Summary

Dessensibilização e recuperação de fotorreceptores de lagostins após a entrega de um estímulo leve

Published: November 09, 2019
doi:

Summary

Um protocolo para o estudo da dessensibilização e recuperação da sensibilidade de fotorreceptores de lagostins em função do tempo circadiano é apresentado.

Abstract

Um método para estudar a dessensibilização e recuperação de fotorreceptores de lagostins é apresentado. Realizamos gravações elétricas intracelulares de células fotorreceptoras em eyestalks isolados usando a configuração de tensão-clamp comutada por eletrodo. Primeiro, com uma lâmina de barbear fizemos uma abertura na córnea dorsal para ter acesso à retina. Depois disso, inserimos um eletrodo de vidro através da abertura, e penetramos uma célula conforme relatado pelo registro de um potencial negativo. O potencial da membrana foi apertado no potencial de descanso do fotorreceptor e um luz-pulso foi aplicado para ativar correntes. Finalmente, o protocolo de dois flashs leves foi empregado para medir a dessensibilização e recuperação atuais. O primeiro flash de luz desencadeia, após um período de atraso, a corrente iônica de transdução, que depois de atingir uma amplitude máxima decai em direção a um estado dessensibilizado; o segundo flash, aplicado em intervalos de tempo variados, avalia o estado da condutância ativada pela luz. Para caracterizar a corrente provocada pela luz, três parâmetros foram medidos: 1) latência (o tempo decorrido entre a entrega de flash de luz e o momento em que a corrente atinge 10% de seu valor máximo); 2) pico de corrente; e 3) tempo de dessensibilização constante (tempo exponencial constante da fase atual de decadência). Todos os parâmetros são afetados pelo primeiro pulso.

Para quantificar a recuperação da dessensibilização, a razão p2/p1 foi empregada versus o tempo entre os pulsos. p1 é a corrente de pico evocada pelo primeiro pulso de luz, e p2 é a corrente de pico evocada pelo segundo pulso. Esses dados foram ajustados a uma soma de funções exponenciais. Finalmente, essas medidas foram realizadas em função do tempo circadiano.

Introduction

A fim de ser percebido como um estímulo visual, a luz atingindo os olhos deve ser transduzida em um sinal elétrico. Assim, em todos os organismos visuais, a luz desencadeia uma corrente íon-transducção, que por sua vez produz uma mudança no potencial de membrana das células fotorreceptoras, o chamado potencial receptor. Devido a isso, a sensibilidade à luz do olho depende principalmente do estado da condutância ativada pela luz, que pode estar disponível para ser ativada ou insensível.

Em fotorreceptores de lagostins, a luz desencadeia uma corrente lenta, transitória e iônica1. Após a iluminação, a corrente de transdução surge após um atraso ou latência antes de atingir o seu máximo; depois disso, decai, como os canais de transdução cair em um estado insensível em que eles não respondem a mais estímulo luz2. Ou seja, a luz, além de ativar a corrente de transdução responsável pela visão, também induz um decrement transitório da sensibilidade das células fotorreceptoras. A dessensibilização pode representar um mecanismo de proteção geral contra a superexposição a um estímulo adequado. A sensibilidade do olho à luz é recuperada à medida que a condução da transdução se recupera da dessensibilização.

A gravação intracelular é uma técnica útil para medir a atividade elétrica das células excitáveis3,4,5,6,7,8. Embora a gravação intracelular tenha se tornado menos frequente com o advento da técnica de braçadeira9,ainda é uma abordagem conveniente quando as células são difíceis de isolar, ou apresentam uma geometria que dificulta a formação das focas giga de fixação de remendos(ou seja,focas ou contatos apertados entre o eletrodo de remendo e membranas com resistência elétrica da ordem de 109ohms). Exemplos desteúltimo são espermatozóides10 e as células fotorreceptoras aqui estudadas. Em nossa experiência, os fotorreceptores Procambarus clarkii são difíceis de isolar e manter na cultura primária; além disso, são hastes finas que tornam difícil a formação giga-seal. Em gravações intracelulares, um eletrodo afiado é avançado em uma célula que é mantida no lugar pelo tecido circundante. O eletrodo é picado pelos circuitos de comutação de alta velocidade do amplificador, de modo que a corrente é amostrada entre pulsos de tensão. Este modo é conhecido como clampedede descontínuo de eletrodo único (modo dSEVC)11. A alta resistência (pequena abertura) do eletrodo dificulta a troca difusão entre a célula e as soluções de pipetas, produzindo uma perturbação mínima do ambiente intracelular3. Uma desvantagem potencial desta técnica é que a inserção de eletrodos pode produzir uma corrente de vazamento não seletiva; portanto, deve ser tomado cuidado para evitar o registro de células onde o tamanho da corrente de vazamento pode interferir com as medições pretendidas4,12.

Aqui, usamos eyestalks lagostins isolados para avaliar a dessensibilização e recuperação da condução de íons ativados pela luz apartir da realização de gravações elétricas intracelulares de células fotorreceptoras condições de braçadeira de tensão.

Protocol

NOTA: Os experimentos cumprem as Leis de Proteção animal do México. 1. Configuração experimental Conexões gerais Conecte o amplificador a um computador adequado através de um conversor analógico e use um osciloscópio para monitorar o experimento (Figura 1). Conecte o photostimulator ao A/D convertido. Câmara de gravação Coloque a câmara de gravação em cima de uma mesa anti-vibração e loca…

Representative Results

Primeiro, um potencial receptor representativo de células fotorreceptoras de lagostins é obtido (Figura 4). Posteriormente, um flash de luz de teste foi aplicado para desencadear a corrente de transdução de luz (Figura 5). A corrente de transdução cationic1 ativa após um atraso, atingindo um máximo e, posteriormente, lentamente cai em um estado absorvente insensível do qual se recupera lentamente….

Discussion

O lagostim provou ser um excelente modelo devido à sua capacidade de sobreviver em condições não naturais. Há fácil acesso a análises eletrofisiológicas in vivo e in vitro. Além disso, os crustáceos são um grupo favorável à pesquisa neurobiológica no campo da cronobiologia comparativa21.

Neste artigo, o estudo da dessensibilização e recuperação da corrente de transdução ativada pela luz das células fotorreceptoras de lagostins é m…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela subvenção DGAPA-UNAM IN224616-RN224616. Os autores querem agradecer à Sra. Josefina Bolado, Chefe do Departamento de Tradução de Artigos Científicos, da División de Investigación da Facultad de Medicina, UNAM, por editar a versão em inglês deste manuscrito.

Materials

Axoclamp2A  Axon Instruments Inc Amplifier
Digidata 1200 Interface Axon Instruments Inc Digitizer
Oscilloscope TDS430A Tektronix Analogic Oscilloscope
Photostimulator PS33 Plus Grass Lamp
Puller PC-100 Narishige Micropipette Puller
Puller P-97 Sutter Instruments Micropipette Puller
Glass Capillary Tube Kimax-51 Kimble Products 34502 0.8, 1.10, 100 mm
HS-2 Headstage Axon Instruments Inc Headstage
Micromanipulator MX-4 Narishige Mechanical Micromanipulator
Stereoscopic Microscope Zeiss Microscope
pClamp Axon Instruments Inc Data acquisition software for digidata 1200 interface
Clampfit Axon Instruments Inc Analysis software linked to pClamp
Origin OriginLab Corp. Data analysis and graphing software
Sodium Chloride Sigma S7653 >99.5%
Potassium Chloride Sigma P-9333 Minimum 99%
Magnesium Sulfate Sigma M7506 Minimum 99.5%
Calcium Chloride Sigma C5080 Minimum 99.0%
Hepes Sigma H7523 >99.5%
Sodium Hydroxide Sigma S8045 98.00%
Sodium hypochlorite solution Sigma 425044 Available chlorine, 10-15% 

References

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Barriga-Montoya, C., de la O-Martínez, A., Picones, A., Hernández-Cruz, A., Fuentes-Pardo, B., Gómez-Lagunas, F. Desensitization and Recovery of Crayfish Photoreceptors Upon Delivery of a Light Stimulus. J. Vis. Exp. (153), e56258, doi:10.3791/56258 (2019).

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