Desensitisierung und Wiederherstellung von Krebse Photorezeptoren nach der Lieferung eines leichten Stimulus
Summary
Ein Protokoll zur Untersuchung der Desensibilisierung und Empfindlichkeit sebung von Krebsphotorezeptoren als Funktion der zirkadianen Zeit wird vorgestellt.
Abstract
Eine Methode zur Untersuchung der Desensibilisierung und Wiederherstellung von Krebsphotorezeptoren wird vorgestellt. Wir führten intrazelluläre elektrische Aufnahmen von Photorezeptorzellen in isolierten Augenstielen mit der diskontinuierlichen Konfiguration der Einzelelektroden-Geschalteten Spannungsklemme durch. Zuerst haben wir mit einer Rasierklinge eine Öffnung in der dorsalen Hornhaut gemacht, um Zugang zur Netzhaut zu erhalten. Danach setzten wir eine Glaselektrode durch die Öffnung ein und drangen in eine Zelle ein, wie durch die Aufzeichnung eines negativen Potentials berichtet. Das Membranpotential wurde auf das Ruhepotential des Photorezeptors eingeklemmt und ein Lichtimpuls angewendet, um Ströme zu aktivieren. Schließlich wurde das zwei Lichtblitzprotokoll verwendet, um die aktuelle Desensibilisierung und Wiederherstellung zu messen. Der erste Lichtblitz löst nach einer Verzögerungsperiode den transduktionsionischen Strom aus, der nach Erreichen einer Spitzenamplitude in einen desensithissiierten Zustand abfällt; der zweite Blitz, der in unterschiedlichen Zeitintervallen angewendet wird, bewertet den Zustand der lichtaktivierten Leitfähigkeit. Um den lichtentwirrten Strom zu charakterisieren, wurden drei Parameter gemessen: 1) Latenz (die Zeit, die zwischen der Lichtblitzabgabe verstrichen ist, und dem Moment, in dem der Strom 10% seines Maximalwerts erreicht); 2) Spitzenstrom; und 3) Desensibilisierungszeitkonstante (exponentielle Zeitkonstante der aktuellen Zerfallsphase). Alle Parameter werden vom ersten Impuls beeinflusst.
Um die Erholung von der Desensibilisierung zu quantifizieren, wurde das Verhältnis p2/p1 im Vergleich zur Zeit zwischen den Impulsen verwendet. p1 ist der Spitzenstrom, der durch den ersten Lichtimpuls evoziert wird, und p2 ist der Spitzenstrom, der vom zweiten Impuls evoziert wird. Diese Daten wurden an eine Summe exponentiver Funktionen angepasst. Schließlich wurden diese Messungen in Abhängigkeit von der zirkadianen Zeit durchgeführt.
Introduction
Um als visueller Reiz wahrgenommen zu werden, muss Licht, das die Augen erreicht, in ein elektrisches Signal umgewandelt werden. Somit löst Licht in allen visuellen Organismen einen Transduktionsionenstrom aus, der wiederum eine Veränderung des Membranpotenzials von Photorezeptorzellen, dem sogenannten Rezeptorpotential, bewirkt. Aus diesem Grund hängt die Lichtempfindlichkeit des Auges in erster Linie vom Zustand der lichtaktivierten Leitfähigkeit ab, die entweder aktiviert oder desensizipiert werden kann.
Bei Krebsphotorezeptoren löst Licht einen langsamen, transienten, ionischen Stromaus 1. Bei der Beleuchtung entsteht der Transduktionsstrom nach einer Verzögerung oder Latenz, bevor er sein Maximum erreicht; danach zerfällt es, da die Transduktionskanäle in einen desensiwordenen Zustand fallen, in dem sie nicht auf weitere Lichtreize reagieren2. Das heißt, Licht, zusätzlich zur Aktivierung der Transduktionsströmung verantwortlich des Sehens, induziert auch eine vorübergehende Dekrementierung der Empfindlichkeit von Photorezeptorzellen. Die Desensizipierung kann einen allgemeinen Schutzmechanismus gegen eine Übermäßige Exposition gegenüber einem angemessenen Stimulus darstellen. Die Lichtempfindlichkeit des Auges wird wiederhergestellt, wenn sich die Transduktionsleitfähigkeit von der Desensibilisierung erholt.
Intrazelluläre Aufzeichnung ist eine nützliche Technik zur Messung der elektrischen Aktivität von erregbaren Zellen3,4,5,6,7,8. Obwohl die intrazelluläre Aufzeichnung mit dem Aufkommen der Patch-Clamp-Technik9seltener geworden ist, ist es immer noch ein bequemer Ansatz, wenn Zellen entweder schwer zu isolieren sind oder eine Geometrie darstellen, die die Bildung der patch-clamping Giga-Dichtungen erschwert(d.h.Dichtungen oder enge Kontakte zwischen der Patchelektrode und Membranen mit elektrischem Widerstand in der Größenordnung von 109Ohm). Beispiele für letztere sind die Spermien10 und die hier untersuchten Photorezeptorzellen. Nach unserer Erfahrung, Procambarus clarkii Photorezeptoren sind schwierig zu isolieren und in der Primärkultur zu halten; Darüber hinaus sind es dünne Stäbe, die die Giga-Siegelbildung schwer zu erreichen machen. In intrazellulären Aufnahmen wird eine scharfe Elektrode in eine Zelle vorgeschoben, die vom umgebenden Gewebe an Ort und Stelle gehalten wird. Die Elektrode wird durch die Hochgeschwindigkeitsschaltschaltung des Verstärkers gehackt, so dass Strom zwischen Spannungsimpulsen abgetastet wird. Dieser Modus wird als diskontinuierliche Single-Elektroden-Spannungsklemme (dSEVC-Modus)11bezeichnet. Der hohe Widerstand (kleine Öffnung) der Elektrode behindert den Diffusionsaustausch zwischen der Zelle und den Pipettenlösungen, was zu einer minimalen Störung des intrazellulären Milieus3führt. Ein möglicher Nachteil dieser Technik ist, dass das Einsetzen von Elektroden einen nicht selektiven Leckstrom erzeugen kann; Daher ist darauf zu achten, dass die Aufzeichnung von Zellen vermieden wird, bei denen die Größe des Leckstroms die vorgesehenen Messungen4,12beeinträchtigen kann.
Dabei verwenden wir isolierte Krebsaugenstiele, um die Desensibilisierung und Wiederherstellung der lichtaktivierten Ionenleitfähigkeit zu bewerten, indem wir intrazelluläre elektrische Aufnahmen von Photorezeptorzellen unter Spannungsklemmenbedingungen durchführen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Krebse haben sich als ausgezeichnetes Modell erwiesen, da sie unter nicht-natürlichen Bedingungen überleben können. Es gibt einen einfachen Zugang zu elektrophysiologischen In-vivo- und In-vitro-Analysen. Darüber hinaus sind Krebstiere eine günstige Gruppe für neurobiologische Forschung auf dem Gebiet der vergleichenden Chronobiologie21.
In diesem Beitrag wird die Untersuchung der Desensibilisierung und Wiederherstellung des lichtaktivierten …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch dGAPA-UNAM IN224616-RN224616-Zuschuss unterstützt. Die Autoren danken Frau Josefina Bolado, Leiterin der Abteilung für wissenschaftliche Übersetzung von Papieren, aus divisién de Investigacion in facultad de Medicina, UNAM, für die Bearbeitung der englischsprachigen Version dieses Manuskripts.
Materials
| Axoclamp2A | Axon Instruments Inc | Amplifier | |
| Digidata 1200 Interface | Axon Instruments Inc | Digitizer | |
| Oscilloscope TDS430A | Tektronix | Analogic Oscilloscope | |
| Photostimulator PS33 Plus | Grass | Lamp | |
| Puller PC-100 | Narishige | Micropipette Puller | |
| Puller P-97 | Sutter Instruments | Micropipette Puller | |
| Glass Capillary Tube Kimax-51 | Kimble Products | 34502 | 0.8, 1.10, 100 mm |
| HS-2 Headstage | Axon Instruments Inc | Headstage | |
| Micromanipulator MX-4 | Narishige | Mechanical Micromanipulator | |
| Stereoscopic Microscope | Zeiss | Microscope | |
| pClamp | Axon Instruments Inc | Data acquisition software for digidata 1200 interface | |
| Clampfit | Axon Instruments Inc | Analysis software linked to pClamp | |
| Origin | OriginLab Corp. | Data analysis and graphing software | |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | >99.5% |
| Potassium Chloride | Sigma | P-9333 | Minimum 99% |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | Minimum 99.5% |
| Calcium Chloride | Sigma | C5080 | Minimum 99.0% |
| Hepes | Sigma | H7523 | >99.5% |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | 98.00% |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma | 425044 | Available chlorine, 10-15% |
References
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