光刺激后小龙虾光受体的脱敏和回收
Summary
提出了一种研究小龙虾光感受器作为昼夜时间函数的脱敏和灵敏度恢复的方案。
Abstract
提出了一种研究小龙虾光感受器脱敏和回收的方法。我们使用不连续的单电极开关电压夹配置对隔离眼眼中的光受体细胞进行了细胞内电记录。首先，用剃刀刀片，我们在背角膜打开，以获得视网膜。之后，我们插入一个玻璃电极通过开口，并穿透一个细胞，如记录负电位报告。膜电位被夹在光受体的静息电位上，并应用光脉冲来激活电流。最后，采用两种光闪协议测量电流脱敏和恢复。第一个光闪光触发，在滞后期后，转导离子电流，达到峰值振幅后衰减为脱敏状态;以不同时间间隔应用的第二次闪光可评估光激活电导的状态。为了描述光激发电流的特征，测量了三个参数：1） 延迟（从光闪光传递到电流达到其最大值的 10% 之间的时间）;2） 峰值电流;3） 脱敏时间常数（电流衰减相的指数时间常数）。所有参数都受到第一个脉冲的影响。
为了量化脱敏回收，采用了 p2/p1 的比率与脉冲之间的时间。p1 是第一个光脉冲引起的峰值电流，p2 是第二个脉冲引起的峰值电流。这些数据被拟合到指数函数的总和上。最后，这些测量是作为昼夜时间的功能进行的。
Introduction
为了被视为视觉刺激，到达眼睛的光必须转换成电信号。因此，在所有视觉生物体中，光触发转导电电流，进而产生光受体细胞膜电位的变化，即所谓的受体电位。因此，眼睛的光灵敏度主要取决于光激活电导的状态，该电导可以激活或脱敏。
在小龙虾光感受器中，光触发一个缓慢的，瞬态的，离子电流1。照明后，转导电流在延迟或延迟后产生，然后达到最大值;之后，它衰减，因为转导通道进入脱敏状态，其中它们对进一步的光刺激2没有反应。也就是说，光除了激活对视觉负责的转导电流外，还会引起光受体细胞的灵敏度的瞬时递减。脱敏可能是防止过度暴露于适当刺激的一般保护机制。当转导电导从脱敏中恢复时，眼睛对光的敏感性会恢复。
细胞内记录是测量兴奋细胞3、4、5、6、7、8的电活性的有用技术。虽然随着贴片夹技术9的出现，细胞内记录已经变得不那么频繁，但当细胞难以分离，或者呈现几何形状，使得贴片夹紧的千兆密封的形成变得困难（即，贴片电极和抗电阻为109欧姆的膜之间的密封或紧密接触），它仍然是一种方便的方法。后者的例子是精子细胞10和本文研究的光受体细胞。根据我们的经验，Procambarus克拉克光感受器很难在初级文化中分离和保存;此外，它们是薄棒，使千兆海豹形成难以实现。在细胞内记录中，一个尖锐的电极被推进到细胞中，由周围的组织固定到位。电极被放大器的高速开关电路切碎，因此在电压脉冲之间采样电流。此模式称为不连续单电极电压夹（dSEVC 模式）11。电极的高电阻（小开口）阻碍细胞和移液器溶液之间的扩散交换，对细胞内环境产生最小的干扰。这种技术的一个潜在缺点是电极插入可能产生非选择性的泄漏电流;因此，必须小心避免从电池记录泄漏电流的大小可能会干扰预定的测量4，12。
在此，我们使用孤立的小龙虾眼眼，通过在电压夹条件下对光受体细胞进行细胞内电记录，评估光激活电导的脱敏和恢复。
Protocol
Representative Results
Discussion
小龙虾由于能够在非自然条件下生存，已被证明是一个优秀的模型。易于进行体内和体外电生理分析。此外，甲壳类动物是比较时间生物学领域神经生物学研究的有利群体。
本文采用细胞内记录技术，对小龙虾光活化转导电流的脱敏和恢复进行了研究。然而，我们相信，只要有可能获得光受体细胞，同样的技术就可以适应其他无脊椎动物视觉?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了DGAPA-UNAMIN224616-RN224616赠款的支持。作者要感谢联合国妇女署医学学院科学论文翻译部主任何塞菲娜·博拉多夫人编辑本手稿的英文版本。
Materials
| Axoclamp2A | Axon Instruments Inc | Amplifier | |
| Digidata 1200 Interface | Axon Instruments Inc | Digitizer | |
| Oscilloscope TDS430A | Tektronix | Analogic Oscilloscope | |
| Photostimulator PS33 Plus | Grass | Lamp | |
| Puller PC-100 | Narishige | Micropipette Puller | |
| Puller P-97 | Sutter Instruments | Micropipette Puller | |
| Glass Capillary Tube Kimax-51 | Kimble Products | 34502 | 0.8, 1.10, 100 mm |
| HS-2 Headstage | Axon Instruments Inc | Headstage | |
| Micromanipulator MX-4 | Narishige | Mechanical Micromanipulator | |
| Stereoscopic Microscope | Zeiss | Microscope | |
| pClamp | Axon Instruments Inc | Data acquisition software for digidata 1200 interface | |
| Clampfit | Axon Instruments Inc | Analysis software linked to pClamp | |
| Origin | OriginLab Corp. | Data analysis and graphing software | |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | >99.5% |
| Potassium Chloride | Sigma | P-9333 | Minimum 99% |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | Minimum 99.5% |
| Calcium Chloride | Sigma | C5080 | Minimum 99.0% |
| Hepes | Sigma | H7523 | >99.5% |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | 98.00% |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma | 425044 | Available chlorine, 10-15% |
References
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