Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

הערכה של מאפייני תאי אנדותל באמצעות תרבית תאים 3D ושאינם-anticoagulated דם קרישה ואנטי דלקתיות

doi: 10.3791/56227 Published: September 5, 2017

Summary

אנו מציגים במבחנה מודל המאפשר את מחקר וניתוח של קרישה בדם שאינו anticoagulated כולה,... בדיקות דם במערכת תלוי אפקט נוגד קרישה הטבעי של תאי אנדותל בריאים והתוצאה תא אנדותל הפעלת הקרישה.

Abstract

In vivo, תאי אנדותל מכריעים עבור בדיקות דם טבעי של כלי-דם. כתוצאה מכך, תאי אנדותל הפעלת מוביל דם קרישה. תופעה זו נצפית במצבים קליניים רבים, כמו השתלת איברים בנוכחות נוגדנים אנטי-תורם הקבועים מראש, כולל השתלת איברים מבעלי חיים, כמו גם איסכמיה/פגיעה reperfusion לפציעה. על מנת להפחית לניסויים בבעלי חיים על פי 3R סטנדרטים (צמצום, החלפה, עידון), במבחנה הדגמים כדי לחקור את ההשפעה של תאי אנדותל הפעלה על קרישת הדם יהיה רצוי מאוד. עם זאת, מערכות סטילס משותף התרבות תאי אנדותל מספקות יחס השטח לבנפח של 1-5 ס מ2 של אנדותל לכל מיליליטר דם, וזה לא מספיק עבור בדיקות דם טבעי, בתיווך אנדותל. Culturing תאי אנדותל על חרוזים microcarrier עשוי להגדיל את היחס בין השטח לבנפח 40-160 ס מ2/mL. יחס מוגבר זה מספיקה להבטיח את בדיקות דם "טבעי" של דם מלא, כך ניתן למנוע את השימוש תרופות נגד קרישת דם. כאן במבחנה microcarrier מבוססי מערכת מתואר לחקור את ההשפעות של ההנדסה הגנטית של תאי אנדותל חזירי על קרישת הדם של דם אנושי שלם, של אי-anticoagulated. ב וזמינותו המתואר, ראשי חזירי תאי אנדותל של אבי העורקים, או פראי סוג (WT) או הטרנסגניים האנושית CD46, thrombomodulin, היו גדל על microcarrier חרוזים, אז נחשפים דם אנושי טרי מצוירות בלתי-anticoagulated. דגם זה מאפשר מדידה של כימות של שחרור ציטוקינים, כמו גם הפעלת סמנים של המשלים קרישה בפלסמת הדם. בנוסף, הדמיה של תאי אנדותל מופעל, בתצהיר של immunoglobulins, חלבונים המשלים, קרישה על החרוזים endothelialized בוצעו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. Assay הזה יכול לשמש גם כדי לבדוק תרופות אשר אמורים למנוע הפעלת תאי אנדותל ובכך, קרישת הדם. על הפוטנציאל שלו כדי להפחית את מספר בעלי החיים שבהם משתמשים לחקירות כאלה, וזמינותו המתואר הוא קל לביצוע, לשחזור באופן עקבי.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

אנדותל כלי הדם מורכב טפט של תאי אנדותל (EC) אשר קו לומן של כלי הדם. במצב פיזיולוגי, EC השבתה הדרגתית אחראים על קיום קרישה וסביבה אנטי דלקתיות. 1 זה מתווך על ידי הביטוי של קרישה, חלבונים אנטי דלקתיות על פני EC. לדוגמה, הפעלת EC הנגרמת על ידי פגיעה reperfusion/איסכמיה פציעה או כלי דם על ידי דחיית (קסנו-) מושתלים איברים תוצאות שינוי פני השטח אנדותל קרישה, מצב דלקתי של פרו-מקריש, הפרו דלקתיים המדינה. 1

ככל האפשר את האינטראקציה מרתק ומורכב בין הגורמים אנדותל, קרישה, מודלים במבחנה המחקות כמו המצב ויוו הם רצוי מאוד. מגבלה נפוצה המאפיינת קונבנציונאלי במבחנה מבחני קרישת הדם הוא השימוש של דם anticoagulated, מה שהופך את הניתוח של קרישת הדם בתיווך ההשפעות המפרך, אפילו recalcification של דם מלא citrated לא יכול להתרבות תוצאות השגה עם דם טרי ללא-anticoagulated. 2 . חוץ מזה, במערכות תרבות מסורתית תא שטוח-מיטה זה בלתי אפשרי לנצל את מאפייני אנדותל קרישה כמו משטח תא אנדותל מספיקות לכל נפח הדם לא יכול להגיע. המודל המוצג כאן מתגבר על מגבלות אלה על-ידי culturing EC על פני השטח של microcarrier כדורי חרוזים, כך יחס השטח-כדי-דם EC של > /mL216 ס"מ ניתן להגיע, בדומה למצב רבים קטנים או ורידים, ו אשר תוארה להיות מספיק כדי לאפשר בדיקות דם "טבעי" של הדם על ידי השטח EC. 3 , 4 דם יכול לשמש ללא קרישה נוסף בהגדרה זו. ניתן לאסוף דגימות דם במהלך הניסוי, ציטוקינים, פקטורי קרישה, סמני הפעלת המשלים מסיסים ועוזרת לכמת. יתר על כן, חרוזים מצופים EC microcarrier עשוי להיות מנותח התצהיר המשלים, אימונוגלובולינים, כמו גם הביטוי של EC הפעלה סמנים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. יישום מעניין נוסף כולל בדיקה של תרופות אשר אמורים למנוע הפעלת תאי אנדותל ובכך, קרישת הדם. 5 . אף על פי מודל זה לחלוטין לא יכול להחליף ניסויים בבעלי חיים, הוא מציע שיטה לבדוק השערות ספציפיות תפקודית שמחוץ באמצעות תאים, ובכך להפחית את מספר בעלי החיים שבהם משתמשים במחקר בסיסי על איסכמיה/פגיעה reperfusion השתלת פציעה או (קסנו).

המודל שתואר שימש לחקות השתלת איברים מבעלי חיים הגדרת אילו חזירי תאי אנדותל של אבי העורקים (PAEC) גדל על החרוזים microcarrier, מודגרות עם דם אנושי שלם, ללא anticoagulated. PAEC הטרנסגניים שונים, נושאת מספר גנים אנושיים כגון CD46 הסדרת מערכת המשלים ו/או thrombomodulin (hTBM) הסדרת במערכת קרישת הדם, נותחו עבור מאפייניהם נוגד קרישה. מערכות הפעלה, המשלים, קרישה תא אנדותל הדוק נשלט, בינהם. 6 לכן חשוב להבין כיצד התאים הטרנסגניים שונים מתנהגים לאחר חשיפה דם אנושי ביחס אדהזיה מולקולה ביטוי ושחרור ציטוקינים, ששפך של glycocalyx ושל אובדן של חלבוני קרישה. 7

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

צמחי תרבות מסורתיים גרמנית חזירים (פראי סוג שחונך בבית חווה מקומיים ו הטרנסגניים bred המכון של גידול בעלי חיים מולקולרית, ביוטכנולוגיה, אוניברסיטת לודוויג-מקסימיליאן, מינכן, גרמניה), במשקל בין 30 ק ג עד 40 ק ג, שהיו בשימוש מחקר זה. כל החיות שוכנו בתנאים סטנדרטיים עם מים ומזון מודעה lib. כל הניסויים בוצעו על פי חוק חיות בבריטניה (וצפייה) המדריך NIH עבור הטיפול, שימוש של חיות מעבדה, כמו גם חוק שוויצרי. מחקרים שנעשו בבעלי חיים כל פעלו לפי ההנחיות יגיעו. הוועדה לניסויים בבעלי חיים של השירות הווטרינרי הקנטונים (קנטון של ברן, שווייץ) אישר כל ההליכים בבעלי חיים, רשות. לא. BE70/14. פרוטוקולים ניסיוני היו מעודנת על פי עקרונות 3R, המדינה-of-the-art הרדמה וניהול הכאב שימשו כדי לצמצם את מספר בעלי חיים, לצמצם את החשיפה של החיות מתח וכאב במהלך הניסויים.

דם אנשים בריאים שבסמל מערכת סגורה venipuncture על פי הנחיות השיפוט והאתיקה שוויצרי של בית החולים של אוניברסיטת ברן. הביטוי " הלא-anticoagulated דם " אומר כי הדם לא התייחסו עם קרישה לכל.

השלבים הבאים מבוצעות בתנאים סטריליים. היכרות עם התרבות התא הבסיסי סטרילי טכניקה נדרש.

1. בידוד של PAEC

הערה: אבי העורקים החזי מקטעים של 6 עד 10 ס מ, התקבלו לאללה חזירים גרמנית צמחי תרבות מסורתיים של 3 עד 6 חודשים של גיל (משמש לניסויים אחרים ב- vivo) ומיד הועבר לתוך בקבוק 500-מ"עמ המכיל אמצעי התעבורה (DMEM + 1% פניצילין/סטרפטומיצין).

  1. מראש מעיל צלחת 6-ובכן עם fibronectin 12.5 µg/mL ב- PBS 1 x ולמקם אותו באינקובטור ב 37 ° C עבור ה 1
  2. לחמם PBS עקר 1 x ותא תרבות בינוני (DMEM).
  3. להוציא את העורקים חזירי מאמצעי התחבורה.
  4. במקום אבי העורקים על צלחת פוליסטירן.
  5. לשטוף עם PBS חמה בעדינות מראש.
  6. לחתוך אבי העורקים longitudinally ותקן אותה באמצעות מחטים.
  7. להוסיף בינוני תרבות תא חמים על המשטח הפנימי כלי.
  8. תשאף בינוני התרבות תאים fibronectin ולהוסיף תא טריים תרבות בינוני (DMEM בתוספת 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו- 0.4% של תא אנדותל הצמיחה בינונית תוספת מיקס).
  9. לטבול מטלית כותנה אחד המדיום התרבות תאים. לנקות את ניצן צמר גפן על העליון של פני השטח הכלי הפנימי ובאיטיות באותו כיוון.
  10. לשפשף התאים באר אחת של 6-ובכן צלחת עגולה על ידי סיבוב.
  11. לעשות זאת גם עבור שאר הבארות.
  12. לבדוק תאים במיקרוסקופ ולמקם את הצלחת 6-ובכן חממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  13. לשנות את המדיום ביום השני ולשנות אותו שוב כל 2-3 ימים.
  14. כאשר תאים לא יהיו confluent, trypsinize תאים, זרע אותם לתוך בקבוקון T75 (PAEC P1).

2. אפיון PAEC

  1. מראש מעיל של chamberslide 8-ובכן עם fibronectin 12.5 µg/mL ב- PBS 1 x ולמקם אותו באינקובטור ב 37 ° C עבור ה 1
  2. זרע 5 x 10 4 תאים/טוב, דגירה בין לילה בחממה ב- 37 מעלות צלזיוס.
  3. לרחוץ את התאים פעמיים עם PBS ++ (PBS בתוספת CaCl 2 ו- MgCl 2), μL 300/טוב.
  4. לתקן תאים עם 3.7% paraformaldehyde 10 דקות בטמפרטורת החדר, μL 200/טוב.
  5. לרחוץ תאים 3 פעמים עם PBS ++, μL 300/טוב.
  6. להוסיף 300 μL של PBS 1 x-3_% BSA (מאגר חסימה) ולהשאיר 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. להחיל נוגדנים הראשי (anti-VE-קדהרין, anti-CD31, אנטי-vWF) מדולל ב- PBS 1x-1%BSA-0.05% דטרגנט, μL 160/טוב, תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר.
  8. לשטוף 3 פעמים עם PBS ++ (200 μL היטב).
  9. החל נוגדנים משניים, דאפי מדולל ב- PBS 1x-1%BSA-0.05% דטרגנט, μL 160/טוב, ולאחר תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר.
  10. לשטוף 3 פעמים עם PBS ++ (200 μL היטב).
  11. הר שקופיות בינונית הרכבה המבוסס גליצרול ולוודא תא אנדותל ביטוי סמני תחת מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית.
    הערה: ניתן להגיע תרבות חזירי תאי אנדותל אבי העורקים בבקבוקון T175 (DMEM גלוקוז נמוך בינוני + 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו- 0.4% של תא אנדותל הצמיחה בינונית תוספת תערובת) עד 90% הנהרות. (זריעה צפיפות עונה 1 פרק 10 6 תאים, 90% הנהרות שיתאימו בערך 5 x 10 6 תאים).

3. ציפוי של חרוזים Microcarrier

  1. לערבב mL 7 של חרוזים microcarrier עם 42 מ של קולגן פתרון שפופרת 50-mL (100 μg/mL, מדולל ב- 0.2% חומצה אצטית פתרון), תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר.
  2. לרחוץ חרוזים פעמיים עם 25 מ של PBS pH 7.4 (להוסיף 25 מ של PBS, מערבבים היטב עם pipet ולחכות עד החרוזים הם התיישבו ואז להשליך את תגובת שיקוע, חזור) פעם אחת עם 25 מיליליטר בינוני DMEM.
  3. מכסים את החרוזים לשפופרת 50-mL עם 10 מ"ל בינוני 199 בתוספת 10% FBS בסה כ, הפניצילין 1% / סטרפטומיצין, 1%-גלוטמין, 0.4% תא אנדותל הצמיחה בינונית תוספת תערובת ו 25 μL של הפארין (5000 IU/mL) ולאפשר equilibration 10 דקות לפני שימוש נוסף.

4. איסוף תאים

  1. להסיר המדיום התרבות תאים מן הבקבוק T175 המכיל PAEC ולהוסיף 5 מ של PBS pH 7.4.
  2. PBS להסיר מן הבקבוק T175.
  3. הוסף 5 מ של Trypsin-0.05% EDTA ואת תקופת דגירה של 3-4 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
  4. לאסוף את התאים על ידי שטיפה את הבקבוק עם 15 מ"ל של התא תרבות בינוני ולהעביר את המתלים בשפופרת 50-mL-
  5. צנטריפוגה תאים ב g x 1,200 במשך 8 דקות בטמפרטורת החדר, הסר בינוני עודף, resuspend בגדר ב 5 מ של מדיום התרבות התא.

5. זריעה תאים לתוך הבקבוק קדירות

  1. להוסיף 20 מ של התא תרבות בינוני התליה תא, resuspend.
  2. להוסיף 20 מ"ל תא תרבות בינונית (ללא תאים) לתוך הבקבוק פלב מ 500-ל.
  3. להוסיף את התאים החרוזים microcarrier שטף מהשלב 3.3 ומערבבים היטב עם פיפטה סרולוגית 25-mL-
  4. להעביר את התערובת חרוזים/תא לתוך הבקבוק טווה מגנטי.
  5. שטוף הצינורית 50-mL עם 10 מ"ל של תא בינוני תרבות כדי לאסוף את התאים הנותרים.
  6. להוסיף אוטם 85 נוספים של התא תרבות בינוני הבקבוק טווה ולמקם אותו לתוך החממה ללון ב- 37 מעלות צלזיוס על מטרף (g 100 x, ערבוב מרווח: 3 דקות כל 45 min).
  7. להוסיף 50 מ של התא תרבות בינוני (נפח כולל 200 מ ל) ולהמשיך ערבוב במשך 24 שעות נוספות-37 מעלות צלזיוס על מטרף (g 100 x, ערבוב מרווח: 3 דקות כל 45 min).
  8. בינוני RPMI השקופה הוספה (בתוספת 10% FBS בסה כ, הפניצילין 1% / סטרפטומיצין, 1%-גלוטמין, 0.4% תא אנדותל הצמיחה בינונית תוספת תערובת ו 25 μL של הפארין) עד 320 מ של הנפח הכולל.
  9. להחליף את המדיום כל 48 ח': להסיר 100 מיליליטר המדיום הישן ולהוסיף 100 מ של טרי RPMI השקופה שהושלם.
  10. התרבות התאים במשך 5 עד 7 ימים. משך הזמן תלוי מצב זרימה של חרוזים מצופים תא.
< p class = "ג'וve_title "> 6. אימות הנהרות

