Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Tilpasset peptid matriser for påvisning av HLA Alloantibodies i organtransplantasjon

doi: 10.3791/56278 Published: September 6, 2017

Summary

Uoverensstemmelser i menneskelig leukocytter antigen (HLA) sekvenser mellom organtransplantasjon og mottaker parene er den viktigste årsaken til antistoff-mediert avvisning i organtransplantasjon. Her presenterer vi bruk av egendefinerte antigen matriser som er basert på individuelle givere HLA sekvenser å undersøke anti-giver HLA alloantibodies i orglet mottager.

Abstract

I organtransplantasjon stole funksjonen og levetid av graftet kritisk på suksessen til kontrollere immunologiske avvisning reaktivitet mot menneskelig leukocytter antigener (HLA). Histocompatibility retningslinjene er basert på laboratorietester av anti-HLA immunitet, som viser enten som eksisterende eller de novo generert HLA antistoffer som utgjør en stor transplantasjon barriere. Dagens testene er bygget på en enkelt-antigen perler (SAB) plattform med en fast ~ 100 forhåndsvalgt rekombinant HLA antigener for å undersøke transplantasjon sera. Men hos mennesker finnes det et større utvalg av HLA typer, med ingen to personer enn identiske tvillinger som kan dele den samme kombinasjonen av HLA sekvenser. Mens avanserte teknologier for HLA å skrive og direkte sekvensering kan nettopp fange noen uoverensstemmelser i DNA sekvens mellom en donor og mottakerens HLA, SAB analysen, på grunn av sin begrensede variasjon i sekvens representasjon, er nettopp finner alloantibodies spesielt mot giveren HLA samsvarer. Vi søkt å utvikle en utfyllende metode som bruker en annen teknologi å oppdage og karakterisere anti-giver HLA antistoffer på et personlig basis. Screening verktøyet er en egendefinert peptid rekke donor HLA-avledet sekvenser for leting etter transplantasjon sera orgel mottakerens å vurdere risikoen for antistoff-mediert avvisning. På en matrise til et donor-mottaker par, er opptil 600 unike peptider gjort basert på donor HLA protein sekvenser, hver peptid bærer minst ett umake rester i en 15-amino acid. I vår piloten eksperimenter sammenligne antigen mønstre for pre- og etter transplantasjon sera på disse kjedene, kunne vi oppdage anti-HLA signaler med oppløsningen som også tillatt oss å presisere immune epitopes involvert. Dette personlig antigen matriser tillate høyoppløselig påvisning av donor-spesifikke HLA epitopes i organtransplantasjon.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Orgel erstatning terapi som utføres rutinemessig over hele verden har reddet millioner av liv. Solid organtransplantasjon oppstår i ca 100 pasienter per millioner mennesker i USA årlig, mens et større antall fortsatt er på ventelistene motta donor organer på grunn av en alvorlig mangel på forsyning (i henhold til informasjon gitt av orgelet Innkjøp og transplantasjon nettverk - OPTN/UNOS: optn.transplant.hrsa.gov). Transplantasjon er sterkt regulert for å redusere orgel avfall og redde liv, men vitenskapelige verktøyene brukes til å informere forskriften er begrenset i effektivitet. For eksempel, det vitenskapelige samfunnet fullt gjenkjenner svært sammensatte statene HLA molekyler og nøyaktig genetiske tester av DNA med høy oppløsning skrive og sekvens-baserte skrive (SBT) har blitt utviklet i de senere år1, 2. men alloantibody testmetoder har ennå ikke kunne produsere det enorme mangfoldet av personlige HLA sekvenser som antigen sonder. Standard testen i dag bruker en ufravikelig panel av ~ 100 allel antigener som består av vanlige varianter av HLA, A, B, C, DQ, DP og DR sekvenser i menneskelige populasjoner3,4,5,6. Ofte faktiske donor HLA sekvenser er ikke inkludert i testpanelet tvinger transplantasjon leger og kirurger å antyde donor-spesifikke reaktivitet basert på delte likheter mellom donor faktiske sekvenser og tilsvarende "standarder" i den test satt7,8. Derfor er det noen ganger vanskelig å gjøre en pålitelig estimering av avvisning risiko basert på antistoff test resultater9,10,11,12. Ny personlig tilpassede tester for alloantibodies er derfor presserende behov13,14.

HLA genene kode av store histocompatibility kompleks (MHC) reseptorer som har en viktig funksjon i immunreaksjoner6. HLA gener er kjent for å være mest polymorfe gener i det menneskelige genom6. På grunn av de raske fremskritt i DNA sekvensering strategier for HLA genene, nye allel varianter (eller bare kalt alleler) blir oppdaget på en eksplosiv rate15,16. 16,755 godkjente alleler hadde blitt satt til IMGT/HLA databasen (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html), av hvilke 12,351 var klassen jeg mars 2017, og 4,404 var av klasse II grupper. I sterk kontrast representeres bare litt over 100 forskjellige alleler i standard enkelt-antigen perler (SAB) analysen, som rutinemessig brukes til å oppdage alloantibodies i organtransplantasjon. Metoden SAB er bygget på en Luminex plattform benytter flowcytometri. Siden analysen benytter en ufravikelig rekke antigener, bortsett fra mindre parti til parti variabilities i produksjon, kan den antiserum testen robust standardiseres på tvers av individer og laboratorier5. Denne testen er imidlertid å fange alle alloantibodies utviklet spesielt mot donor alleler, spesielt når donor sekvensene er fraværende fra SAB. Selv om egendefinerte produksjon av givere antigener basert på sanne sekvenser er ønskelig, fortsatt det tekniske utfordringer i effektivisere den nødvendige produksjonen og testing prosedyrer.

Vi har nylig beskrevet en alternativ metode i en mulighetsstudie nyre transplantasjon fag17. Metoden brukes peptid antigener i matrisen format for undersøkelser før og etter hårtransplantasjon sera i enkelte fag. Hver matrise var tilpasset bygget med SPOT syntese metoden18,19,20,21,22,23 som produserer peptid antigener, hver 15 aminosyrer i lengde, utelukkende basert på de respektive organtransplantasjon HLA alleler a, B, C, DQA1, DQB1 og DRB1. SPOT syntese drives på en cellulose membran bruker standard Fmoc-kjemi22 og kan produsere hundrevis av egendefinerte peptider parallelt med en fullt automatisert robot-system19,21. Membran matrisen tåler flere runder med stripping og reprobing sykluser. I vår retrospektiv studie17, vi har oppdaget endringer i antigen mønstre med lagrede transplantasjon antisera samlet i en tidsserier (dvs. før og etter transplantasjon). Her beskriver vi teknisk protokoll for arbeidsflyten inkludert matrise design, produksjon, antiserum undersøkelser og resultater analyse. Metoden er beregnet for å oppdage alloantibodies mot bestemte lineær epitoper på transplantasjon givere HLA molekyler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av Northwestern University institusjonelle Review Board (IRB protokollen #: STU00104680). En hele arbeidsflyten for protokollen er illustrert i figur 1.

1. Bioinformatic analyse av giver og mottaker HLA sekvenser

  1. hente sekvenser fra IMGT/HLA database 15.
    1. Få HLA skrive rapporter om både orglet donoren og sin mottaker.
      NOTE Sikre riktige prosedyrer til å beskytte konfidensiell pasientjournal benyttes. Institusjonelle Review Board (IRB) godkjenning av studien protokollen eller eksperimentelle testen er vanligvis nødvendig per institusjonelle IRB retningslinjer. Hvis HLA rapporter fra PCR-baserte å skrive (av enten høy eller lav oppløsning) eller sekvensering-baserte skrive (SBT), går direkte til trinn 1.1.3. Hvis sekvenser Hentet fra genomisk/HLA sekvensering, og hvis de er fullført, bruk disse sekvensene direkte i stedet. Noen ganger, når bare ufullstendig skriver eller sekvensering resultater er tilgjengelige, følg det ekstra trinnet 1.1.2. tilordne den " mangler " alleler via web-verktøyet som beskrevet i trinn 1.1.2.
    2. Åpne tvetydig allelet kombinasjonene etter web link - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/ambig.html, og søke det “ tvetydig søkeverktøy for allel-kombinasjoner ” funksjonen til å hente de hypotetisk alleler. Deretter gå videre til trinn 1.1.3. å angi allelet.
    3. Åpne skjemaet IMGT/HLA allelet spørringen på følgende webkoblingen - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html og input emne ’ s allelet navn (hver individuelt, som vist i figur 2) i den “ søk for ” boksen. Klikk på den “ Søk etter alleler nå ” knappen. HLA allelet navn bør bruke standard navn systemer (dvs., A *, en * 01, A * 01:01:01:01, og alle tidligere betegnelser som A * 01010101).
    4. Finne samsvarende allelet navnet som vises på skjermen. Klikk på knappen allelet.
    5. Kopi av " Protein sekvens ", og lim den inn i et tekstdokument under en overskriftslinje av " > allelet navnet ". Effektivt, tekstdokumentet er i FASTA (FAST-alle) format av allelet navnet og sekvens.
  2. Utføre gene-baserte flere justeringer av giver og mottaker/pasienten alleler.
    1. Ett gen (dvs. DQB1 * 03:01:01:01) om gangen, kopier og lim alle fire alleler giver og pasienten FASTA sekvenser (to fra donor) og to fra pasienten i et kombinert tekstdokument. På dette punktet, er det viktig å betegne ulikt donor allelet navn fra pasienten allelet navn (alternativer inkluderer differensial bruk av øvre og nedre tilfeller, eller Opprett atskillende prefiks eller suffiks filtypen til hvert allelet navn separat merke donor vs. pasienten alleler). Input rekkefølgen på sekvensene er ikke viktig fordi etter justering rekkefølgen skal stokkes etter nivåer av likheten mellom alle sekvenser.
    2. Kopier og lim inn sekvenser i FASTA formaterer (som sett i Figur 3) fra over i den “ angi din input sekvenser ” boksen på webområdet klynge Omega: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/.
    3. Klikk på " sende jobben " bruker standard innstillingene for parametere: som " PROTEINŔ og " Clustal med tall ". Utføre justering ved å klikke på " Send ". En justering av fire sekvenser vises på skjermen ( Figur 4).
  3. Merke donor-spesifikke uoverensstemmelser.
    Merk: Det spesielt bemerkes at allel sekvensene gitt her var basert på resultatene av HLA skriver, ikke sekvensering. Derfor er det en risiko som relevante sekvens variasjon i bestemt donor-mottaker paret kan være savnet. Dette potensielle problemet vil bli motvirket som mer og mer transplantasjon sentre oppta nøyaktig høyoppløselig skrive og direkte DNA sekvensering.
    1. Kopier og lim den inn i et tekstdokument justering og opprette et nytt dokument. Hvis formatet på filen justert er forstyrret, løse format ved å endre skriftstil og skriftstørrelse: Bruk alltid " Courier New " skriften i små typestørrelse å passe radene. Lagre dokumentet når formateringen problemene er løst.
    2. Undersøke manuelt justert sekvenser for å identifisere alle umake rester som tilhører unikt donor. Merk hver av disse donor-spesifikke rester bruker en skille skriftfarge.
    3. Understreker bokstaver i donor ' s sekvenser som utvide 14 rester både opp - og nedstrøms for de merkede donor-spesifikke uoverensstemmelser (beregnet som 15 aminosyre peptid minus 1 rester av misforholdet).
  4. Utlede 15-mer peptid sekvenser i en overlappende serie.
    Merk: Til å velge 15-mer peptider var basert på generell kunnskap om typiske epitopes blir 4-9 aminosyrer i lengde. Derfor, når vi brukt en " flytte vinduet " prosedyren trinn størrelse 4 aminosyrer ( figur 1), vårt utvalg av en 15 aminosyre lengde forlot en 15-4 = 11 aminosyre overlapping mellom noen nærliggende peptider i en serie. I teorien, denne 11 aminosyre overlapping er nok til å dekke alle immun epitopes opptil 9 aminosyrer i lengde, slik at ingen epitope blir utilsiktet " delt " i to med bare delvise sekvenser på matrisen.
    1. Bruker understreket sekvensene som maler sekvensielt avlede kort 15 amino acid sekvenser i en serie som overlapper 4 rester mellom noen to umiddelbart tilstøtende sekvenser i serien.
    2. Kopier og lim inn disse 15 amino acid sekvenser i et regneark ( figur 5) i kolonneformat ledsaget av notasjon kolonner med tilsvarende navnene på donor alleler. En ekstra kolonne med aa rester stillinger kan være nyttig.
  5. Gjenta trinnene fra 1.1.3. til 1,3. for hver HLA allelet (dvs. A, B, C, DQA1, DQB1, DRB1 og DP) giveren og mottaker paret å utlede 15 aa kort sekvenser av donor.
  6. Kopier og lim alle kolonnene i en master regneark å opprette en lang kontinuerlig kolonne med alle 15 aa sekvenser fra alle alleler fra donor. Skrive ned det totale antallet rader (for peptid sekvensene) i dokumentet.

2. Design tilpassede matrise Layout og produksjon

  1. Generer et regneark med peptid sekvenser med tilsvarende allelet kall. Matrisen har 20 rader og 30 kolonner og rommer opptil 20 x 30 = 600 plasser for peptider. Avhengig av antall peptider i trinn 1.5 fra en bestemt donor og basert vår tidligere erfaring med to eksempler som vi hadde prøvd i Liu et al. 17 600 spot matrisen kan holde alle sekvenser som er generert fra ~ 2 separate transplantasjon tilfeller.
    1. Rasjonelt plan de efficient måte å passe sett av peptider i 600-spot formatet for matrisen.
    2. Hvis mer enn ett emne kan passe inn i en lang rekke kraftfulle, sette inn tomme rader etter første giveren ' s sekvenser tilsvarer antall rader som kan deles med 30 (antall flekker på rad på matrisen).
    3. Umiddelbart etter den siste tomme raden for det første settet av sekvenser, lim inn hele kolonnen sekvens innhold fra andre transplantasjon saken.
    4. Gjenta disse trinnene til matrisen er fylt og ingen flere tilfeller kan legges uten å overskride de 600 plassene. Hvis hele tomme rader er igjen for å fylle nederst, " flytte " den tomme raden skal plasseres mellom to donor. Denne bred plass mellom tilfeller gjør kutting av membranen etter ferdigstillelse av syntese enklere - følgende trinn 3.2. under.
  2. Program peptid sekvenser i sammenheng med matrise oppsett. Programmet av SPOT synthesizeren tar et tekstformat sekvenser (én rad en peptid sekvens), som kan fås direkte ved å lagre resulterende regnearket fra trinn 2.1.4 som en enkel tekst-dokument (uten ekstra kolonnen(e) allelet navn, aa stillinger etc.).
  3. Kjøre automatisert peptid matrise syntese via SPOT synthesizeren. Hele operasjonen fra syntese er beskrevet i Kudithipudi et al. 21. Merk at Fmoc syntese av to matriser tar ~ 4-5 dager.

3. Sonden og Reprobe Antisera fra en tid en individuell transplantasjon mottakeren.

Merk: 600-spot membran matrisen har dimensjoner ~ 7 cm x 13 cm. Etter syntese, kan arrayene lagres ved romtemperatur som tørr membraner i minst to år når skjermet fra lys. Unngå overdreven folding av membranen å bevare sin levetid for gjentatt bruk.

  1. Rehydrate membran matrisen med etanol og visualisere peptid flekker med Ponceau S.
    1. Rehydrate membranen matrise bærer peptidene gradvis fremgangsmåten optimalisert i Li et al. 24.
      1. fordype matrise membranen i 20 mL av 100% etanol.
      2. Legge til 20 mL destillert vann for å fortynne løsningen på 50% etanol og ruge ved romtemperatur i 15 min.
      3. Endre nedsenking løsningen til 40 mL av 100% vann tre ganger og Inkuber 15 min hver gang.
      4. Vask i en skikkelig arbeider buffer, f.eks 20 mL TBST (Tris-bufret saline med 0,1%), tre ganger i 5 min hver.
    2. Ponceau S flekk i matrisen visualisere syntetiske peptider
      1. legge 20 mL pre-formulerte Ponceau S løsning direkte til hydrert array og Inkuber for ~ 30 s med skjelvende.
      2. Kjøre destillert vann kontinuerlig over membranen de stain bakgrunn Ponceau S fargen. Under prosessen peptid flekker av rød farge kan bli synlige.
      3. Skille delene av matrisen for hver giver ved nøye klippe mellom delene av matrisen for enkeltsaker. Merke retningen til hver matrise.
  2. Før blokk matrise.
    1. Blokk membranen i 20 mL 5% ikke-fett melk oppløst i TBST buffer. Melk-baserte løsningen vil ytterligere de flekken Ponceau S fargen. Erstatte melk bufferen flere ganger for å oppnå de klareste peptid bildene.
    2. For journalføring formål, ta et bilde av Ponceau S bildet av matrisen bruker et håndholdt kamera (eksempel i figur 6).
    3. Fortsett blokkering av membranen i 5% ikke-fett melk på 4 ° C over natten eller ved romtemperatur for 2t med rocking.
  3. Incubate matrise med transplantasjon antiserum.
    Merk: Det burde være bemerket at et fenomen kjent som prozone eller kroken effekten kan skyldes komplement-avhengige innblanding i serum antistoff analyse. For å omgå dette problemet, må et valgfritt serum forbehandling skritt betraktes med EDTA eller varme inaktivering av serumprøver.
    1. Fjerne blokkering buffer og vask membranen med 20 mL TBST tre ganger neste dag for 5 min hver gang.
    2. Legge til 20 µL av råolje serum av mottakeren 20 mL 2,5% melk TBST buffer og ruge med membran for 2-3 h ved romtemperatur. Merk at i denne første runden av undersøkelser, er det anbefalt at siste etter transplantasjon serum (eller trolig mest oppmerksomme serum) i tidsserien brukes først. Dette er basert på en forutsetning om at tidligere prøver i serien, spesielt fra før transplantasjon tidspunkt, har mindre variasjon av alloantibodies som pleier å utvikle seg over tid. Denne måten, enhver mulighet for signalforstyrrelser fra " bære-over " mellom sondering runder kan skilles klart fra virkelig utviklet alloantibody reaktivitet på grunn av immunreaksjoner mot graftet.
  4. Vask matrisen med 20 mL TBST og ruge med sekundær antistoff.
    1. Vask membranen tre ganger i 10 min hver gang.
    2. Incubate med geit anti-IgG-HRP (pepperrotperoksidase) sekundære antistoff på 1:10,000 fortynning TBST buffer med 1% melk for en annen 2 h.
  5. Vask og utvikle blot.
    1. Vask membranen tre ganger med TBST i 10 min hver gang.
    2. Utføre forbedret chemiluminescence (ECL) 5 mL luminol løsning nymalt blandet med 5 mL av peroxide løsningen å utvikle membranen (for 1 min).
    3. Visualisere ECL signaler ved hjelp av en passende imager (dvs. ChemiDoc Imaging Systems eller Azure C600).
  6. Scan og kvantifisere blot.
    1. Lagre utviklet bildene ( figur 7, lavere bilde) og utføre kvantifisering spot intensitetsnivåer.

4. Sammenligne Antiserum reaktivitet over en klinisk tidsserier.

  1. Strip matrisen.
    1. På dette punktet, holde membranen våt bestandig.
    2. Stripe membranen av rugende med 20 mL kommersiell stripping buffer på 37 ° C for 20 min, og så vaske membranen med TBST tre ganger for 10 min. Deretter gjenta blokkering (trinn 4.2) og undersøkelser (trinn 4.3) skritt benytter en annen serum pasientens tatt på et annet tidspunkt.
  2. Blokk strippet membran.
    Merk: Etter stripping, membranen kan gjenbrukes for en ny runde med undersøkelser av en annen serum fra samme pasient i en tid-serie.
    1. Blokkere membranen bruker 5% melk bufferen som før (se trinn 3.2).
  3. Reprobe en annen antiserum fra samme tidsserien (gjenta trinn fra 3,3-3.6, eksemplet i figur 7 øverste bildet).
    Merk: Strippet matrisen kan deretter brukes til å reprobe en annen serum prøven. Siden peptidene er covalently bøyd til støtte matrix av membranen viste vi at matrisen kan gjenbrukes for opptil 20 runder med stripping og reprobing sykluser uten å miste sin performance.
  4. Langtidsoppbevaring av matriser.
    1. Store membranen TBS buffer supplert med 0,02% w/w Natriumazid som konserveringsmiddel. Bruk en forseglet plastpose for langtidslagring. Ved 4 ° C under beskyttelse fra lys, våt membranen kan lagres i minst 2 år.

5. Datainnsamling og analyse

  1. manuelt kommentere positiv antigen peptider.
    1. Finne flekker viser positive antistoff signaler og bestemme hver av sine rutenett posisjoner.
    2. Merke de tilsvarende radene i hovedregnearket for positiv peptidene.
  2. Hente peptid sekvenser i hovedregnearket ( figur 7, nederste listen). I henhold til design-prinsippet i trinn 1.4.1., nærliggende føljetong flekker dele betydelig overlappende sekvenser (15-4 = 11), derfor reaktive epitopes kan deles av peptider i en påfølgende serie.
    1. Markere noen positiv flekker forekommer i rekkefølge.
  3. Finne minimum epitope lengde for hver peptid i en serie.
    1. Høydepunkt noen potensielt delte epitope sekvenser basert på overlappende segmenter av reaktive peptider.
  4. Strukturelt modell antigen epitopes.
    1. Få prototype HLA krystall strukturer fra Protein Data Bank på følgende linken: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do.
    2. Vise prototypen HLA strukturen i Pymol (Last ned fra www.pymol.org).
    3. Kart " eller modell oppdaget anti-giver epitopes til 3D strukturer av prototype HLA molekyler ved å markere den reaktive peptid sekvenser ( Figur 8). Klikk på " skjermen ", deretter " bakgrunn ", og velg " hvit ". Hvis du vil lagre bildet, gå til " filen " og " Lagre bilde som " og Velg formatet " png ".
  5. Rapportere resultater og reaktive epitopes tilordnes de tilsvarende alleler.
  6. Sammenlign array resultatene til single-antigen perler (SAB) resultatene, hvis tilgjengelig.
    Merk: SAB test med enkelt allel antigener måler antistoffer reaktivitet mot en fast panel HLA proteiner. Individuelle peptider som viser antistoff reaktivitet tilhører visse HLA alleler som, hvis også inkludert i SAB panelet, tillater direkte sammenligning mellom matrisen og SAB resultatene. Våre tidligere studie 17 viste en høy korrelasjon mellom resultatene tyder på at peptid epitopes betydelig bidra til den samlede reaktivitet av SAB. I tillegg avsløre matrise resultatene også aminosyre-nivåer av spesifisitet.
    1. Motta SAB resultater fra en HLA laboratorium som gir informasjon om og hvilke donor alleler er reaktiv til etter transplantasjon sera av pasienten. Resultater fra trinn 5.5. basert på matrisen analyse gir også informasjon om tilsvarende donor alleler positivt for alloantibody reaktivitet.
    2. Sammenligne SAB og matrise.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I den opprinnelige studien bruker matrisen screening metode17, begynte vi totalt 5 nyre transplantasjon fag. Vi fikk HLA skriver resultatene av våre kohort og deres respektive givere. Deres medisinske historie og allel antistoff titers fra SAB tester var også tilgjengelig for oss. I vår pilotstudien av disse 5 pasienter, utarbeidet vi to ulike metoder: et standard utvalg består av et fast panel av peptider og personlig matriser som var tilpasset laget for hver giver og mottaker par. Mens den første metoden hadde tillatt oss å validere teknisk ytelsen til matrisen plattformen å oppnå høye nivåer av spesifisitet i individuelle transplantasjoner, er personlig protokollen for denne siste metoden beskrevet i denne artikkelen og video ment for omfattende screening av donor-spesifikke antistoffer (DSA), som korrelerer ofte med dårlig pode resultater5,25,26.

Personlig arrayene ble brukt på to av de fem tilfeller17, og for å illustrere hele arbeidsflyten for metoden, vi fokusere her på en av disse to pasienter (nemlig PTN #4). Nøkkel teknologi for å lage egendefinerte peptid matrise innebærer SPOT synthesizeren. Det er en fullt automatisert robot-system som gjør peptider bruker Fmoc syntese direkte på en spesielt avledede mobilnettet matrise på en membran (figur 1). Vi utnyttet fleksibiliteten av synthesizeren å montere store datasett peptider fra personlige orgel givere HLA sekvenser. For å få tilstrekkelig dekning å unngå en situasjon når en kontinuerlig epitope er å "splitte" og taper antistoff reaktivitet, fulgte vi et "walking" design av føljetong peptider har 15-4 = 11 rester av overlapping mellom alle i umiddelbar nærhet av peptider, så en serie er alltid nok til å dekke typisk lengden av antistoff epitopes anslått til 4-9 aa i lengde (figur 1).

Malen HLA sekvensene var direkte ned fra depotet databasen vedlikeholdes på EMBL-EBI (European Bioinformatics Institute). Som et eksempel, PTN #4 donor's HLA-DQB1 * 03:01:01:01 allelet ble søkt på (nettside bilde i figur 2). Sammen, vi separat lastet ned sekvenser for donor andre HLA-DQB1 allelet av * 02: 01:01, samt de av PTN #4 selv, HLA-DQB1 * 04:02 og * 05:01. Flere sekvens justeringen ble deretter utført Clustal Omegas web funksjoner (Figur 3). Justering filen ble innhentet (Figur 4), fra som alle umake aminosyre rester ble identifisert (donor rester er uthevet). Neste, vi merket mal sekvenser (understreket) av en giver som var langt nok til å dekke alle sine feilaktige rester. Basert på disse mal sekvenser og følge en "walking" design som beskrevet ovenfor, tre serien av peptider hver 15 aa lengde ble Hentet fra HLA-DQB1. Denne prosessen ble gjentatt til resten av donor alleler HLA-A, B, C, DQA1 og DRB1 (DRA1 og DP ble utelatt på grunn av utilgjengelighet av relevant klinisk posten) i forhold til de tilsvarende alleler hans mottakeren. På slutten, totalt 202 peptider ble engasjert for å gjøre matrisen (peptid sekvenser i et regneark i figur 5 og en rekke illustrasjon i figur 6) spesielt for undersøkelser PTN #4 etter transplantasjon serum og sammenlignet resultatene med de fra en påfølgende reprobing av hans før transplantasjon serum (figur 7). Av 202 peptidene, totalt 10 viste antistoff signaler forbundet med etter transplantasjon prøven av som donor-spesifikke rester (mismatched fra mottakeren) E87, I306, W243 og K197 av HLA-B * 52:01, -B * 52:01, -C * 03:04 og -DQA1 * 05:01 syntes å være involvert i eggende antistoff reaktivitet (rester merket røde bokstaver i figur 7).

I tillegg er en av hovedfordelene med metoden matrisen i forhold til tradisjonelle SAB testen at epitope informasjon kan lett fås, som vist i figur 7. Vi sammenlignet den antistoff-reaktive epitopes HLA-DQA1 og - DQB1 fra alle fem pasienter (fra egen array resulterer i Liu et al. 17) ved å ha dem alle modellerte en co krystall struktur av DQA1 og DQB1 heterodimer (Figur 8). Oppmuntrende, er en fremtredende segment i strukturen kjent som den β1 stranden en "hotspot" som hadde en mye høyere sjanse (3/5 i pasienter 2,3,5) bli målrettet av alloantibodies blant de transplantasjon fagene i 5 små kohort.

Figure 1
Figur 1 . Den generelle ordningen med HLA-baserte antigen matrisemetode for påvisning av anti-giver HLA alloantibodies i orglet mottager. (Tilpasset og endret fra Liu et al. 17) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Data lager nettsted
For å gjenerverve HLA sekvenser, kan du gå til følgende nettsted: http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html
Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Flere protein sekvenser justering av giver vs mottaker HLA-DQB1 alleler bruker Clustal Omega web-basert verktøyet.
Kopier og lim inn sekvenser av pasienten #4(PTN#4) DQB1 * 0201 og 03:01, og donor DQB1 * 04:02 og 05:01 i FASTA format i http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ (illustrasjon, DQB1 * 05:01 PTN #4 og DQB1 * 03:01 av donor vises i boksen) . Velg alternativet "Clustal med tall" i "Trinn 2" for utdataformatet og Kjør justering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 . Sammenligning avdonor vs pasient/mottaker HLA DQB1 og valg av mal sekvenser for peptid syntese.
Donor sekvensene er i fet skrift, med donor-spesifikke uoverensstemmelser i rødt og også markert med svarte bokser. Malen sekvenser (understreket) for deriving peptider inneholde disse donor-spesifikke rester. (Dette tallet ble tilpasset og endret fra Liuet al. 17) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 . Et illustrerende eksempel i hovedregnearket i et regneark med donor HLA peptider.
Peptid posisjon på matrisen angis av rad vs kolonnekoordinater. Peptid sekvenser brukes til å programmere syntese bruke robot SPOT synthesizer. Donor-spesifikke rester (mismatched fra mottakerens tilsvarende alleler) er merket med fet skrift og understreket. Start- og plasseringen av peptid tilsvarer full lengde HLA-DQB1 sekvenser er også indikert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 . Bilde av en matrise delen farget med Ponceau S
Merk forskjellen i fargeintensiteten på grunn av forskjellen i aminosyre komposisjon blant peptider, mens peptid konsentrasjoner blant alle spot områder er det samme. (Bildet er et illustrerende eksempel, ikke en fra denne faktiske studien.) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7 . Donor-spesifikke HLA-A, B, C, DQ, DR matrise studie av mismatched epitopes i PTN #4.
Seriell peptider var avledet fra donor sekvenser å dekke rester (et eksempel på DQB1 i Figur 4). Matrisen ble brukt til å undersøke etter transplantasjon serum (lavere blot: post-TX) og senere før transplantasjon serum (øvre blot: pre-TX) fra samme pasient. De fire settene med sterke flekker fra etter transplantasjon undersøkelser er merket med røde linjer (i nedre blot), mens to mellomstore intensitet flekker som bare ble assosiert med pre transplantasjon serum markeres med blå linjer (i øvre blot). Den nederste tabellen viser den tilsvarende peptid sekvenser og deres reaktivitet til etter transplantasjon serum. Donor-spesifikke (uten samsvar) rester E87, I306, W243 og K197 av deres respektive alleler er røde bokstaver peptider viser sterk antistoff reaktivitet er fet skrift. Dette tallet ble tilpasset og endret fra Liu et al. 17. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8 . Strukturelle steder av HLA-DQ epitopes.
Co krystallstruktur av HLA-DQ8 ble brukt som en mal. Strukturen ble består av en DQA1 og en DQB1 underenheter med et antigen peptid (A). Sekundær proteinstrukturer α-helikser og β-tråder vises i panelet (B). DQA1 og DQB1 peptider som reagerte med én av fem serum ble plassert på den co krystallstruktur (i A og B: skyggelagt med blått). Tre β-tråder, β1, β6 og β12 (mørk blå i B), hver representert ved flere peptider (kort rød linje tilsvarer lineær aa plasseringen av DQA1), reagerte med flere pasienter prøver (opprinnelige resultater i Liu et al. 17). alle seks DQB1 peptider (i fet skrift) reaktiv til antistoffer hos pasienter #2 #3 #5 er plassert på β1 "hotspot" segmentet (i B: peker den røde pilen). Dette tallet ble tilpasset fra Liu et al. 17. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I stedet matrisen beskrevet her er for eksperimentelle studier av alloantibody spesifisitet i transplantasjon mot en organtransplantasjon HLA antigener. I motsetning til eksisterende SAB analysen bredt brukt i, har antigen matrise metoden en stor fordel i fleksible utformingen som rommer den sanne HLA sekvenser av enkelte donor. Den nye plattformen utnytter mulighetene for den raskt fremrykkende DNA sekvensering teknologien som vil snart kunne produsere nøyaktige HLA allel sekvens målinger uten tvetydighet16,27 og potensialet i utpekte databaser for repositoriet sekvenser HLA15 i den globale befolkningen. Vår nåværende matrise-screening protokoll utviklet basert på suksessen av flere pilotstudier av transplantasjon sera. Her bør vi understreke at på dette stadiet vår prototype matriser er konstruert for forskningsbruk, ikke til diagnostiske programmer i klinisk praksis.

En annen bemerkelsesverdig forskjell SAB og vår antigen array er at sistnevnte har høyere oppløsning skille potensielle antigen epitopes i de 15 aa segmentene av HLA-sekvenser, som kan gi verdifull informasjon om alloantigenicity18 . Men i motsetning til SAB som presenterer hele protein antigener for å tilpasse deres foldet strukturer, inneholder antigen matrisen bare kort peptider, som utelukker informasjon om conformational folding. Derfor arrayene finner antistoffer som gjenkjenner bare conformational epitopes, som noen mener utgjør et flertall av alle funksjonelle epitopes relevante antistoff mediert avvisning28,29. Likevel, i andre sammenhenger, antistoff aksjoner mot lineær epitopes, som de i korte peptidene, er utnyttet i viral antigen svar og i vaksine design30,31. Vi bør også merke seg at i begrenset antall pasientprøvene testet, deteksjon følsomhet ytelsen av vår array overskredet den SAB og lov påvisning av donor-spesifikke antistoffer før17 under klinisk progresjon av antistoff-mediert avvisning. Dette skyldes høy molar konsentrasjonen av lokale antigen peptider på matrisen i forhold til SAB. Denne funksjonen var spesielt nyttig i tilfeller når SAB oppdaget ingen reaktivitet mens kliniske og patologiske bevis av antistoff-mediert avvisning var klart, vi viste tidligere17. Det er imidlertid viktig å påpeke at denne personlige testen er mer tidkrevende enn standard SAB testen. Matrise testen krever å skaffe organer donor og (forslag) mottakerens HLA sekvenser før du starter utformingen av antigen peptider. Deretter tar flere dager å produsere matrisen og 7-8 timer å oppnå antistoff resultater. Lange prosedyren er derfor ikke egnet for avdød donor transplantasjon, med mindre det hovedavdeling hensikten av antistoff test er for å bestemme fremveksten av donor-spesifikke antistoffer etter transplantasjon, i stedet for før transplantasjon evalueringen av eksisterende antistoffer.

Metoden matrise hadde en stor forbedring fra eksisterende SAB testen oppdage antigen epitopes. Videre gjort vi et forsøk på å tilordne reaktive epitopes i fem transplanterte pasienter til en malstruktur av HLA-DQ, som vi bemerket minst en fremtredende "hotspot" epitope i sin β1 strand som skjedde i tre av de fem pasienter17. Intriguingly, er de β1 trådene HLA-DQA1 og -DQB1 plassert på sporet av antigen-presentasjon konkav (Figur 8), et sted kjent for å være antigen i sammenheng med transplantasjon avvisning32. Derfor forventer vi at fremtidige utforskning av vår personlige antigen matrisemetode i utvidet transplantasjon Kohortstudier vil gi verdifull innsikt i antigen hotspots i HLA molekyler. En katalog av disse identifiserte hotspots, når betraktet i forbindelse med svært nøyaktig DNA sekvensering innskriving av HLA gener mellom potensielle givere og mottakere, vil til slutt hjelpe før transplantasjon beslutninger gjennom akseptabel feil programmer 33, ment å effektivisere unngå visse uoverensstemmelser i nærheten å katalogisert hotspots.

Oppsummert var våre opprinnelige studien17 i å utforske personlig utformingen av et antigen matrisen for gjenkjenning av bestemt anti-HLA alloantibodies først i sitt slag. Studien fokus var på muligheten for matrise design og implementering, som fungerte som en prototyp for potensielle fremtidige teknologi. Våre pilotstudie ikke bare generert oppmuntrende resultatene fra klinisk prøver, men også tillatt oss å beregne totalkostnadene og hastigheten på testen. Produksjonskostnaden for en personlig matrise i vår nåværende laboratorium innstilling er under $1000 USD, som er en engangs kostnad siden matrisen kan brukes over tid i opptil 20 runder av reprobing sykluser uten tap av ytelse. Det er mulig at ytterligere testing av matrise-protokollen med en bredere kohort av transplantasjon fag vil ytterligere effektivisere metoden som kan en dag bli brukt i klinisk praksis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Shawn Li og Xing Li Western University i Canada for deres type hjelp med SPOT array produksjon. Vi er takknemlige for personalet Histocompatibility kjernen og det omfattende transplantasjon sentrum av Northwestern universitetet for å gi utvalg tjenester. Dette arbeidet har vært delvis støttet ekstra bord i nordvestlige Memorial Hospital, og et fakultet oppstart fond fra Northwestern University til JJ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peptide array INTAVIS Bioanalytical Instruments
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170
Non-fat milk Bio Rad Laboratories 1706404
TBST Santa Cruz Biotechnology 10711454001
Goat anti-human IgG–HRP  ThermoFisher Scientific A18811
Clarity Western ECL Substrate Bio Rad Laboratories 1705061
Restore Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientifics 21059
ChemiDoc gel imaging system Bio Rad Laboratories 1708265 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bradshaw, R. A., Dunn, P. P. Unambiguous high resolution genotyping of human leukocyte antigens. J Immunol Methods. (2017).
  2. Robinson, J., Halliwell, J. A., McWilliam, H., Lopez, R., Marsh, S. G. IPD--the Immuno Polymorphism Database. Nucleic Acids Res. 41, D1234-D1240 (2013).
  3. Tait, B. D. Solid phase assays for HLA antibody detection in clinical transplantation. Curr Opin Immunol. 21, (5), 573-577 (2009).
  4. Tait, B. D. Detection of HLA Antibodies in Organ Transplant Recipients - Triumphs and Challenges of the Solid Phase Bead Assay. Front Immunol. 7, 570 (2016).
  5. Gebel, H. M., Bray, R. A. HLA antibody detection with solid phase assays: great expectations or expectations too great? Am J Transplant. 14, (9), 1964-1975 (2014).
  6. Horton, R., et al. Gene map of the extended human MHC. Nat Rev Genet. 5, (12), 889-899 (2004).
  7. Duquesnoy, R. J. HLAMatchmaker: a molecularly based algorithm for histocompatibility determination I. Description of the algorithm. Hum Immunol. 63, (5), 339-352 (2002).
  8. Duquesnoy, R. J., Marrari, M. HLAMatchmaker-based definition of structural human leukocyte antigen epitopes detected by alloantibodies. Curr Opin Organ Transplant. 14, (4), 403-409 (2009).
  9. Wedel, J., Bruneau, S., Kochupurakkal, N., Boneschansker, L., Briscoe, D. M. Chronic allograft rejection: a fresh look. Curr Opin Organ Transplant. 20, (1), 13-20 (2015).
  10. Rostaing, L. P., Malvezzi, P. HLA-Incompatible Kidney Transplantation--Worth the Risk? N Engl J Med. 374, (10), 982-984 (2016).
  11. Gebel, H. M., Bray, R. A., Nickerson, P. Pre-transplant assessment of donor-reactive, HLA-specific antibodies in renal transplantation: contraindication vs. risk. Am J Transplant. 3, (12), 1488-1500 (2003).
  12. Haas, M. An updated Banff schema for diagnosis of antibody-mediated rejection in renal allografts. Curr Opin Organ Transplant. 19, (3), 315-322 (2014).
  13. Cecka, J. M., Reed, E. F., Zachary, A. A. HLA high-resolution typing for sensitized patients: a solution in search of a problem? Am J Transplant. 15, (4), 855-856 (2015).
  14. Tambur, A. R., Claas, F. H. HLA epitopes as viewed by antibodies: what is it all about? Am J Transplant. 15, (5), 1148-1154 (2015).
  15. Robinson, J., et al. The IPD and IMGT/HLA database: allele variant databases. Nucleic Acids Res. 43, D423-D431 (2015).
  16. Gabriel, C., et al. HLA typing by next-generation sequencing - getting closer to reality. Tissue Antigens. 83, (2), 65-75 (2014).
  17. Liu, P., et al. A Novel Method for Anti-HLA Antibody Detection Using Personalized Peptide Arrays. Transplant Direct. 2, (11), (2016).
  18. Frank, R., Overwin, H. SPOT synthesis. Epitope analysis with arrays of synthetic peptides prepared on cellulose membranes. Methods Mol Biol. 66, 149-169 (1996).
  19. Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications. J Immunol Methods. 267, (1), 13-26 (2002).
  20. Amartely, H., Iosub-Amir, A., Friedler, A. Identifying protein-protein interaction sites using peptide arrays. J Vis Exp. (93), (2014).
  21. Kudithipudi, S., Kusevic, D., Weirich, S., Jeltsch, A. Specificity analysis of protein lysine methyltransferases using SPOT peptide arrays. J Vis Exp. (93), e52203 (2014).
  22. Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat Protoc. 2, (6), 1333-1349 (2007).
  23. McBride, R., Head, S. R., Ordoukhanian, P., Law, M. Low-Cost Peptide Microarrays for Mapping Continuous Antibody Epitopes. Methods Mol Biol. 1352, 67-83 (2016).
  24. Li, S. S., Wu, C. Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains. Methods Mol Biol. 570, 67-76 (2009).
  25. Kaczmarek, I., et al. Donor-specific HLA alloantibodies: long-term impact on cardiac allograft vasculopathy and mortality after heart transplant. Exp Clin Transplant. 6, (3), 229-235 (2008).
  26. Claas, F. H. Clinical relevance of circulating donor-specific HLA antibodies. Curr Opin Organ Transplant. 15, (4), 462-466 (2010).
  27. Brown, N. K., Kheradmand, T., Wang, J., Marino, S. R. Identification and characterization of novel HLA alleles: Utility of next-generation sequencing methods. Hum Immunol. 77, (4), 313-316 (2016).
  28. Cino, E. A., Choy, W. Y., Karttunen, M. Conformational Biases of Linear Motifs. Journal of Physical Chemistry B. 117, (50), 15943-15957 (2013).
  29. Duquesnoy, R. J. Human leukocyte antigen epitope antigenicity and immunogenicity. Curr Opin Organ Transplant. 19, (4), 428-435 (2014).
  30. Lavinder, J. J., et al. Identification and characterization of the constituent human serum antibodies elicited by vaccination. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (6), 2259-2264 (2014).
  31. Kloetzel, P. M. Antigen processing by the proteasome. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, (3), 179-187 (2001).
  32. Filippone, E. J., Farber, J. L. The Humoral Theory of Transplantation: Epitope Analysis and the Pathogenicity of HLA Antibodies. J Immunol Res. 2016, 5197396 (2016).
  33. Claas, F. H., Witvliet, M. D., Duquesnoy, R. J., Persijn, G. G., Doxiadis, I. I. The acceptable mismatch program as a fast tool for highly sensitized patients awaiting a cadaveric kidney transplantation: short waiting time and excellent graft outcome. Transplantation. 78, (2), 190-193 (2004).
Tilpasset peptid matriser for påvisning av HLA Alloantibodies i organtransplantasjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, P., Souma, T., Wei, A. Z. S., Xie, X., Luo, X., Jin, J. Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation. J. Vis. Exp. (127), e56278, doi:10.3791/56278 (2017).More

Liu, P., Souma, T., Wei, A. Z. S., Xie, X., Luo, X., Jin, J. Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation. J. Vis. Exp. (127), e56278, doi:10.3791/56278 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter