Summary
في هذا البروتوكول، المسمى فلوريسسينتلي الكروزية ت تم حقن اليرقات الزرد شفافة، وحركية الطفيلي وقد لوحظ في فيفو استخدام الورقة الضوء الفلورية مجهرية.
Abstract
وهو مرض شاغاس عدوى طفيلية الناجم عن المثقبيات الكروزية، الذين حركية ليس هاما للتعريب، بل أيضا لربط الخلوية والغزو. الحالي نماذج حيوانية لدراسة الكروزية ت. السماح بمراقبة محدودة للطفيليات المجراة، تمثل تحديا لفهم السلوك الطفيلي خلال المراحل الأولية للإصابة في البشر. هذا بروتوزوا مرحلة فلاجلر في ناقلات والمضيفين الثدييات، لكن لا توجد دراسات تصف به حركية في فيفو. وكان الهدف من هذا المشروع إلى إنشاء نموذج الزرد فقاريات حية لتقييم حركية الكروزية. ت. في نظام الأوعية الدموية. الزرد شفافة تم حقن اليرقات فلوريسسينتلي المسمى trypomastigotes ولاحظ استخدام الورقة الضوء الفلورية مجهرية ()، أسلوب موسع لتصور الكائنات الحية مع عالية الدقة البصرية. يمكن تصور الطفيليات لفترات طويلة من الوقت بسبب خطر هذا الأسلوب منخفضة نسبيا مقارنة مع [كنفوكل] د أو ابيفلوريسسينسي المجهري. ولوحظت الطفيليات الكروزية ت. السفر في الدورة الدموية الزرد يعيش في الأوعية الدموية مختلفة الأحجام وصفار البيض. أنها يمكن أيضا أن ينظر المرفقة للجدار كيس ألمح وصمام بي على الرغم من القوى القوية المرتبطة بتقلصات القلب. الكروزية. ت.-اليرقات الزرد الملقحين هو أسلوب قيمة التي يمكن استخدامها لوضع تصور تعميم الطفيليات وتقييم انتحاء، وأنماط الهجرة، وحركية في البيئة الحيوية لنظام القلب والأوعية الدموية الحيوانات الحية.
Introduction
هو سبب مرض شاغاس الطفيلي البرزي الكروزية ت. ما يقرب من 6 إلى 7 مليون شخص في العالم مصابون الكروزية. ت.. هذا المرض ينتقل أساسا في أمريكا اللاتينية، ولكن سجلت في الولايات المتحدة، وكندا، والأوروبي كثيرة، فضلا عن بعض بلدان "غرب المحيط الهادئ"، أساسا بسبب هجرة الأفراد المصابين1. داء شاغاس إلى حد كبير المنقولة والمنقولة إلى البشر عن طريق الاتصال مع براز الحشرات هيماتوفاجيك في الفصيلية Triatominae، تعرف عموما باسم "البق". ومع ذلك، الكروزية ت. يمكن أن ينتقل أيضا عن طريق نقل الدم، انتقال عمودي من الأم إلى الطفل، أو ابتلاع الأغذية الملوثة بالطفيليات2. المرحلة الحادة هي أساسا غير متناظرة أو مؤثرا أعراض العدوى ويستمر من 6 إلى 8 أسابيع، بعد الذي يتحكم تحميل الطفيلي المشاركة في الجهاز المناعي لكن لا يلغي تماما الإصابة3. معظم الأفراد ثم أدخل مرحلة أعراض مزمنة؛ ومع ذلك، تقريبا 30% مرضى تطوير مرحلة مزمن أعراض، التي هي نظام القلب وأقل تواترا في الجهاز الهضمي والعصبي الشبهة4. هذا السيناريو يمثل تحديا للعلاج من الأمراض والسيطرة حيث لا تتوفر أي لقاح، وهناك اثنان فقط من الأدوية الفعالة لداء شاغاس: بينزنيدازولي ونيفورتيموكس. كل العلاجات تتطلب إقامة مطولة وقد آثار جانبية شديدة2.
زيادة فهم سلوك الكروزية ت. السلوك في فيفو هو المفتاح لتحديد الهجرة الطفيلية، ومرفق الهاتف الخلوي، وغزو داخل البلد المضيف؛ نقص في فيفو نماذج يحد من تطوير نهج علاجية جديدة. وقد أظهرت الدراسات في المختبر T. الكروزية العدوى أن حركية trypomastigotes مهم لربط أغشية الخلايا المضيفة واجتياح الخلوي5. ثبت استنفاد الطاقة في trypomastigotes في ثقافة المشارك مع خط خلية عرضه للحد من غزو الخلوية6. من المثير للاهتمام، في تريبانوسوماتيدس، حركة فلاجلر كما اتسم كآلية تهرب ضد الأجسام المضادة الخاصة بالطفيل7.
وقد درس على نطاق واسع في المختبر في المثقبيات البروسية، وثيقة الصلة طفيلي الذي يسبب "داء المثقبيات الأفريقي"8فلاجلر حركية. أظهرت الدراسات في المختبر من الحركية من هذه المثقبيات أن محاكاة الظروف للدم أو سوائل الجسم، بما في ذلك اللزوجة ووجود عقبات تمثيلية من خلايا الدم، مهم للتحرك إلى الأمام الطفيلي9 . حتى أنه لم الممكن تصور الحركة للطفيليات في مجرى الدم في الجسم الحي.
الزرد يرقات نموذجا قويا لدراسة التفاعلات المضيف الممرض في فيفو. فصغيرة وغير مكلفة وسهلة نسبيا لزيادة بالمقارنة مع النماذج الفقاريات الأخرى المنشأة لمرض شاغاس. الزرد نظم المناعة الفطرية وتكيفية مماثلة للبشر ولكن على الجهاز المناعي التكيفي يبدأ وضع في 4 أيام بعد الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية) وليست ناضجة ل أسابيع عدة أخرى10. أثناء المبكرة، عندما الضامة فقط موجودة، هناك نافذة كبيرة لدراسة السلوك الطفيلي دون التدخل الفوري محصنة ضد10. بيد أن أكبر ميزة لاستخدام اليرقات الزرد كنموذج فقاريات لدراسة سلوك الكائنات الممرضة يكمن في شفافيتها الضوئية، يجعلها قابلة للفحص المجهري والتصوير11. بالإضافة إلى ذلك، هناك العديد من الأدوات التعامل مع الأسماك علم الوراثة. على سبيل المثال، سلالة كاسبر خط متحولة من الزرد مع لا لون البشرة، مما يجعل الحيوان شفافة تماما ومفيداً للتصور الأجهزة الفردية وتتبع في الوقت الحقيقي لحقن الخلايا12.
حد رئيسية من المراقبة طولية للطفيليات تتحرك سريعاً في استخدام الزرد يعيش [كنفوكل] أو مجهرية ابيفلوريسسينسي يكمن في استحالة التصوير في سرعة اكتساب عالية وأعماق اختراق كبير مع نوعية صورة جيدة ومنخفضة خطر د. ورقة الضوء الفلورية ميكسروسكوبي () وهي تقنية تصوير ناشئة أن يتغلب على هذه القيود للسماح بهذه الملاحظات. باستخدام هدف واحد للكشف عن الأسفار وإضاءة متعامد هدف ثاني الذي ينير فقط المستوى البؤري للكشف عن الهدف، فإنه من الممكن الحصول على مقاطع بصرية عالية الدقة كما هو الحال في مجهر [كنفوكل]، ولكن مع إلى حد كبير انخفاض د، حتى فيما يتعلق ب الفحص المجهري ابيفلوريسسينسي13. لسفم التقنية المستخدمة هنا تسمى واحد الطائرة إضاءة مجهرية (SPIM)، الذي ينير ورقة رقيقة من الضوء طائرة واحدة داخل اليرقات الزرد.
والهدف من هذه المنهجية إنشاء الزرد اليرقات كنموذج العدوى غير قابلة للتطبيق لفهم حركية الكروزية. ت. والسلوك ذات الصلة في فيفو. لتحقيق هذا الهدف، ونحن تحقن اليرقات الزرد شفافة مع المسمى فلوريسسينتلي trypomastigotes، شكل الخلوية المسؤولة عن حالات العدوى للبشر، وحددت حركة الكروزية. ت. في القلب والأوعية الدموية تداول الزرد باستخدام لسفم.
Protocol
وقد أقر البروتوكولات التالية "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة للوس إنديز جامعة (سيكوال). مستوى السلامة الأحيائية 2 (BSL-2) ينبغي اتباع المبادئ التوجيهية صارما لمنع التلوث بمسببات المرض الكروزية ت.
ملاحظة: رعاية الحيوان والصيانة: كاسبر الزرد، سلالة معدلة وراثيا من الزرد (Danio rerio) ويستخدم في هذا البروتوكول بسبب شفافيتها الضوئية قيمة في جميع مراحل النمو. الأسماك يتم التلاعب بها باستخدام الرعاية المثلى الظروف للأنواع 14، ح 14 ضوء-10 ح الظلام دورة، في 28 ± 1 درجة مئوية، في الرقم الهيدروجيني (7.0-7.4) الخاضعة لسيطرة نظام متعدد خزان المياه تعمل. الحيوانات تتغذى مرتين في يوم مع حية الماء المالح الروبيان (سالينا الارتيميا) والمخصب مع تربية الغذاء. وافق جميع البروتوكولات سيكوال في جامعة دي لوس إنديز (C.FUA_14-017)-
1-"إعداد المياه البيض"
- تحضير 0.6 جم/لتر ماء الملح في عكس التناضح (RO) أو المياه (DI) وإضافة 0.01 مغ/لتر الميثيلين الأزرق إلى الحل.
ملاحظة: الموصلية المقاسة ينبغي المايكروثانيه 400-500/سم ودرجة الحموضة مستوى في 7.2-7.9. لخفض درجة الحموضة، تهوية الماء البيض لبضع ساعات.
2. إعداد "حل الأسهم تريكيني"
- تحضير 0.4% تريكيني حل الأسهم بتذويب 400 ملغ تريكيني (MS-222) في المياه مل 97.9 المقطر (ddH 2 س). بعد أن المسحوق قد حلت تماما، ضبط درجة الحموضة إلى 7.0 باستخدام 2.1 مل م 1 تريس (pH 9.0) والحل في الثلاجة.
3. إعداد 1.0% [اغروس] نقطة انصهار منخفضة
الماء- حل المسحوق [اغروس] نقطة انصهار منخفضة في البيض بتركيز نهائي 1.0 في المائة. تسخين المزيج في ميكروويف أو على لوحة الساخن مع التحريك المستمر حتى يظهر الحل [اغروس] متجانسة.
- تخزين مختبرين عند 4 درجة مئوية لمدة لا تزيد على أسبوع.
4. التزاوج المقايسة وجمع الجنين
- ثلاثة أيام قبل الحقن بإعداد ماتينجس باستخدام أزواج صحية للأسماك الذكور والإناث في تربية الدبابات. ويعزز الإثراء بالرخام الزجاج والنباتات الاصطناعية التفريخ. ينبغي إعداد خلال فترة بعد الظهر وترك بين عشية وضحاها ماتينجس.
- في صباح اليوم التالي، جمع البيض الناتجة باستنزاف الخزان من خلال مصفاة وغسل البيض بالماء البيض. إزالة جميع البيض بعكس في المصفاة وصب الماء البيض من خلال المصفاة إلى طبق بيتري. للحفاظ على صحة الأجنة، على مياه نظيفة بإزالة الحطام واجنة ميتة ماصة بلاستيكية نقل أي.
- نقل الأجنة إلى حاضنة في درجة حرارة مستقرة 28.5 درجة مئوية للسماح بتنمية الأجنة وفقا لمعايير التدريج الزرد 15. فحص الأجنة مرتين في يوم، وتجاهل البيض لﻻستمرار للحفاظ على صحة مخلب.
5. الجنين ديتشوريونيشن
ملاحظة: هذا الإجراء مطلوب في حالة الأجنة قد لا تحاك في وقت الحقن. في هذا الإجراء، " اليرقات " هي الحيوانات من المشيمة من ح 48 وظيفة التسميد (hpf) فصاعدا-
- اليوم من التجربة، بوضع طبق بتري يحتوي على أجنة صحية تحت ستيريوسكوبي تشريح.
- الاستيلاء على معارضة نهايات المشيمة مع الملقط حادة اثنين (دومون #5)، ولطف المسيل للدموع وسحب فتح المشيمة. يتم تصويرها حوالي 5-6 يتم حقن اليرقات في وقت واحد، وعادة 3-4-
- إزالة تشوريونس من الماء باستخدام ماصة نقل.
6. إعداد "مواد الحقن"
- الإبر إعداد 1.0 مم استخدام رقيقة الجدار الزجاج الشعيرات الدموية وجهاز ساحبة ميكروبيبيتي مع الإعدادات التالية: الأوزان الخفيفة 2 + 1 الوزن الثقيل، وسحب أعلى مم 2 + 5 مم أسفل السحب، 75.9 درجة مئوية (الخطوة 1) + (78.2 درجة مئوية الخطوة 2). تخزين الإبر في طبق بتري في قطاع من نمذجة الطين. إبرة المثالي ينبغي أن يكون تلميح ضيقة، كما ت الكروزية قياس حوالي 20 × 1-3 ميكرون وسوف يمر عبر الإبرة بسهولة. يمكن أن يختلف طول الحافة: تلميح أطول مفيدة الوصول إلى هياكل أكثر عمقاً، لكن تلميح أقصر ستكون أكثر تشدداً مما يجعل الحقن أسهل للمستخدم-
ملاحظة: حجم تلميح إبرة يعتمد على درجة الحرارة المستخدمة: درجة حرارة أعلى للخطوة 2 النتائج في تلميح أطول وأدق.
تعد حلاً [اغروس] 1.5% في ddH 2 س - وصب ذلك في 10 سم طبق بيتري. وتغطي على عمق حوالي 1.0 سم.
- مكان العفن microinjection جاهزة أكثر من [اغروس] والسماح لها بترسيخ.
- رفع العفن microinjection الجاهزة بها وإضافة الماء البيض للتخزين في 4 درجات مئوية. وهذا يمنع [اغروس] جفاف.
- المياه البيض إضافة إلى حل الأسهم تريكايني بتركيز 150 مغ/لتر. مخزن نهائي في 4 ° C.
7. خلية ثقافة "نمو الطفيلي"
الطفيليات- يتم الاحتفاظ في خط خلية بشرية astrocytoma (CRL-1718) باستخدام الطريقة الموصوفة فارغاس-زامبرانو et al. 16
- ابدأ ثقافة الخلايا البشرية في قوارير ثقافة T25 (المساحة = 25 سم 2) في كثافة من 2 × 10 5 أو 4 × 10 5 خلايا في 4 مل متوسط RPMI 1640 مع 10 ٪ مصل العجل الجنين (FCS)، استكملت مع مم 2 لتر-الجلوتامين والجلوكوز 4.5 غرام/لتر، 10 مم حبيس، بيروفات 1 مم والبنسلين 1%-ستربتوميسين (يشار " إكمال الإعلام "). احتضان ثقافات astrocytoma عند 37 درجة مئوية في بيئة 2 CO 5 ٪.
- مرة واحدة أحادي الطبقة المتلاقية، فصل الخلايا باستخدام 2 مل من 0.25% يدتا التربسين التي تفرخ لهم لمدة 3 دقيقة في 37 درجة "جيم بصريا" الاختيار خلايا لمفرزة، وعرقلة الحل التربسين باستخدام 3 مل RPMI 1640 مع السفح 10% في أنبوب 15 مل.
- أجهزة الطرد المركزي من تعليق خلية لمدة 5 دقائق في 1,350 س غ.
- يغسل بيليه الخلوية الناتجة في المتوسط دميم في أنبوب 15 مل والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1,350 س ز في 22 درجة مئوية.
- عد الخلايا يدوياً في الدائرة نويباور والتحقق من صلاحية في مجهر ضوء على 40 X التكبير-
- بلطف إعادة تعليق الخلوية بيليه في 4 مل من وسائل الإعلام الكامل واستخدامها لخلق الثقافات الخلية الجديدة استخدام 2 × 10 5 خلايا لكل قارورة الثقافة T25-
8- الكروزية. ت. الثقافة والتالي
- الطفيليات سلالة أصلاً التي تم الحصول عليها من إنسان مصاب وتوصف بأنها سلالة الكروزية ت دا (مهوم/CO/01/دا)، النمط الوراثي وحدة كتابة منفصلة (DTU) جزر تركس وكايكوس 16. بعد 3 أو 4 أيام لاستزراع، جمع الطفيليات تتحرك من خلية astrocytoma البشرية ثقافة المادة طافية والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1,350 س زاي تجاهل المتوسطة-
ملاحظة: يمكن استخدام الطفيليات في المتوسط كاملة لإعادة الثقافة في نسبة 1:1 مع خلايا أستروسيتوما في قوارير الثقافة T25- - بلطف إعادة تعليق بيليه في 10 مل معقمة 1 × الفوسفات المالحة المخزن المؤقت (PBS) مع السفح 0.1% والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1,350 س غ.
- تجاهل المادة طافية وإعادة تعليق في 1 مل من برنامج تلفزيوني. تأخذ 10 ميليلتر لعد الطفيليات تخترق في دائرة نويباور.
- أخذ بقية الطفيليات إعادة تعليق (990 ميليلتر) وإضافة 1 ميليلتر من كاربوكسيفلوريسسين اسيتات سوكسينيميdyl إستر (CFSE)، تركيز النهائية 5.0 ميكرومتر. إينكوباتي لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة-
ملاحظة: ينبغي أن تكون الأسهم كفسي في 5 مم الكوتيد والمحتفظ بها في-20 درجة مئوية. - بيليه الطفيليات (1,350 س ز، 5 دقيقة). إعادة تشكيل بيليه الطفيلي خلال يسددها الأنبوب، وتغسل في 10 مل من 1 x PBS-0.1% FCS تليها تدور لاحقة (1,350 س ز، 5 دقيقة)-
- تجاهل المادة طافية ولطف إعادة تعليق بيليه الطفيلي المسمى في برنامج تلفزيوني X 1 بحجم مناسب للحصول على تركيز نهائي لحوالي 10-20 الطفيليات/nL لحقن.
- استخدام كمية صغيرة (∼ 10 ميليلتر، حوالي 1 × 10 4-2 × 10 4 الطفيليات) من trypomastigotes لتقييم الجدوى ووضع العلامات. يمكن استخدامها مجهر مقلوب الأسفار للتصور المباشر للطفيليات. في وضع الخفيفة المنقولة، والتحقق من أن نقل الطفيليات. في وضع الأسفار، واستخدام عامل التصفية Fluorescein Isothiocyanate (فيتك) لتقييم وسم الطفيلي.
9. الحقن "الزرد اليرقات"
- تحميل الطفيلي
- تأخذ 10 ميليلتر من الطفيليات من استثارة (100 ميليلتر) وتحميلها على الإبر الزجاج مختومة باستخدام تلميح ماصة ميكرولوادير 10 ميليلتر.
