Summary
Exposition à des toxines environnementales peut nuire gravement embryons en développement. Perturbateurs endocriniens tels que bisphénols sont défavorablement connus pour affectent le système nerveux. Nous décrivons ici un protocole utilisant un modèle de réseau neuronal in vitro vertébré (embryon de poulet) pour étudier l’impact fonctionnel d’exposition de la toxine sur les embryons au début.
Abstract
Bis-phénols, tels que bis-phénol A (BPA) et bis-phénol-S (BPS), sont polymérisant agents largement utilisés dans la production de plastiques et de nombreux produits de consommation courante. Ils sont classés comme des perturbateurs endocriniens (EDC) ayant des propriétés estradiol. Une exposition prolongée aux perturbateurs endocriniens, même à faibles doses, a été liée avec divers défauts de santé, y compris le cancer, des troubles du comportement et l’infertilité, avec une vulnérabilité accrue au cours des périodes de développement précoces. Afin d’étudier les effets du BPA sur le développement de la fonction neuronale, nous avons utilisé un en vitro neuronal réseau dérivé du cerveau embryonnaire précoce poussin comme modèle. Nous avons constaté que l’exposition au BPA affecté le développement de l’activité réseau, enrichissements spécifiquement l’activité et la synchronisation. Un changement dans l’activité du réseau est le lien essentiel entre la cible moléculaire d’un médicament ou composé et son effet sur les résultats comportementaux. Rangées d’électrodes multiples sont de plus en plus des outils utiles pour étudier les effets des drogues sur réseau activité in vitro. Il existe plusieurs systèmes disponibles sur le marché et, bien qu’il y a des variations dans le nombre d’électrodes, le type et la qualité des électrodes et le logiciel d’analyse, les principes de base sous-jacents, et les données obtenues est le même à travers la différents systèmes. Bien qu’actuellement limité à l’analyse des deux dimensions in vitro de cultures, ces systèmes MEA sont étant améliorées pour permettre in vivo l’activité réseau dans des tranches de cerveau. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour exposition embryonnaire et consigner l’activité réseau neuronal et synchronie, ainsi que des résultats représentatifs.
Introduction
4, 4′-Isopropylidènediphénol, communément sous le nom de bisphénol-A ou BPA, est un additif antioxydant trouvé dans une grande variété de polycarbonate et époxy résine basé produits allant du papier thermosensible, CD et shatter proof verre, à l’intérieur enduit de canettes de boissons. Bien que le BPA a été connu pour être un agent de perturbateurs endocrinien qui imite les œstrogènes1, études sur ses effets néfastes en raison de tous les jours occasionnelle exposition au BPA sont pour la plupart sortis dans les 10-15 dernières années. Les conséquences de même de faibles niveaux d’exposition au BPA sont plus profondes dans les périodes de développement précoces, y compris au cours de l’embryogenèse à travers l’exposition des mères2,3. Exposition in utero des embryons féminins aux perturbateurs endocriniens a également été associée à une sensibilité accrue de la maladie de vaginale à breast cancer4,5. Les études animales ont démontré à l’exposition au BPA conduit à la structure du cerveau atypique et anomalies fonctionnelles que qui se manifestés dans le comportement de6. En conséquence, l’utilisation du BPA dans les biberons a été interdite par les organismes de réglementation plus en Europe et en Amérique du Nord, y compris la FDA. Pour se conformer à la réglementation, de nombreux fabricants ont opté pour 4, 4'-sulfonyldiphenol ou bisphénol-S (BPS). Basé sur le fait que le BPA et BPS sont des analogues structuraux et que les rapports récents montraient une puissance comparable de BPS transcription oestrogéniques7, il est important d’étudier la toxicité de ce composé par rapport au BPA.
Nous décrivons ici un protocole pour tester les effets du BPA (et autres perturbateurs endocriniens) sur les réseaux de neurones en utilisant un modèle de vertébrés, l’embryon de poulet. Les cultures in vitro de neurones forment des contacts synaptiques et génèrent des potentiels d’action (aussi appelés pointes). La fortification de l’activité de ces cultures peut être enregistrée à l’aide de systèmes multiples électrodes (MEA). Pointes sont réputées être en synchronie, lorsqu’ils se produisent au sein de l’autre de 5 ms. Activité de fortification aléatoire initiale qui synchronise éventuellement est un élément clé du développement de réseaux de neurones8,9. Synchronie peut être mesurée à l’aide de diverses méthodes et plusieurs algorithmes sont décrits dans la littérature9,10,11. Dans nos analyses, nous utilisons un algorithme développé par12 Paiva et collègues de travail qui est intégré dans le logiciel d’enregistrement qui alimente le système d’acquisition de MEA. L’activité de fortification robuste des neurones de l’embryon de poulet fournit un prototype pour étudier les effets du BPA sur réseau neuronal activité13. L’utilisation de tableaux multi-électrode à l’activité de fortification record, nous avons observé que l’exposition au BPA inhibe le développement de neuronale fortification synchronie9,14. Ici, nous fournissons une méthodologie détaillée pour l’étude d’exposition au BPA sur les neurones embryon de poussin en culture ainsi que des résultats représentatifs sur le développement de neurones synchronisme fortification en cultures embryonnaires de poulets.
Protocol
Le protocole ci-dessous a été normalisé pour tester les effets de l’exposition au BPA durant l’embryogenèse (au début) et peut-être être modifié pour une utilisation avec BPS, BPF ou autre EDC en neurones embryonnaires de poussin.
Ce protocole suit les politiques institutionnelles du Delaware State University et la politique des NIH pour les embryons aviaires. Le protocole est également en confirmation avec le matériel et les consignes de sécurité chimique du mémorandum d’accord.
1. matériau installation
- Dissoudre le BPA (m.w. 228.29) dans l’éthanol à 10 % (v/v) dans l’eau pour faire une solution mère de 1 mM (0,23 mg / mL d’éthanol à 10 %). Préparer des dilutions suivantes (0,1 µM, 0,5 µM, 1 µM, 5 µM et 10 µM) dans un milieu neurobasal.
ATTENTION : Le BPA est une toxine environnementale et il fallait être prudent lorsque vous manipulez la poudre. - Incuber des oeufs de poulet dans un incubateur de œufs de table disponible dans le commerce à 37 ° C. Incuber les œufs pendant 7 jours pour les embryons de E7.
- Préparer mesure stériliser le nombre requis d’ame tremper dans de l’éthanol à 70 % pendant 3 à 4 h, puis rincer trois fois dans environ 10 mL d’eau distillée stérile dans la hotte BSLII.
Remarque : L’Ame contient 64 électrodes de platine nanoporeux disposés dans une grille 8 x 8. Le diamètre de l’électrode est 30 µm et l’espacement entre les électrodes est de 200 µm. Ne pas utiliser de l’éthanol dénaturé pour stériliser l’Ame que cela conduira à la corrosion de l’Ame. - Placer l’Ame à l’intérieur d’un contenant stérile avec couvercle (pour maintenir des conditions stériles) et passer à un incubateur de dessus de table. Cuire au four pendant au moins 6 heures à 55 ° C. Cette étape est cruciale pour une stérilisation adéquate et la température ne doit pas dépasser 60 ° C. Maintien de la stérilité, déplacez le plat contenant ame à la hotte BSLII pour le stockage avant réutilisation.
Remarque : Nous utilisons un plat allant au four de verre sécurisé de four avec couvercle en plastique et surface il stériliser avec de l’éthanol à 70 % et place dans la hotte BSLII pour le séchage. - Partie aliquote de la solution de la matrice extra-cellulaire mec. Décongeler le flacon à 4 ° C durant la nuit et geler 100 µL d’extraits à-20 ° C.
Remarque : L’ECM est livré congelé. ECM pas devrait être ramené à température ambiante jusqu’au moment pour enduire car il polymérise à température ambiante et, une fois polymérisé, il est impossible de manteau. ECM sans facteurs de croissance est préférable pour éviter des effets supplémentaires en raison de facteurs inconnus. - Stériliser tous les instruments de dissection (pinces Dumont #5, pince courbée, petits ciseaux et ciseaux de printemps) et documents auto-obturant enduit plats de dissection avec 70 % d’éthanol et laissez-les sécher dans la hotte de la dissection.
2. Culture de neurones embryonnaires chick et activité réseau
- Le jour de l’électrodéposition, retirer un flacon de ECM du congélateur-20 ° C, vaporiser avec l’éthanol à 70 % et placer sur la glace. Diluer à 25 % en ajoutant 300 µL de milieu neurobasal froid à l’intérieur de la hotte BSLII.
- En utilisant un P200 pipetteman ajouter 100 µL d’ECM de 25 % au centre de la MEA en prenant soin de ne pas toucher les électrodes et retirez immédiatement laissant une fine pellicule à la surface. Couvrir la MEA et placer dans un incubateur à CO2 (37 ° C et 5 % CO2) jusqu’au moment de la plaque les neurones.
- Stériliser la coque extérieure d’un oeuf de E7 (embryonnaire jour 7, incubée à 37 ° C pendant 7 jours) avec de l’éthanol à 70 %. Décapiter l’embryon dans un plat de dissection de fond Sylgard contenant froid stérile de Hank équilibré sels Solution (HBSS) sans calcium. Coupez autour des yeux et enlevez les globes oculaires. À l’aide de DuMont #5 fine pince et ciseaux printemps faites une incision sur la face ventrale et enlever les couches superficielles de la peau pour exposer le tectum prosencéphale et optique. Peler et retirer la membrane pial soigneusement. Transférer le prosencéphale dans une autre boîte de Pétri et coupez-le en petits morceaux d’environ 2 mm avec des ciseaux de printemps.
Remarque : Il faut éviter tout attachés au prosencéphale après l’ablation de la membrane pial les vaisseaux sanguins. S’il est disponible, il est préférable d’effectuer la dissection sous une hotte à dissection stériles, même si nous avons obtenu des résultats assez bonnes lorsque la dissection est effectuée en dehors d’une hotte, aussi longtemps que les instruments et la zone de dissection sont complètement stérilisés avec l’éthanol à 70 % . - À l’aide d’une pipette stérile, collecter les pièces du cerveau antérieur dans un tube à centrifuger 15 mL et enlevez autant de l’HBSS que possible après avoir laissé les morceaux du prosencéphale évier au fond du tube à centrifuger.
- Ajouter 1 mL de 0.05 % trypsine/EDTA (préalablement chauffé à 37 ° C) et laisser incuber à 37 ° C pendant 15 minutes.
- À l’aide d’une pipette Pasteur, soigneusement retirer la trypsine sans déranger les morceaux de tissus et ajouter 1 mL de milieu de neurobasal. Laisser les morceaux de tissus évier au fond et enlever le milieu. Répéter une fois de plus ce lavage. Cette étape consiste à laver la trypsine/EDTA.
- Ajouter 2 mL de milieu de neurobasal et de commencer la trituration. Trituration consiste à prendre une pipette stérile de Pasteur feu poli et en passant le tissu à travers plusieurs fois doucement jusqu'à ce qu’aucuns plus de morceaux de tissus ne sont visibles. Si tous les morceaux restent après passes répétées, juste les laisser se déposer au fond.
Remarque : Éviter de faire mousser tout en trituration - si la mousse forment, arrêter et supprimer par aspiration. - Diluer les cellules remises en suspension 01:10 avec support neurobasal et compter les cellules viables à l’aide de colorant bleu Trypan et un hémocytomètre. Mélanger 50 µL de cellules dilués avec 50 µL de solution de bleu de Trypan dans un tube à centrifuger 0,5 mL. Ajouter 10 µL de la Hémacytomètre après avoir placé sur la lamelle couvre-objet et compter les cellules clairs brillants (cellules bleues sont morts et ne devraient pas être comptées).
NOTE : Typiquement nombre de cellules d’une plage de tectum optique E7 unique compris entre 1 et 5 x 107 cellules/mL. - Plaque de la dissociation des cellules sur ECM enduit ame à une densité de 2 200 cellules/carré mm. Pour notre système MEA, cela se traduit par environ 130 000 cellules par la MEA. Ajouter neurobasal moyen pour porter le volume à la MEA à 1 mL et placez les AEM dans un incubateur à CO2 pendant la nuit pour la fixation des cellules et des neurites extension (Figure 1).
Remarque : Pour l’ame des différents domaines et des numéros de l’électrode, la densité des différentes cellules pouvait être jugée - en général, une densité cellulaire plus élevée se traduit par une plus grande activité du réseau, mais conduit également à des cultures vécues plus courtes. - Le lendemain, ajouter BPA à une concentration finale de 10 µM dans un milieu neurobasal de la crosse de 1 mM faite à l’étape 1.1 à l’AEM traitée. Au contrôle MEA, ajouter le même volume de l’éthanol de 10 % en solution aqueuse (v/v).
- Moyen de remplacer passé avec neurobasal un milieu contenant 10 µM BPA tous les deux jours jusqu'à 7 jours in vitro (7DIV) et tous les jours par la suite, que l’augmentation de l’activité réseau.
Remarque : Comme l’activité réseau augmente, augmente l’activité métabolique et changements de médias doivent être plus fréquentes. Ne laissez pas le milieu tourner à orange.
3. enregistrement de l’activité réseau Neuronal
- Le jour de l’acquisition, échanger le milieu de culture avec neurobasal frais moyen et regagner l’Ame de l’incubateur à CO2 pendant au moins 2 h avant l’enregistrement. Démarrer le logiciel d’enregistrement et de régler la température de la MEA à 37 ° C en cliquant sur l’icône de température (supplémentaire Figure 3. 1 a-b).
NOTE : Enregistrement peut commencer dès que le jour 3 du bordé et peut continuer aussi longtemps que les cultures sont en vie. - Définir les paramètres de l’acquisition par un clic droit sur l’icône « Muse » (selon les axes dans le panneau de gauche de la fenêtre) et choisissez « Ajouter Processing » et « Détecteur de Spike » et cliquez sur OK dans la fenêtre pop up. « Détecteur de spike (6 x STD) » apparaîtra sous le nom de fichier (supplémentaire Figure 3. 2 a-b).
- Ensuite, faites un clic droit sur le détecteur de Spike, sélectionnez « Ajouter la transformation » et « Détecteur de Burst » et cliquez sur OK dans la fenêtre pop up. « Détecteur de burst » (ISI) apparaîtra sous l’icône de Muse (supplémentaire Figure 3. 3 a-b).
- Ensuite faites un clic droit sur le détecteur de Burst, sélectionnez « Ajouter Processing » et « Neural statistiques Compiler. » Dans la fenêtre pop-up, vérifiez que le fichier en-tête, agrégées bien statistiques et Synchrony sont sélectionnés. Cliquez sur OK. « Compiler des statistiques » apparaîtra en dessous (supplémentaire Figure 3. 4 a-b).
NOTE : Cette fonction définira le franchissement de seuil adaptatif (filtre de STD 6 x), l’intervalle inter-spike à 100 ms avec un nombre minimal de pointes à 5, le moyen tiré de détection du taux à 10 s avec un paramètre de synchronie à 20 ms et le taux minimal de spike à pointes 0,083333 / min. - Configurer l’enregistrement programmé pour la durée d’enregistrement de 5 minutes (300 000 ms) en cliquant sur l’icône de l’horloge en bas. Ceci est réalisé en modifiant les informations contenues dans la section de configuration pour enregistrer toutes les minutes 5,1 et enregistrer pendant 5 minutes. Cela démarre immédiatement et sera exécutée une fois (Supplemental Figure 3.5).
- Veiller à ce que la température de la MEA a atteint 37 ° C avant de passer la MEA. Retirer l’Ame de l’incubateur, placez-le sur l’unité d’enregistrement et de verrouiller la MEA. Démarrer l’enregistrement de l’activité du réseau en cliquant sur le dossier de démarrage dans la section enregistrement programmé ou sur l’icône enregistrement dans la fenêtre « Fichier Play ». En règle générale, un temps d’enregistrement de 5 minutes (300 000 ms) est suffisant, même si des enregistrements plus longs jusqu'à 10 minutes peuvent être obtenues.
- Après l’enregistrement, remettez la MEA dans l’incubateur.
Remarque : Veiller à maintenir la stérilité et à réduire le temps de que la MEA est en dehors de l’incubateur.
4. analyse des données
- Analyse des données brutes peut se faire en mode hors connexion en utilisant le logiciel d’enregistrement. Cliquez sur le menu déroulant fichier et ouvrir l’enregistrement. Sélectionnez le fichier de données brutes à analyser. Relire les enregistrements bruts pour capturer les paramètres requis de fortification.
- Pour obtenir le nombre moyen de pointes, utilisez le module détecteur de Spike et pour obtenir l’Index de synchronie, utiliser le module neuronal statistiques du compilateur.
- Charger le Spike détecteur, détecteur de rafale et de statistiques du compilateur Modules comme avant (Section 3).
- Dans les menus déroulants dans le détecteur de Spike, détecteur de Burst et statistiques du compilateur module windows, sélectionnez liste de Spike, réseau Burst liste et Advanced Metrics, respectivement.
- Cliquez sur le bouton d’enregistrement pour commencer à enregistrer le fichier de données qui permettra de créer un fichier .csv dans le dossier réalisé. Les paramètres de spike - le nombre total de clous ou de l’Index de synchronie - seront enregistrées dans le fichier .csv.
Remarque : analyse en temps réel lors de l’enregistrement des données brutes est déconseillé car cela pourrait consommer de temps processeur et ressources informatiques.
Representative Results
Nous avons examiné les effets du BPA sur le développement de synchronisme dans les cultures neuronale d’embryons de poulets. Synchronisation de l’activité de fortification est un indicateur de l’évolution normale des réseaux neuronaux in vitro. Lorsque deux pointes se produisent au sein de 5 ms de l’autre, ils sont considérés comme synchrones. Cultures de neurones in vitro présentent initialement une activité fortification aléatoire — pointes se produisent au hasard et les intervalles inter-spike montrent une distribution normale. Les cultures à maturité, l’activité de fortification devient plus synchronisée et les intervalles inter-spike sont constants. Activité de fortification synchrone d’une culture a été quantifiée par analyse de corrélation croisée de l’épi fois utilisant un enregistrement logiciel12 pour calculer un indice de synchronie (SI). Nous avons trouvé qu’exposition au BPA affecte développement activité réseau en réduisant l’activité de fortification et l’index de synchronie (Figure 2a et 2 b). En résumé, nous avons montré que les effets néfastes de l’exposition au BPA sur un embryon impact sur son développement, y compris la fonction neuronale qui peut être évaluée grâce au développement de synchronisme dans les neurones de poussin dans la culture.
Figure 1 : Schématique du protocole décrivant les étapes de la dissection du cerveau antérieur poussin à la dissociation, placage et l’enregistrement de l’activité réseau. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : (A) le nombre moyen de pointes est significativement plus faible chez BPA traités E7 cultures prosencéphale de poulets par rapport aux cultures de contrôle. Le nombre moyen de pointes a été extrait en utilisant le logiciel d’enregistrement. Les moyens (contrôle, 14 890 ± 949.0, N = 15 et BPA, ± 5 624 465,9, N = 22) différaient significativement (test-t non apparié, p < 0,0001). (B) l’indice moyen de synchronie (SI) est significativement plus faible chez BPA traités E7 cultures prosencéphale de poulets par rapport aux cultures de contrôle. Le SI a été extrait en utilisant le module neuronal statistiques du compilateur dans le logiciel d’enregistrement. Les moyens SI (contrôle, 0.5159 ± 0.06547 N = 15 et BPA, 0.1140 ± 0.01840 N = 22) différaient significativement (test-t non apparié, p < 0,0001). Barres d’erreur représentent déviation standard. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Discussion
Phases de croissance rapide et de développement tels que l’embryogenèse sont particulièrement vulnérables aux effets néfastes des divers composés perturbant le système endocrinien, notamment BPA. Nous fournissons des protocoles détaillés pour étudier les effets de l’exposition au BPA dans un modèle de réseau neuronal vertébrés in vitro . Utilisant ce protocole, nous avons établi que le BPA abaisse le taux de pointe ainsi que l’index de synchronie dans le développement de réseaux neuronaux (Figure 2a-b).
Notre méthodologie a été conçu pour étudier l’exposition au BPA durant l’embryogenèse précoce et peut être facilement adapté pour étudier les effets d’autres perturbateurs endocriniens. Les cultures de neurones embryonnaires de l’oisillon sont relativement faciles à mettre en place par rapport aux autres modèles de vertébrés, y compris le rat ou la souris. Plus, il n’y a aucune exigence pour une animalerie distinct — un incubateur simple sur un banc de laboratoire est suffisant pour procéder à ces tests. Nous décrivons l’utilisation d’un système d’électrodes multiples (MEA) pour évaluer l’effet de la CED, BPA, sur l’activité du réseau. Les protocoles décrits ici peuvent être appliqués à d’autres systèmes. Un aspect essentiel de ce protocole est le maintien de la stérilité. Cela inclut la dissection de l’embryon dans des conditions stériles, stérilisation des instruments avec l’éthanol à 70 % et l’utilisation de la Solution de sels équilibré de Hank stérile est suffisante. Comme les données sont collectées pendant des semaines, il est essentiel de maintenir la manipulation stérile des AME. Les cultures de neurones dès sa créés peuvent être cultivées à long terme - jusqu'à trois mois — et sont donc utiles pour l’étude d’une exposition prolongée à des perturbateurs endocriniens et d’autres composés sur un réseau neuronal. Un autre aspect important de ce protocole est le temps de dissection à placage. Le temps optimal est de 30 min, y compris l’incubation du tissu avec la trypsine. Plus le temps, plus la survie des cellules.
Nous décrivons ici un protocole de base qui peut être appliqué à l’évaluation de tout produit chimique ou de la drogue qui affecte le comportement et la fonction neurale. Ici, nous avons utilisé une densité cellulaire de 2 200 cellules / mm2; Cependant, ceci peut être modifié et autres densités cellulaires peuvent être utilisées. En général, nous avons trouvé qu’augmenter la densité des cellules augmente l’activité du réseau - pointes plus en moins de temps. La méthode décrite, bien que très utile dans l’évaluation d’effets des produits chimiques sur l’activité réseau a-t-elle des limites. L’une des plus grandes limites de la méthode est que ces cultures in vitro sont deux dimensions peuvent ne pas refléter l’architecture tridimensionnelle du cerveau des vertébrés. Cela peut être surmonté en utilisant des enregistrements de la tranche. Une autre alternative est d’appliquer les traitements à l’embryon de poulet en développement de moyens d’une petite fenêtre, découper à l’extrémité large de l' œuf15, disséquer le cerveau à la fin du schéma thérapeutique, faire des coupes épaisses sur un vibratome et placez-la sur la MEA pour enregistrement de l’activité réseau.
Notre protocole est important car il permet l’examen de l’effet des perturbateurs endocriniens sur le développement de l’activité du réseau et propose l’exploration d’une base mécanique pour les effets de ces substances chimiques.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas des intérêts concurrents.
Acknowledgments
Cette étude est financée par la NSF (HBCU-UP recherche Initiation Award, HRD 1401426 et EPSCoR EPS-0814251) et le NIH (COBRE 1P20GM103653-01 a 1). K.S. est soutenu par une bourse de la Delaware INBRE-III 6404.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 foreceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Axion Muse MEA | Axion Biosystems | M64-GL1-30Pt200 | Will be called MEA system in manuscript |
| Axis Software | Axion Biosystems | Will be called recording software in the manuscript | |
| BPA | Sigma-Aldrich | 239658-250g | |
| curved forceps | Fine Science Tools | 11272-50 | |
| EtOH | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| Fertilized chicken eggs | from any local farm or Spafas | ||
| HBSS | Fisher | 14170112 | |
| Hemacytometer | Fisher | 02-671-6 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free | BD Biosciences | 356231 | Will be called Extra Cellular Matrix (ECM) in the manuscript |
| Neurobasal medium | BrainBits | Nb4-500 | |
| Neuroexplorer statistical software | Nex Technologies | Neuroexplorer version 5 | |
| Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20A | |
| spring scissors | Fine Science Tools | 15514-12 | |
| Sylgard bottom dissection dishes | Living Systems Instrumentaion | DD-90-S-BLK-3PK | |
| Trypan Blue dye | Fisher | 15-250-061 | |
| Trypsin-EDTA | Fisher | 15400054 |
References
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