Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Bewertung der Auswirkungen von endokriner Substanzen auf die Entwicklung der Wirbeltiere neuronales Netz-Funktion mit Multi-Elektroden

doi: 10.3791/56300 Published: April 26, 2018

Summary

Belastung durch Umweltgifte kann akut entwickelnde Embryonen auswirken. Endokriner Chemikalien wie Bisphenole bekannt sind, um das Nervensystem beeinträchtigen. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit einem in-vitro- Wirbeltier (Chick Embryo) neuronale Netzwerkmodell, um die funktionellen Auswirkungen der Toxin-Belastung am frühen Embryo zu studieren.

Abstract

BIZ-Phenole, wie BIZ-Phenol A (BPA) und BIZ-Phenol-S (BPS), sind Agenten am meisten benutzt in der Produktion von Kunststoffen und zahlreichen Produkten des täglichen Lebens dadurch. Sie werden als endokrine hormonhemmende Verbindungen (EDC) mit Estradiol-ähnliche Eigenschaften klassifiziert. Langfristiger Exposition gegenüber EDZ, selbst bei niedriger Dosierung wurde mit verschiedenen gesundheitlichen Mängel einschließlich Krebs, Verhaltensstörungen und Unfruchtbarkeit, mit größere Anfälligkeit Entwicklungsstörungen zu frühen Zeiten verbunden. Um die Auswirkungen von BPA auf die Entwicklung der neuronalen Funktion zu untersuchen, haben wir eine in-vitro- neuronalen Netzes abgeleitet aus dem frühen Küken embryonalen Gehirn als Vorbild verwendet. Wir fanden, dass die Exposition gegenüber BPA beeinflusst die Entwicklung der Netzwerkaktivität, speziell Spick Aktivität und Synchronisation. Eine Änderung der Netzwerk-Aktivität ist das entscheidende Bindeglied zwischen dem molekularen Ziel eines Medikamentes oder zusammengesetzte und seine Wirkung auf Verhaltensstörungen Ergebnis. Multi-Elektroden sind nützliche Werkzeuge, um die Auswirkungen von Drogen auf Netzwerk-Aktivität in VitroStudie zunehmend. Es gibt mehrere Systeme auf dem Markt und zwar gibt es Schwankungen in der Anzahl der Elektroden, die Art und Qualität der Elektroden-Array und Analysesoftware, die zugrunde liegenden Grundsätze und die Daten ist dasselbe über die verschiedene Systeme. Obwohl derzeit auf Analyse der zweidimensionalen in-vitro- Kulturen beschränkt, werden diese MEA-Systeme verbessert um in Vivo Netzwerkaktivität in Hirnschnitten zu ermöglichen. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die embryonale Belichtung und Aufzeichnung von neuronalen Netzwerk-Aktivität und Synchronität sowie repräsentative Ergebnisse.

Introduction

4, 4 '-Isopropylidenediphenol, gemeinhin als Bisphenol-A oder BPA, Zusatzstoff Anti-Oxidationsmittel findet in einer Vielzahl von Polycarbonat und Epoxy Harz basierte Produkte reichen von Thermopapier, CDs und zertrümmern Beweis Glas auf der Innenseite der Beschichtung Getränkedosen. Obwohl BPA bekannt wurde, dass eine endokrine hormonhemmende Agent zu sein, der Östrogen1imitiert, haben Studien über die negativen Auswirkungen aufgrund der täglichen lässig Exposition gegenüber BPA vor allem in den letzten 10 – 15 Jahren kommen. Selbst geringe Mengen an BPA-Exposition folgen tiefsten in frühen Entwicklungs-Perioden, einschließlich in der Embryogenese durch Exposition von Müttern2,3. In Utero Belastung von weiblichen Embryonen mit endokriner Chemikalien hat auch mit erhöhter Krankheitsanfälligkeit von vaginalen Brust Krebs4,5verbunden worden. Tierstudien haben gezeigt, dass BPA-Exposition zu atypischen Gehirnstruktur und funktionellen Abnormitäten manifestiert sich in Verhalten6führt. Infolgedessen hat die Verwendung von BPA in kleinen Fläschchen durch die Zulassungsbehörden in Europa und Nordamerika, darunter der FDA verboten. Zur Einhaltung der Vorschriften haben viele Hersteller auf 4, 4'-Sulfonyldiphenol oder Bisphenol-S (BPS) umgestellt. Dass BPA und BPS sind strukturelle Analoga und, dass die jüngsten Berichte vergleichbare Wirksamkeit der BPS in Östrogene Transkription7 zeigten, ist es wichtig, die Toxizität dieser zusammengesetzten verwandten BPA zu studieren.

Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die Auswirkungen von BPA (und andere endokrine Disruptoren) auf Netzwerken von Neuronen, die mit einem Wirbeltier-Modell, die Küken-Embryos zu testen. In-vitro- Kulturen von Neuronen bilden synaptischen Kontakte und generieren Aktionspotentiale (Spikes auch genannt). Die spiking Aktivität dieser Kulturen kann mit Multi-Elektroden-Array (MEA) Systemen erfasst werden. Spitzen werden als synchron sein, wenn sie innerhalb von 5 ms voneinander auftreten. Erste zufällige spiking Aktivität, die schließlich synchronisiert ist ein wesentliches Merkmal der Entwicklung neuronaler Netzwerke8,9. Synchronität kann mit verschiedenen Methoden gemessen werden und mehrere Algorithmen werden in der Literatur9,10,11beschrieben. In unseren Analysen verwenden wir einen Algorithmus entwickelt von Paiva und Mitarbeiter12 die Recording-Software integriert ist, das MEA-Erfassungssystem treibt. Die robuste spiking Aktivität embryonalen Küken Neuronen bietet einen Prototyp für die Untersuchung der Wirkung von BPA auf neuronale Aktivität13. Verwendung von Multi-Elektroden-Arrays zu Rekord spiking Aktivität haben wir beobachtet, dass BPA-Exposition die Entwicklung von neuronalen spiking Synchronität9,14 hemmt. Hier bieten wir eine detaillierte Methode für BPA-Exposition auf die Küken Embryos Neuronen in der Kultur sowie repräsentative Ergebnisse über die Entwicklung der neuronalen spiking Synchronität in Küken embryonalen Kulturen zu studieren.

Protocol

Das Protokoll, die unten gegeben hat um zu testen, die Auswirkungen von BPA-Exposition in der (frühen) Embryogenese standardisiert worden und kann für die Verwendung mit BPS, BPF oder andere EDC in Küken embryonalen Nervenzellen geändert werden.

Dieses Protokoll folgt der institutionellen Politik der Delaware State University und der NIH-Politik für Vogelgrippe Embryonen. Das Protokoll ist auch in Bestätigung DSUS Material und chemische Sicherheitsrichtlinien.

1. materielle Setup

  1. Lösen Sie BPA (m.w. 228.29) in 10 % Ethanol (V/V) im Wasser, eine 1 mM Stammlösung (0,23 mg / mL 10 % Ethanol) zu machen. Machen Sie spätere Verdünnungen (0,1 µM 0,5 µM, 1 µM, 5 µM und 10 µM) in Neurobasal Medium.
    Vorsicht: BPA ist ein Umweltgift und Vorsicht beim Umgang mit des Pulvers.
  2. Inkubieren Sie Küken-Eiern in einem handelsüblichen Tabletop Ei Inkubator bei 37 ° c 7 Tage für E7 Embryonen inkubieren Sie Eiern.
  3. Bereiten Sie MEAs entkeimen die erforderliche Anzahl von MEAs durch Einweichen in 70 % igem Ethanol für 3 bis 4 h und dann spülen Sie dreimal in ca. 10 mL sterilem destilliertem Wasser in der BSLII-Haube.
    Hinweis: Die MEAs enthalten 64 nanoporöse Platin-Elektroden in einem 8 x 8-Raster angeordnet. Die Elektrodendurchmesser 30 µm und der Abstand zwischen den Elektroden ist 200 µm. Verwenden Sie nicht denaturiertem Ethanol für die Sterilisierung der MEAs, denn dies führt zu Korrosion der MEA.
  4. Legen Sie die MEAs in einen sterilen Behälter mit Deckel (Aufrechterhaltung der Sterilität) und bewegen sich in einem Table-Top-Inkubator. Backen Sie für mindestens 6 Stunden bei 55 ° C. Dieser Schritt ist wichtig für die richtige Sterilisation und die Temperatur sollte nicht mehr als 60 ° C. Aufrechterhaltung der Sterilität, verschieben Sie die Schale mit MEAs, BSLII Haube für die Lagerung bis zur weiteren Verwendung.
    Hinweis: Wir verwenden ein Ofen sicher Glas Auflaufform mit Kunststoffdeckel und Oberfläche Sterilisieren sie mit 70 % Ethanol und in der BSLII-Haube zum Trocknen.
  5. Aliquot der extra-zellulären ECM-Matrixlösung. Tauen Sie das Fläschchen bei 4 ° C über Nacht auf und frieren Sie 100 µL-Aliquots bei-20 ° C ein.
    Hinweis: ECM wird gefroren geliefert. ECM sollte nicht sein auf Raumtemperatur gebracht bis bereit zu beschichten, da es bei Raumtemperatur polymerisiert und einmal polymerisiert, es unmöglich zu beschichten ist. ECM ohne Wachstumsfaktoren wird bevorzugt, um zusätzliche Effekte durch unbekannte Faktoren zu verhindern.
  6. Alle Instrumente der Dissektion (Dumont Nr. 5 Pinzetten, gebogenen Pinzette, kleine Schere und Feder Schere) zu sterilisieren und selbstdichtend Material beschichtet Dissektion Gerichte mit 70 % Ethanol und in der Dissektion Haube trocknen lassen.

2. Küken embryonalen Neuron Kultur und Netzwerk-Aktivität

  1. Am Tag der Beschichtung entfernen ein Fläschchen von ECM aus der Tiefkühltruhe-20 ° C, Sprühen Sie mit 70 % Ethanol, und auf Eis. Durch Zugabe von 300 µL kalter Neurobasal Medium in BSLII Kapuze auf 25 % zu verdünnen.
  2. Mit einem P200 Pipetteman hinzufügen 100 µL 25 % ECM in die Mitte der MEA kümmert sich nicht um die Elektroden zu berühren und sofort verlassen einen dünnen Film auf der Oberfläche zu entfernen. Abdecken der MEA und im CO2 Inkubator (37 ° C und 5 % CO2) erst unmittelbar vor der Neuronen Platte.
  3. Sterilisieren Sie die äußere Hülle der Eizelle E7 (embryonale Tag 7, für 7 Tage bei 37 ° C inkubiert) mit 70 % Ethanol. Enthaupten Sie den Embryo in einen Sylgard unteren Dissektion Teller, kalte sterile Hank ausgewogen Salze Lösung (HBSS) ohne Calcium enthält. Um die Augen herum schneiden Sie und entfernen Sie die Augäpfel. Mit DuMont #5 feine Pinzette und Feder Schere einen Einschnitt auf der Bauchseite machen und entfernen Sie die äußeren Schichten der Haut, das Vorderhirn und Optik Tectum verfügbar zu machen. Schälen und die pial Membran vorsichtig entfernen. Übertragen Sie das Vorderhirn in einem anderen Petrischale und schneiden Sie es in kleine Stücke von ca. 2 mm mit Feder Schere.
    Hinweis: Es sollte Blutgefäße Vorderhirn nach Entfernung der pial Membran befestigt. Falls vorhanden, ist es vorzuziehen, die Zerlegung in einem sterilen Dissektion Abzug durchzuführen, obwohl wir ziemlich gute Ergebnisse erzielt haben, wenn Dissektion außerhalb einer Haube durchgeführt wird, solange die Instrumente und die Dissektion Bereich gründlich mit 70 % Ethanol sterilisiert werden .
  4. Mit einer sterilen transferpipette, sammeln Sie das Vorderhirn in einem 15 mL Zentrifugenröhrchen und entfernen Sie so viel HBSS wie möglich nach dem Loslassen der Stücke des Vorderhirns Waschbecken am unteren Rand die Zentrifugenröhrchen.
  5. Fügen Sie 1 mL 0,05 % Trypsin/EDTA (vorgewärmt auf 37 ° C) und 15 Minuten bei 37 ° C inkubieren.
  6. Mit einer Pasteurpipette, sorgfältig entfernen Sie Trypsin ohne zu stören die Stücke des Gewebes zu und fügen Sie 1 mL Neurobasal Medium. Lassen Sie die Teile des Gewebes sinken nach unten und entfernen Sie das Medium. Wiederholen Sie diese Waschen noch einmal. Dieser Schritt ist die Trypsin/EDTA abwaschen.
  7. Fügen Sie 2 mL des Neurobasal Mediums hinzu und starten Sie verreiben. Verreibung beinhaltet unter einer sterilen Pasteurpipette feuerpoliert und übergeben das Gewebe dadurch mehrmals sanft, bis keine weitere Stücke des Gewebes sichtbar sind. Wenn irgendwelche Stücke nach wiederholten Durchläufen zu bleiben, lassen sie sich auf den Boden.
    Hinweis: Vermeiden Sie Aufschäumen beim verreiben - wenn Schaum bilden, zu stoppen und durch Absaugen entfernen.
  8. Verdünnen Sie die neu suspendierten Zellen 01:10 mit Neurobasal Medium und zählen Sie entwicklungsfähigen Zellen verwenden Trypan blau färben und eine Hemocytometer. Mix 50 µL der verdünnten Zellen mit 50 µL Trypan blau-Lösung in eine 0,5 mL Zentrifugenröhrchen. Die Hemacytometer nach Auflegen des Deckglases 10 µL hinzu und zählen Sie die helle klare Zellen (blaue Zellen sind tot und nicht gezählt werden soll).
    Hinweis: Typische Zelle Zahlen aus einer einzigen E7 optic Tectum Bereich zwischen 1 und 5 x 107 Zellen/mL.
  9. Platte der dissoziierten Zellen auf ECM MEAs bei einer Dichte von 2.200 Zellen/Quadrat mm beschichtet. Für unser MEA-System entspricht dies etwa 130.000 Zellen pro MEA. Fügen Sie Neurobasal Medium bringen die Lautstärke in der MEA zu 1 mL und MEAs in der CO2 Inkubator über Nacht für Zellhaftung und Neurit Erweiterung (Abbildung 1).
    Hinweis: Für MEAs aus verschiedenen Bereichen und Elektrode Zahlen, unterschiedlichen Zelldichten könnte versucht werden - in der Regel höhere Zelldichte ergibt größere Netzwerk-Aktivität, sondern führt auch zu kürzeren gelebten Kulturen.
  10. Fügen Sie am nächsten Tag eine Endkonzentration von 10 µM im Neurobasal Medium aus dem 1 mM bestand in Schritt 1.1 gemacht, um die behandelten MEA BPA hinzu. Das Steuerelement MEA fügen Sie das gleiche Volumen von 10 % Ethanol in (V/V) Wasserlösung hinzu.
  11. Ersetzen Sie verbrachte Medium mit Neurobasal-haltigem Medium 10 µM BPA jeden zweiten Tag bis 7 Tage in Vitro (7DIV) und jeden Tag danach, als die Netzwerk-Aktivität erhöht.
    Hinweis: Da die Netzwerk-Aktivität erhöht, erhöht die Stoffwechselaktivität und Medien Änderungen müssen immer häufiger. Lassen Sie sich nicht das Medium Orange drehen.

3. Aufnahme neuronalen Netzwerk-Aktivität

  1. Am Tag der Übernahme das Kulturmedium mit frischen Neurobasal Medium auszutauschen und CO2 Inkubator für mindestens 2 Stunden vor der Aufnahme die MEAs zurückzukehren. Starten Sie die Aufnahmesoftware und stellen Sie die Temperatur der MEA auf 37 ° C, indem Sie auf das Symbol der Temperatur (ergänzende Abbildung 3.1a-b).
    Hinweis: Aufnahme kann beginnen so früh wie Tag 3 der Beschichtung und kann fortfahren, solange die Kulturen lebendig sind.
  2. Richten Sie die Aufnahmeparameter mit der rechten Maustaste auf das Symbol "Muse" (unter Streams im linken Fenster Panel) und wählen Sie "Hinzufügen Processing" und "Spike Detector" und klicken Sie auf "OK" im Pop-up Fenster. "Spike Detector (6 X STD)" erscheinen unter dem Dateinamen (ergänzende Abbildung 3.2a-b).
  3. Als nächstes klicken Sie rechts auf den Spike-Detektor, wählen Sie "Hinzufügen Processing" und "Burst-Detektor" und klicken Sie auf "OK" im Pop-up Fenster. "Burst Detektor" (ISI) erscheint unterhalb des Muse-Symbols (ergänzende Abbildung 3.3a-b).
  4. Als nächstes klicken Sie rechts auf Burst-Detektor, wählen Sie "Hinzufügen Processing" und "Neuronale Statistiken Compiler." Sicherzustellen Sie im Pop-up Fenster, dass die Datei-Header, aggregiert auch Statistiken und Synchronität ausgewählt sind. Klicken Sie auf OK. "Statistik-Compiler" erscheint unterhalb (ergänzende Abbildung 3,4-b).
    Hinweis: Dies setzt das adaptive Schwelle überschreiten (6 X STD Filter), das Inter Spike-Intervall bei 100 ms mit einer minimalen Anzahl von Spikes auf 5, der Mittelwert feuern Rate Erkennung bei 10 s mit Synchronität Parameter bei 20 ms und die minimale spikerate bei 0,083333 Spikes pro Minute.
  5. Richten Sie die eingeplante Aufzeichnung für die Aufnahmezeit von 5 Minuten (300.000 ms) durch Klicken auf das Uhr-Symbol an der Unterseite. Dies geschieht durch Ändern der Informationen im Abschnitt "Einstellung" alle 5,1 Minuten aufzeichnen und für 5 Minuten aufzeichnen. Dies wird sofort gestartet und wird einmal ausgeführt (ergänzende Abbildung 3.5).
  6. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur der MEA 37 ° C erreicht hat, vor dem Umzug MEA. Entfernen Sie die MEA aus dem Inkubator zu, legen Sie es auf die Aufnahmeeinheit und Sperren Sie die MEA. Starten Sie die Netzwerk-Aktivität durch Klicken auf den Start-Rekord im Abschnitt programmierte Aufnahme oder das Aufnahmesymbol im Fenster "Wiedergabe". In der Regel genügt eine Aufnahmedauer von 5 Minuten (300.000 ms), obwohl längere Aufnahmen von bis zu 10 Minuten erreicht werden können.
  7. Nach der Aufnahme der MEA zurück in den Inkubator.
    Hinweis: Vorsicht ist geboten, Sterilität zu halten und die Zeit zu minimieren, wird die MEA außerhalb des Inkubators.

(4) Datenanalyse

  1. Analyse der Rohdaten kann offline mit der Recording-Software erledigt werden. Klicken Sie auf das Pulldown-Menü Datei und öffnen Sie Aufnahme. Wählen Sie die raw-Daten-Datei analysiert werden. Wiederholen Sie die raw Aufnahmen um einen erforderlichen Parameter zu erfassen.
  2. Um die durchschnittliche Anzahl der Spikes zu erhalten, verwenden Sie das Spike-Detektor-Modul und für den Erhalt der Synchrony Index, verwenden Sie das neuronale Statistiken Compiler-Modul.
  3. Laden Sie die Spike-Detektor, Burst-Detektor und Compiler Statistikmodule als vor (Abschnitt 3).
  4. Wählen Sie aus den Pulldown-Menüs innerhalb der Spike-Detektor, Burst-Detektor und Statistiken Compiler Modul Windows Spike Liste, Netzwerkliste platzen und erweiterte Metriken, beziehungsweise.
  5. Klicken Sie auf die Record-Taste zum Starten der Aufnahme der Datendatei schaffen eine CSV-Datei im Ordner "gerichtet". Die Spike-Parameter - die Gesamtzahl der Spitzen und der Synchrony-Index - werden in der CSV-Datei aufgezeichnet werden.
    Hinweis: Analyse in Echtzeit während der Aufnahme von raw-Daten wird nicht empfohlen, da dies Prozessorzeit und computational Ressourcen verbrauchen konnte.

Representative Results

Wir untersuchten die Wirkung von BPA auf Synchronität Entwicklung in Küken Embryos neuronalen Kulturen. Synchronisation von Spick Aktivität ist ein Indikator für die normale Entwicklung der neuronalen Netzwerke in Vitro. Wenn zwei Spitzen innerhalb von 5 ms voneinander auftreten, gelten sie synchron. In-vitro- neuronale Kulturen zeigen zunächst zufällige spiking Aktivität – Spitzen auftreten nach dem Zufallsprinzip und die Inter Spike-Intervalle zeigen eine normale Verteilung. Als die Kulturen Reifen, spiking Aktivität wird mehr synchronisiert und die Inter Spike-Intervalle konstant sind. Synchrone spiking Aktivität einer Kultur wurde durch die Kreuzkorrelation Analyse der Spike Zeiten abzuleiten ein Synchrony-Index (SI) mit Aufnahme Software12 quantitated. Wir fanden, dass BPA-Exposition Aktivität Netzentwicklung, beeinträchtigt indem spiking Aktivität und die Synchronität Index (Abbildung 2ein und 2 b). Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass die schädlichen Auswirkungen von BPA-Exposition auf ein Embryo beeinflusst seine Entwicklung, einschließlich der neuronalen Funktion, die durch Synchronität Entwicklung in Küken Neuronen in Kultur beurteilt werden kann.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Schritte vom sezieren von Küken Vorderhirn zur Dissoziation, Beschichtung und die Aufzeichnung der Netzwerkaktivität desdem. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: (A) die durchschnittliche Anzahl der Spikes ist deutlich niedriger in BPA behandelt E7 Küken Vorderhirn Kulturen im Vergleich zu Kontrolle Kulturen. Die durchschnittliche Anzahl der Spikes wurde mit der Recording-Software extrahiert. Die Mittel (Kontrolle, 14.890 ± 949.0, N = 15 und BPA, 5.624 ± 465,9, N = 22) unterschieden sich signifikant (ungepaarten t-Test, p < 0,0001). (B) die durchschnittliche Synchrony-Index (SI) ist deutlich geringer im BPA behandelt E7 Küken Vorderhirn Kulturen im Vergleich zu Kontrolle Kulturen. Die SI wurde gewonnen mit dem neuronalen Statistiken Compiler-Modul innerhalb der Recording-Software. Die SI-Mittel (Kontrolle, 0.5159 ± 0.06547 N = 15 und BPA, 0.1140 ± 0.01840 N = 22) unterschieden sich signifikant (ungepaarten t-Test, p < 0,0001). Fehlerbalken darzustellen Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Phasen des schnellen Wachstums und Entwicklung z. B. Embryogenese sind besonders anfällig für die nachteiligen Auswirkungen der verschiedenen endokrinen Störung Verbindungen einschließlich BPA. Wir bieten ausführliche Protokolle zur Untersuchung der Auswirkungen von BPA-Exposition in einem in Vitro vertebrate neuronalen Netzwerk-Modell. Unter Verwendung dieses Protokolls, festgestellt wir, dass BPA die spikerate sowie die Synchronität Index in der Entwicklung neuronaler Netzwerke (Abbildung 2a-b senkt).

Unsere Methodik wurde entwickelt, um die BPA-Exposition in der frühen Embryogenese studieren und kann leicht angepasst werden, um die Untersuchung der Auswirkungen von anderen EDZ. Embryonale neuronale Kulturen aus der Küken sind relativ leicht zu schaffen im Vergleich zu anderen vertebrate Modelle, darunter auch die Ratte oder Maus. Darüber hinaus gibt es keine Notwendigkeit, eine separate tierraum – ein einfache Inkubator auf einem Labortisch ist ausreichend, um diese Tests durchzuführen. Wir beschreiben die Verwendung eines Multi-Elektroden-Systems (MEA) für die Beurteilung der Wirkung von EDC, BPA, auf Netzwerk-Aktivität. Die hier beschriebenen Protokolle können mit anderen Systemen angewendet werden. Ein wichtiger Aspekt dieses Protokolls ist die Aufrechterhaltung der Sterilität. Dazu gehören Dissektion des Embryos unter sterilen Bedingungen – Sterilisation von Instrumenten mit 70 % Ethanol und sterile Hank ausgewogen Salze Lösung ist ausreichend. Da die Daten über einen Zeitraum von Wochen gesammelt werden, ist es wichtig, sterile Handhabung der MEAs pflegen. Die neuronalen Kulturen einmal etabliert können gezüchtet werden langfristig - bis zu drei Monaten – und eignen sich somit für das Studium Langzeitexposition gegenüber EDZ und anderen Verbindungen auf neuronale Vernetzung. Ein weiterer wichtiger Aspekt dieses Protokolls ist die Zeit zwischen Präparation und Beschichtung. Der optimale Zeitpunkt ist 30 min, einschließlich die Inkubation des Gewebes mit Trypsin. Je länger die Zeit, desto schlechtere das Überleben der Zellen.

Wir beschreiben hier ein einfachen Protokolls, das angewendet werden kann, für die Beurteilung von chemischen oder Medikament, das Verhalten und die neuronale Funktion auswirkt. Hier haben wir eine Zelldichte von 2.200 Zellen pro mm2verwendet; Allerdings kann dies geändert werden und andere Zelldichten eingesetzt werden. Im Allgemeinen haben wir festgestellt, dass Zelldichte Netzwerkaktivität - mehr Spikes in kürzerer Zeit erhöht. Die Methode hat beschrieben, obwohl sehr nützlich bei der Beurteilung der Auswirkungen von Chemikalien auf Netzwerk-Aktivität Einschränkungen. Eine der größten Einschränkungen der Methode ist, dass diese in-vitro-Kulturen zweidimensional die dreidimensionale Architektur des vertebrate Gehirns nicht wiedergibt. Dies kann mithilfe von Slice-Aufnahmen überwunden werden. Eine weitere Alternative bedeutet für die Behandlungen auf sich entwickelnden Küken-Embryos durch Anwenden eines kleinen Fensters Schneiden am breiten Ende des Ei-15, sezieren das Gehirn am Ende der Therapie, dicke Schichten auf eine Vibratome zu machen und setzen auf die MEA für Aufnahme-Netzwerk-Aktivität.

Unser Protokoll gilt, dass es ermöglicht die Untersuchung der Wirkung von endokrine Disruptoren auf die Entwicklung von Netzwerk-Aktivität und die Erforschung einer mechanistischen Basis für die Auswirkungen dieser Chemikalien bietet.

Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenskonflikte.

Acknowledgments

Diese Studie stützt sich auf die NSF (HBCU-UP-Forschungspreis der Initiation, HRD 1401426 und EPSCoR EPS-0814251) und NIH (COBRE 1P20GM103653-01A1). K.s. wird unterstützt durch ein Stipendium von der Delaware INBRE III 6404.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#5 foreceps Fine Science Tools 11251-10
Axion Muse MEA Axion Biosystems M64-GL1-30Pt200 Will be called MEA system in manuscript
Axis Software Axion Biosystems Will be called recording software in the manuscript
BPA Sigma-Aldrich 239658-250g
curved forceps Fine Science Tools 11272-50
EtOH Sigma-Aldrich 64-17-5
Fertilized chicken eggs from any local farm or Spafas
HBSS Fisher 14170112
Hemacytometer Fisher  02-671-6
Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free BD Biosciences 356231 Will be called Extra Cellular Matrix (ECM) in the manuscript
Neurobasal medium BrainBits Nb4-500
Neuroexplorer statistical software Nex Technologies Neuroexplorer version 5
Pasteur pipettes Fisher  13-678-20A
spring scissors Fine Science Tools 15514-12
Sylgard bottom dissection dishes Living Systems Instrumentaion DD-90-S-BLK-3PK
Trypan Blue dye Fisher 15-250-061
Trypsin-EDTA Fisher 15400054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anahara, R., Yoshida, M., Toyama, Y., Maekawa, M., Masayuki, K., Ishino, F., Toshimori, K., et al. Estrogen agonists, 17 beta-estradiol, bisphenol A, and diethylstilbestrol, decrease cortactin expression in the mouse testis. Arch. of Histol. Cytol. 69, (2), 101-107 (2006).
  2. Dodds, C. Synthetic oestrogens. Br. Med. Bull. 11, (2), 131-134 (1955).
  3. Grignard, E., Lapenna, S., Bremer, S. Weak estrogenic transcriptional activities of Bisphenol A and Bisphenol S. Toxicology In Vitro. 26, (5), 727-731 (2012).
  4. Herbst, A. L., Ulfelder, H., Poskanzer, D. C. Adenocarcinoma of the vagina: association of maternal stilbestrol therapy with tumor appearance in young women. New Eng. J. Med. 284, 878-881 (1971).
  5. Jenkins, S., Raghuraman, N., Eltoum, I., Carpenter, M., Russo, J., Lamartiniere, C. A. Oral exposure to bisphenol A increases dimethylbenzanthracene-induced mammary cancer in rats. Environ Health Persp. 117, (6), 910-915 (2009).
  6. Okada, A., Kai, O. Effects of estradiol-17beta and bisphenol A administered chronically to mice throughout pregnancy and lactation on the male pups' reproductive system. Asian J Androl. 10, (2), 271-276 (2008).
  7. Palanza, P., Gioiosa, L., Vom Saal, F. S., Parmigiani, S. Effects of developmental exposure to bisphenol A on brain and behavior in mice. Environ. Res. 108, (2), 150-157 (2008).
  8. Mimoto, A., Fujii, M., Usami, M., Shimamura, M., Hirabayashi, N., Kaneko, T., et al. Identification of an estrogenic hormone receptor in Caenorhabditis elegans. Biochem. Biophys. Res. Commun. 364, (4), 883-888 (2007).
  9. Allard, P., Colaiacovo, M. Bisphenol A impairs the double-strand break repair machinery in the germLine and causes chromosome abnormalities. Proceedings Natl. Acad. Sci. 107, (47), 20405-20410 (2010).
  10. Mersha, M. D., Patel, B. M., Patel, D., Richardson, B. N., Dhillon, H. S. Effects of BPA and BPS exposure limited to early embryogenesis persist to impair non-associative learning in adults. Behav. Brain Funct. : BBF. 11, 27 (2015).
  11. Chen, Y., Shu, L., Qiu, Z., Lee, D. Y., Settle, S. J., et al. Exposure to the BPA-Substitute Bisphenol S Causes Unique Alterations of GermLine Function. PLOS Genetics. 12, (7), 1006223 (2016).
  12. Shein Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Innate Synchronous Oscillations in Freely-Organized Small Neuronal Circuits. PLoS ONE. 5, (12), 14443 (2010).
  13. Baltz, T., Herzog, A., Voigt, T. Slow Oscillating Population Activity in Developing Cortical Networks: Models and Experimental Results. J. Neurophysiol. 106, (3), 1500-1514 (2011).
  14. Pettmann, B., Louis, J. C., Sensenbrenner, M. Morphological and Biochemical Maturation of Neurones Cultured in the Absence of Glial Cells. Nature. 281, (5730), 378-380 (1979).
  15. Zhang, H., Wu, C. Y., Wang, W., Harrington, M. A. Interneuronal Synapses Formed by Motor Neurons Appear to Be Glutamatergic. NeuroReport. 22, (16), 809-813 (2011).
  16. Paiva, A. R. C., Park, I., Príncipe, J. C. A Comparison of Binless Spike Train Measures. Neural Comp. and Appl. 19, (3), 405-419 (2010).
  17. Cretu, A., Fotos, J. S., Little, B. W., Galileo, D. S. Human and Rat Glioma Growth, Invasion, and Vascularization in a Novel Chick Embryo Brain Tumor Model. Clin Exp Metastasis. 22, 225-236 (2005).
  18. Chiappalone, M., et al. Dissociated cortical networks show spontaneously correlated activity patterns during in vitro development. Brain Res. 93, (2006).
  19. Li, X., et al. Long-term recording on multi-electrode array reveals degraded inhibitory connection in neuronal network development. Biosens Bioelectron. 22, (7), 1538-1543 (2007).
Bewertung der Auswirkungen von endokriner Substanzen auf die Entwicklung der Wirbeltiere neuronales Netz-Funktion mit Multi-Elektroden
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sanchez, K. R., Mersha, M. D., Dhillon, H. S., Temburni, M. K. Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays. J. Vis. Exp. (134), e56300, doi:10.3791/56300 (2018).More

Sanchez, K. R., Mersha, M. D., Dhillon, H. S., Temburni, M. K. Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays. J. Vis. Exp. (134), e56300, doi:10.3791/56300 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter