Det nuvarande protokollet beskriver en metod genom vilken användare kan upprätthålla livskraften hos akut hippocampus och kortikala slice preparat under datainsamlingen magnetresonans mikroskopi.
Det här protokollet beskriver förfarandena som är nödvändiga för att stödja normala metaboliska funktioner av akut hjärnskada slice preparat under datainsamlingen magnetresonans (MR) mikroskopi. Det är möjligt att utföra herr samlingar på levande, exciderad däggdjursvävnader, sådana experiment har traditionellt varit begränsas av resolution gränser och är således oförmögen att visualisera vävnad mikrostruktur. Omvänt, herr protokoll som uppnådde mikroskopiska bildupplösning krävs användning av fasta prover att rymma behovet av statisk, oföränderlig förhållanden över långa skanna gånger. Det nuvarande protokollet beskriver den första tillgängliga herr tekniken som möjliggör avbildning av levande, däggdjur vävnadsprover vid mikroskopisk upplösningar. Sådana uppgifter är av stor betydelse för förståelsen av hur patologi-baserade kontrast förändringar som sker på mikroskopisk nivå inflytande innehållet i makroskopiska herr skanningar som de används i kliniken. En gång sådan förståelse realiseras, diagnostiska metoder med större känslighet och noggrannhet kan utvecklas, vilket kommer att översätta direkt till tidigare sjukdomsbehandling, mer korrekt terapi övervakning och förbättrade behandlingsresultat.
Medan den beskrivna metoden fokuserar på hjärnan slice preparat, är protokollet anpassningsbar till alla exciderad vävnad segment eftersom ändringar görs på gas och perfusatet preparat att tillgodose vävnadens specifika metaboliska behov. Framgångsrikt genomförande av protokollet bör resultera i levande, akut slice preparat som uppvisar herr diffusion signal stabilitet för perioder upp till 15,5 h. De främsta fördelarna med det nuvarande systemet över andra herr kompatibel perfusion apparaturar är dess förenlighet med herr mikroskopi maskinvara krävs för att uppnå högre upplösning bilder och förmåga att ge konstant, oavbruten flöde med noggrant reglerade perfusatet villkor. Reducerat provgenomströmning är en övervägande med denna design som endast en vävnad slice kan avbildas i taget.
Magnetisk resonanstomografi (MRT) system har stadigt utvecklats till allt högre fältstyrkor, blivit mer information om sammansättning och status för levande vävnader märkbara. Trots sådan maskinvara framsteg är MR imaging upplösningar som är tillräcklig för att visualisera de cellulära strukturerna av vävnader fortfarande inte tillgängliga i kliniken. Därför måste slutsatsen dras cellular-nivå kännetecken för vävnader när man beaktar innehållet i kliniska skanningar. Sådan slutledning kräver kunskap om motsvarande processer utläsa från data tas i modellsystem som kan observeras direkt. Traditionellt har ingår dessa modeller celler från vattenlevande organismer såsom Xenopus laevis äggcellen och Aplysia californica L7 neuron1,2. Dessa var bland de första djurceller tillgängliga för observation med herr metoder på grund av deras atypiskt storlek: cirka 1000 μm och 300 μm diameter, respektive. Mer nyligen, framsteg inom hårdvarudesign har gjort för en av de största exemplen på däggdjursceller — den α-motorneuronen — att avbildas med herr mikroskopi tekniker på fasta vävnad3,4. Medan dessa studier visat direkt visualisering av däggdjur cellulära material med hjälp av herr, fast proverna anställd skiljer sig avsevärt i deras Herr egenskaper från levande vävnad och därmed inte kan fungera som en motsvarande representativa modell5, 6. Viktigare kräver att observera herr kontrast förändringar som sker i samförstånd med komplexa biologiska processer levande prover som kan vara orolig och mätt under loppet av imaging experimentet.
För att underlätta herr mikroskopi studier på levande vävnader, presenteras ett protokoll som omfattar kommersiella microimaging hårdvara7 kopplats ihop till en specialbyggd, herr kompatibel, i-bore oxygenator och perfusion enhet som tidigare beskrivs8 . Unika fördelar av denna design inkluderar cellulär nivå upplösning funktioner i däggdjur vävnader och precisionskontroll över löst gasinnehåll och pH vid platsen för vävnadsperfusion. Också, till skillnad från majoriteten av explant herr studier som avbryter perfusion under bild förvärv att undvika flödet artefakter, denna design stöder användning av kontinuerlig perfusion under datainsamling som har visat sig förbättra fysiologiska tillstånd isolerade vävnader9,10. Slutligen dess stängda inspelning kammare och slice-lagring hårdvara stöd för att minska sannolikheten för rörelse artefakter som annars kan uppstå under utdragna bildsamling.
Medan det nuvarande protokollet beskriver förfaranden som är lämpliga för användning med akut hippocampus och kortikala skivor, kan exakt kontroll över perfusatet metaboliter detta system för att tillgodose en mängd olika vävnadstyper och experimentella förhållanden. Begränsningar av denna design inkluderar en minskning i provkapacitet jämfört med en multi slice perfusion kammare11; men kan denna begränsning övervinnas i framtiden använda multi spole arrayer.
Också, medan det beskrivna systemet kan användas i både horisontell eller vertikal konfigurationer, det nuvarande protokollet har dess användning i en lodrätt orienterad, 600 MHz spektrometer. Alla system som kan herr microimaging studier — vanligtvis narrow-bore (≤6 cm), hög fältet (≥500 MHz) spektrometrar — kommer att rymma oxygenator och perfusion utrustningen beskrivs. Dock kan ändringar imaging spolen, toning, sond system eller andra väsentliga imaging hårdvara anställd nödvändiggöra ändringar av perfusion utrustningen och herr scan parametrar.
Det nuvarande protokollet beskriver förfaranden som är nödvändiga för standarden metabola underhåll av akut hjärnskada slice preparat genomgår magnetisk resonans mikroskopi. Detta förfarande är den enda metoden för närvarande tillgängliga som möjliggör visualisering av levande däggdjur vävnader med herr upplösningar kan lösa celler. Medan de perfusatet villkor som beskrivs är skräddarsydda för centrala nervsystemet vävnader, protokollet är allmänt anpassas till någon slags levande vävnad förberedelse genom justeringar av beståndsdelarna perfusatet och gas samt perfusion flöde och temperatur.
De vanligaste problemen som kan påträffas under de beskrivna förfaranden omfattar de relaterade till brister i metaboliten leverans. Utfällning av kalciumsalter kan uppstå inuti aCSF under gasformiga insufficiens till följd av brister i den bikarbonat buffring system. Sådana fällningar kan täppa till raderna perfusion och svår hårdvara skada. Om salt fällningar observeras i den perfusatet efter sonden församling, perfusion flöde omedelbart upphöra genom att stänga av den peristaltiska pumpen. Bekräfta förekomsten av tillräcklig natriumbikarbonat (4,37 g/2 L) i perfusatet, CO2 nivåer (5,0%) i leverans samt carbogen gasflödet (1/16 L/min) till både reservoar och oxygenator. Slutligen bekräfta pH-nivåer är stabiliserad i fysiologiska intervallet (7,3-7,4). I händelse av att syrehalten gas och pH inte regleras fortfarande lämpligt, bör gasutbyte membranet ersättas.
Om skivor inte uppvisar signal stabilitet över avsedda experimentell tid-kursen, bekräfta att de rätta kemiska beståndsdelarna finns i aCSF blandningen och att de rätta osmolalitet (300 mOsm) och pH (7,3-7,4) upprätthålls. Kontrollera också carbogen gas levereras till perfusatet reservoar och oxygenator på 1/16 L/min. Om dessa steg inte löser perfusatet villkor, rekommenderas byte av gasutbyte membranet. Om vävnad stabilitet inte uppnås efter felsökning perfusatet villkoren, överväga förfining av kirurgiska protokollet med fokus på att minimera tidsintervallet mellan vävnad skörd och perfusion tillämpning.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av anslag från National Institutes of Health (1R21NS094061-01A1) (NIH 1R01EB012874-01) (S10RR031637), och National Science Foundation (samarbetsavtal No. DMR-1157490) genom den nationella höga magnetfält laboratorium (NHMFL) avancerad magnetisk resonanstomografi och spektroskopi (AMRIS) anläggningen på UF och delstaten Florida.
Perfusate Preparation | |||
Osmette A | Precision Systems Inc. | 5002 | freezing point depression osmometer |
Stir Plate Type 1000 | Barnstead/Thermodyne | SPA1025B | magnetic stir plate with heating element |
Accumet Basic pH Meter | Fisher Scientific | AB15 | pH Meter |
pH Probe | Fisher Scientific | 13-620-AP61 | probe for pH measurement |
Oxygen Meter | Microelectrodes Inc. | OM-4 | meter for sampling the oxygen content of gasses or the disolved oxygen content of liquid perfusates |
Oxygen Electrode | Microelectrodes Inc. | MI-730 | microprobe for the oxygen meter |
Scale | Denver Instrument Co. | A-160 | microscale for weighing chemical components |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Slice Preparation | |||
Lancer Vibratome | Ted Pella Inc. | Series 1000 | vibratory tissue slicer |
Disecting Microscope | Carl Zeiss Inc. | OPMI 1-FC | tabletop, binocular disecting microscope |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Perfusion System | |||
Masterflex L/S | Cole-Parmer | 7523-50 | peristaltic micro perfusion pump |
Oxygen Regulators x 2 | Victor Medical | VMG-05LY | device for regulating gas flow |
e-sized carbogen cylinders x 2 | Airgas | gas tanks containing carbogen gas | |
in-bore oxygenator | developed in house | device responsible for pH and oxygen regulation in the perfusate | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
MR Imaging Hardware | |||
Micro Surface Coil (200mm dia., modified) | Bruker Biospin | B6371/0001 | four-turn micro (200mm dia) surface-style radiofrequency coil |
Micro 5 probe body | Bruker Biospin | Z3395 | microimaging probe used in the 600 MHz spectrometer |
Micro 5 gradient coils | Bruker Biospin | M81111 | gradient coil stack used with micro 5 probe body |
600 MHz Spectrometer | Oxford Instruments | superconducting magnet (14.1T) used for MR image generation | |
Imaging Console | Bruker Biospin | Avance III | support and control hardware including gradient amplifiers, preamps, & workstation used for MR image generation |
Air Blower | Bruker Biospin | BCU-II, -80/60 | Air chiller unit used in conjunction with the probe's heating coil to regulate temperature inside the magnet bore |
Gradient Chiller | Thermo Scientific | Neslab Merlin M33 | Water chiller used to disipate heat generated by the gradient coils |