Desensibilisatie en herstel van de kleurplaatjes bij de afgifte van een licht stimulus
Summary
Een protocol voor de studie van desensibilisatie en gevoeligheid herstel van rivierkreeft fotoreceptoren als een functie van de circadiane tijd wordt gepresenteerd.
Abstract
Een methode voor het bestuderen van desensibilisatie en herstel van rivierkreeft fotoreceptoren wordt gepresenteerd. We voerden intracellulaire elektrische opnames van fotoreceptor cellen in geïsoleerde oogsprieten met behulp van de discontinue single-elektrode-geschakelde voltage-clamp configuratie. Ten eerste, met een scheermesje maakten we een opening in het rughoorn vlies om toegang te krijgen tot het netvlies. Daarna, we ingebracht een glaselektrode door de opening, en gepenetreerd een cel zoals gerapporteerd door de opname van een negatief potentieel. Membraanpotentiaal werd geklemd op het rust potentieel van de photoreceptor en er werd een licht puls toegepast om stromingen te activeren. Ten slotte werd het twee Light-Flash protocol gebruikt om de huidige desensibilisatie en het herstel te meten. De eerste lichtflits activeert, na een vertragingsperiode, de transductie Ionische stroom, die na het bereiken van een piek amplitude vervalt naar een ongevoelig staat; de tweede flitser, toegepast met wisselende tijdsintervallen, beoordeelt de toestand van de lichtgeactiveerde conductiviteit. Om de lichtopgewekt stroom te karakteriseren, werden drie parameters gemeten: 1) latentie (de tijd die is verstreken tussen de lichtflits levering en het moment waarop de stroom 10% van de maximale waarde bereikt); 2) piekstroom; en 3) desensibilisatie tijdconstante (exponentiële tijdconstante van de huidige verval fase). Alle parameters worden beïnvloed door de eerste puls.
Om te kwantificeren herstel van desensibilisatie, de verhouding P2/P1 werd gebruikt versus tijd tussen pulsen. P1 is de piekstroom die wordt opgeroepen door de eerste licht puls, en P2 is de piekstroom die wordt opgeroepen door de tweede puls. Deze gegevens werden op een som van exponentiële functies gemonteerd. Tot slot, deze metingen werden uitgevoerd als functie van de circadiane tijd.
Introduction
Om als een visuele stimulans te worden beschouwd, moet licht dat de ogen bereikt, worden opgenomen in een elektrisch signaal. Vandaar, in alle visuele organismen, licht activeert een transductie Ion-Current, die op zijn beurt produceert een verandering in het membraan potentieel van fotoreceptor cellen, de zogenaamde receptor potentieel. Hierdoor is de lichtgevoeligheid van het oog voornamelijk afhankelijk van de toestand van de licht geactiveerde geleiding, die ofwel beschikbaar is om te worden geactiveerd of ongevoelig.
In rivierkreeft photoreceptors activeert licht een langzame, voorbijgaande, Ionische stroom1. Bij verlichting ontstaat de transductie stroom na een vertraging of latentie voordat het maximum bereikt wordt; daarna vervalt het, als de transductie kanalen vallen in een ongevoelig toestand waarin ze niet reageren op verdere licht stimulus2. Dat is, licht, in aanvulling op het activeren van de transductie huidige verantwoordelijk van het gezichtsvermogen, ook induceert een voorbijgaande verlagen van de gevoeligheid van fotoreceptor cellen. Desensibilisatie kan een algemeen beschermingsmechanisme vormen tegen overmatige blootstelling aan een adequate stimulans. De gevoeligheid van het oog voor licht wordt hersteld naarmate de transductie geleiding herstelt van desensibilisatie.
Intracellulaire opname is een nuttige techniek voor het meten van elektrische activiteit van prikkelbaar cellen3,4,5,6,7,8. Hoewel de intracellulaire opname minder frequent is geworden met de opkomst van de patch-clamp techniek9, het is nog steeds een gemakkelijke benadering wanneer cellen moeilijk te isoleren zijn, of een geometrie presenteren die de vorming van de pleister-span Giga-Seals moeilijk maakt (d.w.z.afdichtingen of nauwe contacten tussen de patch-elektrode en membranen met elektrische weerstand van de orde van 109Ohm). Voorbeelden van deze laatste zijn spermacellen10 en de fotoreceptor cellen hierin bestudeerd. In onze ervaring zijn Procambarus clarkii fotoreceptoren moeilijk te isoleren en te behouden in de primaire cultuur; Daarnaast zijn het dunne hengels die het moeilijk maken om de Giga-Seal vorming te realiseren. In intracellulaire opnames wordt een scherpe elektrode gevorderd in een cel die door het omringende weefsel op zijn plaats wordt gehouden. De elektrode wordt geknipt door de High-Speed schakelcircuits van de versterker, zodat de stroom wordt bemonsterd tussen Spanningspulsen. Deze modus staat bekend als discontinu spannings klem met één elektrode (dSEVC-modus)11. De hoge weerstand (kleine opening) van de elektrode belemmert de diffusie-uitwisseling tussen de cel en de pipet oplossingen, wat een minimale verstoring van de intracellulaire milieu3oplevert. Een mogelijk nadeel van deze techniek is dat elektrode invoeging een niet-selectieve lekstroom kan opleveren; Daarom moet worden gezorgd om opname uit cellen te voorkomen waarbij de grootte van de lekstroom de beoogde metingen4,12kan verstoren.
Hierin gebruiken we geïsoleerde rivierkreeft om desensibilisatie en herstel van de lichtgeactiveerde ionconductiviteit te beoordelen door intracellulaire elektrische opnames van fotoreceptor cellen onder spannings klem condities uit te voeren.
Protocol
Representative Results
Discussion
De rivierkreeft heeft bewezen een uitstekend model te zijn vanwege zijn vermogen om te overleven onder niet-natuurlijke omstandigheden. Er is gemakkelijke toegang tot in vivo en in vitro elektrofysiologische analyses. Daarnaast zijn schaaldieren een gunstige groep voor neurobiologisch onderzoek op het gebied van vergelijkende chronobiologie21.
In dit document wordt de studie van desensitisatie en herstel van de lichtgeactiveerde transductie-stroom van …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door DGAPA-UNAM IN224616-RN224616 Grant. De auteurs willen Mrs. Josefina Bolado, hoofd van de afdeling wetenschappelijke papier vertalingen, van de División de onderzoekt aan de Facultad de Medicina, UNAM, bedanken voor het bewerken van de Engelstalige versie van dit manuscript.
Materials
| Axoclamp2A | Axon Instruments Inc | Amplifier | |
| Digidata 1200 Interface | Axon Instruments Inc | Digitizer | |
| Oscilloscope TDS430A | Tektronix | Analogic Oscilloscope | |
| Photostimulator PS33 Plus | Grass | Lamp | |
| Puller PC-100 | Narishige | Micropipette Puller | |
| Puller P-97 | Sutter Instruments | Micropipette Puller | |
| Glass Capillary Tube Kimax-51 | Kimble Products | 34502 | 0.8, 1.10, 100 mm |
| HS-2 Headstage | Axon Instruments Inc | Headstage | |
| Micromanipulator MX-4 | Narishige | Mechanical Micromanipulator | |
| Stereoscopic Microscope | Zeiss | Microscope | |
| pClamp | Axon Instruments Inc | Data acquisition software for digidata 1200 interface | |
| Clampfit | Axon Instruments Inc | Analysis software linked to pClamp | |
| Origin | OriginLab Corp. | Data analysis and graphing software | |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | >99.5% |
| Potassium Chloride | Sigma | P-9333 | Minimum 99% |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | Minimum 99.5% |
| Calcium Chloride | Sigma | C5080 | Minimum 99.0% |
| Hepes | Sigma | H7523 | >99.5% |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | 98.00% |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma | 425044 | Available chlorine, 10-15% |
References
- Barriga-Montoya, C., Gómez-Lagunas, F., Fuentes-Pardo, B. Effect of pigment dispersing hormone on the electrical activity of crayfish visual photoreceptors during the 24-h cycle. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 157 (4), 338-345 (2010).
- Barriga-Montoya, C., de la O-Martínez, A., Fuentes-Pardo, B., Gómez-Lagunas, F. Desensitization and recovery of crayfish photoreceptors. Dependency on circadian time, and pigment-dispersing hormone. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 203, 297-303 (2017).
- Wickenden, A. D. Overview of electrophysiological techniques. Curr. protoc. pharmacol. 11, 1-17 (2014).
- Brette, R., Destexhe, A. Intracellular recording. Handbook of Neural Activity Measurement. , 44-91 (2012).
- Cummins, D., Goldsmith, T. H. Cellular identification of the violet receptor in the crayfish eye. J. Comp. Physiol. 142 (2), 199-202 (1981).
- Eguchi, E. Rhabdom structure and receptor potentials in single crayfish retinular cells. J. Cell and Comp. Physiol. 66, 411-430 (1965).
- Nosaki, H. Electrophysiological study of color encoding in the compound eye of crayfish, Procambarus clarkii. Z. vergl. Physiologie. 64 (3), 318-323 (1969).
- Miller, C. S., Glantz, R. M. Visual adaptation modulates a potassium conductance in retinular cells of the crayfish. Vis Neurosci. 17 (3), 353-368 (2000).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
- Lishko, P., Clapham, D. E., Navarro, B., Kirichok, Y. Sperm patch-clamp. Methods Enzymol. 525, 59-79 (2013).
- Finkel, A. Axoclamp-2A microelectrode clamp theory and operation. Axon Instruments, Inc. , (1990).
- Sakmann, B. . Single-channel recording. , (2013).
- Van Harreveld, A. A physiological solution for freshwater crustacea. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 34 (4), 428-432 (1936).
- Oesterle, A. . pipette cookbook. , 97 (2008).
- Fuentes-Pardo, B., Ramos-Carvajal, J. The phase response curve of electroretinographic circadian rhythm of crayfish. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 74 (3), 711-714 (1983).
- Pace-Schott, E. F., Hobson, J. A. The neurobiology of sleep: genetics, cellular physiology and subcortical networks. Nat. Rev. Neurosci. 3 (8), 591-605 (2002).
- Pittendrigh, C. S., Aschoff, J. On the mechanism of the entrainment of a circadian rhythm by light cycles. Circadian Clocks. , 277-297 (1965).
- Pittendrigh, C. S., Aschoff, J. Circadian systems: entrainment. Handbook Behavioral Neurobiology Biological Rhythms. , 94-124 (1981).
- Vitaterna, M. H., Takahashi, J. S., Turek, F. W. Overview of circadian rhythms. Alcohol Res. Health. 25 (2), 85-93 (2001).
- Hille, B. . Ion channels of excitable membranes. 507, (2001).
- Dircksen, H., Strauss, J. Circadian clocks in crustaceans: identified neuronal and cellular systems. Front Biosci. 15, 1040-1074 (2010).
- Terakita, A., Hariyama, T., Tsukahara, Y., Katsukura, Y., Tashiro, H. Interaction of GTP-binding protein Gq with photoactivated rhodopsin in the photoreceptor membranes of crayfish. FEBS Lett. 330, 197-200 (1993).
- Terakita, A., Takahama, H., Hariyama, T., Suzuki, T., Tsukahara, Y. Light regulated localization of the beta-subunit of Gq-type G-protein in the crayfish photoreceptors. J Comp Physiol A. 183 (4), 411-417 (1998).
- Terakita, A., Takahama, H., Tamotsu, S., Suzuki, T., Hariyama, T., Tsukahara, Y. Light-modulated subcellular localization of the alpha-subunit of GTP-binding protein Gq in crayfish photoreceptors. Vis Neurosci. 13 (3), 539-547 (1996).