  1. לאסוף μL 200 של חרוזים מצופים התא באמצעות פיפטה ולהעביר אותם לתוך צינור פוליפרופילן.
  2. לרחוץ את החרוזים 3 פעמים עם 600 μL של PBS 1 x (להוסיף PBS, להטות את שפופרת, מערבבים בעדינות כדי למנוע ניתוק של התאים, לחכות את החרוזים כדי להתיישב, למחוק את PBS וחזור).
  3. לתקן את החרוזים 10 דקות על-ידי הוספת μL 200 של חומצה parapicric.
  4. שטיפת 3 פעמים עם 600 μL של PBS 1 x.
  5. להוסיף דאפי מדולל ב- PBS 1 x דגירה במשך 10 דקות
  6. להעביר את החרוזים על משטח זכוכית ולהחיל את coverslip באמצעות המבוסס גליצרול הרכבה בינונית.
  7. להמחיש את החרוזים תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.

7. ניתוח ניסיוני

  1. להסיר את החרוזים מצופים תא מן הבקבוק פגים (הליכים לא צריך להיעשות בתנאים סטריליים) עם פיפטה סרולוגית 10-mL ולהעביר אותם לתוך צינורות פוליפרופילן סיבוב המדרגה 12 mL-
  2. לתת החרוזים להתיישב (בסביבות 1-2 דקות) ולהסיר עודפי בינונית.
  3. להוסיף יותר חרוזים הצינורות עד כל שפופרת מכיל בדיוק 2 מ"ל של חרוזים.
  4. להוסיף 5-mL RPMI ברור כל שפופרת ומערבבים היטב בעזרת פיפטה סרולוגית 10-mL-
  5. לתת החרוזים להתיישב ולהסיר עודפי בינונית.
  6. חזור על הפעולות כביסה פעם נוספת עם RPMI ולהסיר כל עודף בינונית.

8. הדגירה בדם Non-anticoagulated

  1. לאט ובזהירות (באמצעות סילון וגם vacutainers) להוציא. דם מתנדבים בריאים ולאסוף זה 9 מ ל צינורות פוליפרופילן ניטרלי (לא נוגד קרישה).
  2. להעביר לאט 8 מ של דם עם פיפטה סרולוגית 10-mL לתוך כל צינורות פוליפרופילן המכיל 2 מ"ל של חרוזים מצופים תא (לנפח הכללי יהיה 10 מ ל). תמיד להימנע טיפול אגרסיבי של דם או חרוזים כדי למנוע הפעלת EC מוקדמת. ההליך לוקח 1-2 דקות
  3. בקפידה להטות את תערובת דם/חרוז כדי להבטיח ערבוב שווה. ואטמו את הכובע עם סרט פרפין.
  4. במקום הצינורות על טבלת הטיית אופקי (עם עדינה הגדרות הטיית בלבד) בתוך 37 ° C ואז הרשומה קרישת פעמים.
    1. במרווחי זמן קבועים, למשל אחרי 10, 20, 30, 50, 70, 90 דקות, להסיר לפחות 1.5-2 מ"ל של דם-חרוז תערובת לניתוח סרום או פלסמה.
      הערה: עבור 6 נקודות זמן אנו מציעים שיש יותר מ-3 משכפל בתוך קבוצה אחת של תאים, כפי שהדגימה הדם ייעשה צינורות שונים.
    2. אוסף של נסיוב, להשאיר את הדם והקרשה. כדי לאסוף הפלזמה, להוסיף EDTA או ציטראט 2 mL צינורות לפני הוספת דגימות דם.
    3. לאחסן הצינורות על קרח, צנטריפוגה ב g 2,500 x 10 דקות ב 4 ° C ו לאחסן סרום/פלזמה ב 80 ° C עד שימוש.
      הערה: פרטים על חומרים הינם מסופקים בכל טבלה של חומרים

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

לאחר 7-10 ימים של תרבות בתוך הבקבוק טווה (איור 1) התאים היו confluent, מכסה את כל המשטח של חרוזים microcarrier (איור 2). אימות של המדינה confluency היא צעד חשוב כי טפט הלא-confluent של EC-גרגרי יוביל ירידה ניכרת במסגרת זמן קרישת דם, בהתחשב microcarrier פני השטח של חרוזים היא חריפה פרו-מקריש (זמן הקרישה: 4 ± 1 דקות) ( איור 3).

נקודה חשובה נוספת, אשר צריך תשומת לב היא המהירות של הטיית צלחת. הטיית במהירות גבוהה תעצים קרישת הדם. התמשכות של זמן קרישה יכול להיות שנצפו ואם היה טפט של EC קיימים על פני השטח של חרוזים microcarrier. השימוש GalTKO/hCD46/hTBM PAEC הטרנסגניים הראו עלייה משמעותית במסגרת זמן הקרישה לעומת WT PAEC (איור 3). העדר xenoantigen גל-α-1, 3-גל-PAEC (GalTKO) הראו עלייה זמן (25 ± 8 דקות עבור PAEC WT) ו- 68 ± 30 דקות עבור PAEC GalTKO הקרישה. עוד עלייה חזקה זמן הקרישה נצפתה כאשר PAEC GalTKO/hCD46/hTBM נכחו microcarrier חרוזים (205 ± 32 min), מה שמרמז על מודולציה מוצלחת של המשלים (hCD46) והן מערכות קרישת הדם (hTBM). בסוף הניסוי מוגדר כאשר נוצר קריש דם גלוי. ההשתנות בתוך דגימות של אותו של הקבוצה הוא גם בשל אינטר assay-השתנות, התורם דם. בכל ניסוי היה משכפל 3, בכל פעם מישהו אחר תורם הדם שימש כדי להגביר את המהימנות של הנתונים. לגבי כל תורם, ניתוח דם (ספירת טסיות, WBC, RBC, של HCT ופרמטרים אחרים) בוצע על ידי מעבדות בריאות חיצוניים. התוצאות המוצגות באיור 3 התקבלו ניסויים שונים עם תורמים דם שונים.

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של וזמינותו מבוסס Microcarrier. (א) EC מורחבות ב T175 מבחנות, (B) הועבר לתוך מבחנות טווה יחד עם חרוזים מצופים קולגן microcarrier. (ג) טריים שאינם-anticoagulated דם נאסף מן מתנדבים בריאים, (ד) מעורבב עם חרוזים מצופים EC microcarrier, מודגרות ב 37 º C. הביטוי "הלא-anticoagulated דם" פירושו כי הדם לא התייחסו עם כל נוגד קרישה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: Immunofluorescence מכתים על חרוזים מצופים EC Microcarrier. חרוזים Microcarrier היו לאחזר, מוכתם CD31 (PECAM-1) כדי להעריך את confluency. הגרעינים היו מוכתמים בצבע כחול (דאפי), CD31 היה מוכתם באדום (Cy3). סרגל קנה מידה: 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: קרישה של לכלכלת שונה קרישת דם פעמים נקבעו באופן חזותי, בסוף הניסוי הוגדרה כאשר קריש דם גלוי נצפתה. אפקט חזק procoagulant נצפתה כאשר שאינם EC-מצופה microcarrier חרוזים נחשפו כל הלא-anticoagulated דם אנושי. העדר xenoantigen גל-α-1, 3-גל-PAEC (GalTKO) הראו עלייה זמן (25 ± 8 דקות עבור PAEC WT) ו- 68 ± 30 דקות עבור PAEC GalTKO הקרישה. התייקרות נוספת זמן הקרישה נצפתה כאשר PAEC GalTKO/hCD46/hTBM נכחו microcarrier חרוזים, מה שמרמז על מודולציה מוצלחת של המשלים (hCD46) והן מערכות קרישת הדם (hTBM). הנתונים מוצגים הממוצע ± סטיית התקן. ניתוח סטטיסטי נעשה שימוש ANOVA להשוואות מרובות עם תיקון Bonferroni. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

המודל המוצג כאן מתאים קרישה הקשורות לימודי המאפשר הניתוח של היבטים שונים של קרישת הדם והאינטראקציה שלו עם לכלכלת 8 במחקר השתלת איברים מבעלי חיים, זוהי מערכת שימושי כדי לבדוק את מאפייני קרישה שונים ECs חזירי מהונדסים לאחר דגירה עם דם אנושי 9.

השלבים הקריטיים ביותר של הפרוטוקול הם אלה המבטיח כיסוי תא מלאה (confluency) של גרגרי לפני תחילת הניסוי ואלה הנוגעים האוסף זהיר וטיפול של כל הלא-anticoagulated הדם כדי להימנע מוקדמת הפעלת טסיות עקב גזירה גבוהה, אשר עלולה להתרחש אם vacutainers משמשות לאיסוף הדם. 10 . עם זאת, מערכת זו יש מספר מגבלות, לרבות העדר מערכת סגורה recirculating, העדר גזירה פיזיולוגיות אשר כדאי מייצגים התנאים ויוו .

למרות מגבלות אלו, המודל המתואר מציע יתרונות רבים על פני כיום קיימים מודלים. עקב השימוש microcarrier חרוזים, השטח EC יחס נפח הדם גדל, המאפשר הקמת לסביבה אנטי מקריש ואנטי דלקתיות ושימוש של דם מלא ללא-anticoagulated. ב המודלים הנוכחיים של התרבות תאים שטוח-מיטה, זה בלתי אפשרי ולכן מנגנונים בהם מעורבים קרישת הדם עקב הפעלת EC ולכן דורשים את השימוש בבע ח. זה יכול להמנע באמצעות מודל חרוז microcarrier המתואר.

יתר על כן, מערכת זו מאפשרת קשת רחבה של יישומים. צדדיות שלה שוכן האפשרות של בדיקות סמים שונים או תרכובות אשר הם לא רק השתלת הקשורים (קסנו-) אלא גם למחלות. השפעת הסמים על אנדותל ועל במערכת קרישת הדם יכול להיות מוערך בקלות על ידי immunofluorescence, אליסה וניתוח מערך מולטיפלקס ההשעיה. זה נעשה בעבר במחקר על השפעת הטרנסגניים הביטוי של האדם thrombomodulin באווירה השתלת איברים מבעלי חיים. 11

שינוי אפשרי של השיטה המתוארת יכול להיות האוסף של דם מלא ללא anticoagulated ישירות לתוך צינורות אשר מלאים בעבר עם חרוזים מצופים תא במטרה לצמצם את הפעלת מגע אוויר ודם באמצעות פיפטה. השימוש של תאי אנדותל אבי העורקים אדם (HAEC) עשוי להיות פקד מעניין, הוא כבר שולב תוכניות לעתיד. ארגון ציפוי של הצינורות עשויים לשמש כדי לצמצם את המגע של הלא-anticoagulated דם עם האוויר, אשר ידוע להוביל ליצור קשר עם ההפעלה של המפל קרישת דם. אם הדם נמשך מהר מדי, לדוגמה באמצעות צינורות שאבה את הריצפה עם גומי stopcocks ו היכרות עם דם לתוך הצינור במטוס בסדר, ואז טסיות להיות מופעל, קרישה תתרחש מוקדם יותר. כדי למנוע הפעלת טסיות, השתמש קוטר גדול hypodermic מחטים (21ɢ - 16ɢ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי קרן המדע הלאומית השוויצרית (SNSF, 320030_156193 מענק מס). המחברים תודה ד ר בנואה Werlen למתן את החרוזים microcarrier Biosilon. אנו מודים גם פרופסור הנס פיטר קולר, פרופסור אנדרה Haeberli לקבלת עזרה בהתקנת הדגם חרוז microcarrier.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PAEC Isolated from pig aorta in our Lab
Microcarrier beads (Biosilon) Thermo Fisher Scientific 160-250
Collagen I, Bovine Gibco A10644-01
DMEM Gibco 21885-025
Medium 199 Sigma M7528
RPMI Gibco 32404-014
Neutral tubes Sarstedt 02.1726.001
Polypropylene tubes Simport T406-2A
Stirrer flasks Tecnomara
Biological stirrer Brouwer MCS-104S
Rat anti CD31 R&D Systems MAB33871 Dilution 1:100
Goat anti-rat IgG-Cy3 Jackson Immuno Research 112-166-003 Dilution 1:500
Goat anti VE-cadherin Santa Cruz sc-6458 Dilution 1:100
Rabbit anti vWF DAKO A0082 Dilution 1:100
Dk anti Gt IgG – Alexa 488 Molecular Probes A11055 Dilution 1:500
Goat anti Rabbit - FITC Southern Biotech 4050-02 Dilution 1:500
DAPI Sigma 32670-25MG-F Dilution 1 µg/mL
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
FBS Gibco 10270-106 Concentration: 10% in cell culture medium
Adapter Sarstedt 14.1205
Confocal microscope Carl Zeiss LSM 710
Image analysis software Image J Available for free at: https://imagej.net
Endothelial Cell Growth Medium SupplementMix PromoCell C-39216 2 mL in 500 mL of DMEM
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 Concentration: 1% in cell culture medium
L-Glutamine Gibco 25030-024 Concentration: 1% in cell culture medium
Heparinun natricum Drossa Pharm AG Stock concentration: 5000 U.I./ mL
Chamberslides Bioswisstec AG 30108
CaCl2 x 2H2O Merck 2382.0500
MgCl2 x6 H2O Merck 1.5833.1000
Tween 20 Axon Lab AG 9005-64-5
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A7030
Glycergel mounting medium Dako C0563

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).
  2. Rajwal, S., Richards, M., O'Meara, M. The use of recalcified citrated whole blood - a pragmatic approach for thromboelastography in children. Pediatric Anesthesia. 14, 656-660 (2004).
  3. Kohler, H. P., Muller, M., Mombeli, M., Mtraub, M. M., Maeberli, M. The Suppression of the Coagulation of Nonanticoagulated Whole-Blood in-Vitro by Human Umbilical Endothelial-Cells Cultivated on Microcarriers Is Not Dependent on Protein-C Activation. Thromb. Haemost. 73, 719-724 (1995).
  4. Biedermann, B., Rosenmund, A., Muller, M., Kohler, H. P., Haeberli, A., Straub, P. W. Human endothelial cells suppress prothrombin activation in nonanticoagulated whole blood in vitro. J. Lab. Clin. Med. 124, 339-347 (1994).
  5. Banz, Y., Cung, T., Korchagina, E. Y., Bovin, N. V., Haeberli, A., Rieben, R. Endothelial cell protection and complement inhibition in xenotransplantation: a novel in vitro model using whole blood. Xenotransplantation. 12, 434-443 (2005).
  6. Cowan, P. J., d'Apice, A. J. Complement activation and coagulation in xenotransplantation. Immunology and Cell Biology. 87, 203-208 (2009).
  7. Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M. A. M. J., oude Egbrink, M. G. A. The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization. Pflugers Arch. 454, 345-359 (2007).
  8. Wiegner, R., Chakraborty, S., Huber-Lang, M. Complement-coagulation crosstalk on cellular and artificial surfaces. Immunobiology. 221, 1073-1079 (2016).
  9. Bongoni, A. K., et al. Transgenic Expression of Human CD46 on Porcine Endothelium: Effect on Coagulation and Fibrinolytic Cascades During Ex Vivo Human-to-Pig Limb Xenoperfusions. Transplantation. 99, 2061-2069 (2015).
  10. Miyazaki, Y., et al. High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles. Blood. 88, 3456-3464 (1996).
  11. Wuensch, A., et al. Regulatory Sequences of the Porcine THBD Gene Facilitate Endothelial-Specific Expression of Bioactive Human Thrombomodulin in Single-and Multitransgenic Pigs. Transplantation. 97, 138-147 (2014).
הערכה של מאפייני תאי אנדותל באמצעות תרבית תאים 3D ושאינם-anticoagulated דם קרישה ואנטי דלקתיות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sfriso, R., Bongoni, A., Banz, Y., Klymiuk, N., Wolf, E., Rieben, R. Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood. J. Vis. Exp. (127), e56227, doi:10.3791/56227 (2017).More

Sfriso, R., Bongoni, A., Banz, Y., Klymiuk, N., Wolf, E., Rieben, R. Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood. J. Vis. Exp. (127), e56227, doi:10.3791/56227 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter