Udsættelse for miljøområdet toksiner kan akut påvirker udviklingslandene embryoner. Hormonsystemforstyrrende kemikalier såsom uvæsentligt er kendt for at påvirke nervesystemet. Her beskriver vi en protokol bruger en in vitro- hvirveldyr (kylling embryo) neuronal netværksmodel til at studere den funktionelle effekt af toksin eksponering på tidlige embryoner.
BIS-phenoler, som bis-phenol A (BPA) og bis-phenol-S (BPS), polymeriserende agenter almindeligt anvendt i produktion af plast og mange dagligdags produkter. De klassificeres som endokrine forstyrre forbindelser (EDC) med østradiol-lignende egenskaber. Langvarig eksponering for EDC, selv ved lave doser, har været forbundet med forskellige sundhed defekter, herunder kræft, adfærdsmæssige forstyrrelser og barnløshed, med større sårbarhed i tidlige udviklingsmæssige perioder. For at studere virkningerne af BPA på udviklingen af neuronal funktion, brugte vi en in vitro- neuronal netværk stammer fra den tidlige chick embryonale hjerne som en model. Vi fandt, at eksponering for BPA påvirket udviklingen af netværksaktivitet, specielt spiking aktivitet og synkronisering. En ændring i netværksaktivitet er den afgørende sammenhæng mellem den molekylære mål af et lægemiddel eller sammensatte og dens virkning på adfærdsmæssige resultatet. Multi elektrode arrays i stigende grad nyttige værktøjer til at studere virkningerne af narkotika på netværk aktivitet in vitro. Der er flere systemer på markedet, og selv om der er variationer i antallet af elektroder, type og kvalitet af elektrode-array og analyse software, de grundlæggende principper, og data indhentet er den samme på tværs af de forskellige systemer. Selv i øjeblikket begrænset til analyse af to-dimensionelle i vitro kulturer, forbedres disse MEA systemer for at aktivere i vivo netværksaktivitet i hjernen skiver. Her give vi en detaljeret protokol for embryonale eksponering og optagelse neuronal netværksaktivitet og synchrony, sammen med repræsentative resultater.
4, 4′-Isopropylidendiphenol, der almindeligvis omtales som Bisphenol-A eller BPA, findes en anti-oxidant tilsætningsstof i en bred vifte af polycarbonat og epoxy harpiks baseret produkter fra termisk papir, cd’er og splintres bevis glas, på indersiden belægning af drikkevarer dåser. Selv om BPA har været kendt for at være hormonforstyrrende forstyrre agent der efterligner østrogen1, har undersøgelser på dens skadelige virkninger som følge af hverdagens casual eksponering for BPA for det meste kommer ud i de sidste 10 – 15 år. Konsekvenserne af selv lave niveauer af BPA eksponering er mest dybtgående i tidlige udviklingsmæssige perioder, herunder under embryogenese gennem eksponering af mødre2,3. In utero eksponering af kvindelige embryoner til hormonforstyrrende kemikalier har også været forbundet med øget sygdom modtagelighed fra vaginal til breast cancer4,5. Dyreforsøg har vist eksponering for BPA fører til atypiske hjernens struktur og funktionelle abnormiteter manifesteret i adfærd6. Som følge heraf har været forbudt brugen af BPA i spædbarn sutteflasker af mest reguleringsorganer i Europa og Nordamerika, herunder FDA. For at overholde regler, har mange producenter skiftet til 4, 4′-sulfonyldiphenol eller bisphenol-S (BPS). Baseret på det faktum, at BPA og BPS er strukturelle analogstoffer deraf, og at de seneste rapporter viste sammenlignelige potens af BPS i østrogene transskription7, er det vigtigt at undersøge toksiciteten af denne sammensatte forhold til BPA.
Her beskriver vi en protokol for at teste effekten af BPA (og andre EDC) på netværk af neuroner ved hjælp af en hvirveldyr model, kylling embryo. In vitro kulturer af neuroner udgør synaptic kontakter og generere handling potentialer (også kaldet pigge). Spiking aktiviteten af disse kulturer kan registreres ved hjælp af multi elektrode array (MEA) systemer. Spikes er anses for at være i synchrony, når de opstår inden for 5 ms af hinanden. Indledende tilfældige spiking aktivitet, der i sidste ende synkroniserer er et centralt element for at udvikle neuronal netværk8,9. Synchrony kan måles ved hjælp af forskellige metoder og flere algoritmer er beskrevet i litteraturen9,10,11. I vores analyser bruger vi en algoritme udviklet af Paiva og kollegaer12 , som er integreret i den optagelse software, som drev MEA erhvervelse system. Den robuste spiking aktivitet af embryonale chick neuroner giver en prototype for at studere effekten af BPA på neurale netværk aktivitet13. Brug af multi elektrode arrays til at optage spiking aktivitet, konstaterede vi, at BPA eksponering hæmmer udviklingen af neuronal spiking synchrony9,14. Her give vi en detaljeret metode til at studere BPA eksponering på kylling embryo neuroner i kultur sammen med repræsentative resultater på udviklingen af neuronal spiking synchrony i chick embryonale kulturer.
Faser af hurtig vækst og udvikling såsom embryogenese er særligt sårbare over for de skadelige virkninger af forskellige hormonforstyrrende stoffer herunder BPA. Vi leverer detaljerede protokoller for at studere virkningerne af BPA eksponering i en in vitro- hvirveldyr neuronal netværksmodel. Ved hjælp af denne protokol, etableret vi at BPA sænker spike sats samt synchrony indekset i de udviklende neuronal netværk (figur 2a-b).
Vores metode var designet til at studere BPA eksponering under tidlige embryogenese og nemt kan tilpasses for at studere virkningerne af andre EDC. Embryonale neuronal kulturer fra chick er relativt let at etablere i forhold til andre hvirveldyr modeller, herunder rotte eller mus. Desuden er der ingen krav om en separat animalske rum — en simpel inkubator på et laboratoriebænk er tilstrækkelige til at udføre disse assays. Vi beskriver brugen af en multi elektrode system (MEA) for at vurdere effekten af EDC, BPA, på netværksaktivitet. De protokoller er beskrevet her kan anvendes på andre systemer. Et kritisk aspekt i denne protokol er vedligeholdelse af sterilitet. Dette omfatter dissektion af embryo under sterile forhold — sterilisering af instrumenter med 70% ethanol og brug af sterile Hank afbalanceret salte løsning er tilstrækkelig. Da data er indsamlet over en periode på uger, er det afgørende at opretholde steril håndtering af de multilaterale miljøaftaler. Neuronal kulturer en gang etableret kan være kulturperler langvarig – op til tre måneder – og er derfor nyttig for at studere langtidseksponering EDC og andre forbindelser på neuronal netværk. Et andet vigtigt aspekt af denne protokol er tiden fra dissektion til plating. Det optimale tidspunkt er 30 min, herunder inkubation af væv med trypsin. Jo længere den tid, det tager, jo dårligere overlevelse af celler.
Vi beskriver her en grundlæggende protokol, der kan anvendes til vurdering af eventuelle kemiske eller stof, der påvirker adfærd og neurale funktion. Her, har vi brugt en celle tæthed af 2.200 celler pr. mm2; men dette kan ændres og andre celle tætheder kan bruges. Generelt har vi fundet at øge celle tæthed øger netværksaktivitet – flere pigge på kortere tid. Metoden beskrevet, selvom meget nyttigt i vurderingen af virkningerne af kemikalier på netværksaktivitet har begrænsninger. En af de største begrænsninger af metoden er, at disse in vitro kulturer er to dimensionelle ikke måske afspejler den tre-dimensionelle arkitektur af hvirveldyr hjernen. Dette kan løses ved hjælp af skive optagelser. Et andet alternativ er at anvende behandlingerne til at udvikle kylling embryo af betyder i et lille vindue skåret på den brede ende af æg15, dissekere hjernen i slutningen af behandlingsregime, gøre tykke sektioner på en vibratome og sted på MEA for optagelse netværksaktivitet.
Vores protokol er væsentlig, idet det giver mulighed for undersøgelse af effekten af EDC på udviklingen af netværksaktivitet og tilbyder udforskning af en mekanistisk grundlag for virkningerne af disse kemikalier.
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse er støttet af NSF (HBCU-UP forskning indledning Award, HRD 1401426 og EPSCoR EPS-0814251) og NIH (COBRE 1P20GM103653-01A1). K.S. understøttes af et stipendium fra Delaware INBRE-III 6404.
#5 foreceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
Axion Muse MEA | Axion Biosystems | M64-GL1-30Pt200 | Will be called MEA system in manuscript |
Axis Software | Axion Biosystems | Will be called recording software in the manuscript | |
BPA | Sigma-Aldrich | 239658-250g | |
curved forceps | Fine Science Tools | 11272-50 | |
EtOH | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
Fertilized chicken eggs | from any local farm or Spafas | ||
HBSS | Fisher | 14170112 | |
Hemacytometer | Fisher | 02-671-6 | |
Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free | BD Biosciences | 356231 | Will be called Extra Cellular Matrix (ECM) in the manuscript |
Neurobasal medium | BrainBits | Nb4-500 | |
Neuroexplorer statistical software | Nex Technologies | Neuroexplorer version 5 | |
Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20A | |
spring scissors | Fine Science Tools | 15514-12 | |
Sylgard bottom dissection dishes | Living Systems Instrumentaion | DD-90-S-BLK-3PK | |
Trypan Blue dye | Fisher | 15-250-061 | |
Trypsin-EDTA | Fisher | 15400054 |