Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

הערכת ההשפעה של משבשי תרכובות על הפיתוח של רשת עצבית חוליות הפונקציה באמצעות אלקטרודה מרובה מערכים

Published: April 26, 2018 doi: 10.3791/56300
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Delaware State University

Summary

חשיפה ל: רעלנים סביבתיים יכולים להשפיע בחריפות עוברי המתפתח. משבשי כגון bisphenols ידועים להשפיע לרעה על מערכת העצבים. כאן נתאר פרוטוקול באמצעות מודל הרשת העצבית בעלי חוליות (אפרוח העובר) במבחנה לחקור את ההשפעה הפונקציונלית של חשיפה הרעלן על עוברי מוקדם.

Abstract

Bis-פנולים, כגון bis-פנול A (BPA) ו- bis-פנול-S (BPS), הם polymerizing סוכנים שימוש נרחב בייצור של פלסטיק ומוצרים רגילים רבים. הם מסווגים כ תרכובות disrupting האנדוקרינית (EDC) עם תכונות כמו אסטרדיול. חשיפה ארוכת טווח והריון, אפילו במינונים נמוכים, חובר פגמים בריאות שונים, כולל סרטן, הפרעות התנהגות, בעיות פוריות, עם פגיעות רבה יותר בתקופות התפתחותי מוקדם. לחקור את ההשפעות של BPA על הפיתוח של תפקוד, השתמשנו במבחנה עצביים רשת נגזר מן המוח העוברי צ'יק מוקדם כמודל. מצאנו כי החשיפה BPA מושפעים התפתחות פעילות רשת, עולה במפורש פעילות וסנכרון. שינוי פעילות רשת הוא החוליה מכריע בין המטרה מולקולרית של תרופה או תרכובת והשפעתו על התוצאה ההתנהגותית. מערכים רב אלקטרודה הופכים יותר ויותר כלים שימושיים כדי ללמוד את השפעות הסמים על פעילות הרשת בתוך חוץ גופית. יש מספר מערכות זמינים בשוק והיא, למרות ישנן וריאציות מספר אלקטרודות, את סוג ואיכות את האלקטרודות ותוכנות אנליזה, עקרונות היסוד הבסיסיים, והשיג הנתונים זהה לרוחב מערכות שונות. למרות מוגבל כרגע ניתוח של תרבויות מימדי במבחנה , להיות שיפור מערכות MEA אלה כדי לאפשר ויוו פעילות רשת פרוסות המוח. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור חשיפה עובריים והקלטת synchrony, יחד עם התוצאות נציג ופעילות הרשת העצבית.

Introduction

4, 4 ′-Isopropylidenediphenol, שכיח כמו שנקרא ביספינול-A או BPA, תוסף נוגד חמצון נמצא מגוון רחב של פוליקרבונט, אפוקסי שרף המבוסס על המוצרים החל נייר תרמי, תקליטורים, ניפוץ הוכחה זכוכית, הפנימי ציפוי של פחיות משקה. למרות BPA ידוע להיות סוכן disrupting האנדוקרינית כי מחקה אסטרוגן1, מחקרים על השפעותיו חולה עקב כל יום מזדמנים החשיפה ל- BPA הגיעו בעיקר 10 – 15 שנים האחרונות. ההשלכות של גם רמות נמוכות של חשיפה BPA הם העמוקים ביותר בתקופות התפתחותי מוקדם, לרבות במהלך מופרה באמצעות חשיפה של אמהות2,3. בתוך הרחם חשיפה של העוברים הנקביים משבשי גם נקשר רגישות מוגברת המחלה מן הנרתיק השד סרטן4,5. מחקרים שנעשו בבעלי חיים הראו החשיפה ל- BPA מוביל במבנה המוח לא טיפוסיות חריגות תפקודית באה לידי ביטוי בהתנהגות6. כתוצאה מכך, השימוש של BPA בתוך בקבוקי האכלה לתינוק כבר אסרו על סוכנויות תקינה ביותר ב אירופה, צפון אמריקה, כולל ה-FDA. בהתאם לתקנות, יצרנים רבים עברו 4, 4'-sulfonyldiphenol או ביספנול-S (BPS). מבוסס על העובדה כי BPA BPS הם מקבילים מבניים כי דיווחים אחרונים הראו דומות בעצמת BPS שעתוק אסטרוגניים7, חשוב ללמוד הרעילות של זה יחסית המורכב BPA.

כאן נתאר פרוטוקול כדי לבחון את ההשפעה של BPA (וגם אחרים והריון) ברשתות של נוירונים באמצעות מודל של חוליות, העובר צ'יק. תרבויות במבחנה של נוירונים ליצור קשרים סינפטיים וצור פוטנציאל פעולה (נקרא גם קוצים). ניתן להקליט את פעילות spiking תרבויות אלה שימוש במערכות מרובות האלקטרודות (מאה). קוצים נחשבים בסנכרון כאשר הם מתרחשים בתוך 5 מילי-שניות אחד את השני. הראשונית אקראי spiking פעילות המסנכרנת בסופו של דבר היא תכונה מרכזית של פיתוח רשתות עצביים8,9. Synchrony ניתן למדוד בשיטות שונות, אלגוריתמים שונים מתוארים בספרות9,10,11. בניתוח שלנו, אנו משתמשים באלגוריתם שפותחה על ידי פייבה ועמיתים12 אשר משולב תוכנת הצריבה אשר מניע את מערכת רכישה MEA. הפעילות spiking חזקים של נוירונים מתחלקים חומוס מספק אב טיפוס לימוד ההשפעה של BPA על הרשת העצבית פעילות13. באמצעות אלקטרודה רב מערכי פעילות שיא עולה, הבחנו כי חשיפה BPA מעכב את התפתחות עצביים עולה synchrony9,14. כאן, אנו מספקים מתודולוגיה מפורט עבור הלומדים BPA חשיפה על הבחורה הנוירונים העובר בתרבות יחד עם נציג תוצאות על התפתחות עצביים synchrony עולה בתרבויות עובריים צ'יק.

Protocol

פרוטוקול כדלקמן יש כבר סטנדרטית כדי לבחון את ההשפעה של חשיפה BPA במהלך מופרה (מוקדם), עשוי להיות שונה לשימוש עם BPS, BPF או אחרים EDC בנוירונים עובריים צ'יק.

פרוטוקול זה עוקב אחר את מדיניות מוסדית של אוניברסיטת מדינת דלאוור המדיניות NIH עבור עוברי העופות. הפרוטוקול גם הוא באישור עם חומר והנחיות בטיחות כימית של DSU.

1. חומרים ההתקנה

  1. להמיס BPA (m.w. 228.29) 10% אתנול (v/v) מים כדי ליצור פתרון מניות 1 מ מ (0.23 מ"ג לכל מיליליטר 10% אתנול). להפוך דילולים עוקבות (מיקרומטר 0.1 0.5 מיקרומטר, 1 מיקרומטר, 5 מיקרומטר, 10 מיקרומטר) neurobasal בינונית.
    זהירות: BPA היא רעלן סביבתי ועבר טיפול צריך להיות בעת טיפול האבקה.
  2. דגירה ביצים חומוס חממה ביצה שולחן זמינים מסחרית ב 37 º C. תקופת דגירה הביצים של 7 ימים עבור עוברי E7.
  3. להכין את MEAs. Sterilize את המספר הנדרש של לי למסמס אתנול 70% עבור 3 עד 4 h ולשטוף לאחר מכן שלוש פעמים כ 10 מ ל מים מזוקקים סטריליים בשכונה BSLII.
    הערה: לי להכיל 64 אלקטרודות nanoporous פלטינה מסודרים של רשת 8x8. קוטר אלקטרודה היא 30 מיקרומטר והיא המרווח בין האלקטרודות 200 מיקרומטר. אל תשתמש אתנול שפגע בסימני לחיטוי לי את כל זה יוביל קורוזיה של כר הדשא.
  4. מקם את אותי בתוך מיכל סטרילי עם מכסה (כדי לשמור על תנאים סטריליים) ולעבור חממה מלמעלה בטבלה. אופים במשך לפחות 6 שעות-55 מעלות צלזיוס. שלב זה הוא קריטי עבור עיקור הנכונה ואת הטמפרטורה לא יעלה על 60 מעלות צלזיוס. שמירה על עקרות, להעביר את המנה המכיל לי מכסה המנוע BSLII לאחסון עד להמשך השימוש.
    הערה: אנו משתמשים צלחת תנור אפיה בטוח זכוכית עם מכסה פלסטיק, משטח לעקר אותה עם 70% אתנול והמקום בשכונה BSLII לייבוש.
  5. Aliquot הפתרון סלולרית נוספת מטריקס ECM. להפשיר את המבחנה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה ומקפיאים 100 aliquots µL ב-20 ° C.
    הערה: ה-ECM משווק קפוא. ECM לא טיכסו לטמפרטורת החדר עד מוכן כדי המעיל כמו זה polymerizes בטמפרטורת החדר, לאחר polymerized, זה בלתי אפשרי. את המעיל. ECM ללא גורמי גדילה הוא העדיף כדי למנוע השפעות נוספות בשל גורמים לא ידועים.
  6. לעקר כל כלי חיתוך (דומונט #5 מלקחיים מלקחיים מעוקל, מספריים קטנות, מעיין מספריים), חומר איטום עצמית מצופה לנתיחה מנות עם 70% אתנול ולתת להן להתייבש בשכונה לנתיחה.

