed. 55 (3), 899-903 (2016).
  41. Hnedzko, D., McGee, D. W., Karamitas, Y. A., Rozners, E. Sequence-selective recognition of double-stranded RNA and enhanced cellular uptake of cationic nucleobase and backbone-modified peptide nucleic acids. RNA. 23 (1), 58-69 (2017).
  42. Wexselblatt, E., Esko, J. D., Tor, Y. On guanidinium and cellular uptake. J Org Chem. 79 (15), 6766-6774 (2014).
  43. Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal. Biochem. 34 (2), 595-598 (1970).
  44. Roberts, R. W., Crothers, D. M. Stability and properties of double and triple helices: dramatic effects of RNA or DNA backbone composition. Science. 258 (5087), 1463-1466 (1992).
  45. Zhou, Y., et al. Recognition of RNA duplexes by chemically modified triplex-forming oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 41 (13), 6664-6673 (2013).
  46. Gisin, B. F. The monitoring of reactions in solid-phase peptide synthesis with picric acid. Anal. Chim. Acta. 58 (1), 248-249 (1972).
  47. Gogoi, K., Mane, M. V., Kunte, S. S., Kumar, V. A. A versatile method for the preparation of conjugates of peptides with DNA/PNA/analog by employing chemo-selective click reaction in water. Nucleic Acids Res. 35 (21), 139 (2007).
  48. Shabanpoor, F., Gait, M. J. Development of a general methodology for labelling peptide-morpholino oligonucleotide conjugates using alkyne-azide click chemistry. Chem Commun. 49 (87), 10260-10262 (2013).
  49. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A Stepwise Huisgen Cycloaddition Process: Copper(I)-Catalyzed Regioselective "Ligation" of Azides and Terminal Alkynes. Angew Chem Int Ed. 41 (14), 2596-2599 (2002).
  50. Haaima, G., Hansen, F. H., Christensen, L., Dahl, O., Nielsen, P. E. Increased DNA binding and sequence discrimination of PNA oligomers containing 2,6-diaminopurine. Nucleic Acids Res. 25 (22), 4639-4643 (1997).
  51. Schroeder, S. J., Turner, D. H. Methods Enzymol. 468, Academic Press. 371-387 (2009).
  52. McDowell, J. A., Turner, D. H. Investigation of the Structural Basis for Thermodynamic Stabilities of Tandem GU Mismatches: Solution Structure of (rGAGGUCUC)2 by Two-Dimensional NMR and Simulated Annealing. Biochemistry. 35 (45), 14077-14089 (1996).
  53. Sato, T., Sato, Y., Nishizawa, S. Triplex-Forming Peptide Nucleic Acid Probe Having Thiazole Orange as a Base Surrogate for Fluorescence Sensing of Double-stranded RNA. J Am Chem Soc. 138 (30), 9397-9400 (2016).
  54. Cheruiyot, S. K., Rozners, E. Fluorescent 2-Aminopyridine Nucleobases for Triplex-Forming Peptide Nucleic Acids. ChemBioChem. 17 (16), 1558-1562 (2016).
  55. Sato, T., Sato, Y., Nishizawa, S. Optimization of the Alkyl Linker of TO Base Surrogate in Triplex-Forming PNA for Enhanced Binding to Double-Stranded RNA. Chem Eur J. 23 (17), 4079-4088 (2017).
  56. Virta, P. M., Tahtinen, V., Granqvist, L., Murtola, M., Stromberg, R. 19F NMR spectroscopic analysis of the binding modes in triple helical PNA/microRNA-complexes. Chem Eur J. , (2017).
  57. Zengeya, T., Gindin, A., Rozners, E. Improvement of sequence selectivity in triple helical recognition of RNA by phenylalanine-derived PNA. Artif DNA PNA XNA. 4 (3), 69-76 (2013).
  58. Moses, A. C., Huang, S. W., Schepartz, A. Inhibition of Rev.RRE complexation by triplex tethered oligonucleotide probes. Bioorg Med Chem. 5 (6), 1123-1129 (1997).
  59. Ben Gaied, N., Zhao, Z., Gerrard, S. R., Fox, K. R., Brown, T. Potent triple helix stabilization by 5',3'-modified triplex-forming oligonucleotides. ChemBioChem. 10 (11), 1839-1851 (2009).
  60. Grimm, G. N., Boutorine, A. S., Lincoln, P., Norden, B., Helene, C. Formation of DNA triple helices by an oligonucleotide conjugated to a fluorescent ruthenium complex. ChemBioChem. 3 (4), 324-331 (2002).
  61. Tran, T., et al. Targeting the r(CGG) Repeats That Cause FXTAS with Modularly Assembled Small Molecules and Oligonucleotides. ACS Chem Biol. , (2014).
  62. Gianolio, D. A., Segismundo, J. M., McLaughlin, L. W. Tethered naphthalene diimide-based intercalators for DNA triplex stabilization. Nucleic Acids Res. 28 (10), 2128-2134 (2000).
  63. Rumney, S., Kool, E. T. Structural Optimization of Non-Nucleotide Loop Replacements for Duplex and Triplex DNAs. J Am Chem Soc. 117, 5635-5646 (1995).
  64. Stafford, R. L., Dervan, P. B. The reach of linear protein-DNA dimerizers. J Am Chem Soc. 129 (45), 14026-14033 (2007).
  65. Gupta, A., Bahal, R., Gupta, M., Glazer, P. M., Saltzman, W. M. Nanotechnology for delivery of peptide nucleic acids (PNAs). J Control Release. 240, 302-311 (2016).
  66. Avitabile, C., et al. Incorporation of Naked Peptide Nucleic Acids into Liposomes Leads to Fast and Efficient Delivery. Bioconjugate Chem. 26 (8), 1533-1541 (2015).

Tags

Genetikk problemet 127 PNA triplex RNA struktur RNA dupleks RNA-bindende ligander solid-fase peptid syntese ikke-denaturing siden 2-Aminopurine UV termisk smelter molekylær anerkjennelse forpliktende tilhørighet større groove
Sekvens-spesifikke og selektiv anerkjennelse av Double-strandet RNAs over Single-strandet RNAs av kjemisk endret peptid nukleinsyrer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Toh, D. F. K., Patil, K. M., Chen,… More

Toh, D. F. K., Patil, K. M., Chen, G. Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (127), e56221, doi:10.3791/56221 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter