Summary
L'esposizione alle tossine ambientali possa avere un impatto acutamente gli embrioni in via di sviluppo. Sistema endocrino prodotti chimici come bisfenoli sono noti per influenzare negativamente il sistema nervoso. Qui descriviamo un protocollo utilizzando un modello di rete di un neurone del vertebrato (embrione) in vitro per studiare l'impatto funzionale di esposizione tossina su embrioni in anticipo.
Abstract
Bis-fenoli, come bis-fenolo A (BPA) e bis-fenolo-S (BPS), sono polimerizzando agenti ampiamente usati nella produzione di materie plastiche e numerosi prodotti di uso quotidiano. Sono classificati come composti interferenza endocrine (EDC) con proprietà simil-estradiolo. A lungo termine dell'esposizione a interferenti endocrini, anche a basse dosi, è stato collegato con vari difetti di salute tra cui il cancro, disturbi del comportamento e della sterilità, con maggiore vulnerabilità durante i periodi dello sviluppo precoce. Per studiare gli effetti del BPA sullo sviluppo della funzione di un neurone, abbiamo usato una in vitro neuronale rete derivata dal cervello embrionale precoce pulcino come un modello. Abbiamo trovato che l'esposizione al BPA ha interessato lo sviluppo di attività di rete, chiodare in particolare attività e sincronizzazione. Un cambiamento nell'attività di rete è il collegamento cruciale tra il bersaglio molecolare di un farmaco o composti e il suo effetto sul risultato del comportamento. Le matrici multi-elettrodo stanno diventando sempre più uno strumento utile per studiare gli effetti delle droghe sulla rete attività in vitro. Ci sono diversi sistemi disponibili sul mercato e, anche se ci sono variazioni nel numero di elettrodi, il tipo e la qualità della matrice dell'elettrodo e il software di analisi, i principi fondamentali sottostanti, e i dati ottenuti è lo stesso in tutto il diversi sistemi. Sebbene attualmente limitato all'analisi delle culture bidimensionale in vitro , questi sistemi MEA vengono migliorati per consentire attività di rete in vivo nelle fette del cervello. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per esposizione embrionale e la registrazione di attività di rete di un neurone e sincronia, insieme a risultati rappresentativi.
Introduction
4, 4 '-isopropilidenedifenolo, comunemente indicato come il bisfenolo-A o BPA, è un additivo antiossidante trovato in un'ampia varietà di policarbonato e resina epossidica resina basata prodotti che vanno dalla carta termica, CD e frantumare vetro, all'interno della prova rivestimento di lattine per bevande. Anche se il BPA è stato conosciuto per essere un agente di interferenza endocrino che imita l'estrogeno1, studi sui suoi effetti malati a causa di esposizione quotidiana casuale al BPA principalmente sono usciti negli ultimi 10-15 anni. Le conseguenze di anche bassi livelli di esposizione al BPA sono più profonde nei primi periodi dello sviluppo, tra cui durante l'embriogenesi attraverso l'esposizione di madri2,3. Esposizione nell'utero degli embrioni femminili a prodotti chimici il sistema endocrino è stato collegato anche a malattia aumentata suscettibilità da vaginale al seno cancro4,5. Gli studi sugli animali hanno dimostrato che l'esposizione al BPA conduce alla struttura cerebrale atipica e le anomalie funzionali che si manifesta nel comportamento6. Di conseguenza, è stato vietato l'uso del BPA nei biberon di più agenzie in Europa e Nord America, tra cui la FDA. Per rispettare le normative, molti produttori sono passati a 4, 4'-sulfonyldiphenol o bisphenol-S (BPS). Basa sul fatto che BPA e BPS sono analoghi strutturali e che i rapporti recenti hanno mostrato potenza paragonabile di BPS in trascrizione estrogenici7, è importante studiare la tossicità di questo composto parente al BPA.
Qui descriviamo un protocollo per testare gli effetti del BPA (e altri EDCs) sulle reti di neuroni utilizzando un modello di vertebrati, l'embrione di pollo. Colture in vitro di neuroni formano contatti sinaptici e generano i potenziali di azione (chiamati anche picchi). L'attività chiodante di queste culture può essere registrato utilizzando sistemi array multi-elettrodo (MEA). Picchi sono considerati essere in sincronia quando si verificano all'interno di 5 ms uno da altro. Attività chiodando casuale iniziale che alla fine Sincronizza è una funzionalità chiave di sviluppare reti neuronali8,9. Sincronia può essere misurato utilizzando diversi metodi e diversi algoritmi sono descritti in letteratura9,10,11. Nella nostra analisi, usiamo un algoritmo sviluppato da Paiva e colleghi di lavoro12 , che è integrato nel software di registrazione che aziona il sistema di acquisizione di MEA. L'attività di spiking robusto dei neuroni embrionali pulcino fornisce un prototipo per studiare l'effetto del BPA sulla rete neurale attività13. Utilizzo di matrici multi-elettrodo per registrare l'attività spiking, abbiamo osservato che l'esposizione al BPA inibisce lo sviluppo di un neurone chiodando sincronia9,14. Qui, forniamo una dettagliata metodologia per lo studio di esposizione al BPA sui neuroni di embrione di pulcino nella cultura insieme risultati rappresentativi sullo sviluppo di un neurone chiodando sincronia nelle colture embrionali pulcino.
Protocol
Il protocollo qui di seguito è stato standardizzato per testare gli effetti dell'esposizione al BPA durante l'embriogenesi (presto) e può essere modificato per l'utilizzo con BPS, BPF o altri EDC in neuroni embrionali pulcino.
Questo protocollo segue le politiche istituzionali del Delaware State University e la politica di NIH per embrioni aviari. Il protocollo è anche nella conferma del DSU materiale e linee guida sulla sicurezza chimica.
1. materiale installazione
- Sciogliere il BPA (m.w. 228.29) in etanolo al 10% (v/v) in acqua fino ad ottenere una soluzione madre di 1 mM (0,23 mg / mL di etanolo al 10%). Effettuare diluizioni successive (0,1 µM, 0,5 µM, 1 µM, 5 µM e 10 µM) in mezzo neurobasal.
Attenzione: Il BPA è una tossina ambientale e cura dovrebbe essere esercitata quando si maneggia la polvere. - Incubare uova di pulcino in un commercialmente disponibili da tavolo uovo incubatore a 37 ° C. Incubare le uova per 7 giorni per gli embrioni E7.
- Preparare il passe-partout sterilizzare il numero richiesto di MEAs ammollo in etanolo al 70% per 3 o 4 h e poi sciacquare tre volte in circa 10 mL di acqua distillata sterile nella cappa BSLII.
Nota: Il MEAs contengono 64 elettrodi di platino nanoporosi disposti in una 8x8 griglia. Il diametro dell'elettrodo è 30 µm e la distanza tra gli elettrodi è 200 µm. Non utilizzare etanolo denaturato per sterilizzare il MEAs come questo porterà alla corrosione di MEA. - Posizionare il MEAs all'interno di un contenitore sterile con coperchio (per mantenere condizioni sterili) e spostare in un'incubatrice di piano d'appoggio. Cuocere per almeno 6 ore a 55 ° C. Questo passaggio è fondamentale per la corretta sterilizzazione e la temperatura non deve superare i 60 ° C. Mantenere la sterilità, spostare il piatto contenente MEAs alla cappa BSLII per deposito fino al successivo utilizzo.
Nota: Usiamo una pirofila da forno di vetro sicuro con coperchio di plastica e superficie sterilizzarlo con etanolo al 70% e posto nella cappa BSLII per l'essiccazione. - Aliquota della soluzione di matrice extracellulare ECM. Scongelare il flaconcino a 4 ° C durante la notte e congelare aliquote di 100 µ l a-20 ° C.
Nota: ECM viene consegnato surgelato. ECM non dovrebbero essere portati a temperatura ambiente fino al momento per rivestire come polimerizza a temperatura ambiente e, una volta polimerizzato, è Impossibile cappotto. ECM senza fattori di crescita è preferito per evitare ulteriori effetti a causa di fattori sconosciuti. - Sterilizzare tutti gli strumenti di dissezione (Dumont #5 forcipe, pinzetta, forbici piccole e forbici di primavera) e autosigillante materiale rivestito piatti di dissezione con etanolo al 70% e lasciarli asciugare nella cappa di dissezione.
2. pulcino neurone embrionale cultura e attività di rete
- Il giorno di placcatura, rimuovere un flaconcino di ECM dal congelatore a-20 ° C, spruzzare con etanolo al 70% e metterli su ghiaccio. Diluire al 25% con l'aggiunta di medie di freddo neurobasal 300 µ l all'interno cappa BSLII.
- Utilizzando un P200 pipetteman aggiungere 100 µ l di ECM 25% al centro della MEA facendo attenzione a non toccare gli elettrodi e rimuovere immediatamente lasciando una sottile pellicola sulla superficie. Coprire la MEA e nell'incubatore CO2 (37 ° C e 5% CO2) fino al momento di piastra i neuroni.
- Sterilizzare il guscio esterno di un uovo di E7 (giorno embrionale 7, incubato a 37 ° C per 7 giorni) con etanolo al 70%. Decapitare l'embrione in un piatto di dissezione di fondo Sylgard contenente freddo sterile di Hank bilanciato sali soluzione (HBSS) senza calcio. Tagliare intorno agli occhi e togliere i bulbi oculari. Utilizzando DuMont #5 bene pinze e forbici di primavera fare un'incisione sul lato ventrale e rimuovere gli strati più esterni della pelle per esporre il tectum del forebrain e ottica. Sbucciare e togliere delicatamente la membrana pial. Trasferire il proencefalo in un'altra piastra di Petri e tagliarlo a pezzetti di circa 2 mm con forbici di primavera.
Nota: Non dovrebbe esserci alcun vasi sanguigni collegati al proencefalo dopo la rimozione della membrana pial. Se disponibile, è preferibile eseguire la dissezione in una cappa sterile dissezione, anche se abbiamo ottenuto risultati abbastanza buoni quando la dissezione viene eseguita all'esterno di un cappuccio, purché gli strumenti e la zona di dissezione sono accuratamente sterilizzati con etanolo al 70% . - Utilizzando una pipetta sterile, raccogliere i pezzi del forebrain in una provetta da centrifuga da 15 mL e rimuovere la maggior quantità di HBSS possibile dopo lasciando i pezzi del proencefalo affondare fino in fondo la provetta da centrifuga.
- Aggiungere 1 mL di 0.05% tripsina/EDTA (pre-riscaldato a 37 ° C) e incubare a 37 ° C per 15 minuti.
- Utilizzando una pipetta Pasteur, attentamente rimuovere tripsina senza disturbare i pezzi di tessuto e aggiungere 1 mL di terreno neurobasal. Lasciate che i pezzi di tessuto affondare verso il basso e rimuovere il mezzo. Ripetere ancora una volta questo lavaggio. Questo passaggio è quello di lavare via la tripsina/EDTA.
- Aggiungere 2 mL di terreno neurobasal e iniziare la triturazione. Triturazione consiste nel prendere una pipetta di Pasteur sterile lucidati a fuoco e passando il tessuto attraverso di essa più volte delicatamente fino a quando non più pezzi di tessuto sono visti. Se eventuali pezzi rimangono dopo ripetuti passaggi, lasciarli a depositarsi sul fondo.
Nota: Evitare la formazione di schiuma durante la triturazione - se schiuma forma, interrompere e rimuovere dall'aspirazione. - Diluire le cellule risospese 01:10 con il mezzo di neurobasal e contare le cellule vitali utilizzando colorante Trypan Blue e un emocitometro. Mix 50 µ l delle cellule diluite con 50 µ l di soluzione di blu di Trypan in una provetta da centrifuga da 0,5 mL. Aggiungere 10 µ l per l'emocitometro dopo aver piazzato il coprivetrino e contare le celle chiare luminose (cellule blu sono morti e non devono essere contate).
Nota: I numeri tipici delle cellule da un singolo intervallo di tectum ottica E7 tra 1 e 5 x 107 cellule/mL. - Piastra la dissociata cellule su ECM rivestito MEAs ad una densità di 2.200 cellule/quadrato mm. Per il nostro sistema MEA, questo si traduce in circa 130.000 cellule per MEA. Aggiungere il terreno neurobasal per portare il volume alla MEA a 1 mL e posizionare MEAs nell'incubatore CO2 durante la notte per il collegamento delle cellule e l'estensione del neurite (Figura 1).
Nota: Per MEAs di diverse aree e numeri di elettrodo, densità differenti delle cellule potrebbe essere provato - in generale, alta densità di cellule si traduce in una maggiore attività di rete, ma porta anche a culture vissute più brevi. - Il giorno successivo, aggiungere BPA a una concentrazione finale di 10 µM in mezzo neurobasal dal tallone 1 mM apportate nel passaggio 1.1 il MEA trattato. Al controllo MEA, aggiungere lo stesso volume di etanolo 10% in soluzione acquosa (v/v).
- Sostituire speso medio con mezzo di neurobasal contenente 10 µM BPA ogni altro giorno fino a 7 giorni in vitro (7DIV) e ogni giorno da allora in poi, come gli aumenti di attività di rete.
Nota: Man mano che aumenta l'attività di rete, l'attività metabolica aumenta e le modifiche di supporto devono essere più frequenti. Non lasciare che il mezzo diventa arancione.
3. registrazione di attività di rete neuronale
- Il giorno dell'acquisizione, scambio di terreno di coltura con medium fresco neurobasal e tornare il MEAs l'incubatrice di CO2 per almeno 2 h prima della registrazione. Avviare il software di registrazione ed impostare la temperatura di MEA a 37 ° C facendo clic sull'icona della temperatura (supplementare figura 3.1 a-b).
Nota: Registrazione può cominciare più presto il giorno 3 di placcatura e può continuare fino a quando le culture sono vive. - Impostare i parametri di acquisizione facendo clic destro sull'icona "Muse" (sotto flussi nel pannello sinistro della finestra) e selezionare "Aggiungi Processing" e "Spike rivelatore" e fare clic su OK nella finestra pop-up. "Spike rivelatore (6x STD)" verrà visualizzato sotto il nome del file (supplementare figura 3.2 a-b).
- Successivamente fare clic con il pulsante destro sul rivelatore di Spike, selezionare "Aggiungi Processing" e "Burst rilevatore" e fare clic su OK nella finestra pop-up. "Burst rilevatore" (ISI) verrà visualizzato sotto l'icona di Muse (supplementare figura 3.3 a-b).
- Avanti fare clic con il pulsante destro sul rilevatore di Burst, selezionare "Aggiungi Processing" e "Compilatore di statistiche neurali". Nella finestra pop-up, assicurarsi che siano selezionate File di intestazione, aggregati anche statistiche e sincronia. Fare clic su OK. "Statistiche compilatore" apparirà sotto (supplementare figura 3.4 a-b).
Nota: Questo imposterà l'attraversamento di soglia adattiva (filtro di STD 6 x), l'intervallo di Inter-spike a 100 ms con un numero minimo di picchi a 5, la media cottura rilevamento della frequenza a 10 s con un parametro di sincronia a 20 ms e il tasso di picco minimo a 0,083333 punti / min. - Impostare la registrazione programmata per il tempo di registrazione di 5 minuti (300.000 ms) facendo clic sull'icona dell'orologio nella parte inferiore. Ciò si ottiene modificando le informazioni nella sezione impostazione di registrare ogni minuti 5,1 e registrare per 5 minuti. Questo verrà avviato immediatamente e verrà eseguito una volta (Supplemental figura 3.5).
- Assicurarsi che la temperatura della MEA ha raggiunto 37 ° C prima di passare il MEA. Rimuovere il MEA dall'incubatrice, posto su un'unità di registrazione e bloccare il MEA. Avviare la registrazione dell'attività di rete facendo clic sul record di avvio nella sezione registrazione programmata o sull'icona di registrazione nella finestra "File Play". In genere, un tempo di registrazione di 5 minuti (300.000 ms) è sufficiente, anche se possono essere ottenute registrazioni più lunghe fino a 10 minuti.
- Dopo la registrazione, è possibile restituire il MEA nell'incubatore.
Nota: Cura deve essere presa per mantenere la sterilità e ridurre al minimo il tempo che il MEA è all'esterno dell'incubatrice.
4. analisi dei dati
- Analisi dei dati grezzi può essere effettuata non in linea utilizzando il software di registrazione. Fare clic sul menu a discesa File e aprire la registrazione. Selezionare il file di dati grezzi per essere analizzati. Riprodurre le registrazioni raw per acquisire i parametri obbligatori chiodando.
- Per ottenere il numero medio di picchi, utilizzare il modulo rivelatore di Spike e per l'ottenimento di sincronia indice, utilizzare il modulo di neurale statistiche del compilatore.
- Caricare la Spike Detector, rivelatore di Burst e statistiche del compilatore moduli come prima (sezione 3).
- Dai menu a tendina all'interno del rilevatore di Spike, Burst rilevatore e statistiche del compilatore modulo windows, selezionare Spike List, elenco di Burst di rete e metriche avanzate, rispettivamente.
- Fare clic sul pulsante di registrazione per iniziare a registrare il file di dati che verrà creato un file CSV nella cartella diretta. I parametri di spike - il numero totale di punte e l'indice di sincronia - saranno registrati nel file CSV.
Nota: analisi in tempo reale durante la registrazione di dati grezzi non è raccomandato come questo potrebbe utilizzare tempo processore e risorse computazionali.
Representative Results
Abbiamo esaminato l'effetto del BPA sullo sviluppo di sincronia in colture neuronali di embrione di pulcino. Sincronizzazione di chiodare l'attività è un indicatore dello sviluppo normale delle reti neuronali in vitro. Quando si verificano due picchi all'interno di 5 ms uno da altro, essi sono considerati sincroni. In vitro colture neuronali inizialmente visualizzano attività chiodando casuale — picchi si verificano in modo casuale e gli intervalli di Inter-spike mostrano una distribuzione normale. Come le culture maturo, l'attività chiodando diventa più sincronizzato e gli intervalli di Inter-spike sono costanti. Attività sincrona spiking di una cultura è stato quantificato dall'analisi cross-correlazione di spike volte utilizzando registrazione software12 per derivare un indice di sincronia (SI). Abbiamo trovato che l'esposizione BPA incide negativamente lo sviluppo di attività di rete riducendo attività chiodando e l'indice di sincronia (Figura 2a e 2b). In sintesi, abbiamo dimostrato che gli effetti nocivi dell'esposizione al BPA su un embrione influisce il suo sviluppo, compreso la funzione di un neurone che possa essere valutati attraverso lo sviluppo di sincronia nei neuroni pulcino nella cultura.
Figura 1: Schematica del protocollo raffiguranti le fasi dalla dissezione del forebrain pulcino alla dissociazione, placcatura e la registrazione dell'attività di rete. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: (A) il numero medio di picchi è significativamente più basso in BPA trattati E7 culture di proencefalo pulcino rispetto alle colture di controllo. Il numero medio di picchi è stato estratto utilizzando il software di registrazione. I mezzi (controllo, 14.890 ± 949.0, N = 15 e BPA, 5.624 ± 465,9, N = 22) erano significativamente differenti (test t spaiato, p < 0,0001). (B) l'indice medio di sincronia (SI) è significativamente più bassa in BPA trattati E7 culture di proencefalo pulcino rispetto alle colture di controllo. Il SI è stato estratto utilizzando il modulo neurale del compilatore statistiche all'interno del software di registrazione. I mezzi SI (controllo, 0.5159 ± 0.06547 N = 15 e BPA, 0.1140 ± 0.01840 N = 22) erano significativamente differenti (test t spaiato, p < 0,0001). Barre di errore rappresentano la deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Fasi di rapida crescita e sviluppo come l'embriogenesi sono particolarmente vulnerabili agli effetti nocivi di vari composti endocrino tra cui BPA. Forniamo dettagliati protocolli per lo studio degli effetti dell'esposizione al BPA in un modello di rete di un neurone vertebrati in vitro . Usando questo protocollo, abbiamo stabilito che il BPA abbassa il tasso di punta come pure l'indice di sincronia nelle reti neuronali in via di sviluppo (Figura 2a-b).
La nostra metodologia è stata progettata per studiare l'esposizione al BPA durante l'embriogenesi precoce e può essere facilmente adattata per studiare gli effetti di altri interferenti endocrini. Colture embrionali neuronali dal pulcino sono relativamente facili da stabilire rispetto ad altri modelli vertebrati, tra cui il ratto o topo. Inoltre, non c'è nessun requisito per un animale separato — una semplice incubatrice su un banco di laboratorio è sufficiente per eseguire queste analisi. Descriviamo l'uso di un sistema multi-elettrodo (MEA) per valutare l'effetto della CED, BPA, sull'attività di rete. I protocolli descritti qui possono essere applicati ad altri sistemi. Un aspetto critico del presente protocollo è il mantenimento della sterilità. Questo include la dissezione dell'embrione in condizioni sterili — sterilizzazione degli strumenti con etanolo al 70% e l'uso della soluzione di sali bilanciati di Hank sterile è sufficiente. Come i dati vengono raccolti in un periodo di settimane, è fondamentale per gestire sterile della MEAs. Le colture neuronali una volta stabilite possono essere coltivate a lungo termine - fino a tre mesi — e sono quindi utili per lo studio a lungo termine esposizione a interferenti endocrini e altri composti su rete neuronale. Un altro aspetto importante di questo protocollo è il momento da dissezione di placcatura. Il momento ottimale è di 30 min, tra cui l'incubazione del tessuto con tripsina. Maggiore è il tempo dello scatto, il più povero la sopravvivenza delle cellule.
Descriviamo qui un protocollo di base che possa essere applicato alla valutazione di qualsiasi sostanza chimica o droga che colpisce il comportamento e funzione neurale. Qui, abbiamo usato una densità cellulare di 2.200 cellule per mm2; Tuttavia, questo può essere modificato e altre densità delle cellule può essere utilizzato. In generale, abbiamo trovato che aumentando la densità delle cellule aumenta l'attività di rete - picchi di più in minor tempo. Il metodo descritto, anche se molto utile nel valutare gli effetti delle sostanze chimiche sull'attività di rete hanno limitazioni. Uno dei più grandi limiti del metodo è che queste colture in vitro sono due dimensioni potrebbero non riflettere l'architettura tridimensionale del cervello dei vertebrati. Questo può essere superato utilizzando registrazioni fetta. Un'altra alternativa è di applicare i trattamenti per l'embrione in via di sviluppo da significa di una finestra piccola tagliata all'estremità larga del uovo15, sezionare il cervello alla fine del regime terapeutico, rendere sezioni spesse su una vibratome ed inserirlo sulla MEA per registrazione attività di rete.
Il nostro protocollo è significativo in quanto consente l'esame dell'effetto di EDCs sullo sviluppo delle attività di rete e propone l'esplorazione di una base meccanicistica per gli effetti di queste sostanze chimiche.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun interessi concorrenti.
Acknowledgments
Questo studio è supportato dalla NSF (HBCU-UP Research Award di iniziazione, HRD 1401426 ed EPSCoR EPS-0814251) e NIH (COBRE 1P20GM103653-01A1). K.S. è supportato da una borsa di studio da il Delaware INBRE-III 6404.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 foreceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Axion Muse MEA | Axion Biosystems | M64-GL1-30Pt200 | Will be called MEA system in manuscript |
| Axis Software | Axion Biosystems | Will be called recording software in the manuscript | |
| BPA | Sigma-Aldrich | 239658-250g | |
| curved forceps | Fine Science Tools | 11272-50 | |
| EtOH | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| Fertilized chicken eggs | from any local farm or Spafas | ||
| HBSS | Fisher | 14170112 | |
| Hemacytometer | Fisher | 02-671-6 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free | BD Biosciences | 356231 | Will be called Extra Cellular Matrix (ECM) in the manuscript |
| Neurobasal medium | BrainBits | Nb4-500 | |
| Neuroexplorer statistical software | Nex Technologies | Neuroexplorer version 5 | |
| Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20A | |
| spring scissors | Fine Science Tools | 15514-12 | |
| Sylgard bottom dissection dishes | Living Systems Instrumentaion | DD-90-S-BLK-3PK | |
| Trypan Blue dye | Fisher | 15-250-061 | |
| Trypsin-EDTA | Fisher | 15400054 |
References
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