- إدراج إبرة الزجاج حامل الإبرة ميكرومانيبولاتور واستخدام موقفا مغناطيسية ومكان جوار ستيريوسكوبي-
- استخدام الملقط غرامة تحت ستيريوسكوبي، قطع الإبرة خلق مفتوحة حادة في نهاية وقياس حجم قطره للحصول على زيادة في حجم حقن 1 nL (وهذا ما يعادل حبة قطرها 0.12-0.13 مم عند قياسه في الزيوت المعدنية 17). تلميح أطول المفضل حيث أن الإبرة يمكن الوصول إلى هياكل عميقة داخل الأسماك دون إلحاق الضرر بالانسجة. في هذا البروتوكول، ويتم استخدام إبرة حادة، ولكن يمكن استخدام إبرة مشطوف كذلك.
- تصاعد
- تخدير يرقات 48 هبف، مع تريكايني 150 مغ/لتر. تحقق من أن أنها لا تستجيب للمس، لكن ضمان أن يتم ضرب القلب.
- وضع اليرقات في القالب [اغروس] microinjection في وضع أفقي. وضع حامل الإبرة بجوار ستيريوسكوبي
- وضبط ميكرومانيبولاتور حيث يكون طرف الإبرة في مركز مجال الرؤية. تحريك الطبق بيتري أعد الخطوات 6.2-إلى 6.4 حيث يكون الصفار اليرقات قريبا من طرف الإبرة. تحقق من حالة اليرقة لضمان استمرار القلب الضرب-
- تعيين القيم ميكروينجيكتور على النحو التالي: حقن الضغط 9.6 جنيه لكل بوصة (psi)؛ وإجراء الضغط: 20 رطل/بوصة مربعة؛ نطاق 100 مللي النابضة؛ الفترة قيمة 1.9 (يناظر 10.9 ms). يجب أن يكون حجم الحقن بين nL 1-3، مع ما يقرب من 10-20 الطفيليات/nL.
10. حقن الطفيليات
- إدخال الأسماك في الجزء الأعلى الأمامي من صفار البيض في مجرى هواء كوفييه. ينبغي أن يمارس هذه الخطوة لضمان بقاء الحيوانات بعد الحقن. يستغرق حوالي 10 دقيقة لحقن اليرقات 5-6 بنجاح.
- كعنصر تحكم، حقن اليرقات 1-2 بنفس حجم المركبة (1 x PBS).
- نقل اليرقة إلى المياه العذبة البيض فورا.
11. لسفم المتصاعدة من حقن اليرقات
- نقل اليرقة حقن الطفيليات طبق بيتري فارغة وإزالة المياه المحيطة ماصة بلاستيكية وورقة ماصة بعناية. فور إضافة 100 ميليلتر من مسخن 1.0% [اغروس] نقطة انصهار منخفضة (راجع الخطوة 3 لإعداد [اغروس]) لتغطية اليرقة. التأكد من [اغروس] ليس أكثر من 40 درجة مئوية.
- إدراج سلك مستقيم داخل زجاج 1.0 مم شعرية واستخدامه المكبس لامتصاص اليرقة في وضع عمودي. تأكد من ترك كمية صغيرة من [اغروس] أعلاه اليرقة. انتظر حتى يقوي [اغروس] قبل تعريض اليرقة (وهذا يتطلب بضع دقائق). إذا لزم الأمر، طرد الزائدة [اغروس] أدناه اليرقة وقطع عليه الجميع
- مكان في شعري في حامل عينة مجهر وطرد نهاية المحتوية على اليرقة حتى توقف مجاناً من شعري. ينبغي أن تملأ قاعة العينة بحل تريكيني (150 مغ/لتر)، ودرجة الحرارة في 28 درجة مئوية. ضع
- اليرقة أمام التلميذ للكشف عن الهدف باستخدام نظام XYZ-ميكرومانيبولاتور. للتناوب حول محور عمودي، استخدام مرحلة تناوب. الموضع من اليرقة وينبغي أن يتم في وضع الخفيفة المنقولة وضوح تحديد هياكل اليرقات.
12. لسفم التصوير لحقن الطفيليات
وضع- التغيير إلى الأسفار وضبط شدة الإضاءة، فضلا عن وقت التعرض لإنقاص د وتحسين وقت القرار. لهذه التجارب، خاصة ونحن تستخدم قوة ميغاواط 2.8-3.0 للعينة ويتعرض كل إطار على 200 مرض التصلب العصبي المتعدد باستخدام كاميرا مع 6.45 بكسل ميكرومتر وكفاءة الكم ~ 70% عند أطوال موجية الكشف. ينبغي أن يؤدي هذه الإعدادات في الصور تتعرض على نحو كاف في حوالي 5 إطارات/س. تأكد من استخدام هدفا مع أعلى الفتحة العددية المحتملة.
- بدء عملية شراء فيديو من المنطقة للفائدة (العائد على الاستثمار). وفي حالتنا، لوحظت الطفيليات المرفقة للصمامات ويتحرك بحرية في منطقة القلب. من المستحسن اتخاذ شريط فيديو لطائرة واحدة على مر الزمن، أو استخدام نظام ميكرومانيبولاتور أو جالفو بيزو لتركز طائرات مختلفة بينما ينتقل الطفيلي.
ملاحظة: هذا الإجراء مفيد لأوقات اكتساب قصيرة تصل إلى 2 حاء. للحصول على المدى الطويل، ينبغي أن شنت اليرقات باستخدام أساليب بديلة 20-
13. صورة تجهيز وتحليل البيانات للحصول على
ملاحظة: أنجز معالجة الصور على كمبيوتر الشخصي مع معالج 2.90 GHz و 8.00 غيغابايت من ذاكرة ومن كرت الفيديو مع 1.00 غيغا بايت من الذاكرة.
Dataset- المفتوحة المكتسبة في معالجة برامج اختيار الصور. الفتح ينصح فيجي برامج لمعالجة البيانات لسفم وتحليلها 21-
- في برنامج تحليل الصورة، ضبط مستوى السطوع والتباين لتعزيز الصور.
ملاحظة: لا توجد معلمات ثابتة المستخدمة في هذه الحالة، ولكن اختيار " السيارات " خيار يمكن أن يكون مفيداً للحصول على تعزيزات أولية.
حدد - دوروا.
ملاحظة: لتتبع الطفيليات الفردية، فيجي على كل الإضافات التتبع اليدوي والتلقائي المتوفرة.
14. استرداد "تصويرها اليرقات"
- إزالة اليرقة بعناية من [اغروس] باستخدام الملقط غرامة وأداة حلقة شعر. نقل السمك إلى المياه بيضة طازجة، والاختيار للانتعاش بعد 15 دقيقة عودة اليرقة إلى حاضنة في 28 ± 0.5 درجة مئوية. بدلاً من ذلك، انتقل
- إلى euthanize اليرقات المصورة مع جرعة زائدة من تريكيني. ثم، إدخال اليرقات في حل من تحت كلوريت الصوديوم (6.15% ناكلو) لمدة 5 دقائق لقتل الطفيليات. التصرف وفقا للمؤسسة ' البروتوكولات القياسية s-
Representative Results
الظروف المثلى للحقن:
تم حقن مجموعات من الزرد اليرقات في 24، 48، 72 و 96 و 120 هبف، في مختلف المواقع التشريحية، والبقاء على قيد الحياة وقد درست كل يوم لمدة 5 أيام. بعد 5 أيام بعد الحقن، حقن الأجنة في 24 هبف قد 6.25 في المائة البقاء (2/32)، بينما نجا هبف 95% (38/40) يرقات حقنه في 48. كعنصر تحكم، تم حقن اليرقات 1 x برنامج تلفزيوني كوسيلة. لم تكن هناك اختلافات في البقاء على قيد الحياة بين اليرقات حقن المركبة وحقنها الطفيلي، تشير إلى أي آثار الطفيلية تعتمد على معدل البقاء على قيد الحياة من الأسماك (p = 0.08). وقد اليرقات حقن بين 72-120 هبف معدلات بقاء قابلة للمقارنة لليرقات حقن هبف 48 في حجم الحقن المستمر. واستخدمت 48 هبف اليرقات لجميع الإجراءات المعروضة هنا، نظراً لسهولة التلاعب، وبعد أن وضعت أجهزة وسهولة اختراق الجلد دون ضرر واضح بعد الحقن.
كانت هبف اليرقات حقنه في 48 حقنه في الفضاء التامور، ذيل العضلات والبطين هيندبرين وحويصله عتيق، نوتوتشورد وقناة كوفييه في كيس ألمح. لم تكن هناك فروق في بقاء اليرقات حقنه في المواقع التشريحية المختلفة. ومع ذلك، كان المنطقة الأسرع والأسهل لحقن قناة كوفييه الموجود في الجزء الأمامي من كيس ألمح (الشكل 1، 1 فيلم). الحقن في هذا الموقع يسمح بإدخال كميات أعلى مع انخفاض خطر الإصابة إلى الهياكل الحيوية. بالإضافة إلى ذلك، أن هذه المنطقة بين 24-72 هبف، موقع أمثل للوصول مباشرة إلى المفرج النامي والقلب11.
التصور الطفيلي باستخدام لسفم:
في 8-10 دقيقة بعد حقن الكروزية. ت. في مجرى هواء كوفييه، حددت الطفيليات في الزرد اليرقات باستخدام لسفم بسبب إشارة كفسي الفلورسنت والشفافية الضوئية لليرقات. ولوحظت الطفيليات بعد التطعيم، أما الالتزام بالجدران حول نظام الدورة الدموية أو السفر في اتجاه تدفق الدم (الشكل 2و الشكل 3). عندما يبقى طفيلي المرفقة إلى بنية القلب، مثل صمام بي، فإنه يتذبذب مع تقلصات القلب، مما يشير إلى أن الآليات الجزيئية لتمسك الطفيليات قد تكون فعالة في نموذجنا الفقاريات (فيلم 2، 3 فيلم ، فيلم تكميلية 1). كما تلتزم الكروزية ت. جدران الكيس صفار اليرقات ( الشكل 2، 2 فيلم)، بنية الذي سيتم في وقت لاحق إعادة استيعاب وتصبح جزءا من الأمعاء الزرد22. وهذا يمكن أن تكون مماثلة لما يحدث أثناء مرحلة المرض المزمن في البشر المصابين، حيث توجد الطفيليات في كارديوميوسيتيس، وفي الجهاز الهضمي العصبي23،24. عندما لم تعلق، جنحت الطفيليات من خلال تدفق الدم في نفس الاتجاه مثل الكريات الحمراء ( الشكل 3، 4 فيلم). الطفيليات يمكن ملاحظته في سفن مختلفة الحجم من الأسماك، ولكن كانت أكثر وفرة في المساحة التامور وفي المنطقة المتاخمة صفار البيض تحتوي على تدفق الدم ( الشكل 2، الرقم 3، فيلم تكميلي 2).
في 10 دقيقة بعد الحقن، كان من الصعب أكثر على بقعة واحدة أشكال الطفيلي نظراً لتوزيعها على طول المفرج، وعدم قدرة على سرعة الشاشة التشريحية مواقع مختلفة من الأسماك بسبب مجال رؤية محدودة من (في 40 X التكبير ). بعد 24 ساعة بعد الحقن (hpi)، ويبدأ إشارة كفسي تتراكم في المنطقة قرب الأمعاء النامي (تكميلية الشكل 1).
رقم 1: موقع الحقن الأمثل. (أ) صورة يرقة 48 هبف تبين مكان الحقن الأمثل في مجرى هواء كوفييه (السهم الأصفر) استخدام ستيريوسكوبي عادية. (ب) ماجنيفيد عرض مربع في عرض قناة كوفييه (السهم الأصفر). شريط المقياس = 200 ميكرومتر (A)، 50 ميكرومتر (ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: الصور لسفم للطفيلي ثابتة في يرقة هبف 48- ت. الكروزية الطفيلي (السهم الأصفر) يبقى الالتزام بها على الجدران من كيس ألمح، في جميع أنحاء التسلسل الزمني الفاصل (7.2 s، 17.2 s، و 27.2 s)، حوالي ~ 15 دقيقة بعد حقن الطفيليات. ويلاحظ أي تغيير في موقف الطفيل أثناء فترة الحصول على مالا يقل عن 30 س. أ، اتريوم؛ الخامس، بطين. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: مسار طفيلي السفر في الفضاء التامور باستخدام لسفم- يمكن تعقب الطفيلي الكروزية ت. بينما الانجراف في الفضاء التامور (PS)، عقب اتجاه تدفق الدم (المسار المبين باللون الأحمر) حوالي ~ 15 دقيقة بعد حقن الطفيليات. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الفيلم 1: وادي دوران الدم من الصفار في يرقة 48 هبف. فيلم ليرقة 48 هبف عرض وادي دوران الدم أو مجرى الهواء من كوفييه استخدام ستيريوسكوبي عادية. وتتركز مناطق مختلفة خلال الفيديو لإظهار خلايا الدم الحمراء المتداولة في جميع أنحاء القناة. يظهر السهم الأصفر مكان الحقن الأمثل. تم تسجيل الفيلم حوالي 10-15 دقيقة بعد حقن الطفيليات. اضغط هنا لتحميل الفيديو.
فيلم 2: الطفيليات الكروزية ت تعلق على جدران الكيس صفار. فيلم لسفم لعرض هبف اليرقة 48 بقاء الطفيليات الكروزية T. التقيد بها كيس ألمح حوالي 10-15 دقيقة بعد حقن الطفيليات. أي تغيير في موقف الطفيلي لوحظ أثناء فترة الحصول على مالا يقل عن 30 س. أ، اتريوم؛ الخامس، بطين. اضغط هنا لتحميل الفيديو.
فيلم 3: الطفيليات الكروزية ت تعلق على جدران القلب. فيلم لسفم ليرقة 48 هبف تبين أن ريمي الطفيليات الكروزية ت. n الالتزام بالجدار القلب والأوعية الدموية، وعلى الرغم من انكماش القلب قوية حوالي 10-15 دقيقة بعد حقن الطفيليات. ويمكن ملاحظة الكريات الحمراء كالظلال السوداء مستدير الزوايا. اضغط هنا لتحميل الفيديو.
4 فيلم: الطفيليات التي تتحرك في الفضاء التامور. فيلم لسفم يرقة 48 هبف إظهار الكروزية ت. الطفيليات الانجراف في الفضاء التامور. يمكن تتبع الطفيليات اثنين في نقاط زمنية مختلفة (معرف 1، في دائرة حمراء، ومعرف 2 في دائرة صفراء)، بعد مسار مماثل. تم تسجيل الفيلم حوالي 10-15 دقيقة بعد حقن الطفيليات. اضغط هنا لتحميل الفيديو.
تكميلية الشكل 1: إشارة "تراكم كفسي" الفلورية في الصفار. صور ستيريوسكوبي ليرقة wildtype حقنه في 48 هبف في مجرى هواء كوفييه. إشارة الفلورسنت كفسي تدريجيا يتراكم في صفار البيض، بعد يومين بعد الحقن (48 hpi). شريط المقياس = 500 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لتحميل الرقم.
تكميلية الفيلم 1: الطفيليات تعلق على الجدران وصمامات الدموية. ستيريوسكوبي الوقت سلسلة الصور من نوع البرية يرقة حقنه في 48 هبف. يتم أخذ صور على 0.2 s فترات التقاط الطفيليات الكروزية ت نقل بالتزامن مع تقلصات عضلة القلب في صمام بي. تم تسجيل الفيلم حوالي 30 دقيقة بعد حقن الطفيليات. اضغط هنا لتحميل الفيديو.
تكميلية الفيلم 2: الطفيليات تتحرك والتقيد بها في الفضاء المحيط بالبطينات وصفار. فيلم لسفم يرقة 48 هبف إظهار الكروزية ت. الطفيليات الانجراف أو التقيد بالمساحة التامور أو صفار البيض. طريقة عرض خفيفة منقولة لوحظ لأول 5 s. وقد لوحظ رأي الأسفار من 5.2-25.8 s. تم تسجيل الفيلم حوالي 10-15 دقيقة بعد حقن الطفيليات. اضغط هنا لتحميل الفيديو.
Discussion
وتبرز هذه الدراسة مزايا الزرد كنموذج حيوان لدراسة العوامل الممرضة السلوك في فيفو. على وجه الخصوص، تقترح هذه الدراسة وسيلة لتصور الممرض الكروزية. ت. في بيئتها الطبيعية: تداول هيماتيك. البيئة المكروية الدورة الدموية في الأسماك مماثل للثدييات، وتريبانوسوماتيدس وقد تطورت آليات للسفر، والتهرب من النظام المناعي، وإرفاق إلى الخلايا للإصابة في تلك البيئة25. ويوفر هذا البروتوكول وصف إجراء الأمثل لثقافة الكروزية. ت. في خط الخلية البشرية والعزلة اللاحقة من أشكال فلاجلر لوسم الفلورسنت. ثم يظهر الإعدادات المناسبة لنجاح حقن الطفيليات في الزرد شفافة للتصور باستخدام لسفم وتصاعد في وقت لاحق. وأخيراً، يقدم هذا البروتوكول اقتراحات للتصوير بكفاءة وفعالية في فيفو موقع الطفيلي والحركة في الدورة الدموية باستخدام لسفم.
السوط مثقبيات ينبثق من منطقتها الخلفية، تتدفق من جسم الخلية، وتوقف مجاناً في الجزء الأمامي من الكائن الحي26. الكروزية T. يدفع نفسه بالتلويح بالسوط قبل الجسم، والذي أوندولاتيس الطفيليات الجسم بأكمله. فلاجلر حركة ليس فقط أمرا لا غنى عنه لحركة الطفيلي، على غرار البروسية ت.27 (المسبّب لداء المثقبيات الأفريقي)، ولكن أيضا استخدامه للعدوى الخلوية، كما ثبت في الكروزية. ت.5 ،28. على الرغم من الزرد ليست المضيفة الطبيعية الكروزية. ت.، يمكن دراسة حركية للطفيلي في نظام الدورة الدموية القلبية الوعائية نامية استخدام البروتوكولات المذكورة هنا. بالإضافة إلى ذلك، هناك مثقبيات الأنواع التي تصيب الكارب، فئة الزرد، مثل كراسي ت. و . ت. بوريلي25. يمكن استخدام هذه الأنواع الطفيليات للدراسة في الوقت الحقيقي الحركات وآليات مرفق لهذه تريبانوسوماتيدس؛ يمكن أن تقدم مثل هذه الدراسات نظرة ثاقبة عملية عدوى خلايا الثدييات.
وفي هذه الدراسة، حقن متحركة الكروزية ت. الطفيليات كانت السفر ملاحظتها من خلال تداول الأسماك الملقحين القلب والأوعية الدموية، وتتحرك جنبا إلى جنب مع الكريات الحمراء المعتمة، والتمسك بهياكل في جدران الأوعية الدموية. كنا الصنع مع 10 X متعامي طويلة المسافة العمل الهدف الجوي (17.6 ملم) للذراع الإضاءة مع فتحه عددية من 0.25. 40 × الهدف غمر المياه اللازيغيه مع فتحه عددية من 0.8 ومسافة عمل 3.5 مم استخدمت للكشف عن الذراع. كانت مغمورة هدف الكشف عن في قاعة عينة، بينما كان الهدف إنارة خارج الدائرة. منفذ في غرفة مغلقة مع ساترة والغراء البصرية يسمح لشعاع الإضاءة لدخول قاعة، كما هو مبين في لورنزو et al. 18 المستخدمة للإضاءة، ونحن ليزر والعسف 50 ميغاواط في 488 نانومتر السلطة التي تمت عن طريق عامل "تصفية الانضباطي بصري أكوستو" التضمين. مسار الكشف عن استخدام مرشحات متوافقة مع أخضر نيون البروتين (بروتينات فلورية خضراء) أو فيتك. مجهر ضوء ورقة مزودة بحامل عينة الشعرية (ومن الناحية المثالية مع التناوب الآلي) والتحكم في درجة الحرارة الدائرة عينة ينبغي أن تكون مناسبة لهذا التطبيق. وينبغي الانحياز المجهر ومعايرة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة أو المستخدم مختبر البروتوكولات القياسية قبل حيازتها، إذا لزم الأمر. في هذا البروتوكول، تسيطر علينا المجهر استخدام البرمجيات SPIM19.
من المهم أن نلاحظ أن في تعميم الزرد، مرفق اليرقات الطفيلية فعالة. وفي السياق الكاردينال، الطفيليات ظلت المرفقة لتصل إلى عدة دقائق؛ في القلب، وعقدوا الصمامات والجدران، وتتأرجح مع تقلصات القلب. يبقى إجراء المزيد من الدراسات من أجل توضيح ما إذا كان ت الكروزية يتفاعل مع الكريات الحمراء تتدفق بالانجراف في اتجاه تدفق الدم. الدراسات السابقة في المختبر أظهرت أن وجود هياكل صلبة (أي، خلايا الدم)، أو زيادة لزوجة السائل لتقليد الدم في المختبر، وله تأثير كبير على الحركة والسرعة للطفيلي 9.
هناك العديد من الأسئلة المتعلقة بمسار العدوى الكروزية. ت. في البشر بعد الهروب amastigotes الخلايا البلعمية، ونوع الخلايا المصابة في البداية29. على سبيل المثال، كيف يصلون إلى الأجهزة المستهدفة؟ ما هي آليات انتحاء إلى الأجهزة المفضلة، مثل القلب والجهاز الهضمي والعصبي المركزي؟ من المثير للاهتمام، في هذه الدراسة الطفيليات كانت في البداية تصويرها في القلب لأنه كان موقع أعلى كثافة للطفيليات. ومع ذلك، إشارة كفسي لاحقاً المتراكمة في الأمعاء النامي خلال 7 أيام بعد الحقن. على الرغم من أن تشريح الأسماك والثدييات المختلفة، تظهر نتائج هذه الدراسة شكلاً من أشكال انتحاء، كما لوحظ أن الطفيليات معارضها انتحاء نحو الأجهزة الهدف المفضل المعروفة على الرغم من الاختلافات العضوي. حد كبير واحد من هذه الدراسة تتعلق بدرجة الحرارة المستخدمة في التجارب. ينبغي أن تظل اليرقات الزرد حوالي 28 درجةمئوية خلال الإجراء بأكمله. على الرغم من أن درجة الحرارة هذه قد تكون مشابهة لناقل المضيف (حشرات فصيلة Triatominae)، فإنه يختلف تماما عن الثدييات ذوات الدم الحار التي تتألف منها يستضيف النهائي (حوالي 37 درجة مئوية). الكروزية. ت. ومن المعروف أن أشكال المعيشة فلاجلر في كلا المضيفين؛ ومع ذلك، من المهم أن نضع في اعتبارنا أن هذا العامل قد يكون له أثر في سلوك الحيوانات في فيفو.
على الرغم من أن النظام المناعي التكيفي fish´s ليست ناضجة حتى 4 أسابيع بعد الإخصاب، تنشط نظام المناعة الفطرية المبكر في التنمية10. أقرب وقت هبف 48 أو 96، لوحظت خلايا متجولة وقد اجتاحت المسمى مثقبيات (البيانات لا تظهر). وهذا يحد من النافذة الزمنية للتصور للطفيلي. ومع ذلك، إذا تمت دراسة التركيز على تقييم الاستجابة المناعية fish´s، قد أوصت الحقن في مراحل لاحقة. أيضا، حقن الطفيليات في خطوط الأسماك المحورة وراثيا مع الضامة المسمى أو خلايا أخرى من الجهاز المناعي يمكن أن تكون مفيدة في دراسة مرفق الطفيلي والآليات الممكنة الالتقام. من المهم أن نلاحظ أنه في حالة الطفيليات المسماة مع كفسي وتسميات الخلايا المحورة وراثيا لا ينبغي أن تكون التجارة والنقل، وعلامة في نهاية الطيف الأصفر أو الأحمر مطلوب.
تقييم اتجاه مفصلة لحركة الطفيلي، قد يكون من المفيد اتباع مسار بهم في 3 الأبعاد (3D). 3D التصور والتعمير عملية، نظام عالي السرعة اللازمة. مع المعدات المستخدمة في هذا البروتوكول، فإنه من الممكن تصور الطفيليات في طائرة واحدة فقط. وفي هذه الحالة، نحن الأولوية للحفاظ على استقرار المستوى البؤري أثناء حركة الطفيلي، وتسجيل مساره في طائرة واحدة.
المنهجية المقترحة هنا يمهد الطريق مواصلة التحقيق في السلوك الطفيلي في الدورة الدموية في القلب والأوعية الدموية. وباختصار، خطوات ضرورية للتصوير الطفيليات الفلورسنت يعيش داخل يرقات الزرد:(ط) استخدام الأجنة مظلل في وقت مبكر (24-48 هبف) أو اليرقات أو الحيوانات بين 72-96 هبف مع لا تصبغ بحيث تكون شفافة وسهلة لحقن؛ (ثانيا) صورة يرقات وقت ممكن بعد الحقن لتجنب إزالة الطفيليات من الخلايا البلعمية؛ ويركز على الموقع للفائدة (مثلاً، منطقة التامور) (ثالثا) والحفاظ على التركيز. يسمح هذا الإجراء رواية تصور trypomastigotes في بيئة شبيهة بمكانته الطبيعية العدوى، توفير إمكانية دراسة الكروزية. ت. في حي للمرة الأولى.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل إينتيرفاكولتاديس كونفوكاتوريا من البحوث de Vicerrectoría de la جامعة دي لوس إنديز، وبرنامج وكالة التنمية الدولية للبحث والابتكار الزمالة. ونحن نشكر خوان رافائيل Buitrago وييفيرزون ارديلا للحفاظ على الأسماك والمساعدة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5-10 μL Micropipette | Fisherbrand | 21-377-815 | |
| Agarose RA | Amresco | N605 | Regular |
| Agarose SFR | Amresco | J234 | Low Melting point |
| Aquarium salt | Instant ocean | SS15-10 | |
| Cell Count chamber | Boeco | Neubauer | |
| Cell culture flasks | Corning | 430639 | |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| CFSE | ThermoFisher | C34554 | |
| Detection objective | Nikon 40x 0.8NA | 40x CFI APO NIR | |
| DMEM medium | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Dumont #5 fine forceps | World precision Instruments | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Eurobio | CVFSVF00-01 | |
| Filter | Chroma | ET-525/50M | |
| Glass capillaries for embryo mounting | Vitrez Medical | 160215 | |
| Glass capillaries for pulling needles | World precision instruments | TW100-4 | |
| Glucose | Gibco | A2494001 | |
| HEPES | Gibco | 156300-80 | |
| Incubator | Thermo Corporation | Revco | |
| Larval microinjection mold | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| Laser | Crystalaser | DL488-050 | |
| L-glutamine | Gibco | 250300-81 | |
| Methylene blue | Albor Químicos | 12223 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| Micromanipulator system | Sutter Instrument | MP-200 | For LSFM |
| Micropipette puller device | Narishige | PC-10 | |
| Microscope | Olympus | CX31 | |
| Microscope (inverted) | Olympus | CKX41 | |
| Multipurpose microscope | Nikon | AZ100M | |
| Neubauer counting chamber | Boeco Germany | ||
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-163 | |
| Petri dish 94x16 | Greiner bio-one | 633181 | |
| Plastic pasteur pipette | Fisherbrand | 11577722 | |
| Rotation stage | Newport | CONEX-PR50CC | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R4130 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Stereoscope | Nikon | C-LEDS | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | |
| TRIS | Amresco | M151 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | R-001-100 | |
| Tubes 15 ml | Corning | 05-527-90 |
References
- WHO. Chagas disease (American trypanosomiasis). , http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs340/en/ (2017).
- Bern, C. Chagas's Disease. New England Journal of Medicine. 373 (5), 456-466 (2015).
- Sosa Estani, S., Segura, E. L., Ruiz, A. M., Velazquez, E., Porcel, B. M., Yampotis, C. Efficacy of chemotherapy with benznidazole in children in the indeterminate phase of Chagas’ disease. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 59 (4), 526-529 (1998).
- Rosas, F., Roa, N., Cucunuba, Z. M., Cuellar, A., Gonzalez, J. M., Puerta, J. C. Chagasic Cardiomyopathy. Cardiomyopathies - From Basic Research to Clinical Management. , (2012).
- Finkelsztein, E. J., et al. Altering the motility of Trypanosoma cruzi with rabbit polyclonal anti-peptide antibodies reduces infection to susceptible mammalian cells. Experimental Parasitology. 150, 36-43 (2015).
- Martins, R. M., Covarrubias, C., Rojas, R. G., Silber, A. M., Yoshida, N. Use of L-Proline and ATP Production by Trypanosoma cruzi Metacyclic Forms as Requirements for Host Cell Invasion. Infection and Immunity. 77 (7), 3023-3032 (2009).
- Engstler, M., et al. Hydrodynamic Flow-Mediated Protein Sorting on the Cell Surface of Trypanosomes. Cell. 131 (3), 505-515 (2007).
- Uppaluri, S., et al. Impact of Microscopic Motility on the Swimming Behavior of Parasites: Straighter Trypanosomes are More Directional. PLoS Computational Biology. 7 (6), e1002058 (2011).
- Heddergott, N., et al. Trypanosome Motion Represents an Adaptation to the Crowded Environment of the Vertebrate Bloodstream. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003023 (2012).
- Gratacap, R. L., Wheeler, R. T. Utilization of zebrafish for intravital study of eukaryotic pathogen–host interactions. Developmental & Comparative Immunology. 46 (1), 108-115 (2014).
- Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-Pathogen Interactions Made Transparent with the Zebrafish Model. Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).
- White, R. M., et al. Transparent Adult Zebrafish as a Tool for In Vivo Transplantation Analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Huisken, J. Slicing embryos gently with laser light sheets. BioEssays. 34 (5), 406-411 (2012).
- Westerfield, M. The zebrafish book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene. http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html (2000).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Vargas-Zambrano, J. C., Lasso, P., Cuellar, A., Puerta, C. J., González, J. M. A human astrocytoma cell line is highly susceptible to infection with Trypanosoma cruzi. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 108 (2), 212-219 (2013).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (25), e1115-e1115 (2009).
- Lorenzo, C., et al. Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy. Cell Division. 6, 22 (2011).
- Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using μManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), e10 (2014).
- Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (84), (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ng, A. N. Y., et al. Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis. Developmental Biology. 286 (1), 114-135 (2005).
- Higuchi, M. D. L., et al. Correlation between Trypanosoma cruzi parasitism and myocardial inflammatory infiltrate in human chronic chagasic myocarditis: Light microscopy and immunohistochemical findings. Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 2 (2), 101-106 (1993).
- Vago, A. R., Silva, D. M., Adad, S. J., Correa-Oliveira, R., d'Avila Reis, D. Chronic Chagas disease: presence of parasite DNA in the oesophagus of patients without megaoesophagus. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 97 (3), 308-309 (2003).
- Wiegertjes, G. F., Forlenza, M., Joerink, M., Scharsack, J. P. Parasite infections revisited. Developmental & Comparative Immunology. 29 (9), 749-758 (2005).
- De Souza, W. Basic cell biology of Trypanosoma cruzi. Current Pharmaceutical Design. 8 (4), 269-285 (2002).
- Langousis, G., Hill, K. L. Motility and more: the flagellum of Trypanosoma brucei. Nature Reviews. Microbiology. 12 (7), 505-518 (2014).
- Johnson, C. A., et al. Cellular response to Trypanosoma cruzi infection induces secretion of defensin α-1, which damages the flagellum, neutralizes trypanosome motility, and inhibits infection. Infection and Immunity. 81 (11), 4139-4148 (2013).
- Magalhães, L. M. D., Viana, A., Chiari, E., Galvão, L. M. C., Gollob, K. J., Dutra, W. O. Differential Activation of Human Monocytes and Lymphocytes by Distinct Strains of Trypanosoma cruzi. PLoS neglected tropical diseases. 9 (7), e0003816 (2015).
