Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

זיהוי רצף ספציפי, סלקטיבי של גדילי כפול RNAs מעל חד גדילי RNAs על ידי שינוי כימי חומצות גרעין פפטיד

Published: September 21, 2017 doi: 10.3791/56221
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Division of Chemistry and Biological Chemistry, School of Physical and Mathematical Sciences, Nanyang Technological University
* These authors contributed equally

Summary

אנחנו מדווחים הפרוטוקולים לסינתזה ולשנות טיהור של פפטיד חומצת גרעין (הרשות) oligomers שילוב משקעים. שיטות אפיון ההכרה של RNA דופלקסים מאת Pna ששונה הביוכימי, biophysical מתוארים.

Abstract

RNAs מתגלים סמנים ביולוגיים חשובים, מטרות טיפוליות. לפיכך, יש פוטנציאל אדיר בפיתוח הגששים כימי ליגנדים טיפולית על ההכרה של רצף ה-RNA ומבנה. מבחינה כימית שונה פפטיד חומצת גרעין (הרשות) oligomers פותחו לאחרונה שיכולים לזהות רנ א דופלקסים באופן ספציפי רצף. Pna יציבים מבחינה כימית עם שדרה פפטיד דמוי נייטרלי. Pna יכול להיות מסונתז יחסית בקלות באמצעות השיטה הידנית של סינתזה מוצק-פאזי פפטיד מפחיד-כימיה. Pna וגופם מטוהר באמצעות HPLC הפוכה-פאזי, ואחריו על ידי אפיון משקל מולקולרי לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון-שעה של טיסה (MALDI-TOF). Non-denaturing לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה (עמוד) טכניקה מקלה על ההדמיה של היווצרות טריפלקס, כי תוכנן בקפידה דופלקס חינם RNA בונה הרשות הפלסטינית מאוגד דופלקסים לעיתים קרובות המחירים שונים ההעברה הצג. Non-denaturing דף עם אתידיום ברומיד פוסט מכתים לעתים קרובות טכניקה קלה ואינפורמטיבי עבור אפיון את הזיקות מחייב ואת specificities של הרשות הפלסטינית oligomers. בדרך כלל, RNA סיכות או דופלקסים עם בסיס יחיד זוג מוטציות מרובות ניתן לאפיין את הרשות הפלסטינית מחייב מאפיינים, כגון איגוד הזיקות ו specificities. 2-Aminopurine הוא איזומר של אדנין (6-aminopurine); עוצמת קרינה פלואורסצנטית 2-aminopurine הוא רגיש לשינויים מבניים הסביבה המקומית, מתאים הפיקוח על היווצרות טריפלקס עם השאריות 2-aminopurine שולבו ליד באתר איגוד של הרשות הפלסטינית. 2-Aminopurine קרינה פלואורסצנטית טיטור יכול לשמש גם כדי לוודא את מידת הבררנות איגוד של PNAs ששונה לקראת זוגיות גדילי יישוב RNAs (dsRNAs) מעל חד גדילי RNAs (ssRNAs). UV-ספיגת-זיהה את תרמית ניסויים ההיתוך לאפשר את המדידה של יציבות תרמית של הרשות הפלסטינית-RNA דופלקסים ו PNA· רנ א2 דופלקסים. כאן, אנו מתארים את הסינתזה, טיהור של הרשות הפלסטינית oligomers שילוב שונה משקעים, והוא מתאר שיטות ביוכימיות biophysical פלואורסנציה ההכרה של RNA דופלקסים מאת Pna ששונה.

Introduction

RNAs מתגלים סמנים ביולוגיים חשובים, מטרות טיפוליות, עקב התפתחויות אחרונות התגליות של התפקידים של RNAs בוויסות, זרז של תהליכים ביולוגיים שונים-1,-2,-3. באופן מסורתי, קווצות antisense שימשו כדי לאגד ssRNAs עד ווטסון-קריק היווצרות דופלקס3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. לאחרונה, יוצרי טריפלקס חומצות גרעין פפטיד (TFPNAs) עוצבו כדי לאגד dsRNAs ויה Hoogsteen מימן מליטה28,3,(איור 1)29. אזורים dsRNA נמצאים רוב מסורתיים, ממוקדות antisense RNAs, לרבות pre-mRNAs ו- mRNAs, קדם או פרי-miRNAs3רבים אחרים ללא קידוד RNAs1,26,27. מיקוד dsRNAs דרך סליל משולש היווצרות באמצעות TFPNAs עשוי להיות יתרון עקב ירידה לפרטים שלו מבנה והוא של פוטנציאל גדול לשימוש עבור שחזור פונקציות רגיל של RNAs, אשר dysregulated מחלות, למשל.

שפורסם לאחרונה לעבוד על-ידי. Rozners et al., וגם אנחנו3,28,29,30,31,32,33, 34,35,36,37,38,39,40,41, דיווח על המאמצים על שיפור הכריכה סלקטיבי של ששונה TFPNAs לכיוון dsRNAs עם זיקה משופרת. פיתחנו שיטות סינתזה עבור הרשות הפלסטינית מעוצב באופן רציונלי מונומרים (איור 2) כולל thio-pseudoisocytosine (L) מונומר30 ו ציטוזין 5-methyl guanidine-לאחרונה (Q) מונומר31. באמצעות שיטות איפיון ביוכימי, biophysical שונות, הראו Pna קצר יחסית (6-10 שאריות) הופכים שאריות L ו- Q הצג לזיהוי טוב יותר של זוגות בסיס ווטסון-קריק G-C ו- C-G, בהתאמה, ב- dsRNAs. יתר על כן, Pna המכילה שאריות L ו- Q בהשוואה ל- Pna שלא שונתה, להראות מחייב יותר סלקטיבי כלפי dsRNA ssRNA ושל dsDNA. פונקציונליות guanidine42 בבסיס Q מאפשר Pna להזין הלה תאים31.

במעבדה שלנו, אנחנו יוצרים Pna מאת מפחיד-הכימיה ידנית (מפחיד או t- מפחיד ופירושה טרט-butyloxycarbony (ראה איור 2) פפטיד מוצק-שלב הסינתזה שיטה4. הסינתזה של מונומר הרשות הפלסטינית עם מפחיד כמו אמין מגן הקבוצה הוא נוח כמו הקבוצה מפחיד sterically פחות מסורבל בהשוואה fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) אמין מגן הקבוצה, אשר עשוי להיות מועיל במהלך מונומר הרשות הפלסטינית צימוד תמיכה מוצקה. הקבוצה מפחיד הוא חומצה-יציב, ניתן להסיר בקלות על התמיכה מוצק על ידי 20-50% חומצה trifluoroacetic (TFA) דיכלורומתאן (DCM) במהלך סינתזה של הרשות הפלסטינית. סינתיסייזר פפטיד אוטומטי יכול להיות מועסק לסנתז oligomers הרשות הפלסטינית; עם זאת, 3-5-קיפול עודף של הרשות הפלסטינית מונומר יש צורך של סינתיסייזר פפטיד אוטומטית. סינתזה ידנית דורשת באופן משמעותי פחות מונומר הרשות הפלסטינית (2-3-לקפל עודפי), עם כל צימוד בפיקוח בקלות המבחן של הקייזר43. יתר על כן, סינתיסייזרים אוטומטיות רבות אינן תואמות הסינתזה אסטרטגיה מפחיד עקב השימוש של מאכל TFA במהלך השלב להסרת מפחיד.

הרשות הפלסטינית oligomers יכולים להיטהר על-ידי הפוכה-פאזי ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (RP-HPLC) ואחריו משקל מולקולרי אפיון על-ידי MALDI-TOF (3 דמויות ו- 4)30, 31. אנו מעסיקים שאינם denaturing דף לפקח על היווצרות טריפלקס, בשל העובדה כי דופלקס RNA חופשי בונה ואת הרשות הפלסטינית מאוגד דופלקסים לעתים קרובות להציג הגירה שונים המחירים (איור 5)30,31 . אין תיוג דרושה אם יעיל פוסט-צביעת יכולה להיות מושגת הן של RNA דופלקס, PNA· רנ א2 להקות טריפלקס. כמות קטנה יחסית של מדגם נדרש לניסויים דף שאינם denaturing. עם זאת, המאגרים טעינה (הדגירה) ואת המאגרים פועל (pH 8.3) לא ניתן אותו, וכתוצאה מכך המידות מצטמצם דופלקסים kinetically יציב, כי pH גבוה יחסית של 8.3 עשוי באופן משמעותי ביציבותה של טריפלקס.

2-Aminopurine הוא איזומר של אדנין (6-aminopurine); עוצמת קרינה פלואורסצנטית 2-aminopurine (עם שיא פליטה-בסביבות 370 ננומטר) רגישות לשינויים מבניים הסביבה המקומית, ולא מתאים הפיקוח על היווצרות טריפלקס עם השאריות 2-aminopurine שולבו ליד איגוד (אתר הרשות הפלסטינית איור 6) 31. שלא כמו רבים אחרים צובעים המוצגים פליטת קרינה פלואורסצנטית לטווח הגלוי, 2-aminopurine-שכותרתו ' RNA ניתן לחשוף לחדר אור ללא צילום הלבנה. בניגוד דף ניסוי שבו מאגר הפעלה של pH 8.3 נדרש לעיתים קרובות, 2-aminopurine המבוסס על ידי קרינה פלואורסצנטית טיטור מאפשרת מדידת מחייב פתרון אחד ב- pH שצוין, ובכך עלולה לאפשר את המידה ואת גילוי של חלשה יחסית, כריכת kinetically יציב על שיווי משקל.

UV-ספיגת-זיהה את תרמית ניסויים ההיתוך לאפשר את המדידה של יציבות תרמית של דופלקסים (איור 7)31 : triרכיבי plex30,32,44,45. בהתאם להרכב רצף לאורכה, כור ההיתוך של דופלקסים עלול או עשוי שלא להציג מעבר ברור. ניתן לקבל פרמטרים תרמודינמי אם העקומות חימום וקירור של חופפים. פרמטרים תרמודינמי מדויק ניתן להשיג על ידי טיטור איזותרמי calorimetry (ITC)32; עם זאת, כמויות גדולות יחסית של דגימות נדרשים בדרך כלל עבור המרכז לטניס בישראל.

Protocol

1. ידני אחיד-פאזי פפטיד סינתזה Pna באמצעות מפחיד לכימיה

הערה: עבור הצלחה ונוחות הסינתזה הרצויה אוליגומר הרשות הפלסטינית, כל ממיסים, ריאגנטים צריך להיות נטול מים. הוסף את הנפות מולקולרית המתאים (4A, 1-2 מ מ בקוטר כדורי), מדי פעם לנקות גז חנקן יבש לתוך בקבוקים. לסינתזה של מונומרים הרשות הפלסטינית המתוקנת, הפרוטוקולים שדווחו ב 30 , הפניות בהתאמה 31 יכול לשמש. ניתן לרכוש מונומרים הרשות הפלסטינית שלא שונתה ממקורות מסחריים. בכל אחד מהשלבים כביסה, הכמות המתאימה של הממס מתווסף השרף, ויוצרים של slurry, לפני זה היא מרוקנת את הנהגים

  1. הטעינה של מונומר הראשון וכיסוי עודף אמינים ראשוני חינם על השרף
    1. שוקל 30 מ"ג 4-methylbenzhydrylamine הידרוכלוריד (MBHA·HCl) פוליסטירן שרף (זמינים מסחרית; טעינה ערך 0.7-1.4 mmol/g; גודל רשת 100-200), והעברה 5 מ ל מיכל התגובה פפטיד מעבדתי מצוידים עם פקק צימוד וזכוכית.
    2. להשרות השרף כמות מספקת של DCM לשעה ומאפשר שרף להתנפח ולחשוף את אמינים (מלח HCl).
      הערה: שרף חרוזים צריך תמיד להיות לגמרי שקועים ממיסים במהלך הסינתזה.
    3. ניקוז הנחה DCM על-ידי החלת זרם עדין של גז חנקן יבש מעל המכסה של הבקבוק. להוסיף 1 מ"ל של 50% (v/v) N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) ב- DCM ולהשאיר את זה למשך 15 דקות. זה מנטרל את המלח HCl המצורפת את אמינים חינם על השרף.
    4. חזור על שלב 1.1.3. בינתיים, שוקל µmol 6 של מונומר, µmol 6 של tripyrrolidinophosphonium (benzotriazol-1-yl-oxy) hexafluorophosphate (PyBOP), ולהעביר לתוך צינור 1.5 מ. להוסיף 200 µL של dimethylformamide (DMF) ו- 12 µmol של DIPEA. מערבולת הפתרון צימוד עבור 3-5 דקות
      הערה: ערך הטעינה הרצוי המשמש היא 0.2 mmol/g. הראשונה מונומר נוסף הוא מונומר על הטרמינל-C של הרצף הרצוי של הרשות הפלסטינית. הערך הטעינה של החומצה אמינית הראשון יכול להיות מחושב על ידי שיטה חומצה picric 46.
    5. ניקוז הנחה DIPEA מ- DCM הפתרון. לשטוף את השרף עם DCM (x 3), ואחריו DMF (x 3), וסגור את צימוד. הוסף את הפתרון צימוד מוכן שרף ומנערים בעדינות. לדחוף את השרף לאורך הקירות הפנימיים של כלי השיט לתוך הפתרון צימוד עם השימוש של מרית נירוסטה נקייה. לצרף את פקק זכוכית ולאבטח את הכלי ב שייקר אינקובטור עבור h 3 בגיל 40 ° C.
      הערה: לחלופין, מיכל התגובה יכול להישמר קבוע בטמפרטורת החדר במשך 6-8 h לאפשר את השלמת פפטיד מצומדות.
    6. להכין את הפתרון הגבלת התכיפות על ידי ערבוב µmol 240 של אנהידריד אצטי µmol 360 של DIPEA לתוך µL 200 של DCM. לנקז את הפתרון צימוד ולשטוף השרף עם DMF (x 3) ו DCM (x 3). מוסיפים הפתרון הגבלת התכיפות, לעזוב את הספינה במשך 30 דקות, מדי פעם לנער את הכלי בעדינות. מיצוי מסכות הקבוצות עודף אמין ראשוני חינם על שרפים מאת acetylation.
    7. חזור על שלב 1.1.6. מסננים את הפתרון הגבלת התכיפות. ולשטוף את השרף עם DCM (x 3).
    8. להסיר aliquot קטן של חרוזים שרף באמצעות צינור קפילרי דק, למקם אותם לתוך בקבוקון זכוכית קטן 1.5 מ. לבצע את הבדיקה של הקייזר 43. הוסף µL 15 מכל סוג של הקייזר בדיקת פתרונות לתוך הכוס בקבוקון וחום באמצעות אקדח חום. לבחון את הצבע של החרוזים לאחר חימום. הצבע של החרוזים שצריך להישאר ללא שינוי, המציינת את היעדרה של קבוצות amine חינם על השרף.
      הערה: ערכת הבדיקה קייזר זמין מסחרית או ניתן להכין לפי הפרוטוקול המדווחת. פתרון ת ninhydrin באתנול; פתרון ב': פנול באתנול; פתרון c: אשלגני (KCN) בפירידין.
      התראה: KCN הוא רעיל מאוד; יש ללבוש ביגוד מגן נכונה, לבצע חימום בשכונה fume מאוורר היטב, בהיעדרו של הממס דליק או ריאגנטים.
    9. חזור על שלב 1.1.6 אם החרוזים שרף להציג צבע כחול כחול או להתעלף.
  2. הסרה של N-מסוף amine שיגן על קבוצה
    1. לרוקן את ממיסים מכלי הקיבול התגובה ולהוסיף פתרון של 50% (v/v) של חומצה trifluoroacetic (TFA) ב- DCM, המבטיח כי שרפים מלא טובע. להשאיר את הכלי למשך 15 דקות, מדי פעם לוחץ כדי לקדם את deprotection של קבוצות אמין. חוזר 2 מחזורים יותר.
      זהירות: TFA היא מאכל מאוד. ביגוד מגן ראוי וכדאי לענוד בעת הטיפול.
    2. לרחוץ השרף עם DCM (x 3), DMF (x 3) ו DCM (x 3). להוסיף פתרון של 5% DIPEA ב DCM. להשאיר את הכלי למשך 15 דקות. שלב זה מפעיל את אמינים חינם על ידי נטרול אניונים מונה את TFA. אני חוזר עוד פעם.
    3. לשטוף את DIPEA מהפתרון DCM. לשטוף את השרף עם DCM (x 3). לבצע את הבדיקה קייזר (שלב 1.1.8).
      הערה: deprotection מוצלחת של קבוצות amine תניב הכחול הדהוי של החרוזים. לאחר deprotection מוצלח, צימוד עוקבות של מונומרים זיווגו פפטיד יכול להתבצע.
  3. מצמד של מונומרים הבאים
    1. שוקל 18 µmol של הצורך מונומר (עבור מונומר מפחיד-הרשות הפלסטינית-Q-הו, 13.2 מ"ג של מונומר מתנהל) ו- 18 µmol של PyBOP לתוך צינור 1.5 מ ל. להוסיף 200 µL של DMF µmol 36 של DIPEA לתוך הצינור 1.5 mL. מערבולת עד שכל התרכובות מוצק הם התפרקה.
    2. לרחוץ השרף עם DMF (x 3). הוסף את הפתרון צימוד לתוך כלי התגובה ומנערים בעדינות. לדחוף את השרף לאורך הקירות הפנימיים של כלי השיט לתוך הפתרון צימוד עם השימוש של מרית נירוסטה נקייה. לצרף את פקק זכוכית ולאבטח את הכלי ב שייקר אינקובטור עבור h 3 בגיל 40 ° C.
    3. ניקוז off הפתרון צימוד ולשטוף השרף עם DMF (x 3) ו DCM (x 3). בצע את שלב 1.1.8. אם הצבע של החרוזים נשאר ללא שינוי, חזור על השלבים 1.2.1-1.3.3 עד הרצף הרצוי של הרשות הפלסטינית. אם הכחול הדהוי של חרוזים נצפית לאחר המושבים של מונומר, חזור על שלבים 1.3.1-1.3.3. אם דהוי עדיין נמשכת, לבצע שוב מהגבלת (שלב 1.1.6).
      הערה: מורחב צימוד זמן (h 3-12) ו/או שימוש עודף המקבילה מונומר, צימוד ריאגנטים מומלצים אם מתעוררות בעיות עם צימוד.
    4. סיום הרצף הרצוי של הרשות הפלסטינית, לשטוף השרף עם DMF (x 3) ו DCM (x 3). יבש לחלוטין השרף על-ידי החלת זרימה רצופה של גז חנקן יבש למשך 15 דקות. שרף יבש זה ניתן לפצל ולעדכן להצמדה ליזין או של תגית פלורסנט כגון cyanine 3 (Cy3) ו- carboxyfluorescein-N-הסופית של הרשות הפלסטינית-
  4. החזקה של תג ליזין או פלורסנט (Cy3, Cy5, או carboxyfluorescein) קצה אמיני של הרשות הפלסטינית
    1. שוקל 10 מ ג של שרף, טעון מראש עם הרצף הרצוי של הרשות הפלסטינית. העברת לתוך כלי התגובה מ. לטבול את השרף DCM עבור ה 1
    2. עבור הקובץ המצורף של ליזין, לבצע צעדים 1.2.1-1.3.3, מחליפים את מונומר או מפחיד-ליס (Z) - הו או Fmoc-ליס (מפחיד) - או-
    3. עבור הקובץ המצורף של carboxyfluorescein, לבצע צעדים 1.2.1-1.3.3, עם עודף 10-fold של 5 (6)-carboxyfluorescein כמו מונומר, ו- N, N '-diisopropylcarbodiimide (DIPC), hydroxybenzotriazole (HOBt) כמו ריאגנטים צימוד ב DMF. להשאיר את התגובה צימוד בין לילה שייקר אינקובטור בגיל 40 ° C.
      הערה: כמו carboxyfluorescein הוא רגיש אור, מיכל התגובה שאמור להיות מכוסה ברדיד אלומיניום-
    4. עבור הקובץ המצורף של צבע Cy3 או Cy5, התוויות באמצעות שיטת כימיה לחץ, לבצע צעדים 1.2.1-1.3.3, החלפת מונומר של N-Boc-2-propargyl-L-glycine. זה functionalizes את קצה אמיני של הרשות הפלסטינית עם קבוצה אלקין. לבצע את תגובת לחץ מזורז נחושת כדי לצרף את Cy3 המכילים אזיד או פלורסנט Cy5 לצבוע 12 , 47 , 48 , 49
  5. הרשות הפלסטינית המחשוף של תמיכה מלאה, טיהור, ואפיון
    הערה: אם כל קבוצה amine מוגן עם Fmoc מגן קבוצתית, deprotect לראשונה קבוצת אמין על ידי טיפול עם 20% piperdine ב DMF פתרון למשך 15 דקות (2 מחזורים). לשטוף את השרף ביסודיות עם DMF (x 3) ואחריו DCM (x 3). יבש השרף לחלוטין על-ידי החלת זרימה רצופה של גז חנקן יבש למשך 15 דקות.
    1. להעביר 5 מ"ג של שרף יבש לתוך בקבוקון קטן. להוסיף 10 µL של thioanisole ו- µL 4 של 1, 2-ethanedithiol, המבטיח כי השרף שקוע ב ריאגנטים. השאר את השפופרת בטמפרטורת החדר במשך 5 דק
      הערה: ריאגנטים אלה לשמש נבלות, אשר השמנה ונבדקים מינים cationic נוצרות במהלך הסרת הגנה על קבוצות של הרשות הפלסטינית. אוכלי נבלות המתאים יכולה להיבחר בהתבסס על הרשת בצד הגנה על קבוצות.
    2. µL להוסיף 100 של TFA לתוך הצינור המכיל את שרף ואוכלי הנבלות. מערבולת בעדינות התערובת ונושא כדי צנטריפוגה קצרה. השאר את השפופרת בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות
      זהירות: TFA היא מאכל מאוד. ביגוד מגן ראוי וכדאי לענוד בעת הטיפול.
    3. בזהירות להוסיף 20 µL של חומצה טריפלואורומתאנגופריתית (TFMSA) הצינור. בעדינות להתסיס את תערובת התגובה לפני העמדת צנטריפוגה קצר בטמפרטורת החדר. להשאיר את הצינור קבוע בטמפרטורת החדר במשך ה 2
      זהירות: TFMSA היא מאכל מאוד. ביגוד מגן ראוי וכדאי לענוד בעת הטיפול.
    4. מסנן את המחשוף קוקטייל לתוך בקבוקון סיבוב המדרגה 5 מ"ל (RBF) עם השימוש של כוס פסטר פיפטה מצוידים עם כותנה. השתמש כמות קטנה של TFA לשטוף השרף.
    5. לטהר את גז חנקן יבש פילטרט של שנאספו עד כל ממסים נדיפים הם התאדו. להוסיף 1 מ"ל של דיאתיל אתר קר RBF.
      הערה: דיאתיל אתר יגרום הרשות הפלסטינית לזרז. אתר
      1. יש לשטוף RBF עם diethyl מספר פעמים לפני העברת הפתרון מעונן לתוך צינור 1.5 מ. נושא צינור כדי צנטריפוגה כדי לאפשר את התמיסה הרשות הפלסטינית להתיישב. ממיסים את decant ולהוסיף 300-500 µL של מים בלוק התמיסה. מערבולת ביסודיות כדי להמיס שהרשות.
    6. לטהר המדגם הרשות הפלסטינית גולמי דרך RP-HPLC באמצעות water-acetonitrile-0.1% TFA כמו השלב ניידים. לאסוף את השברים המתאימים, מתאדים כל ממיסים באמצעות רכז ואקום לפני המסת מחדש שהרשות מטוהרים במים בלוק.
    7. לאפיין את הרשות הפלסטינית מטוהרים באמצעות ניתוח MALDI-TOF עם השימוש של α-cyano-4-hydroxycinnamic חומצה (CHCA) כמו המטריקס התגבשות דגימה.
    8. למדוד את ספיגת UV (260 ננומטר) של הרשות הפלסטינית על 65 ° C. חישוב הריכוז של הרשות הפלסטינית עם המשוואה:
      Equation 1
      הערה: הנה הריכוז c A הוא הקריאה ספיגת שהושג, חדוה הוא המקדם הכחדה של רצף ה-RNA, l הוא אורך אופטי cuvette (1 ס מ)-המקדם הכחדה של הרצף הרשות הפלסטינית הוא הסיכום של המקדם הכחדה של מונומרים בודדים 50. המקדמים הכחדה של אדנין, ציטוזין, גואנין, תימין הם 15.4, 7.3, 11.7, 8.8 mL/µmol·cm, בהתאמה. המקדם הכחדה של מונומרים L ו- Q להשתמש ההנחה תהיה זהה לזה של ציטוזין (C) הבסיס.

2. דף denaturing ללא

  1. הכנת מאגר נדרשים פתרונות
    1. הדגירה להכין מאגר (10 מ"ל) באמצעות 116.88 מ"ג NaCl (200 מ מ), µL 50 100 מ מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) (0.5 מ מ), 200 µL של 1 מ' מניות HEPES (20 מ מ), 9.75 m H 2 O; להתאים את המאגר כדי pH 7.5.
    2. הכן 1 x טריס-בוראט-EDTA (TBE) פועל מאגר (1 ליטר) באמצעות 100 מ ל 10 x טריס-בוראט-EDTA ב pH 8.3 ו- 900 מ ל H 2 O.
    3. הכן 10% אמוניום persulfate (APS) פתרון (300 µL) באמצעות קירור 30 מ"ג, ו- 300 µL H 2 O.
  2. הכנת ג'ל לזיהוי 12%
    1. לנקות את המסרק היטב ויוצרים צלחות ליציקת זכוכית, מפרידי עם אתנול; המסרק היטב ויוצרים מפרידי הם בעובי 1 מ מ. להגדיר את מכלול ג'ל? ולחתום עם ג'ל וסתימה קלטת.
    2. 50 מ של פתרון ג'ל ג'ל לזיהוי של 22 ס"מ x 16.5 ס"מ x 1 מ"מ dimension, היא נאותה. שוקלים לצאת 5.7 גרם של אקרילאמיד ו- 0.3 g N, N '-methylenebisacrylamide (19:1) והעברת לתוך צנטריפוגה 50 מ ל צינור.
      זהירות: אקרילאמיד היא סרטנית. להימנע נושמת אבק אדים של אקרילאמיד ולהבטיח כי ראוי ביגוד מגן שחוקה בעת הטיפול.
    3. לפזר תרכובות מוצק 50 מ ל 1 X TBE מאגר פועל על ידי הנחת הצינור צנטריפוגה לתוך אמבט מים 50 מעלות למשך 15 דקות, או עד שכל התרכובות מוצק יש מומס. לבצע צנטריפוגה (3,000 סל ד, 5 דקות, 25 ° C) כדי להסיר את כל הבועות אוויר בתוך הפתרון. אפשר לתמיסה להתקרר לטמפרטורת החדר.
    4. מוסיפים 250 µL של פתרון APS 10% ו- 50 µL של tetramethylethylenediamine (TEMED) בתוך תמיסת ג'ל ומערבבים בעדינות בעזרת מרית. ומיד שופכים את הפתרון בין הזכוכיות, מקפיד לא להציג את כל בועות האוויר. להוסיף את המסרק היטב ויוצרים ולהשאיר את הכיוונון ג'ל בטמפרטורת החדר במשך לפחות 60 דקות לאפשר הפילמור מתרחשים, לפני אחסון ב 4 ° C עד מוכן להשתמש.
  3. הכנת דוגמאות
    1. להסיר את הכמות הנדרשת של RNA מכבנה (1 מיקרומטר) מן המלאי הראשי לתוך צינור נקי mL 1.5. יבש את פתרון ה-RNA באמצעות ואקום רכז.
      הערה: כל מדגם מכיל 1 מיקרומטר של RNA במאגר הדגירה 20 µL. בדרך כלל, 13 דוגמאות RNA מוכנות עבור עמוד אחד להתנסות. הרנ א עבור כל הדגימות ניתן להכין יחד צינור יחיד.
    2. להסיר את אמצעי האחסון הדרושים של הרשות הפלסטינית יישוב (עם הריכוז הסופי של עד 50 מיקרומטר) המניות הראשי ואת העברת לתוך צינורות mL 1.5 נפרדים. להתאדות המים של הפתרונות הרשות הפלסטינית באמצעות ואקום רכז.
    3. µL 260 להוסיף מאגר הדגירה לתוך 1.5 mL שפופרת המכילה מיובשים RNA, לערבב ביסודיות כדי להבטיח שכל רנ א היא נותנים דיסolved. נושא את הרנ א להצמדת קירור: המקום הצינור לתוך גוש חום (טרופה עד 95 ° C) במשך 5 דק מיד להעביר לתוך אמבטיית קרח ולהשאיר במשך 10 דקות
      4. צינורות
    4. µL להוסיף 20 של RNA לתוך כל אחד 1.5 mL המכיל מיובשים PNA ולערבב ביסודיות. לבצע ריפוי: למקם את הצינור המכיל תערובת RNA ו הרשות הפלסטינית לתוך גוש חום (טרופה עד 65 מעלות צלזיוס) במשך 10 דקות להפוך את הכוח של הבלוק החום ולתת הדגימות מגניב לאט לטמפרטורת החדר. דגירה בדגימות ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  4. פועל, עיבוד של ג'ל
    1. הוצא את הקלטת ג'ל וסתימה בצד התחתון של לוח הזכוכית. הר ולאבטח את לוח הזכוכית על גבי המעמד ג'ל אנכית באמצעות מלחציים פלסטיק.
      הערה: הג'ל פועל מבוצעת בחדר קר כ 4 º C. כל ציוד, דגימות, ו מאגרי מצוננים ב 4 ° C לפני הפעלת הג'ל.
    2. למלא המאגר מאגר התחתון עם 1 x TBE מאגר פועל עד הצלחת שקוע כ 1-2 ס מ של הפעלת מאגר. מילוי המאגר מאגר העליון עם הפעלת מאגר עד הרמה של מאגר חורג העליון של הג'ל על ידי 1-2 ס מ. לאט ולהסיר בעדינות את המסרק היטב ויוצרים, ומאפשר המאגר פועל למלא את הבארות-
    3. להתחבר הדוכן ג'ל ספק כוח. מראש להפעיל את הג'ל במשך 30 דקות לפחות עם מתח קבוע של 250 V, אשר מיטבית של 22 ס מ x 16.5 ס"מ x 1 מ מ ג'ל.
    4. בינתיים, מוסיפים 4 µL (20% נפח דגימה) של 35% גליצרול פתרון לכל אחת הדגימות ומערבבים בעדינות. סיום הפעלה מראש, לטעון µL 20 של כל דגימה (כולל אחד מדגם לבד RNA ועוד דוגמאות המכיל תערובת RNA ו הרשות הפלסטינית) בזהירות לתוך החלק התחתון של טוב באמצעות של micropipette, ג'ל טעינת טיפים, מקפיד לא להציג את כל בועות האוויר. להפעיל את הג'ל על מתח קבוע של 250 V, הדומה רץ מראש, עבור 5 ח'
    5. להפסיק את אספקת החשמל לאחר 5 שעות, הסר את לוחית הזכוכית של העמדה. הוצא את הקלטת ג'ל וסתימה הנותרים, לפרק את לוח הזכוכית. בעדינות להסיר, לטבול את הג'ל לתוך מיכל מלא עם 350 מ ל מים יונים. בזהירות להוסיף µL 35 של אתידיום ברומיד (10 mg/mL) ומניחים את המיכל על מטרף פלטפורמה (מהירות נמוכה) במשך 30 דקות
      התראה: אתידיום ברומיד הוא מוטגן. ביגוד מגן ראוי וכדאי לענוד בעת הטיפול.
    6. להיפטר הפתרון אתידיום ברומיד לתוך מיכל פסולת המיועדת. יש לשטוף את הג'ל עם 1.5-2 L של מים מזוקקים. לסרוק את הג'ל באמצעות imager (ראה טבלה של חומרים) עם לייזר ירוק של 532 nm ו הפליטה לסנן ערכת 610 nm.
  5. ג'ל ניתוח
    1. לכמת עוצמות הלהקה ג'ל באמצעות תוכנה חופשית, GelQuant.NET (http://www.biochemlabsolutions.com/GelQuantNET.html). לנרמל את עוצמות הלהקה על פי:
      Equation 2
      הערה: כאן אני מקס דופלקס זה את העוצמה הלהקה של הסיכה RNA לבד ללא התוספת של הרשות הפלסטינית, ואני מקס טריפלקס זה את העוצמה טריפלקס הלהקה עם הריכוז הגבוה ביותר של הרשות הפלסטינית הוסיף.
      1. לחשב את השבר של היווצרות טריפלקס על פי:
        Equation 3
    2. עלילה השבר של היווצרות טריפלקס (Y) נגד הריכוז של הרשות הפלסטינית הוסיף ( מיקרומטר). להתאים לנתונים למשוואה כדי להשיג את קבוע דיסוציאציה (K d):
      Equation 4
      הערה: כאן R 0 הוא הריכוז סיכת ראש ה-RNA (1 מיקרומטר). Y 0 ו- B להלן הראשונית ואת השינוי המרבי של השבר טריפלקס, בהתאמה. Y הוא השבר של טריפלקס-ריכוז הרשות הפלסטינית מגוונת. X הוא ריכוז הרשות הפלסטינית מוחלט ו- K d הוא קבוע דיסוציאציה.

3-2-Aminopurine קרינה פלואורסצנטית איגוד וזמינותו

  1. הכנת דוגמאות (מכיל dsRNA)
    1. להסיר את הכמות הנדרשת של 2-aminopurine (2AP) שכותרתו dsRNA (מיקרומטר 1 עבור כל אחד לנטישה) מן המלאי הראשי לתוך צינור נקי mL 1.5. והמנהגים בפתרונות RNA באמצעות ואקום רכז.
      הערה: כל מדגם מכיל 1 מיקרומטר של RNA במאגר דגירה µL 75. בדרך כלל, מוכנות 13 דגימות של RNA. RNA עבור כל הדגימות ניתן להכין יחד צינור יחיד.
    2. להסיר את אמצעי האחסון הדרושים של הרשות הפלסטינית ממוקד עבור ריכוזים שונים של המניות העיקרי של העברת לתוך צינורות נפרדת mL 1.5. להתאדות המים של הפתרונות הרשות הפלסטינית באמצעות ואקום רכז.
    3. µL 975 להוסיף מאגר הדגירה לתוך 1.5 mL שפופרת המכילה מיובשים RNA, לערבב ביסודיות כדי להבטיח ש-RNA כל התפרקה. Centrifuge הפתרון RNA בקצרה ונושא זה חישול: למקם את הצינור לתוך גוש חום (טרופה עד 95 ° C) במשך 10 דקות להפוך את הכוח של הבלוק החום ולתת הדגימות מגניב לאט לטמפרטורת החדר.
      4. צינורות
    4. µL 75 להוסיף של RNA לתוך כל אחד 1.5 mL המכיל מיובשים PNA ולערבב ביסודיות. נשאיר את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך לפחות 1 ה Incubate הדגימות 4 ° C בלילה.
  2. הכנת דוגמאות (מכיל ssRNA)
    1. להסיר את הכמות הנדרשת של התווית על-ידי 2AP ssRNA (1 מיקרומטר) מן המלאי הראשי לתוך צינורות mL 1.5 נקי. לחלץ את אמצעי האחסון הדרושים של הרשות הפלסטינית ממוקד עבור ריכוזים שונים מן המניות הראשי העברת לתוך הצינורות המתאימים mL 1.5 המכילים את ssRNA. יבש את התערובת RNA ו הרשות הפלסטינית באמצעות ואקום רכז.
    2. 75 להוסיף µL של דגירה מאגר לתוך כל הצינורות 1.5 מ"ל ומערבבים היטב. נושא את התערובת חישול: למקם את הצינור לתוך גוש חום (טרופה עד 95 ° C) במשך 10 דקות להפוך את הכוח ולתת הדגימות לאט להתקרר לטמפרטורת החדר. דגירה בדגימות ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  3. מדידה וניתוח
    1. להשתמש ספקטרופוטומטרים פלורסצנטיות כדי למדוד את הפליטה מעל טווח אורך הגל של 330-550 ננומטר. השתמש של גל עירור של 303 nm.
      הערה: הדגימות נמדדים בטמפרטורת החדר, כל מדגם נמדד 3 פעמים, שבו נלקח הממוצע.
      2. מאגר
    2. µL 70 העברה של דגירה לתוך cuvette מרובע 1 ס מ. להתחיל את המדידה.
    3. להסיר את החומר הממתן cuvette. לשטוף את cuvette עם מים מזוקקים ולטהר גז חנקן יבש. חזור על כל הדגימות. להחסיר את המידות מאגר של כל הדגימות.
    4. להתוות את עוצמת קרינה פלואורסצנטית (א"א) נגד גל (ננומטר). להקליט את עוצמת קרינה פלואורסצנטית-370 ננומטר עבור כל הדגימות. להתוות את עוצמת קרינה פלואורסצנטית-370 ננומטר (א"א) נגד הריכוז המתאים של הרשות הפלסטינית הוסיף (מיקרומטר).
    5. להתאים לנתונים למשוואה מהשלב 2.5.2 כדי להשיג את קבוע דיסוציאציה (K d): Y = Y 0 + ((2R 0)) (R 0 + X + K d-((R 0 + X + K d) 2 -4R 0 X) 1/2), כאשר R 0 הוא ריכוז dsRNA התווית על-ידי 2AP (1 מיקרומטר).
      הערה: כאן Y 0 ו- B הם השינוי הראשוני ומקסימום של עוצמת קרינה פלואורסצנטית-370 ננומטר, בהתאמה. Y הוא עוצמת קרינה פלואורסצנטית-370 nm ב ריכוז הרשות הפלסטינית מגוונת. X הוא ריכוז הרשות הפלסטינית מוחלט ו- K d הוא קבוע דיסוציאציה.

4. UV-ספיגת-זוהה ניסויים התכה התרמי

  1. הכנת דוגמאות
    הערה: למדוד את ספיגת UV (260 ננומטר) של RNA ב 95 ° C (כדי לוודא המבנים משני RNA הם שיבשו). חשב את ריכוז RNA עם המשוואה:
    Equation 5
    ​ איפה c הריכוז, הוא הקריאה ספיגת שהושג, חדוה הוא המקדם הכחדה של רצף ה-RNA, והוא l אופטי אורך cuvette (1 ס מ). המקדם הכחדה של הרנ א מחושב בהתבסס על מודל הקרוב-השכן באמצעות MeltWin 51 , 52. חבילת תוכנית עשויה להינתן על פי בקשה. צינורות
    1. להסיר הכמות הנדרשת של ssRNA (5 מיקרומטר) מן המלאי הראשי לתוך mL 1.5 נקי. להסיר את אמצעי האחסון הדרושים של הרשות הפלסטינית יישוב (5 מיקרומטר) מן המניות הראשי העברת לתוך הצינורות המתאימים mL 1.5 המכילים את ssRNA. יבש את התערובת RNA ו הרשות הפלסטינית באמצעות ואקום רכז.
    2. 130 להוסיף µL של דגירה מאגר לתוך כל הצינורות 1.5 מ"ל ומערבבים היטב. נושא את התערובת חישול: למקם את הצינור לתוך גוש חום (טרופה עד 95 ° C) במשך 10 דקות להפוך את הכוח ולתת הדגימות לאט להתקרר לטמפרטורת החדר. דגירה בדגימות ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  2. מדידה וניתוח
    1. להשתמש ספקטרופוטומטרים UV-Vis כדי למדוד את ספיגת ב-260 nm באמצעות cuvette 8-microcell עם אורך הנתיב של 1 ס מ. למדוד את הדגימות ' absorbances בהגברת טמפרטורה מ 15 עד 95 מעלות צלזיוס, ואחריו הפחתת טמפרטורה מ 95 ל 15 ° C בקצב הרמפה של 0.5 ° C לדקה
      2. µL
    2. 130 להעביר מדגם לתוך כל היטב, כדי לוודא את זה. טוב מכיל מאגר הדגירה. להתחיל את המדידה. . אני חוזר כנדרש.
    3. לנרמל את הערכים ספיגת עם טמפרטורה גבוהה קריאה מנורמל לאחדות, להתוות את ספיגת מנורמל קריאה נגד טמפרטורה (° C). מגרש הנגזרת הראשונה של העקומות. לקבל את טמפרטורות ההיתוך על-ידי התאמת הראשונה העיקולים נגזרות לפונקציה גאוסיאנית.

Representative Results

הפוך-פאזי HPLC מאפשר הטיהור של הרשות הפלסטינית oligomers. אפשר להשיג טהור oligomers הרשות הפלסטינית עם שני סיבובים של HPLC טיהור (איור 3). ניתן לאשר את הזהות של PNAs ניתוח MALDI-תוף (איור 4).

דף denaturing שאינם הוא טכניקה קלה ואינפורמטיבי עבור אפיון את הזיקות מחייב ואת specificities של הרשות הפלסטינית oligomers. בדרך כלל נשתמש RNA סיכות או דופלקסים מרובים עם מוטציות בסיס יחיד זוג כדי לאפיין את מאפייני האיגוד (איור 5). הלא denaturing דף הנתונים שמוצג באיור 5 בבירור מציע Q ו- L-מהונדס PNA יכול לזהות אזור dsRNA עם זוג C-G (איור 5B, החלונית התחתונה) אך לא אחד ללא זוג C-G (איור 5B, טופ לוח). הכרה זאת ספציפית ומשופרות היא דרך t · A-U, L· G-C, ו- Q· C-G PNA· רנ א2 -צורה משולשת הבסיס (איור 1A, C, D). Pna שונים עם מוטציות בודדות או רבות עשוי לשמש גם כדי להדגים את מאפייני איגוד משופרת הרשות הפלסטינית המתוקנת. הראינו כי הוספת 2 מ מ Mg2 + במאגר הדגירה אינה משפיעה על הכריכה באופן משמעותי31.

הראו על ידי טיטור פלורסצנטיות 2-aminopurine המאגד הרשות הפלסטינית Q ו- L-מהונדס אזור dsRNA יישוב (איור 6א, 6 C, 6 D) אולם לא ssRNA (איור 6B 6E, 6F). הרשות הפלסטינית P3 המאגד 2 aminopurine-שכותרתו dsRNA עם ערךד Kשל 0.8 ± 0.1 מיקרומטר. עוצמת קרינה פלואורסצנטית-370 ננומטר עבור ssRNA 2-aminopurine-שכותרתו ' נשאר קבוע יחסית עם ריכוז P3 מגוונת, המציין היעדר קשירה של הרשות הפלסטינית P3 ssRNA.

Pna המכיל Q משקעים (P2, P3) הצג לא תרמית התכה מעברים (איור 7), רומז לא מחייב ssRNA. זאת בשל ההתנגשות הסטריים נוכח ווטסון-קריק. כמו זוג Q-G. בהשוואה ל- P1 הרשות הפלסטינית שלא שונתה, P4 Pna ומכילה P5 ששינה שאריות L אך ללא שאריות Q, הצג ירדה טמפרטורות ההיתוך דופלקסים RNA-הרשות המתאימה בשל ההתנגשות הסטריים נוכח ווטסון-קריק. כמו זוג L-G. UV-ספיגת-זוהה תרמי ההיתוך הנתונים עקביים עם הנתונים טיטור פלורסצנטיות 2-aminopurine, אשר גם מראים כי הרשות הפלסטינית המכילה שאריות Q ו- L אפשרות לאגד ssRNA ניכרת (איור 6B 6E, 6F). בסיס Q הוא חמוד יותר מאשר בסיס L, כמו בסיס Q יש התנגשות הסטריים משמעותית יותר על היווצרות זוג ווטסון-קריק-כמו ש- G (איור 1F) לעומת זוג דמויי קריק ווטסון L G (איור 1E ).

Figure 1
איור 1 : מבנה כימי של מבנים יציבים בסיס משולש ולא יציב זוג בסיסים. (י-ם) מייג'ור-groove PNA· רנ א2 משולשים הבסיס של t · A-U (), C+· G-C (B), L· G-C (ג) ו- Q· C-G (D). (E, F) לא יציב ווטסון-קריק כמו הרשות הפלסטינית-RNA בסיסי זוגות של L-G (E) ו- Q-G (F). האות R מייצגת את עמוד השדרה של סוכר-פוספט של RNA. קשרי מימן מסומנים באמצעות קווים מקווקווים שחור. הדמות המופקת מן ההפניה31. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : מבנה כימי של הרשות הפלסטינית מונומרים. מוצגים ארבעה מונומרים הרשות הפלסטינית (T, C, L ו- Q). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : המבנה הכימי של הרשות הפלסטינית אוליגומר וכן טיהור על ידי RP-HPLC- (א) המבנה הכימי של הרצף הרשות הפלסטינית P3. (ב, ג) RP-HPLC נתונים של P3 הרשות הפלסטינית גולמי (B) מחדש לטהר P3 הרשות הפלסטינית (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : MALDI-TOF הספקטרום של P3 הרשות הפלסטינית מטוהרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : סיכת ראש ה-RNA, רצפים של הרשות הפלסטינית ואפיון מחייב מאת דף שאינם denaturing. סיכות (A) RNA (rHP1 ו- rHP2), הרשות הפלסטינית P3, PNA· רנ א2 טריפלקס נוצרו בין הרשות הפלסטינית P3 rHP2. דף Non-denaturing (B) (12%) תוצאות עבור rHP1 ו- rHP2 מחייב את הרשות הפלסטינית P3. המאגר הדגירה הוא 200 מ מ NaCl, 0.5 מ מ EDTA, 20 מ מ. HEPES, pH 7.5. סיכות RNA טעון (rHP1 ו- rHP2) הינם 1 מיקרומטר ב 20 µL. הריכוזים הרשות הפלסטינית הנמצאים בסמטאות משמאל לימין הם 0 0.2 0.4, 1, 1.6, 2, 4, 10, 16, 20, 28, ו- 50 מיקרומטר. הרשות הפלסטינית P3 אפשרות לאגד rHP1 (לוח העליון) אבל נקשר rHP2 (פאנל התחתונה). (ג) Kנחישותd עבור איגוד P3 כדי rHP2. השבר של היווצרות טריפלקס (Y) הייתה להתוות נגד הריכוז הרשות הפלסטינית. הדמות היא ממאמרו של הפניה31. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6 : קרינה פלואורסצנטית טיטור מחקר של איגוד הרשות הפלסטינית P3כדי הנקרא-2-aminopurine RNAs. השאריות 2-aminopurine מיועדת כמו '2' ברצף ה-RNA. המאגר הדגירה הוא 200 מ מ NaCl, 0.5 מ מ EDTA, 20 מ מ. HEPES, pH 7.5. (א) PNA· רנ א2 טריפלקס נוצרו בין P3 של dsRNA 2-aminopurine-שכותרתו ' (dsRNA2-2AP). דופלקס הרשות הפלסטינית-RNA היפותטי (B) A נוצר בין P3 ssRNA 2-aminopurine-שכותרתו ' (ssRNA2-2AP). (C, E) קרינה פלואורסצנטית ספקטרום הפליטה עבור 2-aminopurine-שכותרתו ' RNA דופלקס (1 מיקרומטר) ו ssRNA (1 מיקרומטר), בהתאמה, עם מגוון P3 ריכוז ב- pH 7.5. הפסגה-בסביבות 475 nm נובע פליטת קרינה פלואורסצנטית חלש הבסיס L הרשות הפלסטינית. (D, F) K נחישות d בהתבסס על העלילות של עוצמת קרינה פלואורסצנטית 2-aminopurine (ב- 370 ננומטר) של RNA דופלקס, ssRNA, בהתאמה, לעומת הרשות הפלסטינית P3 ריכוז. הדמות היא ממאמרו של הפניה31. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7 : תרמית התכה תוצאות ה-RNA-PNA דופלקסים. המאגר הדגירה הוא 200 מ מ NaCl, 0.5 מ מ EDTA, 20 מ מ NaH2PO4, pH 7.5. כל הדגימות להכיל 5 מיקרומטר RNA חד-גדילי (ssRNA1), ואת הרשות הפלסטינית ב- 130 µL. (א) RNA חד-גדילי (ssRNA1), Pna (P1, P2, P3, P4 ו P5) היפותטי דופלקס הרשות הפלסטינית-RNA שנוצר בין הרשות הפלסטינית P3 ssRNA1 בכיוון מקביל. הקלאש הסטריים הוא הצביע עבור ווטסון-מהנחל כמו ש- G ו- L-G זוגות. התכה (B) ' עקומות ' עבור Pna שונים מחייב את ssRNA1. טמפרטורות ההיתוך מוצגים על העיקולים עם התכה מעברים. הדמות היא ממאמרו של הפניה31.

Discussion

RNA oligomers של הרשות הפלסטינית מחייב דופלקס (למשל, 10-מרס) הם מולקולות בגודל בינוני, ובכך יכול להראות electrophoretic ניידות shift בעת איגוד RNAs בגודל דומות או מעט גדול יותר (לדוגמה, 50-מר או קטן יותר). אם RNA הוא גדול יותר באופן משמעותי מאשר הרשות הפלסטינית, טיטור של הרשות הפלסטינית לתוך RNA לא יפעלו עקב שינוי הניידות ג'ל מוגבלת. לפיכך, הרנ א גדולים עשויים להיחתך עבור מבחני דף שאינם denaturing. טיטור של RNA גדול אל הרשות הפלסטינית התווית על-ידי fluorophore מאפשר פיקוח על היווצרות טריפלקס על ידי ג'ל agarose ללא denaturing עם הדגימה טעון באמצע ג'ל40.

עבור ניסוי טיטור מאת שאינם denaturing דף עם ריכוז מוחלט קבוע של RNA, אנחנו בדרך כלל להשתמש ללא תווית של RNA ריכוז 1 מיקרומטר עבור פוסט יעיל מכתים של RNA חופשי, להקות טריפלקס על ידי אתידיום ברומיד. ריכוז ה-RNA המתחילים 0.2 µM ייתכן גם יספיק בהתאם הבונה RNA31. ריכוז RNA ללא תווית (0.2 µM) קובע כי הערכיםד Kניתן למדוד באופן מדויק צריך להיות על 0.2 µM או גדול יותר. צבעי מכתימים אחרים עשוי לשמש כדי לשפר את היעילות מוכתמים. לחלופין, נתונים שלא פורסמו שלנו מראים כי Cy3 RNAs שכותרתו צבען יכול לשמש בניסויים דף שאינו denaturing כדי למדוד את האירועים איגוד חזק.

בשל העובדה כי 2-aminopurine הוא רק בינוני פלורסנט, 2-aminopurine קרינה פלואורסצנטית טיטור מוגבל גם למדידה של האיגוד עם ערכיםד Kקרוב או מעל 0.2 µM31. את הרנ א או הרשות יכולה להיקרא עם צבע בהיר יחסית אורגנים מחייב יחסית חזק על פתרון באמצעות טיטור פלורסצנטיות, אם הכריכה גורמת לשינויים פלורסצנטיות אותות53,54, 55.

האסטרטגיה של פילוח RNA מבנים על ידי איגוד dsRNA Pna נבדקו עבור מספר מוגבל של RNAs. סביר כי איגוד מאפיינים עשויים להשתנות עבור dsRNAs עם יצירות רצפים וזוג בסיס שונים. אדם יכול תמיד לבחור סטרנד פורין עשיר של דופלקס על עיצוב האתר של TFPNAs. זה קריטי להבין איך ברציפות Q· C-G משולשים עשוי להשפיע על יציבות טריפלקס. מחקרים מקיפים יותר תלוית רצף בבירור הדרושים כדי להבין את מאפייני האיגוד תלוית רצף של TFPNAs.

זיקה מחייבת של TFPNAs יכול להיות משופרת נוספת על ידי הגדלת האורך ו/או שינוי עוד יותר את עמוד השדרה ובאוהלי56,57 של TFPNAs. עם זאת, אזור דופלקס רציף לא לעיתים קרובות מורכבים יותר מ- 10 זוגות בסיס רצופים ללא הפרעה על ידי מבנים שאינם-ווטסון-קריק. אחד אולי נזווג TFPNAs עם מולקולות קטנות להכרה הלא-ווטסון-קריק במבנים סמוכים לאזורים dsRNA. בעקרון, המספר המשלים מולקולת TFPNA-קטן צפוי פופולארים זיקה מחייבת וספציפיות ביחס TFPNA או מולקולה קטנה לבד. עם זאת, מאפייני מקשר עבור ההטיה58,59,60,61,62,63,64 כימיים חייב להיות מותאם.

העובדה כי TFPNAs יכול באופן סלקטיבי לאגד dsRNAs על ssRNAs ועל dsDNAs מרמז שזה אפשרי לפתח TFPNAs וגם מאוד שימושי הגששים כימי פוטנציאלי ליגנדים טיפולית באמצעות ויסות dynamics מבניים RNA ואינטראקציות עם חלבונים, מטבוליטים. ספיגת הסלולר של TFPNAs עשויים להקל דרך הבניין עם חודר לתא moieties כמו מולקולות קטנות, פפטידים, חלקיקים, או complexation עם מבנים סופרא מולקולרית כגון ליפוזומים5,6 ,12,17,25,31,41,65,66. להמשיך functionalization של TFPNAs עם bioimaging תגיות כגון fluorophores ופילטרציה-מיכשור וציוד עשוי לקדם את הזיהוי, הדמיה, והיעדים של מבנים פונקציונליים RNA היצורים החיים.

Disclosures

כבר הגיש בקשה לרישום פטנט (פט/179/14/15/PCT) בהתבסס על העבודה שדווחו פה.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי סינגפור משרד החינוך (מו) Tier 1 (RGT3/13 ו- RG42/15-G.C.) ו מו Tier 2 (MOE2013-T2-2-024 וגם MOE2015-T2-1-028 כדי G.C.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Molecular sieves, 4A, 1-2 mm diameter pellets  Alfa Aesar 87956
4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHAŸHCl) Sigma-Aldrich 532444
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) Alfa Aesar A11801
(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP) Alfa Aesar B25251
Acetic anhyride Sigma-Aldrich 320102
Kaiser Test Kit  Sigma-Aldrich 60017
Trifluoroacetic acid (TFA) Alfa Aesar L06374
Unmodified PNA monomers ASM Research Chemicals GmbH 5004007, 5004008, 5004009, 5004010
Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH Sigma-Aldrich B8389 / 47624
Thioanisole Alfa Aesar A14846
1,2-Ethanedithiol Alfa Aesar L12865
Trifluoromethanesulfonic acid Alfa Aesar A10173
LiChrosper® 100 RP-18 endcapped (5 µm) LiChroCART® 250-4 Merck Millipore 150838
RNA Oligos  Sigma-Aldrich Customized 
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) Sigma-Aldrich 39468
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Alfa Aesar J15694
HEPES  Lonza 17-737E
Acrylamide Sigma-Aldrich A8887
N.N'-methylenebisacrylamide Sigma-Aldrich  146072
Ammonium persulfate (APS) Bio-rad 161-0700
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-rad 161-0800
10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3 1st Base BUF-3010-10X1L
Glycerol  Promega  H5433
Ethidium bromide (10 mg/mL) Bio-rad  161-0433
High Precision Cell (Quartz Suprasil, 200-2500 nm) Hellma Analytics  105.250-QS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cech, T. R., Steitz, J. A. The noncoding RNA revolution-trashing old rules to forge new ones. Cell. 157 (1), 77-94 (2014).
  2. Velagapudi, S. P., Gallo, S. M., Disney, M. D. Sequence-based design of bioactive small molecules that target precursor microRNAs. Nat Chem Biol. 10, 291-297 (2014).
  3. Patil, K. M., Chen, G. Modified Nucleic Acids in Biology and Medicine. Jurga, S., Erdmann, V. A., Barciszewski, J. , Springer International Publishing. 299-317 (2016).
  4. Hyrup, B., Nielsen, P. E. Peptide nucleic acids (PNA): synthesis, properties and potential applications. Bioorg Med Chem. 4 (1), 5-23 (1996).
  5. Shiraishi, T., Nielsen, P. E. Improved cellular uptake of antisense peptide nucleic acids by conjugation to a cell-penetrating peptide and a lipid domain. Methods Mol Biol. 751, 209-221 (2011).
  6. Shiraishi, T., Nielsen, P. E. Nanomolar cellular antisense activity of peptide nucleic acid (PNA) cholic acid ("umbrella") and cholesterol conjugates delivered by cationic lipids. Bioconjugate Chem. 23 (2), 196-202 (2012).
  7. Khoo, B., Roca, X., Chew, S. L., Krainer, A. R. Antisense oligonucleotide-induced alternative splicing of the APOB mRNA generates a novel isoform of APOB. BMC Mol Biol. 8, 3 (2007).
  8. Stein, C. A., et al. Efficient gene silencing by delivery of locked nucleic acid antisense oligonucleotides, unassisted by transfection reagents. Nucleic Acids Res. 38 (1), 3 (2010).
  9. Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nat Rev Drug Discov. 11 (2), 125-140 (2012).
  10. Peacey, E., Rodriguez, L., Liu, Y., Wolfe, M. S. Targeting a pre-mRNA structure with bipartite antisense molecules modulates tau alternative splicing. Nucleic Acids Res. 40 (19), 9836-9849 (2012).
  11. Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3 (1), 1 (2012).
  12. Ma, X., et al. Intracellular delivery of antisense peptide nucleic acid by fluorescent mesoporous silica nanoparticles. Bioconjugate Chem. 25 (8), 1412-1420 (2014).
  13. Wojtkowiak-Szlachcic, A., et al. Short antisense-locked nucleic acids (all-LNAs) correct alternative splicing abnormalities in myotonic dystrophy. Nucleic Acids Res. 43 (6), 3318-3331 (2015).
  14. Lenartowicz, E., et al. Antisense Oligonucleotides Targeting Influenza A Segment 8 Genomic RNA Inhibit Viral Replication. Nucleic Acid Ther. 26 (5), 277-285 (2016).
  15. Avitabile, C., et al. Targeting pre-miRNA by peptide nucleic acids: a new strategy to interfere in the miRNA maturation. Artif DNA PNA XNA. 3 (2), 88-96 (2012).
  16. Barczak, A. K., et al. RNA signatures allow rapid identification of pathogens and antibiotic susceptibilities. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (16), 6217-6222 (2012).
  17. Das, I., et al. A peptide nucleic acid-aminosugar conjugate targeting transactivation response element of HIV-1 RNA genome shows a high bioavailability in human cells and strongly inhibits tat-mediated transactivation of HIV-1 transcription. J Med Chem. 55 (13), 6021-6032 (2012).
  18. Fabani, M. M., et al. Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids. Nucleic Acids Res. 38 (13), 4466-4475 (2010).
  19. Riguet, E., et al. A peptide nucleic acid-neamine conjugate that targets and cleaves HIV-1 TAR RNA inhibits viral replication. J Med Chem. 47 (20), 4806-4809 (2004).
  20. Torres, A. G., et al. Chemical structure requirements and cellular targeting of microRNA-122 by peptide nucleic acids anti-miRs. Nucleic Acids Res. 40 (5), 2152-2167 (2012).
  21. Upadhyay, A., Dixit, U., Manvar, D., Chaturvedi, N., Pandey, V. N. Affinity capture and identification of host cell factors associated with hepatitis C virus (+) strand subgenomic RNA. Mol Cell Proteomics. 12 (6), 1539-1552 (2013).
  22. Wesolowski, D., et al. Basic peptide-morpholino oligomer conjugate that is very effective in killing bacteria by gene-specific and nonspecific modes. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (40), 16582-16587 (2011).
  23. Armitage, B. A. The impact of nucleic acid secondary structure on PNA hybridization. Drug Discov Today. 8 (5), 222-228 (2003).
  24. Thomas, S. M., et al. Antitumor effects of EGFR antisense guanidine-based peptide nucleic acids in cancer models. ACS Chem Biol. 8 (2), 345-352 (2013).
  25. Bahal, R., McNeer, N. A., Ly, D. H., Saltzman, W. M., Glazer, P. M. Nanoparticle for delivery of antisense gammaPNA oligomers targeting CCR5. Artif DNA PNA XNA. 4 (2), 49-57 (2013).
  26. Adams, B. D., Parsons, C., Walker, L., Zhang, W. C., Slack, F. J. Targeting noncoding RNAs in disease. J. Clin. Invest. 127 (3), 761-771 (2017).
  27. Matsui, M., Corey, D. R. Non-coding RNAs as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 16 (3), 167-179 (2017).
  28. Devi, G., Zhou, Y., Zhong, Z., Toh, D. -F. K., Chen, G. RNA triplexes: from structural principles to biological and biotech applications. Wiley Interdiscip Rev RNA. 6 (1), 111-128 (2015).
  29. Rozners, E. Recent Advances in Chemical Modification of Peptide Nucleic Acids. J Nucleic Acids. 2012, 8 (2012).
  30. Devi, G., Yuan, Z., Lu, Y., Zhao, Y., Chen, G. Incorporation of thio-pseudoisocytosine into triplex-forming peptide nucleic acids for enhanced recognition of RNA duplexes. Nucleic Acids Res. 42 (6), 4008-4018 (2014).
  31. Toh, D. K., et al. Incorporating a guanidine-modified cytosine base into triplex-forming PNAs for the recognition of a C-G pyrimidine-purine inversion site of an RNA duplex. Nucleic Acids Res. 44 (19), 9071-9082 (2016).
  32. Li, M., Zengeya, T., Rozners, E. Short peptide nucleic acids bind strongly to homopurine tract of double helical RNA at pH 5.5. J Am Chem Soc. 132 (25), 8676-8681 (2010).
  33. Gupta, P., Zengeya, T., Rozners, E. Triple helical recognition of pyrimidine inversions in polypurine tracts of RNA by nucleobase-modified PNA. Chem Commun. 47 (39), 11125-11127 (2011).
  34. Zengeya, T., Li, M., Rozners, E. PNA containing isocytidine nucleobase: synthesis and recognition of double helical RNA. Bioorg Med Chem Lett. 21 (7), 2121-2124 (2011).
  35. Gupta, P., Muse, O., Rozners, E. Recognition of double-stranded RNA by guanidine-modified peptide nucleic acids. Biochemistry. 51 (1), 63-73 (2012).
  36. Zengeya, T., Gupta, P., Rozners, E. Triple-helical recognition of RNA using 2-aminopyridine-modified PNA at physiologically relevant conditions. Angew Chem Int Ed. 51 (50), 12593-12596 (2012).
  37. Muse, O., et al. Sequence selective recognition of double-stranded RNA at physiologically relevant conditions using PNA-peptide conjugates. ACS Chem Biol. 8 (8), 1683-1686 (2013).
  38. Hnedzko, D., Cheruiyot, S. K., Rozners, E. Using Triple Helix Forming Peptide Nucleic Acids for Sequence-selective Recognition of Double-stranded RNA. Curr Protoc Nucleic Acid Chem. 58, 61-64 (2014).
  39. Zengeya, T., Gupta, P., Rozners, E. Sequence selective recognition of double-stranded RNA using triple helix-forming peptide nucleic acids. Methods Mol Biol. 1050, 83-94 (2014).
  40. Endoh, T., Hnedzko, D., Rozners, E., Sugimoto, N. Nucleobase-Modified PNA Suppresses Translation by Forming a Triple Helix with a Hairpin Structure in mRNA In Vitro and in Cells. Angew Chem Int Ed. 55 (3), 899-903 (2016).
  41. Hnedzko, D., McGee, D. W., Karamitas, Y. A., Rozners, E. Sequence-selective recognition of double-stranded RNA and enhanced cellular uptake of cationic nucleobase and backbone-modified peptide nucleic acids. RNA. 23 (1), 58-69 (2017).
  42. Wexselblatt, E., Esko, J. D., Tor, Y. On guanidinium and cellular uptake. J Org Chem. 79 (15), 6766-6774 (2014).
  43. Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal. Biochem. 34 (2), 595-598 (1970).
  44. Roberts, R. W., Crothers, D. M. Stability and properties of double and triple helices: dramatic effects of RNA or DNA backbone composition. Science. 258 (5087), 1463-1466 (1992).
  45. Zhou, Y., et al. Recognition of RNA duplexes by chemically modified triplex-forming oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 41 (13), 6664-6673 (2013).
  46. Gisin, B. F. The monitoring of reactions in solid-phase peptide synthesis with picric acid. Anal. Chim. Acta. 58 (1), 248-249 (1972).
  47. Gogoi, K., Mane, M. V., Kunte, S. S., Kumar, V. A. A versatile method for the preparation of conjugates of peptides with DNA/PNA/analog by employing chemo-selective click reaction in water. Nucleic Acids Res. 35 (21), 139 (2007).
  48. Shabanpoor, F., Gait, M. J. Development of a general methodology for labelling peptide-morpholino oligonucleotide conjugates using alkyne-azide click chemistry. Chem Commun. 49 (87), 10260-10262 (2013).
  49. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A Stepwise Huisgen Cycloaddition Process: Copper(I)-Catalyzed Regioselective "Ligation" of Azides and Terminal Alkynes. Angew Chem Int Ed. 41 (14), 2596-2599 (2002).
  50. Haaima, G., Hansen, F. H., Christensen, L., Dahl, O., Nielsen, P. E. Increased DNA binding and sequence discrimination of PNA oligomers containing 2,6-diaminopurine. Nucleic Acids Res. 25 (22), 4639-4643 (1997).
  51. Schroeder, S. J., Turner, D. H. Methods Enzymol. 468, Academic Press. 371-387 (2009).
  52. McDowell, J. A., Turner, D. H. Investigation of the Structural Basis for Thermodynamic Stabilities of Tandem GU Mismatches: Solution Structure of (rGAGGUCUC)2 by Two-Dimensional NMR and Simulated Annealing. Biochemistry. 35 (45), 14077-14089 (1996).
  53. Sato, T., Sato, Y., Nishizawa, S. Triplex-Forming Peptide Nucleic Acid Probe Having Thiazole Orange as a Base Surrogate for Fluorescence Sensing of Double-stranded RNA. J Am Chem Soc. 138 (30), 9397-9400 (2016).
  54. Cheruiyot, S. K., Rozners, E. Fluorescent 2-Aminopyridine Nucleobases for Triplex-Forming Peptide Nucleic Acids. ChemBioChem. 17 (16), 1558-1562 (2016).
  55. Sato, T., Sato, Y., Nishizawa, S. Optimization of the Alkyl Linker of TO Base Surrogate in Triplex-Forming PNA for Enhanced Binding to Double-Stranded RNA. Chem Eur J. 23 (17), 4079-4088 (2017).
  56. Virta, P. M., Tahtinen, V., Granqvist, L., Murtola, M., Stromberg, R. 19F NMR spectroscopic analysis of the binding modes in triple helical PNA/microRNA-complexes. Chem Eur J. , (2017).
  57. Zengeya, T., Gindin, A., Rozners, E. Improvement of sequence selectivity in triple helical recognition of RNA by phenylalanine-derived PNA. Artif DNA PNA XNA. 4 (3), 69-76 (2013).
  58. Moses, A. C., Huang, S. W., Schepartz, A. Inhibition of Rev.RRE complexation by triplex tethered oligonucleotide probes. Bioorg Med Chem. 5 (6), 1123-1129 (1997).
  59. Ben Gaied, N., Zhao, Z., Gerrard, S. R., Fox, K. R., Brown, T. Potent triple helix stabilization by 5',3'-modified triplex-forming oligonucleotides. ChemBioChem. 10 (11), 1839-1851 (2009).
  60. Grimm, G. N., Boutorine, A. S., Lincoln, P., Norden, B., Helene, C. Formation of DNA triple helices by an oligonucleotide conjugated to a fluorescent ruthenium complex. ChemBioChem. 3 (4), 324-331 (2002).
  61. Tran, T., et al. Targeting the r(CGG) Repeats That Cause FXTAS with Modularly Assembled Small Molecules and Oligonucleotides. ACS Chem Biol. , (2014).
  62. Gianolio, D. A., Segismundo, J. M., McLaughlin, L. W. Tethered naphthalene diimide-based intercalators for DNA triplex stabilization. Nucleic Acids Res. 28 (10), 2128-2134 (2000).
  63. Rumney, S., Kool, E. T. Structural Optimization of Non-Nucleotide Loop Replacements for Duplex and Triplex DNAs. J Am Chem Soc. 117, 5635-5646 (1995).
  64. Stafford, R. L., Dervan, P. B. The reach of linear protein-DNA dimerizers. J Am Chem Soc. 129 (45), 14026-14033 (2007).
  65. Gupta, A., Bahal, R., Gupta, M., Glazer, P. M., Saltzman, W. M. Nanotechnology for delivery of peptide nucleic acids (PNAs). J Control Release. 240, 302-311 (2016).
  66. Avitabile, C., et al. Incorporation of Naked Peptide Nucleic Acids into Liposomes Leads to Fast and Efficient Delivery. Bioconjugate Chem. 26 (8), 1533-1541 (2015).

Tags

גנטיקה גיליון 127 הרשות הפלסטינית טריפלקס מבנה רנ א דופלקס RNA מחייב RNA ליגנדים סינתזה פפטיד מוצק-פאזי הלא denaturing עמוד 2-Aminopurine UV תרמי התכה הכרה מולקולרית זיקה מחייבת groove הגדולות
זיהוי רצף ספציפי, סלקטיבי של גדילי כפול RNAs מעל חד גדילי RNAs על ידי שינוי כימי חומצות גרעין פפטיד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Toh, D. F. K., Patil, K. M., Chen,… More

Toh, D. F. K., Patil, K. M., Chen, G. Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (127), e56221, doi:10.3791/56221 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter