Summary
בפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה שבה משתמשים ניתן לתחזק הכדאיות של ההכנות חריפה פרוסה בהיפוקמפוס, בקליפת המוח במהלך איסוף של נתונים מיקרוסקופ תהודה מגנטית.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר את ההליכים הנחוצים כדי לתמוך פונקציות מטבוליות נורמלית של המוח חריפה פרוסה ההכנות במהלך איסוף של נתונים מיקרוסקופ תהודה מגנטית (MR). אמנם זה ניתן לבצע מר אוספים על רקמות בתרבית של חי, נכרת, ניסויים אלה באופן מסורתי יש היה מוגבל בשל מגבלות רזולוציה, ולכן אינם מסוגלים להמחיש רקמות מיקרו. לעומת זאת, פרוטוקולים של מר להשיג רזולוציה של תמונה מיקרוסקופית נדרש שימוש קבוע דוגמאות כדי להתאים את הצורך תנאים סטטיים, משתנה על פי הסריקה ממושך. בפרוטוקול הנוכחי מתאר את השיטה מר זמין הראשונה המאפשרת הדמיה של דגימות רקמה חי, יונקים ברזולוציות מיקרוסקופיים. נתונים מסוג זה הוא בעל חשיבות רבה להבנת איך מבוסס על פתולוגיה ניגודיות שינויים המתרחשים ההשפעה ברמה מיקרוסקופית התוכן של סריקות מר מאקרוסקופית כגון אלה להשתמש במרפאה. פעם אחת כזו הבנה זה יתממש, שיטות אבחון עם יותר רגישות ודיוק יכול להיות מפותח, אשר יתרגם טיפול מוקדם יותר של המחלה, מעקב אחר טיפול מדויק יותר של תוצאות משופרות.
בעוד המתודולוגיה המתוארת מתמקד המוח פרוסה ההכנות, הפרוטוקול לסגלה כל פרוסה רקמת נכרת לאור העובדה שינויים ההכנות והגז perfusate כדי להתאים לצרכים מטבוליים הספציפיים של הרקמה. ביצוע מוצלח של הפרוטוקול צריך לגרום ההכנות פרוסה חי, חריפה, כי התערוכה מר דיפוזיה אות יציבות לתקופות 15.5 h. היתרונות העיקריים של המערכת הנוכחית מעל אחרים שההדרכה זלוף תואם מר הם התאימות שלו עם מר מיקרוסקופ החומרה הדרושה כדי להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה יותר ויכולת לספק זרימה קבועה, ללא הפרעה עם בזהירות תנאים perfusate מוסדרים. תפוקת מדגם מופחת הוא שיקול עם העיצוב הזה כמו פרוסה אחת בלבד רקמות עשויה לדימות בכל פעם.
Introduction
כמו מערכות תהודה מגנטית (MRI) התקדמו בהתמדה כדי שדה גבוהה פעם החוזק, פרטים נוספים על הרכב ואת המצב של רקמות החי הפכו ניכרת. למרות ההתקדמות חומרה כזו, מר הדמיה ברזולוציות מספיק כדי להמחיש את המבנים התאיים של רקמות היא עדיין אינה זמינה במרפאה. כתוצאה מכך, מאפייני הסלולר ברמת רקמות חייב מהמשמעת כאשר בוחנים את התוכן של סריקות קליניים. היסק כזה דורש ידע של תהליכים המקביל שלוקט נתונים על מערכות מודל אשר יכול להיות שנצפו ישירות. באופן מסורתי, מודלים אלה כללו תאים של אורגניזמים ימיים כגון צפרדע רפואית זריזה oocyte ו Aplysia קליפורניה L7 נוירון1,2. אלה היו בין תאי בעלי חיים הראשון זמין עבור תצפית עם מר שיטות עקב גודלם אופיינית גדולה: כ 1000 μm ואת קוטר 300 μm, בהתאמה. לאחרונה, התקדמות בעיצוב החומרה אפשרו לאחת הדוגמאות הגדול של תאי יונקים — α-מוטור נוירון — לדימות באמצעות טכניקות במיקרוסקופ מר על רקמות קבוע3,4. בעוד מחקרים אלו הראו פריט חזותי ישיר של יונקים חומר הסלולר באמצעות מר, הדגימות קבועים המועסקים נבדלים באופן משמעותי תכונותיהם מר מרקמות בשידור חי, ולכן לא יכולה לשמש מודל נציג שווי ערך5, 6. חשוב יותר, התבוננות מר ניגודיות שינויים המתרחשים בתאום עם תהליכים ביולוגיים מורכבים דורשת דגימות חיים זה יכול להיות מוטרד שנמדד במהלך הניסוי הדמיה.
כדי להקל על מר מחקרים מיקרוסקופ על רקמות החי, מוצג פרוטוקול הכולל חומרה microimaging מסחרי7 לממשק בנוי למטרה, מר תואם, ב נשא oxygenator של המכשיר זלוף שתואר קודם לכן8 . היתרונות הייחודיים של עיצוב זה לכלול הסלולר ברמת רזולוציה יכולות בתרבית של רקמות, דיוק שליטה על גזים מומסים תוכן ו- pH באתר של רקמות זלוף. כמו כן, בניגוד לרוב לימודים מר explant להפריע זלוף במהלך ייבוא תמונות כדי למנוע זרימה חפצי אמנות, עיצוב זה תומך בשימוש זלוף רציפה במהלך איסוף נתונים אשר הוכח לשפר את מצבם פיזיולוגיים של מבודדים רקמות9,10. לבסוף, שלה סגור הקלטה קאמרית ושמירה פרוסה חומרה סיוע בהקטנת הסבירות בחפצים תנועה אחרת יכול להתרחש במהלך ממושכת אוסף תמונה.
בעוד בפרוטוקול הנוכחי מתאר הליכים המתאים לשימוש עם פרוסות בהיפוקמפוס ואת קורטיקלית חריפה, שליטה מדויקת perfusate מטבוליטים מאפשר מערכת זו להתאים מגוון רחב של סוגי רקמות מגוונות ותנאי ניסיוני. מגבלות של עיצוב זה כוללות הפחתה מדגם התפוקה לעומת קאמרית פרוסה רב זלוף11; עם זאת, מגבלה זו עשויה להתגבר בעתיד השימוש במערכים רב סליל.
בעוד המערכת המתוארת יוכל להיות מועסק בתצורות אופקי או אנכי, בפרוטוקול הנוכחי כולל גם השימוש בו שכיוונו אנכי, ספקטרומטר 600 מגה-הרץ. כל מערכת מסוגל מר microimaging מחקרים — בדרך כלל צר נשא (≤6 ס מ), שדה גבוה (≥500 MHz) ספקטרומטרים — יהיה להתאים את הציוד oxygenator זלוף המתואר. עם זאת, שינויים הסליל הדמיה, מעבר צבע, מערכת בדיקה או חומרה הדמיה חיוניים אחרים המועסקים עשויים להצריך שינויים ל מר סריקה פרמטרים וציוד זלוף.
Protocol
כל הניסויים המתוארים עקוב אחר ההנחיות שנקבעו ה-National Academies למדעי ' מדריך הטיפול ואת השימוש של חיות מעבדה, היו נבדקו ואושרו על-ידי באוניברסיטת פלורידה ' s טיפול בבעלי חיים המוסדית והוועדה שימוש (IACUC). פעל בהתאם לכל הכללים והתקנות כאשר וישתתפו ניסויים בבעלי חיים-
1. הכנה של Perfusate עבור תחזוקה של מערכת העצבים המרכזית רקמות
- להכין טרי נוזל מוחי שדרתי מלאכותי (כלנית חדד).
- ייצור 2 ל' של חנה המבר באגירה ביקרבונט perfusate, למדוד את 1500 מ ל מים מטוהרים על ידי כפול זיקוק או אוסמוזה הפוכה לתוך בקבוקון 4 L. מניחים פס מגנטי מערבבים הבקבוק, להתסיס את הנוזל בעזרת צלחת למהומה.
- למים מטוהרים, לפזר את הכמויות הבאות של מלחי: g 14.03 (120 מ"מ) נתרן כלורי, 4.37 גרם (26 מ מ) סודיום ביקרבונט, g 0.41 (1.5 מ מ) monobasic אשלגן פוספט, heptahydrate מגנזיום גופרתי 0.69 g (1.4 מ מ), סידן 0.59 אינצ g (2 מ מ) כלוריד וגופרית והרכבו, 0.45 g (3 מ"מ) אשלגן כלורי, גלוקוז 3.6 גרם (10 מ מ)-
הערה: תכולת הכימית perfusate יהיו שונים בהתאם לדרישות מטבולי ספציפי הרקמה ואת התנאים הרצויים של הניסוי- - מערבבים פתרון זה ביסודיות עד מלחי כל יש מומס. להתאים את אמצעי האחסון כדי 2 ל' באמצעות מים מטוהרים נוספים-
- לבדוק את osmolality של חנה המבר באמצעות osmometer דיכאון של נקודת הקיפאון. התאם ל-300 משתמשים בסורביטול mOsm/kg. תוספת של בסורביטול 324 מ ג לליטר 2 299 mOsm/kg כלנית חדד perfusate יגדל osmolality כדי mOsm 300/ק"ג (כ 1 mOsm לכל 324 מ ג).
הערה: חנה המבר שניתן לאחסן ב 4 ° C בבקבוק, אטום לאוויר במשך תקופה לא יעלה על 24 ח'
2. הגדרת מערכת זלוף
- להכין את perfusate חנה המבר.
- Equilibrate חנה המבר לטמפרטורת הסביבה (~ 23 ° C) בעת ההמתה עם carbogen 95% (95% או 2, 5% CO 2; 1/16 L/min) באמצעות מבעבעים ישירה על לא פחות מ 1 ח'
הערה: סוגי רקמות שונות או תנאים ניסיוני הרצוי עשוי לדרוש התאמה של התכנים בטמפרטורה או גז perfusate. יכול להיות נשלט את התנאים הרצויים עבור גזים מומסים בתוכן perfusate דווקא על ידי שינוי הריכוזים אחוז של רכיבים בודדים של הגז האספקה ( איור 1). - , ברגע כלנית חדד מגיע טמפרטורה נדרשת, רוויה carbogen, לאשר ה-pH בטווח פיזיולוגיים (7.3-7.4). להמשיך בועות גז ישירות לתוך המאגר perfusate (L-1/16/דקה) לאורך כל הקורס של ניסוי על מנת לשמור על נאות התפרקה חמצן תוכן ותנאי pH מסיע את חילוף החומרים של רקמה בריאה.
- Equilibrate חנה המבר לטמפרטורת הסביבה (~ 23 ° C) בעת ההמתה עם carbogen 95% (95% או 2, 5% CO 2; 1/16 L/min) באמצעות מבעבעים ישירה על לא פחות מ 1 ח'
- פריים הקווים זלוף.
- Submerge כניסת הצינור מחובר המיקרו-משאבת סחרור לתוך מוכן כלנית חדד (300 mOsm, pH 7.3-7.4, ברציפות בגז).
- פאס oxygenator המכשיר ( איור 2) וקווים זלוף משני המגנט נשא, סליל הדרגתיות מחסנית (מלמעלה למטה) ולהגדיר את הגלילים הצידה עד בדיקה הרכבה. לתלות את oxygenator מעל גביע לתפוס כל למטעי חנה המבר.
הערה: בהתאם לעיצוב מערכת MRI, זלוף קווים ייתכן שיהיה עליך לעבור דרך נשא מגנט, סלילי מעבר צבע או בדיקה בגוף הבסיס לפני הטרמה המערכת עם חנה המבר. לאשר את מיקום קו זלוף לא יפריעו מכלול של גוף המכשיר או ההכנסה של המכשיר לתוך נשא לפני תחילת ההליך לקרקע. - לאשר את קצב הזרימה המיועד (2 mL/min) נבחרה ולהתחיל למלא את השורות זלוף על ידי מיתוג על המשאבה.
- להפוך את מלכודת בועות ריקות, בשורה כך חנה המבר יתפוס את מקומו של האוויר בתוך.
- לחבר את oxygenator ' s גז יציאת מקור השני של carbogen (של יריעה או צילינדר carbogen משניים) ולקבוע את קצב זרימה של L-1/16 לדקה
- לאשר את carbogen זורם מעל oxygenator ' s קרום חילופי גז בטבילת יציאת הפליטה מעל oxygenator לתוך המים.
- ברגע חנה המבר מזוהה נוטפים תא זלוף, לטהר בועות גז גלוי משורות תזרים על ידי עצבנות ידנית.
- לאשר oxygenator פועל כראוי על-ידי השוקע האלקטרודה חמצן ב חנה המבר זורם מן החדר זלוף.
הערה: קראת את מד חמצן צריך משוער את אחוז החמצן הנכלל הגז שסופקו.
3. הכנת הרקמה
- המתת חסד
- המקום חולדה (125-150 גרם) לתוך התא אינדוקציה של מכונת הרדמה, וחושפים לאיזופלוריין 4% ב נושאת חמצן גז בקצב של 1 ליטר/דקה עבור 4 דק.
- להסיר את העכברוש חסר הכרה מן החדר הרדמה.
- לבצע בדיקת רפלקס שקמה בעצמה אחרי שמפילים על-ידי הצבת העכבר במצב פרקדן. בדוק כל תנועות — ראש מפנה, הרמת הרגל, עמוד השדרה, כיפוף, וכו ' — מצביע כי החיה הוא פונה אל הבטן שלו.
- לבצע מבחן למצמץ רפלקסיבי על-ידי נגיעה העין פתוחה של החיה באמצעות מקלון צמר גפן. בדוק כל תגובה — מכסה סגירה, רעד שרירי, וכו ' — על הקלט החושי הזה.
- לבסוף, ביצוע האיבר-לסגת בדיקת רפלקס על ידי התכווצות העור בין האצבעות של העכברוש ' s מתוחות הרגל האחורית באמצעות פינצטה או ועוצרי דימום. בדוק אם כיפוף של ברגל
הערה: במקרה של תוצאה חיובית רפלקסיבי, אל תמשיך עם המתת חסד- - בכל מקרה שבו אחת מהבדיקות רפלקס שלושה מעורר תגובה, להחזיר את החולדה באופן מיידי לחדר הרדמה ולאפשר 2 דקות נוספות של חשיפה לאיזופלוריין 4%-
- לבצע את כל הבדיקות רפלקסיבי שלוש מעל בשלמותם. חזור על החשיפה הרדמה 2 דקות לפי הצורך והמשך רק לאחר חוסר מוחלט בתגובה כל שלוש בדיקות רפלקסיבי נצפתה.
- המתת חסד העכברוש באמצעות הגיליוטינה עריפת ראש.
- המוח כריתה
- להסיר את מוח עכברוש על ידי דיסקציה ברוטו. להתחיל עם הראש במצב שכיבה. בעזרת מספריים, rostrally לחתוך העור מן הצד האחורי של הצוואר האף ולחשוף את הגולגולת.
- להסיר רקמות רכות מפני השטח של הגולגולת גשש בוטה.
- עובדים מהקצה סימטרית, להסיר את העורף הקודקודית, חזיתי עצמות הגולגולת באמצעות rongeurs.
- משכי השכבה הקשה של המוח על ידי חיתוך לאורך פיסורה האורך עם מספריים מיקרו ולאחר מקלפת את השכבה של שתי ההמיספרות.
- להסיר במוח הגולגולת על-ידי הפעלת הראש למיקום פרקדן ניתוק עצבי בצד הגחוני.
- פרוסה בידוד
- לחזור המוח בשכיבה, לבודד את החלק המרכזי המכילה ההיפוקמפוס על-ידי הסרת כל רקמות סימטרית פיסורה רוחבי, rostral כדי fimbria. להכין שני חתכים לאורך המטוס רוחבי (קרי הילתית פרוסות) עם תער ישרים.
- מוספית המוח ' s המטוס סימטרית ביותר למרכז אמבטיה חיתוך vibratome באמצעות דבק cyanoacrylate.
- להוסיף קר כקרח, carbogen מבעבע חנה המבר לאמבטיה חיתוך vibratome ומניחים את החומרה השמירה ניילון בתוך.
- 300 לחתוך פרוסות עבה μm להשיג 3 או 4 ההכנות שמיש פרוסה לכל האונה (סה כ 6-8).
- לבודד של ההיפוקמפוס או סעיף קורטיקלית ההמיספרות ולחיתוך הפרוסה כך שיתאים לגודל microcoil ' s 5 מ מ בקוטר רקמות טוב.
4. לטעום את המיקום ואת מכלול המערכת זלוף
- סליל הכנה
- מילוי microcoil ' s רקמות קאמרית עם חנה המבר מחומצן מ vibratome ' s חיתוך אמבט באמצעות פיפטה העברה של.
- שייקח. את המוח החתוך ומקם את האזור של הריבית (למשל. שכבת תאים כפירמידה) מעל microcoil באמצעות טווח ויבתר.
- הכנס את ההתקן השמירה של רקמות (רשת ניילון נטו למוט מכונת כביסה ניילון) כדי לשמור על מיקום הדגימה לאורך כל הניסוי הדמיה-
הערה: להמשיך במהירות באמצעות המדגם מיצוב הליך כדי למזער חשיפה לאור חזק. לספק חנה המבר מחומצן נוספים לפי הצורך באמצעות פיפטה העברה של.
- בהרכבת ב נשא oxygenator, microcoil, בדיקה
- המאבטחים את מכלול microcoil שונה ( איור 3) בהשולחן מלחציים, ולהצמיד את המכשיר ב נשא oxygenator על-ידי הוספת אצטל פג תמיכה לתוך החור על גבי הסליל.
- לאטום את המערכת זלוף על-ידי הצבת תא זלוף מעל microcoil ' s רקמות טוב, cinching השניים יחדיו באמצעות עניבה כבל מיניאטורי.
- לקצץ את אורך עודף של העניבה בכבלים באמצעות מספרי התיל.
הערה: בעת איטום מוצלח, perfusate להתייחס יציאה דרך קווי זרימה החוצה, אין נזילה צריך להיות ברור סביב החותם סיליקון לשכת זלוף. כשל כדי לאשר את התנאים האלה לפני ההרכבה בדיקה יכול לגרום נזק חמור הדמיה חומרה. - ברגע כלנית חדד ניתן לראות מטפטף לתוך המאגר פסולת, לקחת את microcoil ואת oxygenator ולצרף את מכלול לחלק העליון של הגוף בדיקה הדמיה-
- שקופיות הערימה מעבר צבע על פני מכלול, מושב מעבר הצבע על גבי המכשיר. תצלומים המפרט את המיקום היחסי ואת חיבור תקין של סליל, רכיבי חומרה oxygenator, בדיקה מסופקים ( איור 4).
5. מבצע את אוסף תמונות של מר
- Inserting נשא את החללית התאספו לתוך המגנט
- מקום בגוף המכשיר בסמיכות ספקטרומטר נשא את הפתח בתחתית של המגנט.
- . משכי את אורך קווי זלוף דרך נשא פתיחת בחלק העליון של המגנט עודף.
- לאחר כל מרווח זמין נלקח מן הקווים זלוף, מראש לגוף החללית אל המגנט נשא בבסיס בעת בו-זמנית הסרת מרווח יותר מן הקווים זלוף מהחלק העליון של נשא.
- לשרשר את שני הברגים ההידוק בבסיס של המכשיר לתוך החריצים המתאימים של הערימה shim.
- לפני שתמשיך, בדוק כי קווי זלוף היו לא צבט או לפגוע במהלך הכניסה בדיקה על-ידי המאשר יצוא כלנית חדד לתוך המאגר פסולת.
הערה: כשל לאשר perfusate יצוא יכול לגרום נזק בלתי הפיך זלוף קווים והסיכונים נזק קטסטרופלי ומר הדמיה חומרה. - במקרה perfusate לא נתפסת יציאה שורת ההחזרה לתוך המאגר פסולת, להסיר את הגוף בדיקה, לאשר כי זרימת perfusate החל מחדש לפני שתנסה reinsertion. פריסה סכמטי של ספקטרומטר ומערכת הדמיה זלוף שהורכב היה שתואר לעיל 8.
- חיבור הגוף בדיקה
- לצרף את תזרים וקווי מים יצוא מ chiller מעבר צבע.
- להפעיל את המשאבה עבור chiller הדרגתיות, לאשר את הגדרת טמפרטורת המים (19 ° C).
- לצרף את צינור האוויר מיחידת chiller אוויר לגוף המכשיר בעזרת מהדק צינור.
- סובב את הזרימה על יחידת chiller אוויר " 1 " עמדה.
- לצרף את החוט צמד תרמי לגוף החללית.
- חבר את כבל קואקסיאלי מ preamp תדר רדיו (RF) קלט/פלט על הגוף בדיקה ' ערוץ פרוטון (H) s.
- לצרף את כבל החשמל של מגברים הדרגה לגוף החללית.
- בתוך ה RF, מארון להפעיל את הכוח יחידת פיצוי B0, כל מגברים הדרגתיות שלוש (x, y, z), את היחידה הראשית
- מכין את ספקטרומטר
- לקבוע את הטמפרטורה נשא המיועד בעזרת המודול התאמת הטמפרטורה משתנה במסוף.
- לתאום (עכבה), לכוון מעגל (תדירות) הגג על ידי התאמת של קבלים משתנים בתוך החללית. מטרה זו מושגת על-ידי מניפולציה אביא את מטות הקסם בבסיס של הגוף בדיקה.
- להתאים את ההגדרות הנוכחיות ספקטרומטר ' s סלילי הגבהה כדי למקסם את אחידות השדה המגנטי ב המדגם.
- להתחיל אוסף תמונה
- לאסוף תמונות פיילוט כדי לקבוע המיקום המרחבי של דגימת בתוך המגנט נשא. טיפוסי פרמטרים עבור שני אקו מעבר צבע תלת-ממדי הם כדלקמן (TR/טה = 100/4 ms, ממוצעים = 1, הדופק זווית = 30 o, זמן = מטריקס שנייה, 6 = 64 x 64, שדה ראייה = 0.3 x 0.3 ס"מ, רזולוציה = 47 x 47 μm).
- לאסוף את הטייסים משוקלל דיפוזיה כדי לאשר את מיקום הגיאומטריה ורקמות סריקה נכונה אם ישים. טיפוסי פרמטרים עבור שני סריקה תלת-ממדי משוקלל דיפוזיה טייס הם כדלקמן (TR/טה = 2000/11.6 ms, זמן = 4.3 דקות, Δ = 6 מילי-שניות, אלפא = 1 ms, ממוצעים = 1, b = 1200 (1860 יעיל) מ"מ/s 2, מטריקס = 64 x 64, שדה ראייה = 0.2 x 0.2 ס מ רזולוציה = 31 μm).
- לאסוף סדרה משוקלל דיפוזיה זמן כדי לקבוע מאפייני יציבות ההכנה חריפה פרוסה. טיפוסי פרמטרים עבור תמונת משוקלל דיפוזיה ממדי שני הם כדלקמן (TR/טה = 2000/11.6 ms, זמן = 1.5 h, Δ = 6 מילי-שניות, אלפא = 1 ms, ממוצעים = 42, b = 1200 מ"מ/s 2, מטריקס = 64 x 64, שדה ראייה = 0.2 x 0.2 ס"מ, רזולוציה = 31 μm). הערה: אפיון יציבות של מערכת נתונה ישתנו מן הפרוטוקול המתואר תלוי בגורמים כגון מר הניגוד המועסקים (למשל T1, T2, דיפוזיה, רגישות), את ההפרעות הפיזית למדה, ואת השינוי אות מר ליחידת זמן הנובע אמר ההפרעות.
Representative Results
הכנה Perfusate
על עבודה מוצלחת של המכשיר ב נשא חמצון, גזים נוכח carbogen שסופקו תגיע 100% תנאים רוויה בתוך perfusate חנה המבר. זה ניתן להדגים על ידי משתנה ריכוז החמצן של הגז שסופקו ומדידת השינוי חמצן מומס בתוכן perfusate חנה המבר בתוך תא זלוף באמצעות חמצן מטר (איור 1)8. על פי חוק הנרי, כמות גז מומס זה בשיווי משקל עם דגימת נוזל היא ביחס ישר לחץ חלקי של הגז ובלבד הטמפרטורה נשארת קבועה12. באמצעות תקנים גז זה ידע ודיוק, זה אפשרי לכמת את כמות החמצן המומס הנכלל דוגמה חנה המבר כמתואר. זו מושגת על ידי כיול מד חמצן באמצעות פתרונות רוויים (מבעבע ישירות עבור 1 h או יותר) של חנה המבר נחשפים גזים של הרכב ידוע: גז אחד עם ריכוז חמצן גבוהה כגון carbogen (95% O2) ועוד עם חמצן נמוך ריכוז כגון חנקן (0% O2). לאחר מכן, ניתן לקחת מדידות על ידי השוקע קצה האלקטרודה חמצן לתוך מדגם. אישור כי oxygenator ב נשא תקין יכולה להיות מושגת על ידי מדידת למסקנות מ זלוף טוב. אחוז החמצן המומס נמדדת על ידי מד חמצן צריך להתאים את אחוז ריכוז חמצן נשא את אספקת הגז. אם נמדד בערכים נמוכים יותר מאלו של אספקת הדלק, זה הייתי מציע כשל חומרה זה עלול להוביל אי ספיקה חילוף החומרים בתוך הפרוסה רקמות.
דוגמה המראה וההתנהגות
ההכנות חריפה פרוסה המקבלים זלוף די מספיק כדי לספק את הצורך מטבוליטים, לסחוף פסולת מטבולית בקרוב להגיע למצב של יציבות יחסית. מנקודה זו, ניתן יהיה נתון פרוסות חריפה ההפרעות חיצוני, ניתן למדוד את התגובות שלהם שינויים אלה למחקר מדעי. לניסויים מר, מעקב אחר האות עניין לאורך זמן הוא מנהג נפוץ כדי להדגים את היציבות היחסית של ההכנות חריפה פרוסה13. האות משוקלל דיפוזיה רגישה במיוחד לשינויים מים ניידות של רקמה, תוכן, הפצה, כפי ניתן להערכה על ידי שימוש זה מנגנון הניגודיות לזהות infarcts שבץ איסכמי14,15. התוויית האות דיפוזיה מנורמל לאורך זמן בפרוסות קורטיקלית חריפה מתוחזקים תחת מגוון תנאים זלוף מדגים יחסית יציבות (2 ± 3% מ 15.5 h) לאחר בידוד הרקמות מושגת (איור 5). דיפוזיה אות יציבות נשמר ללא קשר לתנאים זלוף (רציף או לסירוגין) או אורך סריקת MRI (קצר [4 דקות] או מספר ארוך [1.5 h])8. אם פרוסות לא מוצג אות יציבות לאורך זמן, כגון העלייה אות חדה דיפוזיה נצפו בקליפת חיים זה לא קיבל זלוף, זה מרמז מהתנאים ניסיוני שיוצרת. פרטורבציה ניסויים צריך לא להיות ניסיון לפני אישור של האות יציב תנאים בהכנות פרוסה.
בנוסף האות יציבות, מיקום הדגימה הנכונה יש לאשר בזמנו של אוסף תמונות. אף-על-פי מיקום הדגימה נשלטת במהלך הצבתן רקמות המיקרוסקופ ויבתר, משמרות בעמדה הדגימה עלולה להתרחש במהלך ההרכבה של המנגנון זלוף, או עקב טיפול אגרסיבי של סליל או בדיקה לפני הכניסה לתוך המגנט. אישור על השמה בהיפוקמפוס נכונה יכולה להיות מושגת על ידי איסוף קצר (2 דקות), טייס סריקות עם ניגודיות דיפוזיה (איור 6). מכיוון השכבה תא כפירמידה רגיש כדי פיזור אחיד יותר שנבזזו בהיפוקמפוס סמוכים, מבנה זה יופיע בתור להקה כהה יותר בתמונות משוקלל דיפוזיה. כיוונוני שאינם מציגים תכונה אופיינית זו מכיל דגימות מחוץ למרכז, כדי להיות חוזרות ונשנות.
איור 1: התפרקה תכולת החמצן של כלנית חדד perfusate כפונקציה של אחוז O תוכן2 גז המסופק. Carbogen תערובות המכילות ריכוזים משתנים של חמצן (95%, 60% ו- 19%) מועסקים אספקת גז. קריאות אחוז חמצן מומס ואז שנלקחו זלוף ובכן, לעומת שני פקדים מוכרים: מאגר perfusate מבעבע ישירות עם carbogen (95% O2), מאגר perfusate נחשפים תנאים אטמוספיריים (23% O2 ). בכל מקרה, אחוז חמצן באתר של רקמות זלוף גישות 100% ריכוז2 O בתוך התערובת carbogen בשימוש. קווי שגיאה שווים ל סטיית התקן של המדגם. איור לשכפל בהיתר המקורי בסעיף8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: הסכימטי לשכת oxygenator זלוף ב נשא. השרטוט מציג רכיבי עיצוב מפורט אחראי על הפונקציה של התקנים קריטיים אלה. Perfusate טריים זה יש כבר שאוב באמצעות מלכודת בועות מזין את oxygenator דרך החלק העליון של צינור NMR 10 מ מ. בעשותו כן, זה המעברים לתוך גז מאוד חדיר סיליקון אבובים (מקטע כחול) זה כרוך סביב צינור 5 מ"מ NMR שראשי, מקונן בתוך. Carbogen גז המסופק דרך החלק העליון של הצינור 5 מ מ נכנס לתא דרך התחתון פתוח, עובר לאורך צינור סיליקון מפותל לפני היציאה את oxygenator דרך חור פתח מכסה הצינורית 10 מ מ. במהלך חשיפה זו, perfusate זורם דרך הצינור סיליקון יהיה רווי הרכיבים הכימיים של תערובת הדלק המסופק. בעת היציאה של oxygenator, perfusate עובר ישירות אל החדר זלוף לפני הזנת שורת ההחזרה המוביל אל מאגר ומפקחת. רכיבים אחרים קריטי זה עיצוב כוללים את פג תמיכה אצטל אשר מאפשר את oxygenator לעמוד אנכית על גבי microcoil RF ששונה, דסקית סיליקון (טבעת האדומה) המהווה את החותם נוזל חזק בין זלוף תא של oxygenator ו הרקמות של microcoil היטב, ואת הכבל עניבה חריץ המאפשר פעולה השמה של תיקו כבל משמש כדי ליצור את החותם הפיך. איור זה יש לשנות, לשכפל בהיתר המקורי בסעיף8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: שינויים מכלול microcoil המתירים ממשק ל oxygenator ב נשא. שני חריצים 3.0 מ"מ x 1.5 מ"מ (חיצים שחורים) נחתכו לתוך הצד של מכלול להכיל את הרוחב של עניבה כבל המשמש כדי לאטום את התא זלוף ערוץ (15 מ מ x 3 מ מ x 4 מ מ) מקשר את מטעי פני גב של הסליל. שני חללים ניילון להציב הצדדים של חוק הערוץ (חצים אדומים) כמו מציאה עבור כבל עניבה הראש אשר מקלה על ההליך איטום. קדח חור (2 מ מ x 14 מ מ) בחלק העליון של מכלול סליל (בעיבוד צהוב. אוו) צירופים כדי אצטל תומך פג כדי לאבטח את oxygenator. איור זה יש לשנות, לשכפל בהיתר המקורי בסעיף8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: צילום מונטאז המפרט את המיקום היחסי ואת הרכבה נכונה של microcoil, oxygenator ורכיבים בדיקה. תמונות אלה כוללים רכיבי מפתח החומרה של המכשיר ב נשא oxygenator ו- microperfusion, להמחיש כמה חלקים נפרדים ממשק אחד עם השני. (א) תצוגה מורחבת צילום מציג את המיקום היחסי של כל הרכיבים לפני איטום טוב של הרקמה או מכלול של גוף המכשיר. הוקדשה כדי להציג את המיקום היחסי של החלקים באופן מדויק; עם זאת, מקטע של הקווים זלוף יש כבר חזרו בסדרה זו כך כל הרכיבים מתאימים בתוך מסגרת תמונה. (1 = בדיקה הראש, 2 = microcoil הרכבה, 3 = ניילון רקמות השמירה טבעת, 4 = זלוף, 5 = כבל עניבה, 6 = ב נשא oxygenator, 7 = סלילי הדרגתיות, 8 = מלכודת בועות). רכיבים (B) בעקבות הרכבה coil ו oxygenator. בתמונה זו, הושם הטבעת השמירה ניילון בתוך טוב של microcoil רקמות כדי לאבטח מדגם. תמיכה אצטל המקל על בסיס oxygenator אובטח לחור המתאים מעל microcoil. האטם סיליקון בסוף זלוף פתוח ובכן הושם על הבאר רקמות, עניבה כבל הודקה סביב רכיבים אלה כדי לאטום את התא זלוף. לבסוף, הבסיס של microcoil חובר לחלק העליון של הראש בדיקה. (ג) רכיבי בעקבות בדיקה הרכבה. בחלונית ' האחרון, אורך עודף מ אזיקון קיטום מיושרות עם microcoil. הערימה סליל הדרגתיות מכן החליקה למקומו על ידי קידום בקפידה את הצילינדר לעבר החללית תוך העברת קווי העודפים זלוף, oxygenator, microcoil דרך המרכז חלול שלו. ברגע מעברי הצבע מחוברים בראש המכשיר, הם מוחזקים במקום על ידי דופקת את הקולר ההידוק על החללית הבסיס תהליכים של מעברי הצבע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: דיפוזיה יציבות אות בפרוסות קורטיקלית חריפה superfused. (א) Normalized דיפוזיה אות הערכים ארבע פרוסות חריפה נתון פרדיגמות שונות superfusion מותוות לאורך זמן לתקופה של עד 21.5 h בעקבות המתת חסד. פרוסות להישאר בגבולות ± 5% המדידה האות שלהם דיפוזיה הראשונית לתקופה של 15.5 h בעקבות המתת חסד ללא קשר אם superfusion רציף או לסירוגין, עצמאית של אורך הסריקה מר (1.5 שעות או 4 דקות). הקלטות אות שנלקחו קליפת פורמלדהיד-קבועה לשמש הפקד חיובי (n = 1) ליציבות בשל אופיו סטטי, משתנה של דגימות רקמה קבוע. לעומת זאת, דיפוזיה האות נמדד פרוסה חיה נעדרת תמיכה superfusion (n = 1) משמש פקד עבור מטבולי לקוי. ניסוי פרמטרים של הניסויים superfusion שונים הם כדלקמן: רציף (superfusion תמיד בזמן, לכל סריקה = 1.5 h), לסרוגין (superfusion על 10 דקות מרווח בין הסריקות, זמן לכל סריקה = 1.5 h) רב מרווח, זמן הסריקה (superfusion- במהלך סריקה, אבל מושהה למשך 10 דקות בין הסריקות, זמן לכל סריקה = 1.5 h), מרווח זמן ארוך, קצר סריקה (superfusion-עבור 1.5 h מרווח בין הסריקות, זמן לכל סריקה = 4 דקות). (B) Analyzed נתונים בסה כ מציג קבוצה פירושה של הניסויים פרוסות live superfusion ארבעה מלוח (א). פעפוע לסמן פרופיל מן המקובץ, פרוסות קורטיקליים superfused תערוכות גרסא חדשה לאורך זמן (2 ± 3% מ 15.5 h) ואילו הפקד ללא perfused (n = 1) נספחים אות דרמטי יציבות בתחילת הניסוי (15% מאת 6.5 h). איור זה יש לשנות, לשכפל בהיתר המקורי בסעיף8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: אישור דרגת פרוסה בהיפוקמפוס במהלך דימות טייס. לפני הפעלת מר מורחבת הפעלת מיקרוסקופ, הנכון השמה של המדגם היא קריטית כדי להבטיח משאבים כגון סורק זמן יקר perfusate תוספים לא יתבזבזו. שכבת תאים כפירמידה CA1 באזור ההיפוקמפוס להיות visualized בדקות מהר יותר (4.3), להוריד את הרזולוציה (31 μm x 31 μm בתוך המטוס) סריקות פיילוט כדי להבטיח הרקמה עניין הוכנסה כהלכה, ביחס המיקרו-הסליל. סריקה פרמטרים משותפים גם תמונות הם כדלקמן: TR/טה = 2000/11.6 ms, Δ = 6 מילי-שניות, אלפא = 1 ms, ממוצעים = 1. (א) b = 0 (227 יעיל) מ"מ/s2. ב סריקה ראשונית זו, pyramidale הרובד מוצגת רק כמו סוס אפור, הלהקה אלכסוני במרכז עירור פרופיל של הסליל. B (B) = 1200 (1,860 יעיל) מ"מ/s2. -דיפוזיה גבוהה יותר חדות ניפוח, interlamellar מגביר שכבת תאים כפירמידה הופך כהה יותר רקמות סחוס סמוכים (לעיל: הרובד oriens; להלן: הרובד radiatum). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
בפרוטוקול הנוכחי מתאר את ההליכים הדרושים לתחזוקה מטבולית סטנדרטי של המוח חריפה פרוסה ההכנות שעברו מיקרוסקופ תהודה מגנטית. ההליך זה השיטה היחידה זמין כעת המאפשר ויזואליזציה של רקמות בתרבית של החיים עם מר ברזולוציות מסוגל לפתור תאים. בעוד perfusate בתנאים המתוארים המותאמים במיוחד בשביל לרקמות מערכת העצבים המרכזית, הפרוטוקול לסגלה נרחב בכל צורה של חיים הכנה רקמות באמצעות התאמות של המרכיבים perfusate וגז, כמו גם קצב הזרימה זלוף הטמפרטורה.
הבעיות הנפוצות ביותר נוטים להיות נתקלה במהלך ההליכים המתוארים כוללים את אלה הקשורים כשלים באספקת מטבוליט. משקעים של מלחי סידן יכולה להתרחש בתוך חנה המבר במהלך אי ספיקה לגז בשל כשלים ביקרבונט אגירה מערכת. כל כך פוחת משקעים ניתן לסתום את הקווים זלוף, לגרום נזק חמור חומרה. אם פוחת משקעים מלח הם נצפו על perfusate בעקבות בדיקה הרכבה, הפסקת זרימת זלוף מיד על-ידי ביטול את משאבת סחרור. לאשר נוכחות מספקת רמות נתרן ביקרבונט (4.37 גרם של 2 L) perfusate, CO2 רמות (5.0%) אספקת גז, ואת זרימת הגז carbogen (L-1/16/דקה) לתוך מאגר והן oxygenator. לבסוף, אשר רמות ה-pH התייצבו בטווח פיזיולוגיים (7.3-7.4). בכל מקרה שבו רמות חמצן גז ו- pH עדיין לא מוסדר כראוי, יש להחליף את קרום חילופי גז.
אם פרוסות לא אות יציבות במהלך המיועד ניסיוני הזמן-, תערוכה לאשר כי המרכיבים הכימיים הנכונים נמצאים התערובת כלנית חדד, כי osmolality הנכון (300 mOsm) ו- pH (7.3-7.4) נשמרים. כמו כן, ודא carbogen הגז מסופק מאגר perfusate ו- oxygenator-L-1/16/min. אם שלבים אלה לא פותרות perfusate תנאים, החלפה של קרום חילופי גז מומלץ. אם הרקמה יציבות לא מושגת לאחר פתרון בעיות התנאים perfusate, שקול עידון של פרוטוקול כירורגית עם דגש על צמצום את מרווח הזמן בין יישום הקציר זלוף רקמות.
Disclosures
המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מכוני הבריאות הלאומיים (1R21NS094061-01A1) (1R01EB012874 NIH-01) (S10RR031637), ואת הקרן הלאומית למדע (הסכם שיתופיות מס DMR-1157490) באמצעות מתקן דימות תהודה מגנטית מתקדמת לאומי גבוה שדה מגנטי מעבדה (NHMFL) ו ספקטרוסקופיה (AMRIS) UF, פלורידה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusate Preparation | |||
| Osmette A | Precision Systems Inc. | 5002 | freezing point depression osmometer |
| Stir Plate Type 1000 | Barnstead/Thermodyne | SPA1025B | magnetic stir plate with heating element |
| Accumet Basic pH Meter | Fisher Scientific | AB15 | pH Meter |
| pH Probe | Fisher Scientific | 13-620-AP61 | probe for pH measurement |
| Oxygen Meter | Microelectrodes Inc. | OM-4 | meter for sampling the oxygen content of gasses or the disolved oxygen content of liquid perfusates |
| Oxygen Electrode | Microelectrodes Inc. | MI-730 | microprobe for the oxygen meter |
| Scale | Denver Instrument Co. | A-160 | microscale for weighing chemical components |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slice Preparation | |||
| Lancer Vibratome | Ted Pella Inc. | Series 1000 | vibratory tissue slicer |
| Disecting Microscope | Carl Zeiss Inc. | OPMI 1-FC | tabletop, binocular disecting microscope |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion System | |||
| Masterflex L/S | Cole-Parmer | 7523-50 | peristaltic micro perfusion pump |
| Oxygen Regulators x 2 | Victor Medical | VMG-05LY | device for regulating gas flow |
| e-sized carbogen cylinders x 2 | Airgas | gas tanks containing carbogen gas | |
| in-bore oxygenator | developed in house | device responsible for pH and oxygen regulation in the perfusate | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MR Imaging Hardware | |||
| Micro Surface Coil (200mm dia., modified) | Bruker Biospin | B6371/0001 | four-turn micro (200mm dia) surface-style radiofrequency coil |
| Micro 5 probe body | Bruker Biospin | Z3395 | microimaging probe used in the 600 MHz spectrometer |
| Micro 5 gradient coils | Bruker Biospin | M81111 | gradient coil stack used with micro 5 probe body |
| 600 MHz Spectrometer | Oxford Instruments | superconducting magnet (14.1T) used for MR image generation | |
| Imaging Console | Bruker Biospin | Avance III | support and control hardware including gradient amplifiers, preamps, & workstation used for MR image generation |
| Air Blower | Bruker Biospin | BCU-II, -80/60 | Air chiller unit used in conjunction with the probe's heating coil to regulate temperature inside the magnet bore |
| Gradient Chiller | Thermo Scientific | Neslab Merlin M33 | Water chiller used to disipate heat generated by the gradient coils |
References
- Aguayo, J. B., Blackband, S. J., Schoeniger, J., Mattingly, M. A., Hintermann, M. Nuclear magnetic resonance imaging of a single cell. Nature. 322, 190-191 (1986).
- Schoeniger, J. S., Aiken, N., Hsu, E., Blackband, S. J. Relaxation-time and diffusion NMR microscopy of single neurons. J. Magn. Reson. B. 103, 261-273 (1994).
- Flint, J. J., et al. Magnetic resonance microscopy of mammalian neurons. Neuroimage. 46, 1037-1040 (2009).
- Flint, J. J., et al. Magnetic resonance microscopy of human and porcine neurons and cellular processes. Neuroimage. 60, 1404-1411 (2012).
- Kamman, R. L., Go, K. G., Stomp, G. P., Hulstaert, C. E., Berendsen, H. J. C. Changes of Relaxation times T1 and T2 in rat tissues after biopsy and fixation. Magn. Reson. Imag. 3, 245-250 (1985).
- Shepherd, T. M., Thelwall, P. E., Stanisz, G. J., Blackband, S. J. Aldehyde fixative solutions alter the water relaxation and diffusion properties of nervous tissue. Magn. Reson. Med. 62, 26-34 (2009).
- Massin, C., Boero, G., Vincent, F., Abenhaim, J., Besse, P. -A., Popovic, R. S. High-Q factor RF planar microcoils for micro-scale NMR spectroscopy. Sensor. Actuat. A-Phys. 97, 280-288 (2002).
- Flint, J., Menon, K., Hansen, B., Forder, J., Blackband, S. J. A microperfusion and in-bore oxygenator system designed for magnetic resonance microscopy studies on living tissue explants. Sci. Rep. 5, 18095 (2015).
- Khong, Y. M., et al. Novel intra-tissue perfusion system for culturing thick liver tissue. Tissue Eng. 13 (9), 2345-2356 (2007).
- Schumacher, K., Khong, Y. -M., Chang, S., Ni, J., Sun, W., Yu, H. Perfusion culture improves the maintenance of cultured liver tissue slices. Tissue Eng. 13 (1), 197-205 (2007).
- Shepherd, T. M., Blackband, S. J., Wirth, E. D. Simultaneous diffusion MRI measurements from multiple perfused rat hippocampal slices. Magn. Reson. Med. 48, 565-569 (2002).
- Henry, W. Experiments on the quantity of gases absorbed by water, at different temperatures, and under different pressures. Phil. Trans. R. Soc. Lond. 93, (1803).
- Bui, J. D., Buckley, D. L., Phillips, M. I., Blackband, S. J. Studies of perfused brain slices with MR microscopy. Spatially Resolved Magnetic Resonance. Blümler, P., Blümich, B., Botto, R., Fukushima, E. , Wiley-VCH. 337-343 (1998).
- Moseley, M. E., et al. Early detection of regional cerebral ischemia in cats: Comparison of diffusion- and T2-weighted MRI and spectroscopy. Magn. Reson. Med. 14 (2), 330-346 (1990).
- Moseley, M. E., et al. Diffusion-weighted MR imaging of acute stroke: Correlation with T2-weighted and magnetic susceptibility-enhanced MR imaging in cats. Am. J. Neuroradiol. 11, 423-429 (1990).
