Summary

הפחתת רגישות והתאוששות של סרטן הנהרות בעת העברת גירוי באור

Published: November 09, 2019
doi:

Summary

פרוטוקול לחקר הפחתת הרגישות וההתאוששות הרגישות של מנועי סרטן הסרטנים כפונקציה של הזמן האחראי מוצג.

Abstract

שיטה לחקר הפחתת רגישות והתאוששות של מנועי סרטן הנהרות מוצגת. ביצעת הקלטות חשמל תאיים של תאים תא קולט אור בתוך העיניים מבודדים באמצעות אלקטרודה רציפה בודדת ממותגת מתח-מהדק התצורה. עם סכין גילוח הצלחנו לפתוח את הקרנית. כדי לקבל גישה לרשתית העין לאחר מכן, הוספת אלקטרודה זכוכית דרך הפתח, וחדרה לתא כפי שדווח על ידי הקלטה של פוטנציאל שלילי. פוטנציאל הממברנה היה מהודק בפוטנציאל המנוחה של photoreceptor והדופק האור הוחל על הפעלת זרמים. בסופו של דבר, שני פרוטוקול פלאש האור הועסק כדי למדוד את הפחתת הרגישות וההתאוששות הנוכחית. האור הראשון מפעיל הבזק, לאחר תקופת השהיה, הזרם היוני התמרה, אשר לאחר שהגיע משרעת שיא לקראת מדינה בעלת הרגישות למדינה; ההבזק השני, המוחל במרווחי זמן משתנים, מעריך את מצב הכיוון של מוליכות האור המופעלת. כדי לאפיין את הזרם, שלושה פרמטרים נמדדו: 1) השהיה (הזמן שחלף בין מסירת פלאש קלה לבין הרגע שבו הנוכחי משיגה 10% מהערך המירבי שלו); 2) השיא הנוכחי; ו 3) הפחתת הרגישות קבוע זמן (קבוע זמן מעריכי של השלב ריקבון הנוכחי). כל הפרמטרים מושפעים מהפעימה הראשונה.

כדי לכמת התאוששות מהפחתת הרגישות, היחס p2/p1 היה מועסק לעומת הזמן בין פולסים. p1 היא הפיסגה העדכנית מעורר על ידי פולס האור הראשון, ו p2 הוא השיא הנוכחי מעורר על ידי הדופק השני. נתונים אלה הותאמו לסכום של פונקציות מעריכי. לבסוף, המידות האלה בוצעו כפונקציה של זמן מעגלי.

Introduction

כדי להיתפס כגירוי ויזואלי, האור המגיע לעיניים חייב להיות מחולק לאות חשמלי. מכאן, בכל האורגניזמים החזותיים, אור מפעיל יון התמרה-זרם, אשר בתורו מייצרת שינוי בפוטנציאל הממברנה של התאים תא קולט אור, הפוטנציאל הנקרא הקולטן. בשל כך, הרגישות הקלה של העין תלויה בעיקר במצב של מוליכות האור המופעלת, שיכולה להיות זמינה להפעלה או לחוסר הרגישות.

ב מנועי סרטן הנהרות, אור מעורר איטי, ארעי, זרם יוני1. עם התאורה, הזרימה הנוכחית מתעוררת לאחר השהיה או השהיה לפני שהגיעה למקסימום; לאחר מכן הוא decays כמו ערוצי התמרה ליפול למצב מתחת לחוסר הרגישות שבו הם אינם מגיבים לגירוי אור נוסף2. כלומר, אור, בנוסף להפעלה האחראית הנוכחית של חזון, משרה גם הפחתה ארעית של הרגישות של תאים תא קולט אור. הפחתת רגישות עשויה לייצג מנגנון הגנה כללי מפני חשיפה יתר לגירוי מספיק. הרגישות של העין לאור הוא התאושש כאשר מוליכות התמרה משחזרת מתוך הפחתת רגישות.

הקלטה תאיים היא טכניקה שימושית למדידת פעילות חשמלית של תאים להתרגש3,4,5,6,7,8. למרות הקלטה תאיים הפכה להיות פחות תכופים עם הופעתו של התיקון מהדק טכניקה9, זה עדיין גישה נוחה כאשר התאים הם קשים לבידוד, או להציג הגיאומטריה שהופך את היווצרות של התיקון-החותמות giga-אטמים קשה (כלומר, חותמות או קשר הדוק בין האלקטרודה תיקון ממברנות עם עמידות החשמל של הסדר של 109ohms). דוגמאות לאלה הן תאי זרע10 ותאים תא קולט אור כאן למדו. הניסיון שלנו, מאוד קשה לבודד ולשמור בתרבות הראשית; בנוסף, הם מוטות דקים הופכים giga-חותם היווצרות קשה להשיג. בהקלטות תאיים, אלקטרודה חדה מתקדמת לתא שנשמר במקום על ידי הרקמה הסובבת. האלקטרודה קצוצה על-ידי המעגלים העוברים במהירות גבוהה של המגבר, ולכן הזרם מנדגם בין פולסים במתח. מצב זה ידוע כתפס מקוטע של מתח יחיד באלקטרודה (מצב dSEVC)11. ההתנגדות הגבוהה (פתיחה קטנה) של האלקטרודה מעכבת את החילוף התפוצא בין התא לפתרונות הפיפטה, ומניב הפרעה מינימלית של הסביבה התאיים3. חיסרון פוטנציאלי של טכניקה זו היא כי החדרת אלקטרודה עשויה לייצר זרם דליפה לא סלקטיבי; לכן, יש לנקוט טיפול כדי למנוע הקלטה מתאים בהם גודל זרם הדליפה עלול להפריע למידות המיועדות4,12.

בזאת, אנו משתמשים בגבעולי סרטנים מבודדים כדי להעריך את הפחתת הרגישות וההתאוששות של מוליכות האור המופעל על ידי ביצוע הקלטות חשמל תאיים של תאים תא קולט אור באמצעות מהדק מתח התנאים.

Protocol

הערה: הניסויים עומדים בחוק הגנת בעלי חיים של מקסיקו. 1. התקנה ניסויית קשרים כלליים חבר את המגבר למחשב מתאים באמצעות ממיר אנלוגי לדיגיטלי והשתמש באולוסקופ כדי לנטר את הניסוי (איור 1). חבר את מגירוי התמונה ל-A/D המומר. תא הקלטה מניח…

Representative Results

ראשון, פוטנציאל קולטן הנציג של התאים של סרטן הסרטנים תא קולט אור מתקבל (איור 4). לאחר מכן, הוחל הבזק מבחן על מנת להפעיל את זרם האור הנוכחי (איור 5). הזרימה הנוכחית מפעילה לאחר השהיה, ומגיעה למצב מקסימלי ולאחר מכן יורדת לאט לתוך המד…

Discussion

סרטני הנהרות הוכיחו כמודל מצוין בשל יכולתה לשרוד בתנאים שאינם טבעיים. יש גישה קלה בvivo ובניתוחים אלקטרולוגיים מחוץ לגופית . בנוסף, סרטנים הם קבוצה חיובית עבור מחקר נוירוביולוגי בתחום הכרונוביולוגיה21השוואתי.

במאמר זה, המחקר של הפחתת הרגישות וההתאוששו?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי D, UNAM IN224616-RN224616 גרנט. המחברים רוצים להודות לגברת ג’וזפינה בולאדו, ראש המחלקה לתרגום ניירות מדעיים, מאליפות דה בדיקה בפסולטד דה מדיטינה, UNAM, לעריכת הגרסה האנגלית של כתב יד זה.

Materials

Axoclamp2A  Axon Instruments Inc Amplifier
Digidata 1200 Interface Axon Instruments Inc Digitizer
Oscilloscope TDS430A Tektronix Analogic Oscilloscope
Photostimulator PS33 Plus Grass Lamp
Puller PC-100 Narishige Micropipette Puller
Puller P-97 Sutter Instruments Micropipette Puller
Glass Capillary Tube Kimax-51 Kimble Products 34502 0.8, 1.10, 100 mm
HS-2 Headstage Axon Instruments Inc Headstage
Micromanipulator MX-4 Narishige Mechanical Micromanipulator
Stereoscopic Microscope Zeiss Microscope
pClamp Axon Instruments Inc Data acquisition software for digidata 1200 interface
Clampfit Axon Instruments Inc Analysis software linked to pClamp
Origin OriginLab Corp. Data analysis and graphing software
Sodium Chloride Sigma S7653 >99.5%
Potassium Chloride Sigma P-9333 Minimum 99%
Magnesium Sulfate Sigma M7506 Minimum 99.5%
Calcium Chloride Sigma C5080 Minimum 99.0%
Hepes Sigma H7523 >99.5%
Sodium Hydroxide Sigma S8045 98.00%
Sodium hypochlorite solution Sigma 425044 Available chlorine, 10-15% 

References

  1. Barriga-Montoya, C., Gómez-Lagunas, F., Fuentes-Pardo, B. Effect of pigment dispersing hormone on the electrical activity of crayfish visual photoreceptors during the 24-h cycle. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 157 (4), 338-345 (2010).
  2. Barriga-Montoya, C., de la O-Martínez, A., Fuentes-Pardo, B., Gómez-Lagunas, F. Desensitization and recovery of crayfish photoreceptors. Dependency on circadian time, and pigment-dispersing hormone. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 203, 297-303 (2017).
  3. Wickenden, A. D. Overview of electrophysiological techniques. Curr. protoc. pharmacol. 11, 1-17 (2014).
  4. Brette, R., Destexhe, A. Intracellular recording. Handbook of Neural Activity Measurement. , 44-91 (2012).
  5. Cummins, D., Goldsmith, T. H. Cellular identification of the violet receptor in the crayfish eye. J. Comp. Physiol. 142 (2), 199-202 (1981).
  6. Eguchi, E. Rhabdom structure and receptor potentials in single crayfish retinular cells. J. Cell and Comp. Physiol. 66, 411-430 (1965).
  7. Nosaki, H. Electrophysiological study of color encoding in the compound eye of crayfish, Procambarus clarkii. Z. vergl. Physiologie. 64 (3), 318-323 (1969).
  8. Miller, C. S., Glantz, R. M. Visual adaptation modulates a potassium conductance in retinular cells of the crayfish. Vis Neurosci. 17 (3), 353-368 (2000).
  9. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
  10. Lishko, P., Clapham, D. E., Navarro, B., Kirichok, Y. Sperm patch-clamp. Methods Enzymol. 525, 59-79 (2013).
  11. Finkel, A. Axoclamp-2A microelectrode clamp theory and operation. Axon Instruments, Inc. , (1990).
  12. Sakmann, B. . Single-channel recording. , (2013).
  13. Van Harreveld, A. A physiological solution for freshwater crustacea. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 34 (4), 428-432 (1936).
  14. Oesterle, A. . pipette cookbook. , 97 (2008).
  15. Fuentes-Pardo, B., Ramos-Carvajal, J. The phase response curve of electroretinographic circadian rhythm of crayfish. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 74 (3), 711-714 (1983).
  16. Pace-Schott, E. F., Hobson, J. A. The neurobiology of sleep: genetics, cellular physiology and subcortical networks. Nat. Rev. Neurosci. 3 (8), 591-605 (2002).
  17. Pittendrigh, C. S., Aschoff, J. On the mechanism of the entrainment of a circadian rhythm by light cycles. Circadian Clocks. , 277-297 (1965).
  18. Pittendrigh, C. S., Aschoff, J. Circadian systems: entrainment. Handbook Behavioral Neurobiology Biological Rhythms. , 94-124 (1981).
  19. Vitaterna, M. H., Takahashi, J. S., Turek, F. W. Overview of circadian rhythms. Alcohol Res. Health. 25 (2), 85-93 (2001).
  20. Hille, B. . Ion channels of excitable membranes. 507, (2001).
  21. Dircksen, H., Strauss, J. Circadian clocks in crustaceans: identified neuronal and cellular systems. Front Biosci. 15, 1040-1074 (2010).
  22. Terakita, A., Hariyama, T., Tsukahara, Y., Katsukura, Y., Tashiro, H. Interaction of GTP-binding protein Gq with photoactivated rhodopsin in the photoreceptor membranes of crayfish. FEBS Lett. 330, 197-200 (1993).
  23. Terakita, A., Takahama, H., Hariyama, T., Suzuki, T., Tsukahara, Y. Light regulated localization of the beta-subunit of Gq-type G-protein in the crayfish photoreceptors. J Comp Physiol A. 183 (4), 411-417 (1998).
  24. Terakita, A., Takahama, H., Tamotsu, S., Suzuki, T., Hariyama, T., Tsukahara, Y. Light-modulated subcellular localization of the alpha-subunit of GTP-binding protein Gq in crayfish photoreceptors. Vis Neurosci. 13 (3), 539-547 (1996).

Play Video

Cite This Article
Barriga-Montoya, C., de la O-Martínez, A., Picones, A., Hernández-Cruz, A., Fuentes-Pardo, B., Gómez-Lagunas, F. Desensitization and Recovery of Crayfish Photoreceptors Upon Delivery of a Light Stimulus. J. Vis. Exp. (153), e56258, doi:10.3791/56258 (2019).

View Video