2. חומוס נוירון עובריים תרבות, פעילות רשת

  1. ביום של ציפוי, להסיר את בקבוקון של ECM מהמקפיא-20 ° C, לרסס עם 70% אתנול, ומניחים על קרח. לדלל כדי 25% על-ידי הוספת 300 מדיום קר neurobasal µL בתוך BSLII הוד.
  2. באמצעות P200 pipetteman להוסיף 100 µL של 25% ECM במרכז כר הדשא מטפל לא כדי לגעת האלקטרודות ולהסיר מיד עוזב בשכבה דקיקה על פני השטח. לכסות את כר הדשא ולמקם בחממה2 CO (37 ° C ו- 5% CO2) עד מוכן צלחת הנוירונים.
  3. לעקר את המעטפת החיצונית של ביצה E7 (עובריים יום 7, מודגרות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 7 ימים) עם 70% אתנול. לערוף את העובר לתוך תבשיל לנתיחה התחתון Sylgard המכיל מאוזנת מלחי פתרון (HBSS של האנק סטרילי קר) ללא סידן. לחתוך מסביב לעיניים, להסיר את העיניים. באמצעות דומונט #5 בסדר מלקחיים, מעיין מספריים אעשה חתך בצד הגחוני ולהסיר את השכבות החיצוניות של העור כדי לחשוף את tectum הקדמי ואת הראייה. לקלף ולהסיר בזהירות את הקרום pial. להעביר הקדמי לתוך צלחת פטרי עוד וחותכים אותו לחתיכות קטנות כ- 2 מ מ עם מספריים האביב.
    הערה: לא אמור כל כלי הדם המצורפת הקדמי לאחר הסרת קרום pial. אם זמין, עדיף לבצע את הקרע בשכונה חיתוך סטרילי, למרות לנו להשיג תוצאות טובות למדי בעת ניתוח מתבצע מחוץ ברדס כל עוד מכשירים ואזור לנתיחה ביסודיות סטריליים עם 70% אתנול .
  4. באמצעות פיפטה של העברת סטרילי, לאסוף את השברים של הקדמי לתוך שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל, להסיר כמה HBSS ככל האפשר לאחר שנתת את פיסות הקדמי לשקוע לתחתית הצינור צנטריפוגה.
  5. להוסיף 1 מ"ל של 0.05% (טרום התחמם עד 37 ° C) טריפסין/EDTA דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
  6. באמצעות פיפטה של פסטר, בזהירות להסיר טריפסין מבלי להפריע את פיסות רקמה ולהוסיף 1 מ"ל neurobasal בינונית. . תן את פיסות רקמה לשקוע לתחתית ולהסיר את המדיום. לחזור על השטיפה הזאת פעם נוספת. השלב זה לשטוף את טריפסין/EDTA.
  7. להוסיף 2 מ"ל של מדיום neurobasal ולהתחיל triturating. Trituration כרוך לוקח סטרילי מלוטשים אש פסטר פיפטה ולהעביר את הרקמה דרכו מספר פעמים בעדינות עד אין יותר חתיכות רקמה נראים. אם כל החלקים נשארים לאחר עובר חוזרות ונשנות, פשוט לעזוב אותם ליישב את העניין
    הערה: להימנע קצף בזמן triturating - אם וביצי טופס, להפסיק להסיר על ידי השאיפה.
  8. לדלל את התאים מחדש על תנאי 1:10 neurobasal בינונית ותספור התאים קיימא באמצעות צבע Trypan Blue ו- hemocytometer מערבבים 50 µL של התאים מדולל עם 50 µL של פתרון Trypan Blue שפופרת צנטרפוגה 0.5 mL. להוסיף 10 µL hemacytometer לאחר הצבת coverslip ולספור התאים בהיר בהיר (כחול תאים מתים, לא ייספר).
    הערה: מספרי הטלפון הנייד הטיפוסי מטווח E7 tectum סיב אופטי יחיד בין 1 ל- 5 x 107 תאים למ"ל.
  9. צלחת dissociated של תאים ב- ECM מצופה אותי על צפיפות של תאים/מרובע 2200 מ מ. מערכת MEA שלנו, זה מתרגם לתאים כ 130,000 לכל MEA. הוסף neurobasal בינוני כדי להביא את עוצמת הקול על כר הדשא 1 מ"ל מקום אותי בחממה2 CO ללילה עבור התא מצורף וסיומת neurite (איור 1).
    הערה: כטבעת של אזורים שונים ומספרים אלקטרודה, צפיפויות שונות התא יכול להישפט - באופן כללי, תוצאות פעילות רשת גדולה יותר צפיפות גבוהה יותר של התא, אבל מוביל גם לתרבויות חיו קצר יותר.
  10. למחרת, להוסיף BPA ריכוז סופי של 10 מיקרומטר במדיום neurobasal מן המלאי 1 מ"מ בשלב 1.1 שבוצעו התייחס כר הדשא. אל הפקד MEA, להוסיף באותו אמצעי אחסון של האתנול 10% מים (v/v) פתרון.
  11. החלף בילה בינונית בינונית neurobasal המכיל 10 מיקרומטר BPA בכל יום עד 7 ימים במבחנה (7DIV), כל יום לאחר מכן, כמו עליות פעילות רשת.
    הערה: כפי מגביר פעילות הרשת, מגביר פעילות חילוף החומרים ואת שינויים מדיה צריך להיות תכופים יותר. אל תתנו המדיום להפוך כתום.

3. רישום פעילות הרשת העצבית

  1. ביום הרכישה, להחליף המדיום תרבות neurobasal טריים בינונית וחוזרים לי את החממה2 CO למשך תקופה מינימלית של 2 h לפני הקלטה. הפעלת תוכנת הצריבה והגדר את הטמפרטורה של כר הדשא 37 ° C על-ידי לחיצה על הסמל טמפרטורה (איור משלים 3.1a-b).
    הערה: אפשר להתחיל מוקדם ככל יום 3 של ציפוי והקלטה יכולים להמשיך כל עוד התרבויות הם בחיים.
  2. הגדר את פרמטרי רכישה על ידי לחיצה ימנית על הסמל "מוזה" (תחת זרמים שבלוח החלון השמאלי), בחר "הוסף עיבוד" ואת "ספייק גלאי" ולחצו אישור למעלה חלון פופ. "ספייק גלאי (6 x STD)" יופיע מתחת שם הקובץ (איור משלים 3.2a-b).
  3. לאחר מכן לחץ לחיצה ימנית על גלאי ספייק, בחר "הוסף עיבוד" ואת "גלאי פרץ" ולחץ על אישור בלמעלה חלון פופ. "פרץ גלאי" (ISI) יופיע מתחת לסמל מוזה (איור משלים 3.3a-b).
  4. לאחר מכן לחץ לחיצה ימנית על גלאי פרץ, בחר "הוסף עיבוד" ואת "מהדר סטטיסטיקה עצבית". ב למעלה חלון פופ, ודא כי קובץ כותרת, המצטברים סטטיסטיקה. ובכן, Synchrony נבחרו. לחץ על אישור. "סטטיסטיקה מהדר" יופיע מתחת (איור משלים 3.4a-b).
    הערה: פעולה זו תגדיר מעבר הסף אדפטיבית (מסנן STD x 6), מרווח הזמן בין ספייק ב-100 מילישניות עם מספר מינימלי של קוצים בחמש, הממוצע ירי קצב זיהוי 10 s עם פרמטר synchrony ב- 20 ms, הקצב ספייק המינימלי 0.083333 קוצים לכל מין.
  5. להגדיר את ההקלטה המתוזמנת עבור זמן ההקלטה של 5 דקות (300,000 ms) על ידי לחיצה על סמל השעון בחלק התחתון. זו מושגת על ידי שינוי המידע בסעיף הגדרת כדי להקליט את כל דקות 5.1 ולהקליט במשך 5 דקות. זה יהיה נכתבו באופן מיידי, תבוצע פעם (3.5 איור משלים).
  6. ודא כי הטמפרטורה של כר הדשא הגיעה 37 ° C לפני העברת כר הדשא. להסיר את כר הדשא החממה, להניחה על יחידת הקלטה, נעלו את כר הדשא. . תתחיל להקליט את פעילות הרשת על-ידי לחיצה על רשומת ההתחלה בסעיף הקלטה מתוזמנת או סמל להקליט בחלון "קובץ לשחק" בדרך כלל, זמן ההקלטה של 5 דקות (300,000 ms) מספיקה, למרות ניתן להשיג עוד הקלטות של עד 10 דקות.
  7. לאחר ההקלטה, לחזור כר הדשא החממה.
    הערה: יש לנקוט כדי לשמור על עקרות וכדי למזער את הזמן שכר הדשא נמצא מחוץ החממה.

4. ניתוח נתונים

  1. ניתן לבצע ניתוח של הנתונים הגולמיים במצב לא מקוון באמצעות תוכנת הצריבה. לחץ על קובץ המשיכה למטה בתפריט ופתח הקלטה. בחר את קובץ הנתונים הגולמיים כדי להיות מנותח. החוזר ההקלטות raw כדי ללכוד את הפרמטרים spiking הנדרשים.
  2. כדי לקבל את המספר הממוצע של קוצים, להשתמש במודול ספייק גלאי, להשגת Synchrony מדד, להשתמש במודול מהדר סטטיסטיקה עצבית.
  3. לטעון את ספייק גלאי, גלאי פרץ, סטטיסטיקה מהדר מודולים כמו בעבר (סעיף 3).
  4. בתפריטים נפתחים בתוך הגלאי ספייק, גלאי פרץ, סטטיסטיקה מהדר מודול windows, בחר ספייק רשימה, רשימת הרשתות פרץ, ומדדים מתקדם, בהתאמה.
  5. לחץ על לחצן הרשומה כדי להתחיל להקליט קובץ הנתונים אשר תיצור את קובץ. csv בתיקיה מכוונת. הפרמטרים ספייק - המספר הכולל של קוצים, המדד Synchrony - יירשמו בקובץ. csv.
    הערה: ניתוח בזמן אמת בעת הקלטת נתונים גולמיים לא מומלץ כי זה יכול לצרוך זמן מעבד ומשאבים חישובית.

Representative Results

בדקנו את ההשפעה של BPA על פיתוח synchrony בתרבויות העצבית של העובר צ'יק. סינכרון של עולה פעילות הוא סימן להתפתחות תקינה של רשתות עצביים בתוך חוץ גופית. כאשר שני קוצים להתרחש בתוך 5 מילי-שניות אחד את השני, הם נחשבים סינכרוני. במבחנה תרבויות עצביים בתחילה להציג פעילות עולה אקראי – קוצים מתרחשות באופן אקראי ולהראות המרווחים בין ספייק בהתפלגות רגילה. כל התרבויות בוגר, הפעילות spiking הופך להיות יותר מסונכרנים, המרווחים בין ספייק מתמדת. פעילות סינכרונית עולה של תרבות היה quantitated על ידי ניתוח קרוס-המתאם של ספייק זמני באמצעות הקלטה תוכנה12 להפיק אינדקס Synchrony (SI). מצאנו כי חשיפה BPA משפיעה לרעה פיתוח פעילות הרשת על ידי הפחתת פעילות עולה מדד synchrony (איור 2 ו- 2b). לסיכום, אנחנו הראו כי השפעות מזיקות של BPA חשיפה על העובר משפיעה על התפתחותו, כולל תפקוד זה ניתן לבדיקה באמצעות פיתוח synchrony בנוירונים צ'יק בתרבות.

Figure 1
איור 1: סכמטי של פרוטוקול המתארים את השלבים של דיסקציה של הבחורה הקדמי לדיסוציאציה, יופיצ, ורישום פעילות רשת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: (א) המספר הממוצע של קוצים הוא נמוך משמעותית ב BPA מטופלים E7 צ'יק הקדמי תרבויות לעומת שליטה תרבויות. המספר הממוצע של קוצים שהופק באמצעות תוכנת הצריבה. האמצעים (שליטה, 14,890 ± 949.0, N = 15 ו BPA, ± 5,624 465.9, N = 22) היו שונים באופן משמעותי (אינטראקצית מבחן t, p < 0.0001). (B) האינדקס synchrony הממוצע (SI) הוא נמוך באופן משמעותי ב BPA מטופלים E7 צ'יק הקדמי תרבויות לעומת שליטה תרבויות. סי שהופק באמצעות מודול מהדר סטטיסטיקה עצביים בתוך תוכנת הצריבה. האמצעים סי (שליטה, 0.5159 ± 0.06547 N = 15 ו BPA, 0.1140 ± 0.01840 N = 22) היו שונים באופן משמעותי (אינטראקצית מבחן t, p < 0.0001). קווי שגיאה מתארים את סטיית התקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

שלבי מהיר של גדילה והתפתחות כגון מופרה פגיעים במיוחד להשפעות מזיקות של תרכובות שונות שיבוש אנדוקרינית, כולל BPA. אנו מספקים נתונים היסטוריים פרוטוקולים ללמוד את ההשפעות של חשיפה BPA במודל הרשת העצבית חוליות במבחנה . באמצעות פרוטוקול זה, הקמנו כי BPA מורידה את קצב ספייק, כמו גם מדד synchrony רשתות עצביים המתפתח (איור 2-ב).

המתודולוגיה שלנו תוכנן כדי ללמוד BPA חשיפה במהלך מופרה מוקדם, ניתן להתאים בקלות לחקור את ההשפעות של אחרים והריון. של הבחורה עובריים תרבויות עצביים קלים יחסית להקים לעומת דגמים אחרים חוליות, כולל חולדה או עכבר. יתר על כן, יש ללא דרישה עבור בעלי חיים חדר נפרד — חממה פשוטה על ספסל מעבדה מספיקה לבצע מבחני אלה. אנו מתארים את השימוש של מערכת מרובת אלקטרודה (מאה) להערכת השפעת EDC, BPA, על פעילות רשת. ניתן להחיל את הפרוטוקולים המתוארים כאן למערכות אחרות. היבט חשוב של פרוטוקול זה הוא תחזוקה של עקרות. זה כולל ניתוח של העובר תחת תנאים סטריליים — לחיטוי מכשירים עם 70% אתנול ושימוש מאוזנת מלחי פתרון של האנק סטרילי מספיקה. איסוף הנתונים על פני תקופה של שבועות, זה קריטי לשמור על טיפול עקר לי. התרבויות עצביים הוקמה לאחר יכול להיות תרבותי ארוך טווח - עד לשלושה חודשים — ולפיכך הם שימושיים ללמוד שהחשיפה והריון ותרכובות אחרות את הרשת העצבית. היבט חשוב נוסף של פרוטוקול זה הוא הזמן של דיסקציה ציפוי. הזמן האופטימלי הוא 30 דקות, כולל הדגירה של הרקמה עם טריפסין. ככל הזמן תפוס, נחמדכך ההישרדות של התאים.

נתאר כאן פרוטוקול בסיסי שניתן להחיל את ההערכה של כל חומר כימי או תרופה המשפיעה על התנהגות ותפקוד עצבי. כאן השתמשנו צפיפות התא של תאי 2,200 מ מ2; עם זאת, זה יכול להיות שונה, אחרים צפיפויות התא יכול לשמש. באופן כללי, מצאנו כי הגדלת צפיפות תא מגביר פעילות רשת - קוצים יותר בזמן קצר. השיטה המתוארת, למרות מאוד שימושי להערכת ההשפעות של כימיקלים על פעילות רשת יש מגבלות. אחת המגבלות הגדולים של השיטה היא כי אלה תרבויות במבחנה הם שני מימדים שלא לשקף את הארכיטקטורה תלת מימדי של המוח חוליות. זה ניתן להתגבר באמצעות הקלטות פרוסה. אפשרות נוספת היא כדי להחיל את הטיפולים העובר האפרוח המתפתח על ידי משמעותה של חלון קטן חתוך בצד הרחב של ביצה15, לנתח את המוח בסוף משטר הטיפול, להפוך חלקים עבה vibratome, מניחים על גבי כר הדשא עבור הקלטת פעילות רשת.

פרוטוקול שלנו היא משמעותית כי הוא מאפשר בחינת השפעת והריון על ההתפתחות של פעילות רשת ומציע חקר בסיס מכניסטית על ההשפעות של כימיקלים אלה.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי ה-NSF (HBCU-UP מחקר חניכה בפרס, HRD 1401426 ו- EPSCoR EPS-0814251) NIH (COBRE 1P20GM103653-01A1). K.S. נתמך על ידי התחברות מ 6404 INBRE-III דלאוור.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#5 foreceps Fine Science Tools 11251-10
Axion Muse MEA Axion Biosystems M64-GL1-30Pt200 Will be called MEA system in manuscript
Axis Software Axion Biosystems Will be called recording software in the manuscript
BPA Sigma-Aldrich 239658-250g
curved forceps Fine Science Tools 11272-50
EtOH Sigma-Aldrich 64-17-5
Fertilized chicken eggs from any local farm or Spafas
HBSS Fisher 14170112
Hemacytometer Fisher  02-671-6
Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free BD Biosciences 356231 Will be called Extra Cellular Matrix (ECM) in the manuscript
Neurobasal medium BrainBits Nb4-500
Neuroexplorer statistical software Nex Technologies Neuroexplorer version 5
Pasteur pipettes Fisher  13-678-20A
spring scissors Fine Science Tools 15514-12
Sylgard bottom dissection dishes Living Systems Instrumentaion DD-90-S-BLK-3PK
Trypan Blue dye Fisher 15-250-061
Trypsin-EDTA Fisher 15400054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anahara, R., Yoshida, M., Toyama, Y., Maekawa, M., Masayuki, K., Ishino, F., Toshimori, K., et al. Estrogen agonists, 17 beta-estradiol, bisphenol A, and diethylstilbestrol, decrease cortactin expression in the mouse testis. Arch. of Histol. Cytol. 69 (2), 101-107 (2006).
  2. Dodds, C. Synthetic oestrogens. Br. Med. Bull. 11 (2), 131-134 (1955).
  3. Grignard, E., Lapenna, S., Bremer, S. Weak estrogenic transcriptional activities of Bisphenol A and Bisphenol S. Toxicology In Vitro. 26 (5), 727-731 (2012).
  4. Herbst, A. L., Ulfelder, H., Poskanzer, D. C. Adenocarcinoma of the vagina: association of maternal stilbestrol therapy with tumor appearance in young women. New Eng. J. Med. 284, 878-881 (1971).
  5. Jenkins, S., Raghuraman, N., Eltoum, I., Carpenter, M., Russo, J., Lamartiniere, C. A. Oral exposure to bisphenol A increases dimethylbenzanthracene-induced mammary cancer in rats. Environ Health Persp. 117 (6), 910-915 (2009).
  6. Okada, A., Kai, O. Effects of estradiol-17beta and bisphenol A administered chronically to mice throughout pregnancy and lactation on the male pups' reproductive system. Asian J Androl. 10 (2), 271-276 (2008).
  7. Palanza, P., Gioiosa, L., Vom Saal, F. S., Parmigiani, S. Effects of developmental exposure to bisphenol A on brain and behavior in mice. Environ. Res. 108 (2), 150-157 (2008).
  8. Mimoto, A., Fujii, M., Usami, M., Shimamura, M., Hirabayashi, N., Kaneko, T., et al. Identification of an estrogenic hormone receptor in Caenorhabditis elegans. Biochem. Biophys. Res. Commun. 364 (4), 883-888 (2007).
  9. Allard, P., Colaiacovo, M. Bisphenol A impairs the double-strand break repair machinery in the germLine and causes chromosome abnormalities. Proceedings Natl. Acad. Sci. 107 (47), 20405-20410 (2010).
  10. Mersha, M. D., Patel, B. M., Patel, D., Richardson, B. N., Dhillon, H. S. Effects of BPA and BPS exposure limited to early embryogenesis persist to impair non-associative learning in adults. Behav. Brain Funct. : BBF. 11, 27 (2015).
  11. Chen, Y., Shu, L., Qiu, Z., Lee, D. Y., Settle, S. J., et al. Exposure to the BPA-Substitute Bisphenol S Causes Unique Alterations of GermLine Function. PLOS Genetics. 12 (7), 1006223 (2016).
  12. Shein Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Innate Synchronous Oscillations in Freely-Organized Small Neuronal Circuits. PLoS ONE. 5 (12), 14443 (2010).
  13. Baltz, T., Herzog, A., Voigt, T. Slow Oscillating Population Activity in Developing Cortical Networks: Models and Experimental Results. J. Neurophysiol. 106 (3), 1500-1514 (2011).
  14. Pettmann, B., Louis, J. C., Sensenbrenner, M. Morphological and Biochemical Maturation of Neurones Cultured in the Absence of Glial Cells. Nature. 281 (5730), 378-380 (1979).
  15. Zhang, H., Wu, C. Y., Wang, W., Harrington, M. A. Interneuronal Synapses Formed by Motor Neurons Appear to Be Glutamatergic. NeuroReport. 22 (16), 809-813 (2011).
  16. Paiva, A. R. C., Park, I., Príncipe, J. C. A Comparison of Binless Spike Train Measures. Neural Comp. and Appl. 19 (3), 405-419 (2010).
  17. Cretu, A., Fotos, J. S., Little, B. W., Galileo, D. S. Human and Rat Glioma Growth, Invasion, and Vascularization in a Novel Chick Embryo Brain Tumor Model. Clin Exp Metastasis. 22, 225-236 (2005).
  18. Chiappalone, M., et al. Dissociated cortical networks show spontaneously correlated activity patterns during in vitro development. Brain Res. 93, (2006).
  19. Li, X., et al. Long-term recording on multi-electrode array reveals degraded inhibitory connection in neuronal network development. Biosens Bioelectron. 22 (7), 1538-1543 (2007).

Tags

ביולוגיה התפתחותית בעיה 134 Bis-פנול-A C. elegans הבחורה העובר EDC habituation BPA התפתחות עובריים נוירונים פעילות רשת synchrony אינדקס
הערכת ההשפעה של משבשי תרכובות על הפיתוח של רשת עצבית חוליות הפונקציה באמצעות אלקטרודה מרובה מערכים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sanchez, K. R., Mersha, M. D.,… More

Sanchez, K. R., Mersha, M. D., Dhillon, H. S., Temburni, M. K. Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays. J. Vis. Exp. (134), e56300, doi:10.3791/56300 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter