Flimmerhåren utveckling är avgörande för korrekt organogenes. Det här protokollet beskriver en optimerad metod för att märka och visualisera cilierade celler i zebrafiskar.
Under de senaste åren har zebrafiskar embryot blivit en populär modell att studera utvecklingsbiologi på grund av egenskaper som ex utero embryots utveckling och optisk transparens. I synnerhet blivit zebrafiskar embryot en viktig organism att studera ryggradsdjur njure organogenesen samt multiciliated cell (MCC) utveckling. För att visualisera MCCs i embryonala zebrafiskar njuren, vi har utvecklat ett kombinerat protokoll i hela-mount fluorescerande i situ hybridisering (FISH) och montera hela immunofluorescens (IF) som möjliggör hög upplösning imaging. Detta manuskript beskriver vår teknik för samtidig lokalisera RNA avskrifter och protein som ett verktyg för att bättre förstå regleringen av utvecklande program genom uttryck av olika härstamning faktorer.
Under de senaste decennierna, har zebrafiskar (Danio rerio) vuxit fram som främsta modellorganism att studera utvecklingsbiologi. Embryona utvecklas utanför mor och är optiskt transparenta. Bildandet av vitala organ såsom öga, njure och framhjärnan uppstår också, snabbt, med strukturer som bildas av bara 24 h post befruktning (hpf). Ännu viktigare, är zebrafiskar genomet starkt bevarad med däggdjur1,2,3. Dessutom har Sebrafisken och däggdjur organ liknande anatomi och fysiologi. Den zebrafiskar embryonala njure, eller pronephros, visar värdet av modell systemet för att pröva geners funktion under tidig nephrogenesis och öde bestämning av bevarade epitelial cellpopulationer av vertebrate nefronet4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. likaså zebrafiskar embryot har blivit allt viktigare att undersöka Ontogeni av MCCs11,12,13,14,15, 16 , 17.
Som namnet antyder, är MCCs epitelceller som kännetecknas av en bunt av rörliga flimmerhår ligger på apikala ytan17. I zebrafiskar, MCCs fungera i vätskeflöde och är spridda i en ”melerad” som mode under mitten av varje nefronet av pronephros av 24 hpf11,12,13,14, 15 , 16 , 17. även om de bara har noterats i en handfull av mänskliga njurar sjukdom fall18,19,20,21, MCCs är utbredda i andra däggdjur vävnader såsom hjärnan och luftstrupen22,23,24, som utgör en mängd utmaningar för experimentell design. Eleganta studier i olika ryggradsdjur modeller inklusive zebrafisk har visat en bevarade väg av MCC öde, med skåran signalering utbildningsavsnitt som en hämmare av MCC utveckling12,17,25 ,26,27. Därför ger den zebrafiskar pronephros ett lättillgängligt modell för att studera de genetiska mekanismerna MCC utveckling i vivo11,12,13,14, 15 , 16 , 17.
Både öppenhet och lätt genmanipulation av zebrafisk embryon har visat sig vara ovärderliga egenskaper när man studerar de genetiska och molekylära vägar som reglerar cell öde, vävnadstillväxt och utveckling av tidiga embryot1,2 ,3. Som sådan, traditionella tekniker för att visualisera protein och gen avskrifter, såsom i situ hybridisering och hela berget om, har tillämpats till och optimerad för den zebrafiskar16,28,29, 30,31,32,33,34,35,36,37,38. Genom att kombinera populära protokoll för fisk och om, är det möjligt att märka och analysera MCCs i vivo16,28,37,38.
Det protokoll som anges ovan är optimerad för märkning MCCs i pronephros med odf3b avskrifter och α-tubulin i 24 hpf zebrafiskar embryon. För bästa resultat, är det rekommenderat att använda färska fasta och beredda embryon. Embryon som har fast och lagras i antingen MeOH eller Hyb + vid-20 ° C under längre tid än en vecka kan användas, men sannolikheten för oönskad bakgrund färgning ökar med den tid som embryona förvaras i lagring.
Felsökning av denna teknik och ändringar är nödvändiga för att skräddarsy denna metod för andra sviter av särskilda markörer, e.g. andra antisense riboprober och andra antikroppar. Många metoder för att justera parametrarna för steg i processen hela berget i situ hybridisering har tidigare dokumenterats av vår grupp och andra31,34,36,38, 39. Jämväl, varje protein antikropp kräver viss felsökning när det gäller färgning gånger och ungefärliga intervall av utspädningar och inkubationstider för varje primär antikropp uppskattas bäst av utvärdering av dokumenterade resultat28, 35. för embryon yngre än 24 hpf, pK behandling bör vara kortare än 2 min, där embryon som är äldre än 24 hpf bör behandlas med pK längre än 2 min. Även embryon som är äldre än 24 hpf bör vara blekt av pigment innan pK behandling.
Efter färgning med fluorescerande färglösningen, är det viktigt att ta bort alla återstående fläcken, antikroppar och peroxidaser genom att utföra serien metanol och väteperoxid tvättar. De PBS tvättar omedelbart efter är viktigt att ta bort överskjutande metanol från embryon. Viktigt, innan om antikropparna, har vi funnit att aceton och avjoniserat vatten tvättar göra embryona som är mindre benägna att följa varandra eller Centrifugera rören. I vår erfarenhet, antikroppar för specifika transkriptionsfaktorer och andra gener, men de kan fungera effektivt Western blotting, fungerar inte bra för om i zebrafiskar. Mycket och riklig proteiner, såsom α-tubulin och β-catenin, fungerar dock bra i zebrafiskar för om16,37.
Med fisk är det möjligt att visualisera RNA avskrifter av gener som ännu inte har specifika antikroppar i zebrafiskar. Genom att kombinera fisk med IF, vilket framgår av detta protokoll, kan samtidig lokalisering av RNA avskrifter och protein vara ses i vivo (figur 2). Flexibiliteten i protokollet möjliggör snabb felsökning för visualisering av olika RNA avskrifter och proteiner i många vävnader och tidpunkter. Kombination med de redan respekterade drag av zebrafisk embryon, ger detta protokoll av fisk + om ett annat verktyg för att utforska uttrycket av gener och proteiner viktiga utvecklings väg förordning.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds delvis av att bevilja R01DK100237 till R.A.W. och National Science Foundation Graduate Research Fellowship nej DGE-1313583 till A.N.M. Vi tackar också College av vetenskap sommaren Undergraduate Research Fellowship-programmet för stöd till M.U. Vi vill tacka centrum för zebrafiskar forskning på University of Notre Dame för deras hängivna vård av våra zebrafiskar. Vi vill också tacka Institutionen för biologiska vetenskaper samt medlemmarna i vårt labb för alla deras stöd och värdefulla insikter.
non-specific protease mixture solution | Roche | 11459643001, pronase from Streptomyces griseus | Dilute in E3 without methylene blue to make 50mg/mL stock solution; store at -20°C |
E3 solution | Dilute 50X E3 (250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water) in distilled water; add 1 x 10-5 M methylene blue (sigma M9140) to inhibit contamination | ||
tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Fluka | A5040-250G | To make a 0.2% stock solution, dissolve 1 g of tricaine powder in 10 mL Tris, pH 9.5 and distilled water up to 500 mL |
embryo dishes | VWR | 351029 | |
5 mL glass vials | Wheaton | 225012 | |
disposable plastic Pasteur pippettes | VWR | 414004-004 | |
4% paraformaldehyde (PFA) solution | Electron Microscopy Services | 19210 | Dissolve 4% PFA in 1X PBS and bring to a boil under a fume hood. Cool and aliquot, then store at -20°C. Do not refreeze once thawed for use. |
10X PBS | American Bioanalytical | AB11072 | Dilute in distilled water to make a 1X stock |
Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | Make a 0.1% Tween-20 stock by diluting in distilled water. |
1X phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBST) | Sigma | P9416 | 0.1% Tween-20 in 1X PBS |
methanol (MeOH) | Sigma | 34860-4L | |
proteinase K | Roche | 3115879001 | Dissolve in distilled water to make a 10 mg/mL stock; aliquot and store at -20°C |
flat bottom microcentrifuge tubes | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
formamide | American Bioanalytical | AB00600 | store at -20°C |
hybridization solution (HYB+) | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 μg/μL heparin; store at -20°C | ||
hybridization oven | Fisher Scientific | 13-247-10Q | |
20X saline-sodium citrate (SSC) buffer solution | American Bioanalytical | AB13156 | dilute in distilled water to make 2X and 0.2X stocks |
blocking reagent solution | Roche | 11096176001 | dilute in maleic acid buffer to make a 10% stock solution; store at 4°C |
maleic acid buffer solution | Sigma | M0375 and S7653 | 150mM maleic acid, 100mM NaCl (pH 7.5) |
anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche | 11207739910 | store at 4°C |
Cy3 fluorescent staining solution | PerkinElmer, Inc. | NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 system | store at 4°C; prepare staining solution fresh by making a 1:50 dilution of TSA reagent (dissolved in 60 uL of DMSO) in the kit buffer |
Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma | H1009-500mL | store at 4°C |
molecular grade distilled water (ddH2O) | Mediatech | 25-055-CM | |
acetone | American Bioanalytical | AB00636-01000 | store an aliquot at -20°C |
DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10438-034 | aliquot and store at -20°C |
monoclonal anti-acetylated tubulin clone 6-11B-1 | Sigma-Aldrich | T6793 | aliquot and store at -20°C |
anti-γ-tubulin anitbody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | T5192 | aliquot and store at -20°C |
odf3b cDNA clone MGC:63985 | OpenBiosystems | IMAGE:6792478 | store bacterial glycerol stock at -80°C |
NaCL | American Bioanalytical | AB01915-05000 | |
Alexa flour 647 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | store at 4°C; protect from light |
Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11029 | store at 4°C; protect from light |
DAPI | Life Technologies | D1306 | aliquot and store at -20°C |
glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | |
glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
mounting media | Polysciences, Inc. | 18606, Aqua-Poly/Mount | store at 4°C |
confocal microscope and associated software | We use a Nikon C2plus Confocal Microscope with NIS-elements AR software | ||
rocker | Bio-Rad | 1660710EDU |