Summary
I denne protokol, fluorescently mærket T. cruzi blev sprøjtet ind i gennemsigtige zebrafisk larver og parasit motilitet blev observeret i vivo ved hjælp af lys ark Fluorescens mikroskopi.
Abstract
Chagas sygdom er en parasitisk infektion forårsaget af Trypanosoma cruzi, hvis motilitet ikke er kun vigtigt for lokalisering, men også for cellulære bindende og invasion. Nuværende dyremodeller til undersøgelse af T. cruzi tillader begrænset observation af parasitter in vivo, der repræsenterer en udfordring for forståelse parasit adfærd i de indledende faser af infektion hos mennesker. Denne protozo har en flagellaternes fase i både vektor- og pattedyr værter, men der er ingen undersøgelser, der beskriver dens motilitet i vivo. Formålet med dette projekt var at etablere en levende hvirveldyr zebrafisk model til at vurdere T. cruzi motilitet i det vaskulære system. Gennemsigtig zebrafisk larver blev sprøjtet med fluorescently mærket trypomastigotes og observeret ved hjælp af lys ark Fluorescens mikroskopi (LSFM), en invasiv metode til at visualisere levende organismer med høj optisk opløsning. Parasitter kan visualiseres for længere perioder på grund af denne teknik relativt lav risiko for solskader i forhold til Konfokal eller epifluorescensmikroskop mikroskopi. T. cruzi parasitter blev observeret rejser i kredsløbet af levende zebrafisk i forskellige størrelser blodkar og æggeblomme. De kunne også ses vedlagte blommesækken væg og atrioventrikulær ventilen trods de stærke kræfter tilknyttet hjerte sammentrækninger. LSFM af T. cruzi-podede zebrafisk larver er en værdifuld metode, der kan bruges til at visualisere parasitter i omløb og evaluere deres tropisme, migrationsmønstre og motilitet i den dynamiske miljø af hjerte-kar-systemet med et levende dyr.
Introduction
Chagas sygdom er forårsaget af en protozo parasit T. cruzi. Ca 6 til 7 millioner mennesker verden over er smittet med T. grusom. Sygdommen overføres primært i Latinamerika, men er blevet rapporteret i USA, Canada, og mange europæiske såvel som nogle vestlige Stillehav lande, primært på grund af migration af smittede personer1. Chagas er i vid udstrækning vektorbårne og overføres til mennesker ved kontakt med afføring fra hematophagic insekter i Triatominae underfamilie, almindeligt kendt som "kysse bugs". T. cruzi kan dog også sendes via blodtransfusioner, lodret overførslen fra mor til barn, eller indtagelse af mad forurenet med parasitter2. Den akutte fase af infektion er hovedsageligt asymptomatiske eller constitutively symptomatisk og varer fra 6 til 8 uger, hvorefter engagement i immunsystemet styrer parasit belastning, men helt fjerne ikke infektion3. De fleste individer derefter indtaste en kronisk asymptomatiske fase; dog udvikler næsten 30% af patienterne en symptomatisk, kronisk fase, hvor de hjerte system og mindre hyppigt fordøjelsessystemet og nervesystem er kompromitteret4. Dette scenario er en udfordring for sygdom behandling og kontrol, da der findes ingen vacciner, og der er kun to effektive lægemidler til Chagas: benznidazole og nifurtimox. Begge behandlinger kræver langvarig administration og kan have alvorlige bivirkninger2.
Øget forståelse af funktionsmåden for T. cruzi er adfærd i vivo afgørende for at parasitære migration, cellulære vedhæftet fil og invasion i værten; en mangel i vivo modeller begrænser udviklingen af nye terapeutiske tilgange. In vitro undersøgelser af T. cruzi infektion har vist, at motilitet af trypomastigotes er vigtigt for binding til vært cellemembraner og efterfølgende cellulære invasion5. Energi udtynding i trypomastigotes i fælles kultur med en modtagelige cellelinie har vist sig at reducere cellulær invasion6. Interessant, i trypanosomatids, har flagellaternes bevægelse også været karakteriseret som en unddragelse mekanisme mod parasit-specifikke antistoffer7.
Flagellaternes motilitet er blevet grundigt undersøgt i vitro i Trypanosoma brucei, et nært beslægtede parasitten, der forårsager afrikanske Trypanosomiasis8. In vitro undersøgelser af motilitet af disse trypanosomes viste at simulering af betingelserne for blod eller kropsvæsker, herunder viskositet og tilstedeværelsen af hindringer repræsentant af blodlegemer, er vigtigt for parasitten bevægelse fremad9 . Som af har endnu det ikke været muligt at visualisere bevægelse af parasitter i blodbanen i vivo.
Zebrafisk larver er en kraftfuld model til at studere vært-patogen interaktioner in vivo. De er små, billige og forholdsvis let at hæve sammenlignet med andre etablerede hvirveldyr modeller for Chagas sygdom. Zebrafisk har medfødte og adaptive immunforsvar ligner for mennesker, men deres adaptive immunsystem begynder at udvikle på 4 dage post befrugtning (dpf) og er ikke moden til en anden flere uger10. I den tidlige udvikling, når kun makrofager er til stede, er der et stort vindue for at studere parasit adfærd uden umiddelbar immun indblanding10. Men den største fordel af at udnytte zebrafisk larver som hvirveldyr model til at studere patogen opførsel ligger i deres optiske gennemsigtighed, hvilket gør dem modtagelig for mikroskopiske screening og imaging11. Derudover er der flere værktøjer til at manipulere fisk genetik. For eksempel, er Casper stamme en mutant linje af zebrafisk med ingen pigmentering, hvilket gør dyret fuldstændig gennemsigtig og nyttig for visualisering af individuelle organer og til real-time sporing af injicerede celler12.
En afgørende begrænsning af langsgående observation af hurtigt bevægende parasitter i live zebrafisk bruger Konfokal eller epifluorescensmikroskop mikroskopi ligger i er umuligheden billedbehandling på høje anskaffelses hastigheder og store penetration dybder med god billedkvalitet og lav risikoen for solskader. Lys ark fluorescens micsroscopy (LSFM) er en spirende billedbehandling teknik, der overvinder disse begrænsninger for at tillade disse observationer. Ved hjælp af en målsætning for at opdage fluorescens og en anden ortogonal belysning mål, der kun oplyser brændplanet af målet påvisning, er det muligt at opnå høj opløsning optisk sektioner i en Konfokal mikroskop, men med betydeligt reduceret solskader, selv hvad angår epifluorescensmikroskop mikroskopi13. LSFM teknik, der anvendes her er kaldet enkelt fly belysning mikroskopi (SPIM), hvor en tynd plade af lys oplyser et enkelt fly inden for zebrafisk larver.
Formålet med denne metode er at etablere larve zebrafisk som en levedygtig ikke-infektion model for forståelse T. cruzi motilitet og relaterede adfærd i vivo. For at opnå dette, vi injicerede gennemskuelige zebrafisk larver med fluorescently mærket trypomastigotes, cellulære form ansvarlig for infektion af mennesker, og identificeret bevægelighed for T. cruzi i hjerte-kar-omsætning af zebrafisk ved hjælp af LSFM.
Protocol
følgende protokoller blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget af Los Andes Universitet (CICUAL). Biosikkerhed niveau 2 (BSL-2) retningslinjer følges strengt for at forhindre forurening med patogenet T. cruzi.
Bemærk: dyrs pleje og vedligeholdelse: Casper zebrafisk, en genetisk modificerede stamme af zebrafisk (Danio rerio) bruges i denne protokol på grund af deres værdifulde optisk gennemsigtighed i alle udviklingstrin. Fisk manipuleres ved hjælp af optimal pleje betingelser for arter 14, i en 14 h lys-10 h mørke cyklus, på 28 ± 1 ° C i en pH-værdi (7,0-7,4) kontrollerede multi tanken recirkulerende vandsystem. Dyr er fodret to gange dagligt med levende artemia (Artemia salina) og beriget med opdræt mad. Alle protokollerne godkendtes af CICUAL på Universidad de los Andes (C.FUA_14-017).
1. forberedelse af æg vand
- Forbered 0,6 g/L akvariet salt i omvendt osmose (RO) eller deioniseret vand (DI) vand og Tilføj 0,01 mg/L methylenblåt til løsningen.
Bemærk: Den målte ledningsevne skal være af 400-500 µS/cm og pH niveau på 7,2-7.9. For at sænke pH, lufte æg vand i et par timer.
2. Forberedelse af Tricaine Stock løsning
- Forbered 0,4% tricaine stamopløsning ved at opløse 400 mg tricaine (MS-222) i 97,9 mL destilleret vand (ddH 2 O). Når pulveret er helt opløst, justere pH 7.0 ved hjælp af 2,1 mL 1M Tris (pH 9,0) og opbevares i køleskab løsningen.
3. Fremstilling af 1,0% lav smeltepunkt Agarosen
- opløse lavt smeltepunkt punkt Agarosen pulveret i egg vand til en endelig koncentration på 1,0%. Opvarm blandingen i mikroovn eller på en varmeplade med kontinuerlig omrøring indtil løsningen ved agarosegelelektroforese vises homogen.
- Opbevares i alikvoter ved 4 ° C i længere end en uge.
4. Parring Assay og embryonopsamlingsteam
- tre dage før injektioner oprettet parringer ved hjælp af sunde par af mandlige og kvindelige fisk i opdræt tanke. Berigelse med glas kugler og kunstige planter øger gydning. Parringer bør sat op i løbet af eftermiddagen og natten over til venstre.
- Den næste morgen, indsamle opfostrede æggene ved afdrypning tanken gennem en si og vask æg med vand, æg. Fjerne alle æg af invertere sien og hælde æg vand gennem sien i en petriskål. Hen til opbevare embryoner sund, rense deres vand ved at fjerne eventuelle rester og døde embryoner med overførsel plast pipette.
- Overførsel af embryoner til en inkubator ved en stabil temperatur på 28,5 ° C at tillade udviklingen af embryoner ifølge zebrafisk midlertidige standarder 15. Undersøge embryonerne to gange om dagen, og kassér inviable æg for at holde koblingen sund.
5. Embryo Dechorionation
Bemærk: denne procedure er påkrævet, hvis embryoner ikke er klækket på tidspunktet for indsprøjtning. I denne procedure, " larver " er dyr ud af deres chorion fra 48 timer efter befrugtning (hpf) fremefter.
- På dagen for eksperimentet, placere petriskålen indeholdende de raske embryoer under en dissekere Stereoskopet.
- Grab modsatte ender af chorion med to skarpe pincet (Dumont #5), og forsigtigt rive og pull åbne chorion. Omkring 5-6 larver er indsprøjtet ad gangen, og typisk 3-4 er afbildet.
- Fjerner chorions fra vandet ved hjælp af en overførsel pipette.
6. Forberede injektion materiale
- forberede 1,0 mm nåle ved hjælp af tynde væg glas kapillærer og en mikropipette puller enhed med følgende indstillinger: 2 lys vægte + 1 tung vægt, top trække sig 2 mm + 5 mm bund pull, 75.9 ° C (trin 1) + () 78.2 ° C Trin 2). Gemme nåle i en petriskål på en stribe af modeling ler. Den ideelle nål bør have en smal spids, som T. cruzi måler ca 20 x 1-3 µm og vil passere gennem nålen let. Længden på spidsen kan variere: en længere tip er nyttigt at nå dybere strukturer, men en kortere tip bliver mere stiv, at foretage injektion lettere for brugeren.
Bemærk: Nål tip størrelse afhænger af temperaturen anvendes: en højere temperatur for trin 2 resulterer i et længere og finere tip. - Udarbejde en 1,5% Agarosen løsning i ddH 2 O og hæld det i en 10 cm petriskål. Dække en dybde på ca. 1,0 cm.
- Placerer en præfabrikerede mikroinjektion mug over Agarosen og lad den størkne.
- Lift præfabrikerede mikroinjektion mug ud og tilføje ægget vand til opbevaring ved 4 ° C. Dette forhindrer Agarosen udtørring.
- Tilføj æg vand til tricaine stamopløsning til en endelig koncentration på 150 mg/L. butik på 4 ° C.
7. Celle kultur for parasitten vækst
- parasitter vedligeholdes i en menneskelig astrocytoma cellelinje (CRL-1718) ved hjælp af metoden beskrevet af Vargas-Zambrano et al. 16
- starte kultur af menneskelige celler i en T25 kultur kolber (areal = 25 cm 2) med en tæthed på 2 x 10 5 eller 4 x 10 5 celler i 4 mL af RPMI-1640 medium med 10% af føtalt kalveserum (FCS), suppleret med 2 mM L-glutamin, 4,5 g/L glukose, 10 mM HEPES, 1 mM pyruvat og 1% penicillin-streptomycin (benævnt " komplet media "). Inkuber astrocytoma kulturer ved 37 ° C i 5% CO 2 omgivelser.
- Når en éncellelag er sammenflydende, frigør celler ved hjælp af 2 mL 0,25% af trypsin-EDTA ved at inkubere dem for 3 min. ved 37 ° C. visuelt markere celler for udstationering, og blokere trypsin løsning ved hjælp af 3 mL af RPMI-1640 med 10% FCS i en 15 mL tube.
- Centrifuge cellesuspension for 5 min til 1.350 x g.
- Vaske den resulterende cellulære pellet i DMEM medium i en 15 mL rør og centrifugeres i 5 min til 1.350 x g på 22 ° C.
- Tælle celler manuelt i en Neubauer kammer og check for levedygtighed i et lysmikroskop på 40 X forstørrelse.
- Forsigtigt igen suspenderet cellulære pellet i 4 mL af komplette medier og bruge det til at oprette nye cellekulturer med 2 x 10 5 celler pr. T25 kultur kolbe.
8. T. cruzi kultur og mærkningsbestemmelserne
- parasitter er en stamme oprindeligt stammer fra en inficeret menneske og karakteriseret som T. cruzi DA stamme (MHOM/CO/01/DA), genotype diskret at skrive enhed (DTU) TcI 16. Efter 3 eller 4 dage for dyrkning, indsamle de bevægelige parasitter fra menneskelige astrocytoma celle cellekultur supernatant og centrifugeres i 5 min til 1.350 x g. kassere mellemlang.
Bemærk: Parasitter i komplet medium kan bruges til re kultur i forholdet 1:1 med astrocytoma celler i T25 kultur kolber. - Forsigtigt genopslæmmes toerstoffet i 10 mL sterilt 1 x fosfat Buffer saltvand (PBS) med 0,1% FCS og centrifugeres i 5 min på 1.350 x g.
- Supernatanten og genopslæmmes i 1 mL PBS. Tage 10 µL for at tælle de fritsvømmende parasitter i en Neubauer afdeling.
- Tage resten af de re suspenderede parasitter (990 µL) og tilføje 1 µL af Carboxyfluorescein diacetat SuccinimiDYL Ester (CFSE), slutkoncentration 5,0 µM. Incubate i 10 min ved stuetemperatur.
Bemærk: CFSE lager på 5 mM skal være aliquoted og vedligeholdt på -20 ° C. - Pellet parasitter (1.350 x g, 5 min). Rekonstruere parasit pellet ved at bladre til røret og vask i 10 mL af 1 x PBS-0.1% FCS efterfulgt af en efterfølgende spin (1.350 x g, 5 min).
- Supernatanten og forsigtigt genopslæmmes mærket parasit pellet i 1 X PBS med den passende mængde til at opnå en endelig koncentration på omkring 10-20 parasitter/nL injektionsvæske.
- Bruger en lille mængde (∼ 10 µL, ca 1 x 10 4 -2 x 10 4 parasitter) af trypomastigotes at vurdere levedygtighed og mærkning. En inverteret fluorescens mikroskop kan bruges til direkte visualisering af parasitter. I den overførte lys, tilstand, kontrollere, at parasitterne bevæger sig. I tilstanden fluorescens bruge filteret Fluorescein isothiocyanat (FITC) til at vurdere parasit mærkning.
9. Indsprøjte zebrafisk larverne
- parasit lastning
- tage 10 µL af parasitter fra ophvirvling (100 µL) og indlæse dem i de forseglede glas nåle ved hjælp af en 10 µL microloader pipette tip.
- Indsætte glas nålen i nål indehaveren af micromanipulator, bruge en magnetisk stand og sted ved siden af Stereoskopet.
- Brug af fine pincet under Stereoskopet, skære nålen skaber en stump åbne ende og måle drop størrelse for at opnå en Injektionsvolumen på 1 nL (dette er svarende til en perle diameter på 0,12-0,13 mm, målt i mineralolie 17). En længere tip er foretrukne, så nålen kan nå strukturer dybt inde i fisk uden at beskadige vævet. I denne protokol, en stump nål bruges, men en skrå nål kan bruges som.
- Montage
- bedøver larver af 48 hpf, med 150 mg/L tricaine. Kontroller, at de ikke reagerer på berøring, men sikre, at hjertet slår.
- Placer larverne i mikroinjektion Agarosen skimmel i en sideleje.
- Sæt nål holderen ved siden af Stereoskopet og justere micromanipulator, således at spidsen af nålen er i midten af synsfeltet. Flytte petriskålen forberedt i trin 6.2 - til 6.4, så larve blommesækken er tæt på nål-spids. Kontrollere tilstanden af larve til at sikre, at hjertet stadig bankende.
- Sæt microinjector værdier som følger: indsprøjtning pres 9,6 pounds per inch (psi), holde pres: 20 psi; 100 ms række gating; periodeværdi 1,9 (svarer til 10,9 ms). Mængden af injektionen bør være mellem 1-3 nL, med ca 10-20 parasitter/nL.
10. Injektion af parasitten
- Inject fisk i superior-forreste del af æggeblomme på kanalen af Cuvier. Dette skridt bør praktiseres for at sikre dyrenes overlevelse efter injektion. Det tager ca 10 min at injicere 5-6 larver held.
- Som et kontrolelement, indsprøjte 1-2 larver med samme køretøj volumen (1 x PBS).
- Overføre larve til friske æg vand straks.
11. LSFM montering af indsprøjtet larverne
- overføre larve injiceres med parasitter til en tom petriskål og fjern forsigtigt de omgivende vand med en plastik pipette og absorberende papir. Straks tilføje 100 µL forvarmet 1,0% lavt smeltepunkt punkt Agarosen (Se trin 3 til Agarosen forberedelse) til at dække larve. Sikre Agarosen ikke er over 40 ° C.
- Indsætte en lige ledning inde en 1.0 mm glas kapillær og bruge det som en stemplet til at suge op larve i en lodret position. Sørg for at efterlade en lille mængde af Agarosen ovenfor larve. Vent, indtil Agarosen størkner før udsætter larver (dette vil kræve et par minutter). Eventuelt skubbe overskydende Agarosen nedenfor larve og skære det ud
- Placere kapillar i mikroskop prøveholderen og skubbe ud i den ende, der indeholder larver, indtil det hænger gratis fra kapillar. Modellen kammer skal udfyldes med tricaine opløsning (150 mg/L) og temperaturen på 28 ° C.
- Placer larve foran elev af målet påvisning ved hjælp af en XYZ-micromanipulator system. Rotationer om den lodrette akse, brugsfasen en rotation. Positionering af larve bør ske i transmitteres lys tilstand tydeligt larve strukturer.
12. LSFM Imaging af indsprøjtet parasitter
- forandring til fluorescens mode og justere belysning intensitet samt eksponeringstid at mindske solskader og optimere tidsopløsning. For disse særlige eksperimenter, vi brugte en strøm på 2,8-3,0 mW for prøven og udsat hver ramme til 200 ms ved hjælp af et kamera med 6,45 µm pixels og ~ 70% kvante effektivitet på opdagelse bølgelængder. Disse indstillinger bør resultere i tilstrækkelig grad eksponerede billeder på omkring 5 frames/s. Sørg for at bruge et mål med den højeste mulige numerisk blænde.
- Start en video erhvervelse af region af interesse (ROI). I vores tilfælde, er parasitter observeret knyttet til ventiler og frit bevægelige omkring området hjertet. Det anbefales at tage en video af et enkelt fly over tid eller bruge micromanipulator eller piezo-galvo system til at fokusere forskellige planer, mens parasitten flytter.
Bemærk: Denne procedure er nyttig til kort erhvervelse gange på op til 2 h. For lange sigt erhvervelse, larverne bør monteres ved hjælp af alternative metoder 20.
13. Billede behandling og analyse af erhvervet Data
Bemærk: billedbehandling blev udført på en personlig computer med en 2,90 GHz processor, 8.00 GB hukommelse og et grafikkort med 1,00 GB hukommelse.
- Åben den erhvervede datasæt i billedbehandling software valg. Åbn software FiJi anbefales for LSFM databehandling og analyse 21.
- i billed analyse software, justere lysstyrke og kontrast niveauer for at forbedre billederne.
Bemærk: Ingen faste parametre er brugt i denne sag, men at vælge den " Auto " mulighed kan være nyttigt at få en indledende enhancement. - Vælg ROI.
Bemærk: Til at spore individuelle parasitter, FiJi har både manuelle og automatiske tracking plugins til rådighed.
14. Inddrive afbildet larverne
- Fjern larve omhyggeligt fra Agarosen ved hjælp af fine pincet og en hår løkke værktøj. Overføre fisken tilbage til friske æg vand og check for recovery efter 15 min. tilbage af larve til inkubator ved 28 ± 0,5 ° C.
- Alternativt, gå videre til at aflive de afbildede larver med en overdosis af tricaine. Derefter, indføre larver i en opløsning af natriumhypochlorit (6.15% NaClO) for 5 min at dræbe parasitten. Afhænde ifølge instituttet ' s standardprotokoller.
Representative Results
Optimale betingelser for injektion:
Grupper af zebrafisk larver blev sprøjtet på 24, 48, 72, 96 og 120 hpf, på forskellige anatomiske steder, og deres overlevelse blev undersøgt hver dag i 5 dage. Efter 5 dage efter injektion, embryoner injiceres på 24 hpf havde 6,25% (2/32) overlevelse, mens 95% (38/40) af larver injiceres på 48 hpf overlevede. Som en kontrol blev larver sprøjtet med 1 x PBS som et køretøj. Der var ingen forskel i overlevelse mellem køretøj-indsprøjtning og parasit-indsprøjtning larver, der angiver ingen parasitære-afhængige effekter på overlevelsesraten for fiskene (p = 0,08). Larverne injiceres mellem 72-120 hpf havde sammenlignelige overlevelsesprocenten til 48 hpf-indsprøjtning larver på konstant Injektionsvolumen. Til alle, der præsenteres her, blev 48 hpf larver brugt på grund af deres lethed af manipulation og har udviklet organer og let gennemtrængelige hud uden tydelige skader efter injektion.
Larverne injiceres på 48 hpf blev injiceret i perikardial plads, hale muskel, baghjernen ventrikel, eksotiske vesikel, notochord og kanalen af Cuvier i blommesækken. Der var ingen forskel i overlevelse af larver injiceres på forskellige anatomiske steder. Den hurtigste og nemmeste region at injicere var imidlertid kanalen af Cuvier placeret i den forreste del af blommesækken (figur 1, film 1). Injektioner på dette websted tilladt indførelsen af større mængder med en lavere risiko for skade at afgørende strukturer. Derudover mellem 24-72 hpf er denne region en optimal site direkte adgang til udviklingslandene Vaskulaturen hjerte11.
Parasit visualisering ved hjælp af LSFM:
Inden for 8-10 min efter injektion af T. cruzi ind i kanalen af Cuvier, blev parasitter identificeret i zebrafisk larver ved hjælp af LSFM på grund af deres CFSE fluorescerende signal og optisk gennemsigtigheden af larverne. Efter podning, blev parasitter observeret enten overholdt mure rundt kredsløbssygdomme eller rejser i retning af blodgennemstrømningen (figur 2, figur 3). Når en parasit forbliver knyttet til et hjertets struktur, såsom atrioventrikulær ventilen, svinger det med hjertet sammentrækninger, der angiver, at de molekylære mekanismer til overholdelse af parasitter kan være effektive i vores hvirveldyr model (film 2, Movie 3 Supplerende movie 1). T. cruzi overholdt også vægge af larve blommesækken ( figur 2, Movie 2), en struktur, som senere vil blive reabsorberes og blive en del af zebrafisk tarmen22. Dette kunne være svarende til hvad der sker i den kroniske sygdom fase i inficerede mennesker, hvor parasitter er fundet i cardiomyocytes og i fordøjelsessygdomme nervesystemet23,24. Når ikke er fastgjort, parasitterne gled gennem blodgennemstrømningen i samme retning som erytrocytter ( figur 3, film 4). Parasitter kan iagttages i forskellige størrelse fartøjer af fisk, men var mere rigelige i perikardial plads og i regionen tilstødende æggeblomme indeholdende blodgennemstrømning ( figur 2, figur 3, supplerende movie 2).
På 10 min post injektion var det vanskeligere at spot enkelt former for parasit på grund af deres distribution langs Vaskulaturen og manglende evne til at hurtigt skærmen forskellige anatomiske steder af fisk på grund af en begrænset synsfelt af LSFM (på 40 X forstørrelse ). Efter 24 timer post injektion (hpi), CFSE signalet begynder at akkumulere i regionen nær udvikle tarmen (tillægs figur 1).
Figur 1: Optimal injektionsstedet. (A) billede af larve 48 hpf viser det optimale injektionsstedet på kanalen af Cuvier (gul pil) ved hjælp af en regelmæssig Stereoskopet. (B) Magnified se boks i en viser kanalen af Cuvier (gul pil). Skalalinjen = 200 µm (A), 50 µm (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: LSFM billeder af en statisk parasit i en 48 hpf larve. T. cruzi parasitter (gul pil) forbliver overholdt vægge af blommesækken, hele den time-lapse sekvens (7.2 s, 17,2 s, og 27,2 s), omkring ~ 15 min efter parasit injektion. Ingen ændring i holdning af parasitten er observeret i løbet af en overtagelse periode på mindst 30 s. a, Atrium; v, ventrikel. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Bane af en parasit rejser i perikardial plads ved hjælp af LSFM. T. cruzi parasitter kan spores mens drivende i den perikardievæske plads (PS), efter retningen af blodgennemstrømningen (track vist i rød) omkring ~ 15 min efter parasit injektion. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 1: blod omløb dalen af æggeblomme i en larve 48 hpf. Film af en larve 48 hpf viser blod omløb valley eller kanalen af Cuvier ved hjælp af en regelmæssig Stereoskopet. Forskellige regioner er fokuseret under video at vise røde blodlegemer cirkulerer i hele kanalen. Gul pil viser det optimale injektionsstedet. Filmen blev indspillet ca 10-15 min efter parasit injektion. Venligst klik her for at downloade videoen.
Movie 2: T. cruzi parasitter fastgjort til væggene af blommesækken. LSFM film om en larve 48 hpf viser at T. cruzi parasitter er overholdt til blommesækken ca 10-15 min efter parasit injektion. Ingen ændring i placeringen af parasitten blev observeret i løbet af en overtagelse periode på mindst 30 s. a, Atrium; v, ventrikel. Venligst klik her for at downloade videoen.
Filmen 3: T. cruzi parasitter fastgjort til væggene i hjertet. LSFM film om en larve 48 hpf viser at T. cruzi parasitter resterenden levet op til hjerte-kar-væggen, trods stærke hjerte sammentrækninger omkring 10-15 min efter parasit injektion. Erytrocytter kan iagttages som sorte afrundede skygger. Venligst klik her for at downloade videoen.
Movie 4: parasitter bevæger sig i den perikardievæske plads. LSFM film af en larve 48 hpf viser T. cruzi parasitter drivende i den perikardievæske plads. To parasitter kan spores på forskellige tidspunkter (ID 1, i rød cirkel og ID 2 i gul cirkel), efter et lignende forløb. Filmen blev indspillet ca 10-15 min efter parasit injektion. Venligst klik her for at downloade videoen.
Supplerende figur 1: ophobning af CFSE fluorescerende signal i blommesækken. Stereoskopet billeder af en vildtype larve injiceres på 48 hpf på kanalen af Cuvier. CFSE fluorescerende signal akkumuleres gradvis i æggeblomme, efter to dage efter injektion (48 hpi). Skalalinjen = 500 µm. venligst klik her for at downloade figuren.
Supplerende Movie 1: parasitter knyttet til vægge og ventiler i kredsløbsorganer. Stereoskopet tid serie billeder af en vildtype larve injiceres på 48 hpf. Billeder er taget med 0,2 s mellemrum indfange T. cruzi parasitter bevæger sig i synchrony med hjertemusklen sammentrækninger på atrioventrikulær ventilen. Filmen blev indspillet ca 30 min efter parasit injektion. Venligst klik her for at downloade videoen.
Supplerende Movie 2: bevægelige og overholdt parasitter i periventricular plads og æggeblomme. LSFM film om en larve 48 hpf viser T. cruzi parasitter drivende eller levet op til den perikardievæske plads eller æggeblomme. Overførte lys udsigt blev observeret for de første 5 s. Visningen fluorescens blev observeret fra 5,2-25,8 s. Filmen blev indspillet ca 10-15 min efter parasit injektion. Venligst klik her for at downloade videoen.
Discussion
Denne undersøgelse fremhæver fordelene ved zebrafisk som en dyremodel for at studere patogen adfærd i vivo. Især dette studie foreslår en metode til at visualisere patogen T. cruzi i dets naturlige miljø: hematic cirkulation. Miljøet i de kredsløbssygdomme mikromiljø i fisk er sammenlignelig med pattedyr, og trypanosomatids har udviklet mekanismer for rejser, undgåelse af immunsystemet, og knyttet til celler for infektion i dette miljø25. Denne protokol giver en beskrivelse af en optimal procedure for kultur af T. cruzi i en human cellelinie og efterfølgende isolation af flagellaternes former for fluorescerende mærkning. Den viser derefter de relevante indstillinger for vellykket injektion af parasitter i gennemsigtig zebrafisk for senere montering og visualisering ved hjælp af LSFM. Endelig, denne protokol giver forslag til effektive i vivo billeddannelse af parasitten placering og bevægelse i omløb ved hjælp af LSFM.
Fimrehår i trypanosomes fremgår af dens posterior region, flyder fra cellen organ, og hænger gratis på den forreste del af organismen26. T. cruzi slynger sig af vinkede fimrehår foran kroppen, hvilket undulates den parasittens hele kroppen. Flagellaternes bevægelse er ikke kun nødvendig for parasitten motilitet, som i tilfælde af T. brucei27 (agens af afrikanske trypanosomiasis), men det bruges også til cellulære infektion, som er blevet påvist i T. cruzi5 ,28. Selvom zebrafisk ikke den naturlige vært for T. cruzi, kan den parasittens motilitet undersøges i en hjerte-kar-cirkulation system, der udvikles ved hjælp af de protokoller, der er beskrevet her. Derudover er der trypanosomes arter, der inficerer karpefisk, klasse i zebrafisk, som T. carassii og T. borreli25. Disse parasit arter kunne bruges til at studere i realtid, bevægelser og vedhæftet fil mekanismer af disse trypanosomatids; sådanne undersøgelser kan låne indsigt i pattedyr celle infektion proces.
I denne undersøgelse, injiceres motile T. cruzi parasitter blev observeret rejser gennem det kardiovaskulære omsætning af podede fisk, flytter sammen med uigennemsigtig erytrocytter og fastholdelsen af strukturer i hjertekarsystemet vægge. Vi brugte et hjem-bygget LSFM med en 10 X akromatisk længe arbejde afstand luft mål (17,6 mm) til belysning arm med en numerisk blænde på 0,25. Et 40 X apokromatiske vand fordybelse mål med en numerisk blænde på 0,8 og en arbejdende afstand af 3,5 mm blev brugt til registrering af armen. Påvisning mål var nedsænket i prøve salen, mens belysning mål var uden for mødesalen. En port i kammeret lukket med en coverslip og optiske limen tilladt for belysning stråle ind i salen, som afbildet i Lorenzo et al. 18 for belysning, brugte vi en 50 mW DPSS laser på 488 nm hvis magt blev moduleres af en akustisk optisk afstemmelige Filter. Registrering sti anvendes filtre kompatibel med grøn fluorescerende proteiner (NGL) eller FITC. En lys ark mikroskop udstyret med en kapillær prøveholderen (ideelt med automatiseret rotation) og temperaturregulering af prøve salen bør være egnede til dette program. Mikroskopet bør justeres og kalibreres i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger eller brugerens laboratorium standardprotokoller før erhvervelse, hvis nødvendigt. I denne protokol kontrollerede vi mikroskop ved hjælp af SPIM software19.
Det er vigtigt at bemærke, at i omløb af zebrafisk larver parasitære udlæg er effektiv. I kardinal venen forblev parasitter fastgjort til op til flere minutter; i hjertet holdt de ventiler og vægge, oscillerende med hjertet sammentrækninger. Yderligere undersøgelser er stadig for at belyse hvorvidt T. cruzi interagerer med de strømmende erytrocytter, der glider i retning af blodgennemstrømningen. Tidligere in vitro- undersøgelser har vist, at tilstedeværelsen af faste strukturer (dvs., blodlegemer) eller øgede viskositet af væske til at efterligne blod i vitro, har en betydelig effekt på motilitet og velocity med parasitten 9.
Der er mange spørgsmål om løbet af infektion af T. cruzi hos mennesker efter amastigotes undslippe fagocyterende celler, i første omgang inficerede celle type29. For eksempel, hvor de ankommer til deres målorganer? Hvad er mekanismerne for tropisme til de foretrukne organer, såsom hjerte, fordøjelseskanalen og centrale nervesystem? Interessant, i denne undersøgelse blev parasitter oprindeligt afbildet i hjertet fordi det var stedet for højeste tæthed af parasitter. Imidlertid CFSE signal efterfølgende akkumuleret i udviklingslandene tarmen ved 7 dage post injektion. Selv om anatomi af fisk og pattedyr er forskellige, viser resultaterne af denne undersøgelse en form for tropisme, da det blev konstateret, at parasitter udstillet tropisme mod kendte foretrukne målorganer trods kropsligt forskelle. En væsentlig begrænsning af denne undersøgelse vedrører temperatur anvendes i eksperimenter. Zebrafisk larver bør holdes omkring 28 °C under hele proceduren. Selvom denne temperatur kan være lignende til vektor vært (insekter af Triatominae underfamilie), er det helt forskellig fra de varmblodede pattedyr, der omfatter de endelige værter (omkring 37 ° C). T. cruzi er kendt for at have flagellaternes levende former i begge værter; Det er dog vigtigt at huske på, at denne faktor kan have en virkning i funktionsmåden for de animalske in vivo.
Selvom fish´s adaptive immunsystem ikke er moden, indtil 4 uger post befrugtning, er den medfødte immunsystem active tidligt i udviklingen10. Så tidligt som 48 eller 96 hpf blev fagocyterende celler observeret at have opslugt mærket trypanosomes (data ikke vist). Dette begrænser vindue af tid for visualisering af parasitten. Men, hvis en undersøgelse skulle fokusere på evaluering fish´s immunrespons, kan indsprøjtning i senere faser anbefales. Også kan indsprøjtning af parasitter i transgene fisk linjer med mærket makrofager eller andre celler i immunsystemet være nyttige i at studere parasit vedhæftet fil og mulige endocytose mekanismer. Det er vigtigt at bemærke, at hvis parasitterne er mærket med CFSE, transgene celle etiketter bør ikke være normal god landbrugspraksis og en markør i den gule eller røde ende af spektret er påkrævet.
For at vurdere den detaljerede bevægelsesretning parasit, kan det være nyttigt at følge deres bane i 3 dimensioner (3D). 3D-visualisering og genopbygning af processen er en højhastigheds-systemet nødvendigt. Med det udstyr, der anvendes i denne protokol, er det kun muligt at visualisere parasitter i ét plan. I dette tilfælde prioriteret vi opretholdelse brændplanet stabilitet under parasitten transporten, og optager sin bane i et plan.
Den metode, der foreslås her baner vejen for yderligere at undersøge parasit adfærd i hjerte-kar-omsætning. I sammendrag er de væsentlige skridt til imaging live fluorescerende parasitter inde zebrafisk larver:(i) brug af tidlige skraverede embryoner (24-48 hpf) eller larver eller dyr mellem 72-96 hpf med ingen pigmentering således at de er gennemsigtige og let at injicere; (ii) billede larver hurtigst muligt efter injektion til at undgå parasitten clearance af fagocyterende celler; og (iii) fokuserer LSFM på webstedet af interesse (f.eks., perikardial region) og fastholde fokus. Denne nye procedure tillader visualisering af trypomastigotes i et miljø svarende til dens naturlige infektion niche, giver for første gang mulighed for at studere T. cruzi i en levende organisme.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Convocatoria Interfacultades fra Vicerrectoría de Investigaciones de la Universidad de los Andes, og USAID forskning og Innovation Fellowship program. Vi takker Juan Rafael Buitrago og Yeferzon Ardila for fisk vedligeholdelse og bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5-10 μL Micropipette | Fisherbrand | 21-377-815 | |
| Agarose RA | Amresco | N605 | Regular |
| Agarose SFR | Amresco | J234 | Low Melting point |
| Aquarium salt | Instant ocean | SS15-10 | |
| Cell Count chamber | Boeco | Neubauer | |
| Cell culture flasks | Corning | 430639 | |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| CFSE | ThermoFisher | C34554 | |
| Detection objective | Nikon 40x 0.8NA | 40x CFI APO NIR | |
| DMEM medium | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Dumont #5 fine forceps | World precision Instruments | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Eurobio | CVFSVF00-01 | |
| Filter | Chroma | ET-525/50M | |
| Glass capillaries for embryo mounting | Vitrez Medical | 160215 | |
| Glass capillaries for pulling needles | World precision instruments | TW100-4 | |
| Glucose | Gibco | A2494001 | |
| HEPES | Gibco | 156300-80 | |
| Incubator | Thermo Corporation | Revco | |
| Larval microinjection mold | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| Laser | Crystalaser | DL488-050 | |
| L-glutamine | Gibco | 250300-81 | |
| Methylene blue | Albor Químicos | 12223 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| Micromanipulator system | Sutter Instrument | MP-200 | For LSFM |
| Micropipette puller device | Narishige | PC-10 | |
| Microscope | Olympus | CX31 | |
| Microscope (inverted) | Olympus | CKX41 | |
| Multipurpose microscope | Nikon | AZ100M | |
| Neubauer counting chamber | Boeco Germany | ||
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-163 | |
| Petri dish 94x16 | Greiner bio-one | 633181 | |
| Plastic pasteur pipette | Fisherbrand | 11577722 | |
| Rotation stage | Newport | CONEX-PR50CC | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R4130 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Stereoscope | Nikon | C-LEDS | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | |
| TRIS | Amresco | M151 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | R-001-100 | |
| Tubes 15 ml | Corning | 05-527-90 |
References
- WHO. Chagas disease (American trypanosomiasis). , http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs340/en/ (2017).
- Bern, C. Chagas's Disease. New England Journal of Medicine. 373 (5), 456-466 (2015).
- Sosa Estani, S., Segura, E. L., Ruiz, A. M., Velazquez, E., Porcel, B. M., Yampotis, C. Efficacy of chemotherapy with benznidazole in children in the indeterminate phase of Chagas’ disease. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 59 (4), 526-529 (1998).
- Rosas, F., Roa, N., Cucunuba, Z. M., Cuellar, A., Gonzalez, J. M., Puerta, J. C. Chagasic Cardiomyopathy. Cardiomyopathies - From Basic Research to Clinical Management. , (2012).
- Finkelsztein, E. J., et al. Altering the motility of Trypanosoma cruzi with rabbit polyclonal anti-peptide antibodies reduces infection to susceptible mammalian cells. Experimental Parasitology. 150, 36-43 (2015).
- Martins, R. M., Covarrubias, C., Rojas, R. G., Silber, A. M., Yoshida, N. Use of L-Proline and ATP Production by Trypanosoma cruzi Metacyclic Forms as Requirements for Host Cell Invasion. Infection and Immunity. 77 (7), 3023-3032 (2009).
- Engstler, M., et al. Hydrodynamic Flow-Mediated Protein Sorting on the Cell Surface of Trypanosomes. Cell. 131 (3), 505-515 (2007).
- Uppaluri, S., et al. Impact of Microscopic Motility on the Swimming Behavior of Parasites: Straighter Trypanosomes are More Directional. PLoS Computational Biology. 7 (6), e1002058 (2011).
- Heddergott, N., et al. Trypanosome Motion Represents an Adaptation to the Crowded Environment of the Vertebrate Bloodstream. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003023 (2012).
- Gratacap, R. L., Wheeler, R. T. Utilization of zebrafish for intravital study of eukaryotic pathogen–host interactions. Developmental & Comparative Immunology. 46 (1), 108-115 (2014).
- Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-Pathogen Interactions Made Transparent with the Zebrafish Model. Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).
- White, R. M., et al. Transparent Adult Zebrafish as a Tool for In Vivo Transplantation Analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Huisken, J. Slicing embryos gently with laser light sheets. BioEssays. 34 (5), 406-411 (2012).
- Westerfield, M. The zebrafish book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene. http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html (2000).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Vargas-Zambrano, J. C., Lasso, P., Cuellar, A., Puerta, C. J., González, J. M. A human astrocytoma cell line is highly susceptible to infection with Trypanosoma cruzi. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 108 (2), 212-219 (2013).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (25), e1115-e1115 (2009).
- Lorenzo, C., et al. Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy. Cell Division. 6, 22 (2011).
- Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using μManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), e10 (2014).
- Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (84), (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ng, A. N. Y., et al. Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis. Developmental Biology. 286 (1), 114-135 (2005).
- Higuchi, M. D. L., et al. Correlation between Trypanosoma cruzi parasitism and myocardial inflammatory infiltrate in human chronic chagasic myocarditis: Light microscopy and immunohistochemical findings. Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 2 (2), 101-106 (1993).
- Vago, A. R., Silva, D. M., Adad, S. J., Correa-Oliveira, R., d'Avila Reis, D. Chronic Chagas disease: presence of parasite DNA in the oesophagus of patients without megaoesophagus. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 97 (3), 308-309 (2003).
- Wiegertjes, G. F., Forlenza, M., Joerink, M., Scharsack, J. P. Parasite infections revisited. Developmental & Comparative Immunology. 29 (9), 749-758 (2005).
- De Souza, W. Basic cell biology of Trypanosoma cruzi. Current Pharmaceutical Design. 8 (4), 269-285 (2002).
- Langousis, G., Hill, K. L. Motility and more: the flagellum of Trypanosoma brucei. Nature Reviews. Microbiology. 12 (7), 505-518 (2014).
- Johnson, C. A., et al. Cellular response to Trypanosoma cruzi infection induces secretion of defensin α-1, which damages the flagellum, neutralizes trypanosome motility, and inhibits infection. Infection and Immunity. 81 (11), 4139-4148 (2013).
- Magalhães, L. M. D., Viana, A., Chiari, E., Galvão, L. M. C., Gollob, K. J., Dutra, W. O. Differential Activation of Human Monocytes and Lymphocytes by Distinct Strains of Trypanosoma cruzi. PLoS neglected tropical diseases. 9 (7), e0003816 (2015).
